DD245881A5 - Gnrh antagonisten ix - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids fuer die Anwendung als Arzneimittel. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung neuer Peptide mit staerkerer antagonistischer Wirkung gegenueber endogenem GnRH, welche die Abgabe von Steroiden durch die Gonaden hemmen. Erfindungsgemaess wird ein Peptid mit der Formel XR1(A)DPheR3R4R5R6R7R8(G)ProR10NH2hergestellt, worin beispielsweise bedeuten: X Wasserstoff oder eine Acylgruppe mit bis zu 7 Kohlenstoffatomen; R1 Dehydro-Pro, D-pGlu,(A)D-Phe u. a.; R3 D-PAL, b-D-NAL, (B)D-Trp; R4 Cys, Asp, Glu u. a.; R5 Tyr, (C) Arg, (A)Phe u. a.; R6 b-D-NAL, (B)D-Trp, (A)D-Phe u. a.; R7 Nle, Leu, NML, Phe u. a.; R8 Arg, Ser, Tyr, Thr, PAL; G H, OH, Dehydro: R10 Cys, asp, glu, orn, dab, abu.
Description
aufweist
10. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Peptid die Formel
aufweist.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder eines nicht toxischen Salzes davon. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die Herstellung von Peptiden, die die Abgabe von Gonadotropinen durch die Hypophyse von Säugetieren, einschließlich von Menschen, hemmen und auf Verfahren zur Verhinderung der Ovulation und/ oder der Hemmung der Abgabe von Steroiden. Insbesondere bezieht sich diese Erfindung auf Peptide, die die Funktion der Gonaden hemmen sowie die Abgabe von Stereoidhormonen, Progesteron und Testosteron unterdrücken.
Die Hypophyse ist über einen Stiel an den Bereich in der Basis des Gehirns verbunden, der als Hypothalamus bekannt ist. Durch die Hypophyse werden insbesondere das Follikel stimulierende Hormon (FSH) und das luteinisierende Hormon (LH), die auch als Gonadotropine oder gonadotropische Hormone bezeichnet werden, abgegeben. Diese Hormone regulieren
zusammen die Funktion der Gonaden, die Testosteron in den Testes und Progesteron und Östrogen in den Ovarien produzieren, und sie regulieren darüber hinaus die Erzeugung und Reifung von Gameten.
Die Freisetzung eines Hormons durch den Vorderlappen der Hydrophyse setzt im allgemeinen die vorhergehende Freisetzung einer anderen Klasse von Hormonen, die durch den Hypothalamus produziert werden, voraus. Eines der Hormone des Hypothalamus wirkt als Faktor, der die Abgabe der gonadotropischen Hormone auslöst, insbesondere LH. Dieses.Hormon wird hierin als GnRH bezeichnet, obwohl es auch als LH-RH und als LRF bezeichnet worden ist. GnRH ist isoliert und charakterisiert worden und ist ein Decapeptid derfolgenden Struktur:
P-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
Peptide sind Verbindungen, die zwei oder mehr Aminosäuren enthalten, in denen die Carbonsäuregruppe der einen Säure mit der Amingruppe der anderen Säure verbunden ist. Die Formel für das GnRH, wie sie oben dargestellt wurde, stimmt mit der üblichen Darstellung von Peptiden überein, in denen die endständige Aminogruppe links und die Carbonsäuregruppe rechts steht. Die Stellung der Aminosäurenreste wird dadurch identifiziert, daß die Aminosäurenreste von links nach rechts numeriert werden. Im Falle des GnRH wurde die Hydroxylgruppierung der Carbonsäuregruppe des Glycins durch eine Aminogruppe (NH2) ersetzt. Die Abkürzungen für die einzelnen Aminosäurenreste, wie sie oben angegeben wurden, gehen auf die Trivialnamen der Aminosäuren zurück und sind üblich, z. B. ist pGlu Pyroglutaminsäure, GIu Glutaminsäure, His Histidin, Trp Tryptophan, Ser Serin, TyrTyrosin, GIy Glycin, Leu Leucin, Nie Norleucin, Orn Ornithin, Arg Arginin, Pro Prolin, Sar Sarcosin, Phe Phenylalanin, AIa Alanin, VaI Valin, Nva Norvalin, He Isoleucin, Thr Threonin, Lys Lysin, Asp Asparaginsäure, Asn Asparagin, Gin Glutamin, Cys Cystein, Met Methionin.
Außer im Falle des Glycins sind die Aminosäuren der Peptide in dieser Erfindung in der L-Konfiguration, wenn es nicht anders beschrieben wird. Die Abkürzung mit Kleinbuchstaben, z. B. asp, wird jedoch verwendet, um sowohl das L- als auch das D-lsomer zu bezeichnen, d. h. Asp oder D-Asp.
Es gibt Gründe, die es wünschenswert erscheinen lassen, die Ovulation in weiblichen Säugetieren zu verhindern. Durch die Verabreichung von GnRH-Analogen, die zur normalen Funktion von GnRH antagonistisch sind, wurde die Ovulation unterdrückt oder verzögert. Aus diesem Grunde werden Analoge des GnRH, die Antagonisten von GnRH sind, in Hinblick auf ihre mögliche Verwendung als Contraceptiva oderzur Regulierung der Conceptionsperioden untersucht. GnRH-Antagonisten können auch zur Behandlung frühzeitiger Pubertät und von Endometriosis verwendet werden. Es wurde weiterhin festgestellt, daß derartige Antagonisten zur Regulierung der Abgabe von Gonadotropinen bei männlichen Säugetieren geeignet sind und deshalb verwendet werden können, die Samenbildung zu hemmen, z. B. als Contraceptiva bei männlichen Tieren, oder die prostatische Hypertrophie zu behandeln. Insbesondere können GnRH-Antagonisten dazu verwendet werden, durch Steroide hervorgerufene Tumore,z. B. Tumore der Prostata oder der Brust, zu behandeln.
Es ist daher wünschenswert, verbesserte Peptide zur Verfügung zu stellen, die gegenüber endogenem GnRH stark antagonistisch wirken und die die Abgabe von LH verhindern sowie die Abgabe von Steroiden durch die Gonaden von Säugetieren hemmen; weiterhin ist es wünschenswert, Verbindungen zur Verfügung zu stellen, die bei oraler Verabreichung in vivo wirksamer sind.
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von neuartigen Peptiden mit stark antagonistischer Wirkung gegenüber endogenem GnRH, welche die Abgabe von LH verhindern und die Abgabe von Steroiden durch die Gonaden von Säugetieren hemmen.
Die Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Peptide mit den gewünschten Eigenschaften, die eine größere Wirksamkeit bei oraler Verabreichung aufweisen als bekannte Peptide und Verfahren zu ihrer Herstellung aufzufinden.
Erfindungsgemäß werden Peptide zur Verfügung gestellt, die die Abgabe von Gonadotropien bei Säugetieren, einschließlich des Menschen, hemmen und sie stellt darüberhinaus Verfahren zur Hemmung der Abgabe von Steroiden durch die Gonaden männlicher und weiblicher Säugetiere zur Verfügung. Die verbesserten GnRH-Analogen sind gegenüber GnRH stark antagonistisch und weisen einen Hemmeffekt auf die Reproduktionsprozesse von Säugetieren auf. Folglich werden sie als GnRH-Antagonisten bezeichnet. Diese Analogen können zur Hemmung der Produktion von Gonadotropinen und Sexualhormonen unter den verschiedensten Bedingungen, einschließlich der vorzeitigen Pubertät, hormonabhängigen Neoplasie, Dysmenorrhoe, Endometriosis und steroidabhängiger Tumore, verwendet werden.
Ganz allgemein werden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren Peptide synthetisiert, die die Abgabe der Gonadotropine durch die Hypophyse von Säugetieren, einschließlich des Menschen, stark hemmen und/oder die Abgabe von Steroiden durch die Gonaden hemmen. *
Diese Peptide sind zyklische Analoge des GnRH, die eine kovalente Bindung zwischen dem Aminosäurerest in der Position 4 und dem Aminosäurerest in der Position 10 aufweisen. Vorzugsweise weist der Aminosäurerest in der Position 4 eine Carbonsäureseitengruppeauf, am meisten bevorzugt wird Asp; und der Aminosäurerest in der Position 10 weist eine Aminogruppenseitenkette auf, am meisten bevorzugt wird daP. Diese Peptide sollten in der Position 1, 2 und 3 substituiert sein, und zwar in der Position 1 vorzugsweise durch Dehydro-Pro oder/3-(1-oder 2-Naphthyl)-D-alanin (im folgenden als/3-D-1NAL oder/3-D-2NAL bezeichnet), in der Position 2 in Form eines modifizierten D-Phe und in der Position 3 vorzugsweise in Form eines substituierten D-Trp, D-3PAL oder /3-D-NAL. Die Substitution in der Position 4 kann Cys, eine Diaminosäure mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen, eine Aminodicarbonsäure wie Asp, GIu oder aBu sein. Die Position 5 kann durch folgende Gruppierungen eingenommen werden: (a)Tyr, (b) ein halogeniertes oder methyliertes Phe oder Tyr, (c) His oder vorzugsweise (d) Arg. Das Peptid weist eine Substitution in der Position 6 auf, hat gegebenenfalls eine Substitution in der Position 7, z. B. Nie, NML, Phe, Nva, Met, Tyr, Trp oder PAL, gegebenenfalls Substitutionen in den Positionen 8 und 9 sowie eine Substitution in der Position 10, die zu dem Rest in der Position 4 komplementär ist und sowohl ein D als auch ein L-Isomer sein kann.
Eine modifizierte D-Phe-Gruppierung in der Position 2 führt zu einer erhöhten antagonistischen Aktivität auf Grund der speziellen Modifizierungen am Benzenring. Einzelne Substitutionen für Wasserstoffatome werden vorzugsweise in der para- oder 4-Stellung durchgeführt, können jedoch auch in der 2- oder 3-Stellung erfolgen". Die Substituenten gehören zu der Gruppe Chlor, Fluor, Brom, Methyl-, Methoxy- und Nitrogruppe, wobei Chlor, Fluor und die Nitrogruppe bevorzugt sind. Die Dichlor-Substitutionen befinden sich in den 2,4- oder 3,4-Stellungen des Ringes. Das alpha-Kohlenstoffatom kann außerdem methyliert sein, z. B. (CaMe/4CI)Phe. Der Substituent in der Position 1 ist vorzugsweise modifiziert, so daß seine alpha-Aminogruppe eine Acylgruppe enthält, z. B. eine Formyl-(For), Acetyl-(Ac), Acrylyl-(Acr), Vinylacetyl-(Vac)- oder Benzoyl-(Bz)-Gruppe, wobei die Acetyl- und Acrylylgruppe bevorzugt sind. PAL und D-PAL bezeichnen die D- und L-Isomeren des Pyridylalanins, in denen das /3-Kohlenstoffatom des AIa an die 2-, 3- oder 4-Stellung, vorzugsweise die 3-Stellung, des Pyridinringes gebunden ist. Wenn 0-D-NAL in der Position 1 steht und R5 nicht Arg ist, wird in der Position 6 ein hydrophiler D-Aminosäurerest, z. B. 4-NH2-D-Phe, 4-Guanidino-D-Phe, D-His, D-Lys, D-Orn, D-Arg, D-Har (Homoarginin) oder D-PAL, bevorzugt. Wenn in der Position 1 Dehydro-Pro steht, wird in der Position 6 ein D-Isomer einer lipophilen Aminosäure, z. B. D-Trp, D-Phe, For-D-Trp, NO2-D-Trp, D-Leu, D-IIe, D-NIe, D-Tyr, D-VaI, D-Al3, D-Ser(OtBu), /3-D-NAL oder (imBzl)D-His bevorzugt, jedoch kann D-PAL verwendet werden. Bei oraler Verabreichung sind diese GnRH Antagonisten sehr wirksame Mittel. Die Peptide hemmen die Ovulation weiblicher Säugetiere, wenn sie beim Proöstrusin niedriger Dosierung verabreicht werden. Sie sind außerdem wirksam in Bezug auf die Resorption befruchteter Eier, wenn sie kurze Zeit nach der Befruchtung verabreicht werden. Diese Peptide sind weiterhin wirksam bei der konzentrazeptiven Behandjung männlicher Säugetiere und bei der Behandlung steroid-bedingter Tumore.
Die Peptide der Erfindung werden durch die folgende Formel I genauer dargestellt:
worin X Wasserstoff oder eine Acylgruppe mit bis zu 7 Kohlenstoffatomen, R1 Dehydro-Pro-D-pGlu, (A)D-Phe, (B)D-Trp, Pro oder 0-D-NAL; A H, Cl, F, NO2, CH3, OCH3, CaMe/4CI, Cl2 oder Br; B H, NO2, NH2, OCH3, F, Cl, Br, CH3, N in For oder N in Ac; R3 D-PAL, /3-D-NAL oder (B)D-Trp; R4 Cys, Asp, Orn, daß, daP oder aBu; R5Tyr, (C)Arg, (A)Phe, (3l)Tyr oder His; R6/3-D-NAL, (B)D-Trp, (A')D-Phe, (D)D-Lys, (D)D-Om, D-Har, D-Tyr, (E)D-His, D-PAL oder (C)D-Arg; A' A, NH2, NHCH3 oder gua; C eine (niedere Alkylgruppe)n,worinnO, 1 oder 2 ist; DXodereineArylgruppe; E H, im BzI oder Dinitrophenyl; R7NIe, Leu, NML, Phe, Met, Nva, Trp oder PAL; Re Arg, Ser, Tyr, Thr oder PAL; G H, OH oder Dehydro und R10 cys, asp, glu, orn, dab, dap, oder abu bedeuten. Wenn R1 /3-D-NAL bedeutet und R5 nicht Arg ist, dann ist R6 vorzugsweise 4-NH2-D-Phe, D-Lys, D-Om, D-Har, D-His, 4-gua-D-Phe, D-PAL oder D-Arg.
Durch Dehydro-Pro wird 3,4-Dehydroprolin, C6H7O2N, bezeichnet. Durch /3-D-NAL wird das D-Isomer des Alanins bezeichnet, das am /3-Kohlenstoffatom durch eine Naphtylgruppe substituiert ist, also auch 3-D-NAL. Vorzugsweise wird /3-D-2NAL verwendet, wobei die Verknüpfung mit dem Naphthalinring in der 2-Stellung der Ringstruktur ist, jedoch kann auch /3-D-1NAL verwendet werden. PAL bezeichnet Alanin, das am /3- Kohlenstoffatom durch eine Pyridylgruppe substituiert ist. Vorzugsweise findet diese Bindung an die 3-Stellung des Pyridinringes statt. Wenn substituiertes D-Trp verwendet wird, können einzelne Wasserstoffatome entweder in der 5- oder 6-Stellung substituiert sein. Die Substituenten können Chlor, Fluor, Brom, Methyl-, Amino-, Methoxy- oder Nitrogruppen sein, wobei Chlor, Fluor und die Nitrogruppe bevorzugt sind. Andererseits kann die Indol-Stickstoff acyliert sein, z. B. mit einer Formyl- (N in For-oder 1-For-) oder Acety!gruppe. N in For-D-Trp und 6NO2-D-Trpsind die bevorzugten substituierten Aminosäurereste. Durch NML wird NaCH3-L-Leu bezeichnet. Durch aBu wird eine a-Aminobuttersäure und durch daß eine a, -Diaminobuttersäure bezeichnet. Durch daP wird a,/3-Diaminopropionsäure dargestellt. Wenn in der Position 1 Dehydro-Pro steht, ist in der Position 5 vorzugsweise Tyr anwesend und in der Position 6 ein lipophiler Rest. Durch 4-gua-D-Phe wird ein Rest von D-Phe mit einer Guanidin-Substitution in der para-Stellung bezeichnet. Die Guanido-Gruppe eines Arg-Restes in der Position 5 oder 6 kann einmal oder zweimal durch niedere Alkylgruppen substituiert sein, d.h. durch Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, z. B. mit einer Propylgruppe (Pr). Wenn in der Position 6 D-Lys oder D-Orn stehen, können ihre Seitenkettenaminogruppen durch Acylgruppen (1 bis 7 Kohlenstoffatome) oder durch eine Arylgruppe mit nicht mehr als einem Phenylring substituiert sein.
Die Peptide dieser Erfindung können durch die klassische Synthesemethode in Lösung oder durch ein Festphasenverfahren an einem chlormethylierten Kunstharz, einem hydroxymethylierten Kunstharz, einem Methylbenzhydrylaminharz (MBHA), einem Benzhydr-ylaminharz (BHA).oder einem anderen, nach dem Stand der Technik geeigneten Kunstharz, synthetisiert werden. Die Festphasensynthese wird vorzugsweise in der Form durchgeführt, daß die Aminosäuren in der Kette schrittweise angefügt werden, wie es nach dem Stand der Technik bekannt ist. Seitenkettenschutzgruppen, die nach dem Stand der Technik gut bekannt sind, werden vorzugsweise an die in der Synthese verwendeten Reste mit besonders labilen Seitenketten gebunden und können gegebenenfalls auch an andere Aminosäurenreste, z. B. an Trp, gebunden werden, bevor diese Aminosäuren an die Kette gebunden werden, die auf dem Kunstharzträger aufgebaut wird. Eine derartige Synthesevariante beinhaltet ein vollständig geschütztes Peptidharz als Zwischenstufe.
Chemische Zwischenstufen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, können durch die Formel Il dargestellt werden:
RgiX4 oder X5I-R6(X4 oder X5 oder X6J-R7(X2 oder x7)-R8(X4 oder Xs oder X8)-(G)Pro-R10(X3)-X9
worin bedeuten:
X1 eine a-Aminoschutzgruppe von der Art, die nach dem Stand der Technik in der stufenweisen Synthese von Polypeptiden geeignet sind und wenn X in der gewünschten Peptidkette eine spezielle Acylgruppe ist, kann diese Gruppe als die Schutzgruppe verwendet werden. Unter den Gruppen an a-Aminschutzgruppen, die durch X1 repräsentiert werden, sind (1) Schutzgruppen
vom Acyltyp, ζ. B. Formyl (For), Trifluoracetyl, Phthalyl, p-Toluensulfonyl (Tos), Benzoyl (Bz), Benzensulfonyl, o-. Nitrophenylsulfenyl (Nps), Tritylsulfenyl, o-Nitrophenoxyacetyl, Acrylyl (Acr), Chloracetyl, Acetyl (Ac) und γ-Chlorbutyryl; (2) Schutzgruppen von der Art der aromatischen Urethane, z. B. Benzyloxycarbonyl (Z), Fluorenylmethyloxyca.rbonyl (Fmoc) und substituierte Benzyloxycarbonylgruppen wie p-Chlorbenzyloxycarbonyl (CIZ), p-Nitrobenzyloxylcarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl und p-Methoxybenzyloxycarbonyl; (3) Schutzgruppen aus aliphatischen Urethangruppen,z. B. tert-Butyloxycarbonyl (Boc), Diissopropylmethoxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, Ethoxycarbonyl und Allyloxycarbonyl; (4) Schutzgruppen von der Art der Cycloalkylurethane, z. B. Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und Cyclohexyloxycarbonyl; (5) Schutzgruppen vom Typ der Thiocarbamate, z. B. Phenylthiocarbonyl; (6) Schutzgruppen vom Alkyltyp, z. B. Allyl (AIy), Triphenylmethyl (Trityl) und Benzyl (BzI); (7) Trialkylsilangruppen, z. B. Trimethylsilan. Die bevorzugte a-Aminschutzgruppe ist Boc, wenn X Wasserstoff bedeutet.
X2 Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für den Indol-Stickstoff von Trp, z. B. Bz; oder For. In vielen Synthesen besteht nicht die .Notwendigkeit, Trp zu schützen; deshalb wird ein solcher Schutz nicht verwendet, wenn an anderer Stelle des Peptidsacyliertes D-Trp vorhanden ist.
X3 eine Schutzgruppe für die Sulfhydrylgruppe des Cys, vorzugsweise p-Methoxybenzyl (MeOBzI), p-Methylbenzyl, Acetamidomethyl, Trityl oder BzI; oder eine geeignete Schutzgruppe für eine Aminsoseitenkette, z. B. Z Cl-Z oder t-Amyloxycarbonyl; oder eine geeignete, vorzugsweise hydrazinempfindliche Schutzgruppe für eine Carboxylseitenkette, z. B. OBzI (Benzylester); oder eine direkte Bidung, wodurch die.zyklische Form aus einer Carba- oder Dicarbabindung resultiert. X4 Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die phenolische Hydroxylgruppe des Tyr, ausgewählt aus der Gruppe, die'aus Tetrahydropyranyl, tert.-Butyl, Trityl, Benzyl, Z, 4-Brombenzyloxycarbonyl und 2,6-Dichlorbenzyl besteht. Bevorzugt wird 2,6-Dichlorbenzyl (DCB).
Xs eine Schutzgruppe für eine Seitenketten-Guanidgruppe, wiez. B. der in Arg, oderfür die Imidazolgruppe des His, z.B. Nitro, Tos, Trityl, Adamantyloxycarbonyl, Z und 2,4-Dinitrophenyl (DNP). X5 kann auch Wasserstoff sein, was bedeutet, daß die Atome der Seitenkettengruppen nicht geschützt sind. Im allgemeinen wird Tos bevorzugt.
X6 eine Schutzgruppe für eine Seitenketten-Aminogruppe, die nicht abgespalten wird, wenn X3 von einer Seitenketten-Aminogruppein der Position 4 oder 10 entfernt wird, wobei diese Gruppe dann an dem Ringschluß beteiligt sein wird. Vorzugsweise ist diese Gruppe Fmoc.
X7 Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für Met, z. B. Sauerstoff.
Xs eine Schutzgruppe für eine Hydroxylseitenkette des Ser oder Thr, z. B. Ac, Bz, Trityl, BzI oder DCB. X9 O-CH2-Träger aus synthetischem Polymeren, -NH-Träger aus synthetischem Polymeren, OH, Ester oder NH2. Das Auswahlkriterium für die Schutzgruppen der Seitenketten X2-X8 ist, daß die Schutzgruppen gegenüber dem Reagens unter den Reaktionsbedingungen, die zur Entfernung der a-Aminschutzgruppe (vorzugsweise Boc) ausgewählt wurden, in jeder Synthesestufe stabil ist. Die Schutzgruppe soll unter den Bedingungen der Kopplung nicht abspalten, sie soll jedoch nach Abschluß der Synthese der gewünschten Aminosäuren-Sequenz unter Reaktionsbedingungen abspaltbar sein, die die Peptidkette nicht verändern. Die Schutzgruppen X3 sollten in bestimmten Synthesen vor der Abspaltung der Schutzgruppe X6 abtrennbar sein.
Wenn X9 eine -O-CH2-(Träger aus synthetischem Polymeren)-Gruppierung bedeutet, wird damit die Estergruppe von einer der vielen funktioneilen Gruppen des Polystyren-Trägers dargestellt. Wenn die X9-Gruppierung -NH-(Träger aus synthetischem Polymeren) bedeutet, verbindet eine Amidbindung Ri0 mit einem BHA-Harz oder einem MBHA-Harz.
Wenn X eine Acetylgruppe bedeutet, z. B. in der Formel des Endprodukts, ist es möglich, diese als die Schutzgruppe X1 für eine a-Aminogruppedes D-NAL oder einer beliebigen anderen Aminosäure in.der Position 1 zu verwenden, indem diese Gruppe addiert wird, bevor die Kopplung dieser letzten Aminosäure an die Peptidkette erfolgt. Vorzugsweise wird eine Umsetzung jedoch mit dem Peptid am polymeren Träger durchgeführt (nach der Debiockierung der a-Aminogruppe, wobei die Seitenkettengruppen geschützt bleiben), z.B. durch Umsetzung mit Essigsäure in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder vorzugsweise mit Acetanhydrid, oder durch eine andere geeignete Umsetzung, die nach dem Stand der Technik bekannt ist.
Der Ringschluß wird vorzugsweise am linearen, freien Peptid durchgeführt und nicht, während das Peptid Teil des Peptidpolymeren ist. Wenn der Ringschluß über eine Disulfidbrücke ausgeführt wird, kann das vollständig geschützte Peptid von einem hydroxymethylierten Polymeren oder einem chlormethylierten polymeren Träger durch Ammonolyse abgespalten werden, wie es nach dem Stand der Technik bekannt ist, wodurch das Amid vollständig geschützt als Zwischenstufe erhalten wird, das anschließend auf geeignete Weise zyklisiert und die Schutzgruppen abgespalten werden. Nach einer alternativen Methode kann die Abspaltung der Schutzgruppen und die des Peptides von einem Benzhydrylamin-Polymeren bei O0C mit Fluorwasserstoffsäure durchgeführt werden. Nach einigen Arbeitsvorschriften kann dieZyklisierung ausgeführt werden, während das teilweise geschützte Peptid am Polymerträger gebunden bleibt, es ist jedoch in diesem Falle möglich, daß die Ausbeuten nicht so hoch sind.
Die Durchführung der Ringschluß-Stufe für das Analoge des GnRH-Peptids ist natürlich von der Art der Bindung abhängig, die zwischen den Aminosäureresten in der Position 4 und 10 gewünscht werden. Wenn in den Positionen 4 und 10 jeweils D-oder L-Cys-Reste eingebaut sind, ist es günstig, die Ringschluß-Stufe im Anschluß an die Abspaltung vom Polymerträger und der Entfernung aller Schutzgruppen vom Peptid durchzuführen. Die zyklische Form des Peptids wird dadurch erhalten, daß mit einer Eisen-lll-cyanid-Lösung oder durch Luft oxydiert wird oder daß eine andere der bekannten Methoden angewendet wird. Erfolgt der Ringschluß über eine Amidbindung zwischen einer Seitenkettenaminogruppe des Aminosäurerestes in der Position 4 und einer Seitenketten-Carbonsäuregruppe des Aminosäurerestes in der Position 10 (was bevorzugt sein kann), oder umgekehrt, ist es vorzuziehen, das geschützte Peptid an einem MBHA- oder BHA-Polymeren zu synthetisieren und den Benzylester der Carbonsäure-Seitengruppe zum Hydrazid umzusetzen, während das Peptid noch am Polymerträger gebunden ist. Das kann dadurch erreicht werden, daß OBzI als Schutzgruppe für die Carbonsäure-Seitengruppe des Aminosäureesters, der an der Amidbindungs-Brücke beteiligt ist, verwendet wird, und darüber hinaus Fmoc als Schutzgruppe für alle Aminoseitenketten am Aminosäurerest in der Position 6 benutzt wird. Anschließend an diese selektive Aktivierung durch Hydrazid werden noch verbliebene Schutzgruppen an den Seitenketten außer den Fmoc-Schutzgruppen am Aminosäurerest in der Position 6 abgespalten und die Abspaltung vom Polymerträger vollzogen. Danach wird die Reaktion zur Erzielung des Ringschlusses ausgeführt, indem mit Isoamylnitrit und einer starken Säure, z.B. HCI, versetzt wird, um dadurch das Azid
herzustellen, das nun wiederum mit der freien Arhinogruppe reagiert, nachdem vorher neutralisiert worden ist, und so die Amidbindung erzeugt. Im Anschluß an den Ringschiuß werden alle Schutzgruppen vom Peptid abgespalten, indem alle Fmoc-Gruppen durch Verwendung eines basischen Reagenzes, z. B. durch Piperidin, entfernt werden. Ganz allgemein werden Ringschlußreaktionen von Peptiden in ihrer Gesamtheit durch die Lehre der folgenden US-PS gelehrt: 4.115.554 (19. September 1978); 4.133.805 (9. Januar 1979); 4.140.767 (20. Februar 1979); 4.161.521 (17.JuIi 1979); 4.191.754 (4. März 1980); 4.238.481 (9. Dezember 1980); 4.244.947 (13. Januar 1981) und 4.261.885 <14. April 1981).
Analoge des GnRH, die äquivalente, modifizierte Cystein-Reste in den Positionen 4 und 10 aufweisen, in denen die Disulfidbindung durch eine -CH2-Bindung ersetzt worden ist, werden hier als „Dicarba" bezeichnet. Wenn nur eine der Sulfhydrylgruppeh durch eine CH2-Gruppe ersetzt worden ist, wird dieses als „Carba" bezeichnet, z. B. carba4, Cys10 -GnRH. Von der Struktur des als Endprodukt erhaltenen Peptids her betrachtet, enthält die Position, die andererseits von einem Cys-Rest eingenommen werden würde, an dessen Stelle einen Rest der alpha-Aminobuttersäure (aBu). Wenn Peptide mit einer solchen Dicarba-oder Carba-S-Bindung hergestellt werden, wird vorzugsweise die im USP 4.161.521 ausgeführte Methode angewendet, so daß im Zwischenprodukt nach Formel Il X3 eine direkte Bindung zu einem anderen Aminosäurerest bedeutet. Die Erfindung stellt somit auch ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder eines nicht toxischen Salzes davon zur Verfugung, wobei dieses Peptid die Formel aufweist:
-(A)D-PlIe-B3-R4-E5-R5-E7-E8-CG)PrO-B1Q-HH
worin X Wasserstoff oder eine Acylgruppe mit mindestens 7 Kohlenstoffatomen; R1 Dehydro-Pro, D-pGlu, (A)D-Phe, (B)D-Trp, Pro oder/3-D-NAL; A Wasserstoff, Cl, F, NO2, CaMe/4CI, Cl2 oder Br; B Wasserstoff, H, NO2, NH2, OCH3, F, Cl, Br, CH3, NinFor, oder NinAc; R3 D-PAL, /3-D-NAL oder (B)D-Trp; R4 Cys, Asp, GIu, Om, daß, daP oder aBu; R5 Tyr, (C)Arg, (A)Phe, (3l)Tyr, oder His; R6 0-D-NAL, (B)D-Trp, (A')D-Phe, (D)D-Lys, (D)D-Orn, D-Har, D-Tyr, (E)D-His, D-PAL oder (C)D-Arg; A' A, NH2, NHCH3 oder gua; C (niedere Alkylgruppe)n, worin η gleich 0,1 oder 2 ist; D X oder eine Arylgruppe; E Wasserstoff, im BzI oder Dinitrophenyl; R7 Nie, Leu, NML, Phe, Met, Nva,Tyr, Trp oder PAL; Rs Arg, Ser, Tyr, Thr, oder PAL; G Wasserstoff, OH oder Dehydro und R10 cys, asp, glu, orn, dab, dap oder abu bedeuten, wobeidieses Verfahren darin besteht, (a) eine Zwischenstufe mit der folgenden Formel herzustellen:
X1-Rr(A)D-Phe-R3(X2)-R4(X3)-Rs(X4 oder X5J-R6(X4 oder X5 oder X6)-R7(X2 oder X7)-R8(X4 oder X5 oder X8)-(G)Pro-R10(X3)-X9,
worin X1 Wasserstoff oder eine a-Amino-Schutzgruppe; X2 Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für einen Indol-Stickstoff; X3 eine direkte Bindung, Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für Cys oder eine Seitenketten-Amino- oder Carbonsäuregruppe; X4 Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für eine phenolische Hydroxylgruppe des Tyr; X5 entweder Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für eine Guanido- oder Imidazol-Seitenkette; X6 eine Schutzgruppe für eine Aminoseitenkette; X7 eine Schutzgruppe für Met; Xs eine Schutzgruppe für eine alkoholische Hydroxylgruppe des Ser oder Tyr bedeuten und X9 aus der Gruppe O-CH2-(Polymerträger), -NH-(Polymerträger), Ester und Amide ausgewählt wurde; (b) eine oder mehrere der Gruppen X1 bis X8 abzuspalten und/oder von einem polymeren Träger, der in X9 enthalten ist, abzuspalten; (c) gegebenenfalls einen Ringschluß zwischen R4 und R10 auszuführen, wenn er nicht bereits vorhanden ist, und, wenn es gewünscht wird, (d) das so erhaltene Peptid in eines seiner nicht toxischen Salze zu überführen.
Die Reinigung des Peptids wird durch lonenaustausch-Chromatographie an einer CMC-Säule und anschließender Verteilungschromatographie unter Verwendung des Elutionssystems n-Butanol:0,1 η Essigsäure (1:1 Volumenverhältnis) an einer mit Sephadex G-25 gefüllten Säule oder mittels HPLC, wie es nach dem Stand derTechnik bekannt ist, ausgeführt. Die erfindungsgemäßen Peptide sind bei Dosierungen von weniger als 100 Mikrogramm pro Kilogramm Körpergewicht wirksam, wenn sie ungefähr zu Mittag des Tages des Proöstrus verabreicht werden, um eine Ovulation in weiblichen Ratten zu verhindern. Für eine längere Unterdrückung der Ovulation kann es sich als notwendig erweisen, Dosierungsmengen im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 2,5 Milligramm je Kilogramm Körpergewicht zu verwenden. Diese Antagonisten sind auch wirksam in der Unterdrückung der Spermatogenese, wenn sie männlichen Säugetieren regelmäßig verabreicht werden. Sie können folglich als Kontroceptiva verwendet werden. Da diese Verbindungen die Konzentration an Testosteron (eine unerwünschte Folge bei normalen, sexuell aktiven Männchen) reduzieren, kann es sich als geeignet erweisen, zusammen mit dem GnRH-Antagonisten eine Ersatzdosis an Testosteron zu verabreichen. Diese Antagonisten können auch dazu verwendet werden, die Erzeugung von Gonadotropinen und von Sexualsteroiden zu anderen Zwecken, als sie hierin beschrieben worden sind, zu reduzieren.
Ausführungsbeispiel
Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert.
Peptide der Tabelle I mit der Formel
Ac-R1-(4Gl)D-PLe-D-SPaI-R4-ArE-R6-LeU-R8-PrO-R1 Q-IH2
werden nach dem Festphasen-Verfahren, auf das weiter oben Bezug genommen wurde, hergestellt.
Ri Ri R4 Rg Rs R10
1 0-D-2NAL Cyc D-3PAL Arg · Cys
2 /3-D-2NAL daP D-3PAL . Arg Asp
- 6 - £«K> OO I
| 3 | Dehydro-Pro | Cys | /3-D-NAL | Arg | Cys |
| 4 | /3-D-2NAL | Cys | D-Tyr | Thr | Cys |
| 5 | /3-D-2NAL | daP | D-3PAL | Arg | D-Asp |
| 6 | /3-D-2NAL | Om | . D-3PAL | Arg | Asp |
| 7 | /3-D-2NAL | Asp | D-Tyr | Ser | daP |
| 8 | /3-D-2NAL | Aso | D-Tyr | 3PAL | daP |
| 9 | /3-D-2NAL | GIu | D-Tyr | 4PAL | daP |
| 10 | /3-D-2NAL | GIu | D-2PAL | Tyr | daP |
| 11 | /3-D-2NAL | daB | (4gua)D-Phe . | Tyr | Asp |
| 12 | 0-D-2NAL | daß | D-His | Ser | Asp |
| 13 | Dehydro-Pro | daB | D-Leu | Arg | GIu |
| 14 | D-Trp | daB | D-Phe | 4PAL | GIu |
| 15 | D-pGlu | daP | D-IIe | Thr | GIu |
| 16 ' | D-Phe | daP | D-VaI | 2PAL | Asp |
Zum Zwecke der Erläuterung wird eine repräsentative Festphasen-Synthese des Peptids Nr. 1 der Tabelle I, das als AC-/3-D-2NAL1, (4CI)D-Phe2, D-3PAL3·6, Cys4'10, Arg5 -GnRH bezeichnet wird, im folgenden beschrieben. Dieses Peptid hat die folgende Formel: Ac-/3-D-2NAL-(4CI)D-Phe-D-3PAL-Cys-Arg-D-3PAL-Leu-Arg-Pro-Cys-NH2
Die anderen Peptide werden ebenso hergestellt und gereinigt. Als Träger wird ein BH Α-Harz verwendet. Innerhalb von 2 Stunden wird Boc-geschütztes GIy in CH2CL2 unter Verwendung eines dreifachen Überschusses des Boc-Derivates und DCCaIs Aktivierungsmittel an den polymeren Träger gekoppelt. Der Glycinrest bindet sich an das BHA-Harz über eine Amidbindung. Die daran anschließende Kopplung jedes Aminosäurerestes, Waschen, Deblockierung und Kopplung des nächsten Ami.nosäureresteswird nachfolgendem Reaktionsschema unter Verwendung eines Syntheseautomaten, beginnend mit etwa 5g des Polymeren, ausgeführt:
Stufe Reagenzien und Operationen Mischzeit(min)
1 CH2CI2-Waschung,80ml(2mal) 3
2 Methanol (MeOH)-Waschung, 30 ml (2 mal) 3
3 CH2CI2-Waschung,80ml(3mal) 3
4 50%TFA + 5%1,2-EthanditiolinCH2CL2,
70 ml,2 mal . 10
5 Isopropanol + 1 "/oEthanditiol-Waschung,
80ml,-2mal 3
6 TEA 12,5% in CH2CI2,70ml (2 mal) . ' 5
7 Methanol-Waschung,40mal(2mal) 2
8 CH2CI2-Waschung,80ml(3mal) 3
9 Boc-Aminosäure(IOmmol) in30ml DMFoder CH2CI2, in Abhängigkeit von der Löslichkeit derspeziellen,geschützten Aminosäure (1 mal)
+ DCC (10 mmol) in CH2CI2 30-300
10 MeOH-Waschung,40ml(2mal) . 3
11 TEA12,5%inCH2CI2,70ml(1 mal) 3
12 · MeOH-Waschung,30ml(2mal) · 3
13 CH2CI2-Waschung,80ml(2mal) 3
Nach der Stufe 13 kann ein Aliquot abgenommen werden, um den Ninhydrin-Test durchzuführen: wenn der Test negativ ausfällt, muß zu Stufe 1 Zurückgekehrtwerden, um die nächste Aminosäure anzukoppeln; wenn der Test positiv oder schwach positiv ist, ist zurückzugehen und Schritte 9 bis 13 zu wiederholen.
Das obige Reaktionsschema wird für die Kopplung jeder Aminosäure des erfindungsgemäßen Peptids verwendet, nachdem die erste Aminosäure gebunden worden ist. Die Schutzgruppe NaBoc wird für jeden der noch verbleibenden Aminosäurereste während der Synthese verwendet. NaBoc-/3-D-2NAL wird nach einem Verfahren, das nach dem Stand der Technik bekannt ist, hergestellt oder von einer US-Vertriebsfirma bezogen. Die Seitenkette des Arg wird mit Tos geschützt. MeOBzI wird als Seitenketten-Schutzgruppe für die Sulfhydrylgruppe des Cys verwendet. Boc-Arg(Tos), das in CH2CI2 schlecht löslich ist, wird unter Verwendung eines DMF-CH2CI2-Gemisches gekoppelt.
Nach der Deblockierung der a-Aminogruppe am N-Ende unter Verwendung von Trifluoressigsäure (TFA), wird die Acetylierung mit einem großen Überschuß an Essigsäureanhydrid durchgeführt, wobei Dichlormethan als Lösungsmittel verwendet wird. Die Spaltung des Peptids vom polymeren Träger und die vollständige Abspaltung der Schutzgruppen der Seitenketten findet sehr schnell mit HF bei 00C statt. Vor der Umsetzung mit HF wird Anisol als Fänger zugesetzt. Nachdem das HF im Vakuum entfernt worden ist, wird der polymere Träger mit 50%iger Essigsäure extrahiert. Die Waschlösungen werden lyophilisiert und ergeben so ein rohes Peptidpulver.
Das Peptid wird dann bei 22 °C innerhalb von 24 Stunden an der Luft oxidiert, um eine Disulfidbrücke zwischen den Cys-Resten in jedem Molekül herzustellen.
Die Reinigung des Peptids wird danach durch lonenaustausch-Chromatographie an CMC (Whatmann CM 32 unter Verwendung eines Gradienten von 0,05 bis 0,3 M NH4OAc in 50/50 Methanol/Wasser) und nachfolgender Verteilungschromatographie in einer Säule mit Gelfilter unter Verwendung des Elutionssystems n-Butanol:0,1 η Essigsäure (1:1 Volumenverhältnis) durchgeführt.
Die Beurteilung des Peptids auf seine Homogenität hin erfolgt durch Dünnschichtchromatographie und verschiedene „ Lösungsmittelsysteme sowie durch Verwendung der Revers-Phasen-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit einer wäßrigen Triethylammoniumphosphatlösung und Acetonitril.
Die Aminosäureanalyse des so so erhaltenen, gereinigten Peptids stimmt mit der Formel für die herzustellende Struktur überein ' und weist im wesentlichen Werte ganzer Zahlen für jede Aminosäure in der Kette auf. Die optische Drehung wird mit einem photoelektrischen Polarimeter gemessen und beträgt [a]2 D = -37,8° ± 1 (C = 1,50% Essigsäure).
Ein Peptid wie Nr. 2 der Tabelle I, das über eine Amidbindung zwischen den Seitenketten der Aminosäurereste in den Positionen 4 und lOzyklisiert ist, kann nach den allgemeinen Syntheseverfahren der US-Patente Nr.4.133.805 oder 4.161.521 hergestellt werden. Als Beispiel für die geeignete Synthesevorschrift wird das folgende Zwichenprodukt an einem MBHA-Härz zusammengesetzt:
Ac-/3-D-NAL-(4CI)D-Phe-D-3PAL-daP(Z)-Arg(Tos)-D-3PAL-Leu-Arg(Tos)-Pro-Asp(OBzl)-MBHA-Polymerträger. Die Abspaltung der Schutzgruppen und der Ringschluß werden wie folgt durchgeführt. 4g des geschützten Peptid-Polymerträger-Komplexes werden bei Zimmertemperatur in 40ml DMF suspendiert. Unter kontinuierlichem Rühren wird dazu 1 ml wasserfreies Hydrazin (30-40-facher Überschuß) zugegeben. Durch das Reaktionsgemisch wird Stickstoff geleitet. In einem geschlossenen Gefäß wird 48 Stunden kontinuierlich gerührt. Der Polymerträger wird abfiltriert, mit DMF, MeOH, CH2CI2 und MeOH gewaschen und schließlich getrocknet.
4g des geschützten Peptid-Hydrazid-Polymerträger-Komplexes werden mit 10-15 ml destillierter HF versetzt (60 Minuten bei O0C), um die noch verbliebenen Schutzgruppen abzuspalten und das Peptid vom Träger zu trennen. HF wird unter Hochvakuum entfernt und das Peptid mit wasserfreiem Ethylether gefällt. Der Feststoff wird abfiltriert, in 50 ml eines 1:1-Gemisches von CH3CNiH2O gelöst und lyophilisiert. Danach wird es unter Verwendung der RP-HPLC, wie es in Bezug auf das Peptid Nr. 1 beschrieben worden ist, vor Durchführung des Ringschlusses gereinigt.
1000 mg des Peptid-Hydrazids werden in 15 ml DMF gelöst, auf -25°C abgekühlt und Stickstoff durchgeleitet. 0,56ml (etwa 2,25mMol) 4N HCI in Dioxan werden hinzugefügt. Schließlich werden 105μ.Ι (etwa 0,78mMol) Isoamynitrit innerhalb von 10 Minuten zugegeben. Es wird bei —25°C weitere 3 Stunden gerührt. Die Azidlösung wird mit 1 000 ml vorgekühltem DMF (-250C) verdünnt. Dazu wird N,N-Diisopropylamin in geeigneten Anteilen hinzugefügt, so daß schließlich ein pH-Wert von 7,8 erhalten wird. Der pH-Wert wird mehrere Male, überprüft und erneut eingestellt.
Die Lösung wird drei Tage bei 40C aufbewahrt und danach im Hochvakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Ethylether aufgeschlämmt. Der Feststoff wird abfiltriert und im Vakuum getrocknet.
Die Peptide werden in vivo untersucht und können auch in vitro getestet werden. Wenn die Untersuchung in vitro durchgeführt wird, werden abgetrennte Hypophysen-Zellen von Ratten verwendet, die vor der Untersuchung 4 Tage in einer Kultur gehalten wurden. Die LH-Niveaus, die als Reaktion auf die Anwendung der Peptide ermittelt werden, werden durch spezifische Radioimmunotests für Ratten-LH bestimmt. Kontrollansätze von Zellen erhalten nur eine Gabe, die 3 nanomolar in Bezug auf GnRH ist; Testansätze erhalten eine Dosis, die 3 nanomolar in Bezug auf GnRH ist und zusätzlich eine Dosis, die entweder den gegenwärtigen Standard-Antagonisten für Vergleichszwecke, d. h. [Ac-Dehydro-Pro1, (4F)D-Phe2, D-Trp3/6]-GnRH, oder das Testpeptid in-Konzentrationen im Bereich von 0,01 bis 10 nanomolar enthält. Die Menge des abgegebenen LH in den Proben, die nur mit GnRH behandelt wurden, wird mit der verglichen, die in den Proben abgegeben wurden, die mit dem Peptid und GnRH behandelt wurden. Die Fähigkeit des untersuchten Peptids, die durch 3 nanomolare GnRH freigesetzte Menge an LH zu reduzieren, wird mit der des gegenwärtigen Standard-Peptids verglichen. Durch die Untersuchung in vivo wird die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Peptide zur Verhinderung der Ovuiation in weiblichen Ratten bestimmt. Bei dieser Untersuchung wird einer vorgegebenen Anzahl erwachsener, weiblicher Sprague-Dawley-Ratten, z. B. fünf bis zehn, mit einem Körpergewicht von jeweils 225g bis 250g eine spezifizierte Menge des Peptids in Mikrogramm-Dosis entweder in physiologischer Kochsalzlösung oder bakteriostatischem Wasser ungefähr zu Mittag am Tage des Proöstrus injiziert. Als Kontrolle wird eine abgetrennte Gruppe von Ratten verwendet, denen das Peptid nicht injiziert wurde. Jede der Ratten der Kontrollgruppe hat am Abend des Proöstrus eine Ovuiation. Von den behandelten Ratten wird die Anzahl derjenigen, die eine Ovuiation haben, aufgezeichnet. Jedes der Peptide wird als signifikant wirksam betrachtet, das die Ovuiation weiblicher Ratten bei sehr geringer Dosierung verhindert und jedes der Peptide wird als vollkommen wirksam betrachtet, das bei einer Dosis von etwa 500 Mikrogramm wirkt. Alle Peptide der Tabelle I werden als wirksam zur Blockierung der durch GnRH induzierten LH-Sekretion in vitro bei brauchbaren Konzentrationen betrachtet. Viele dieser Peptide sind in vivo wirksamer als der gegenwärtige Standard. Alle diese Peptide werden als wirksam zur Unterdrückung der Ovuiation in weiblichen Säugetieren bei niedriger Dosierung eingeschätzt. So zeigt z.B. die Untersuchung des Peptids Nr. 1 mit einer Dosierung von 10 Mikrogramm, daß nur 7 von 10 Ratten eine Ovuiation. aufweisen. Die gleiche Untersuchung beim Peptid Nr. 2 zeigt, daß bei einer Dosierung von 10yug9 von 10 Ratten zur Ovuiation kommen und daß bei einer Dosierung von 50^g Ovon 10 Ratten zur Ovuiation kommen. Die Untersuchung des Peptids Nr. 5 zeigt, daß bei einer Dosierung von 50,ug nur 2 von 9 Ratten zur Ovuiation kommen.
Peptide der Tabelle Il mit der Formel Ac-DehydroPro-(A)D-Phe-R3-R4-R5-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Rio-NH2
werden nach der Festphasen-Methode, die weiter oben beschrieben wurde, hergestellt.
| Tabelle Il | A | R3 | R4 | R5 | Rio |
| Nr. | 4F | D-Trp | Cys | Tyr | Cys |
| 17 | 4F | D-Trp | daP | Tyr | Asp |
| 18 | 4Cl | (IFor)D-Trp | Om | (2F)Phe | Asp |
| 19 | 4Cl | (IFor)D-Trp | daß | Tyr | GIu |
| 20 | 4Cl | (IFor)D-Trp | daß | (2NO2)Phe | Asp |
| 21 | 4Cl | (1 Ac)D-Trp | daP | (2CH3)Phe | Asp |
| 22 | |||||
| 23 | 4Br | (1Ac) D-Trp ·. | daP | Tyr | D-GIu |
| 24 | 4Br | (1Ac)D-Trp | daß | (2Br)Phe | D-GIu |
| 25 | H | D-Trp | daß | (2CI)Phe | Asp |
| 26 | 4NO2 | (5CH3)D-Trp | daß | (3CH3)Phe | Asp |
| Tl | 4NO2 | '(5F)D-Trp | Asp | Tyr | D-daP |
| 28 | 2,4Cl2 | (5CI)D-Trp | Asp | (3F)Phe | d-daB |
| 29 | 2,4Cl2 | (6NO2)d-Trp | GIu | (3Br)Phe | D-daB |
| 30 | CaMe/4CI | (5OCH3)D-Trp | aßü | (3l)Tyr | D-Cys |
| 31 | 3,4Cl2 | . (5NH2)D-Trp | Cys | . (3CI)Phe | D-aBu |
Die Untersuchung der Peptide der Tabelle Il in vitro und/oder in vivo zeigt, daß die in Tabelle Il aufgeführten Peptide als wirksam eingeschätzt werden können, die GnRH-induzierte LH-Sekretion in vitro bei geeigneten Konzentrationen zu blockieren. Eine Anzahl dieser Peptide ist in vivo wirksamer als der gegenwärtige Standard. Alle diese Peptide werden als wirksam eingeschätzt, daß sie die Ovulation weiblicher Säugetiere bei niedrigen Dosierungen verhindern.
Peptide der Tabelle III mit der Formel X-^-D-2NAL-(4CI)D-Phe-D-3-PAL-R4-R5-R6-NML-Arg-Pro-R10-NH2
werden nach dem Festphasen-Verfahren, wie es weiter oben beschrieben wurde, hergestellt.
| Tabelle III | X | R4 | R5 | . R6 ' | Rio |
| Nr. | Ac | Cys | Tyr | D-Arg | aBu |
| 32 | Acr | aBu | Arg | D-Tyr | D-aBu |
| 33 | For | Asp | (Et2)Ar9 | D-Tyr | daP |
| 34 | Bz | Asp | (Et2)Arg | (Et)D-Arg | D-daB |
| 35 | Ac | daP | (Et)Arg | D-Lys | D-Asp |
| 36 | Vac | daP | (Me2)Arg | D-Har | GIu |
| 37 | Acr | Orn | Arg | (4gua)D-Phe | GIu |
| 38 | Ac | daß | (Pr)Arg | D-Om | D-Asp |
| 39 | Acr | Cys | (Bu)Arg | D-His - | Cys |
| 40 | Ac | Orn | His | (Bu)D-Arg | Asp |
| 41 | Ac | daP | (Pr2)Arg | (Bz)D-Om | Asp |
| 42 | r Vac | daP | (His) | 4NH2D-Phe | D-GIu |
| 43 | Bz | GIu | (Me) Arg | (Ac)D-Lys | daP |
| 44 | |||||
Peptide wie die Nr. 32 und 33 werden unter Anwendung der allgemeinen Lehre des USP Nr. 4.161.521 synthetisiert. Die Untersuchung der in Tabelle IM aufgeführten Peptide in vitro und/oder in vivo zeigt, daß die in Tabelle III aufgelisteten Peptide als wirksam eingeschätzt werden können, die GnRH-induzierte LH-Sekrektion in vitro bei geeigneten Konzentrationen zu blockieren. Eine Vielzahl dieser Peptide ist in vivo wirksamer als der gegenwärtige Standard. Alle diese Peptide werden als wirksam eingeschätzt, daß sie die Ovulation weiblicher Säugetiere bei niedriger Dosierung verhindern.
Peptide derTabelle IV mit der Formel Ac-Rr(4CI)-D-Phe-D-Trp-R4-Tyr-D-3PAL-R7-ARG-(G)Pro-R10-NH2
werden nach dem Festphasen-Verfahren, wie es weiter oben beschrieben wurde, hergestellt.
| Tabelle IV | /3-D-2NAL | R4 | R7 | :G | Rio |
| Nr. | (1 Ac)D-Trp | Asp | NIe | H | daP |
| 45 | ' (6Br)D-Trp | Asp | Met | OH | daP |
| 46 | (5F)D-Trp | Asp | Tyr | H | D-daB |
| 47 | (6NO2)D-Trp | Asp | NIe | dehydro | d-daB |
| 48 | (5CI)D-Trp | Asp | Met | dehydro | daß |
| 49 | (4CI)D-Phe | Asp | Tyr | H | D-daP |
| 50 | (4F)D-Phe | Asp | Phe | H | Om |
| 51 | (2,4-C2)D-Phe | Asp | 4F-D-Phe | H | Orn |
| 52 | (dehydro-Pro) | GIu | NML | OH | D-Om |
| 53 | /3-D-2NAL | GIu | NIe | OH | daß |
| 54 | GIu | Trp | H | daß | |
| 55 | |||||
Nr. R1 R4 R7
| 56 | (6OCH3)D-Trp | GIu | . Leu | H | daP |
| 57 | (5NH2)D-Trp | GIu | Nva | H | daP |
| 58 | (4NO2)D-Phe | GIu | • NML | H | D-daP |
| 59 | dehydro-Pro | GIu | Tyr | OH | D-daP |
Alle in Tabelle IV aufgelisteten Peptide werden als wirksam eingeschätzt, die durch GnRH induzierte LH-Sekretion in vitro bei geeigneten Konzentrationen zu blockieren. Eine Vielzahl dieser Peptide ist in vivo wirksamer als der gegenwärtige Standard. Alle Peptide werden als wirksam eingeschätzt, die Ovulation weiblicher Säugetiere bei niedriger Dosierung zu verhindern.
Peptide der Tabelle V mit der Formel - .
Ac-R1-(4F)D-Phe-R3-R4-Tyr-R6-Tyr-Arg-Pro-Rlo-NH2
werden nach dem Festphasen-Verfahren, wie es weiter oben beschrieben worden ist, synthetisiert.
| Tabelle V | Ri | R3 | R4 | Re | Rio |
| Nr. | /3-D-2NAL | (6NO2)D-Trp | Cys | (Et2)D-Arg | Cys |
| 60 | /3-D-2NAL | (6NO2)D-Trp | Cys | (DNP)D-His | aBu |
| 61 | /3-D-2NAL | D-Trp | Cys | (4gua)D-Phe | Cys |
| 62 | dehydro-Pro | /3-D-2NAL | Cys | (6NO2)D-Trp | Cys |
| 63 | dehydro-Pro | /3-D-1NAL | Cys | D-VaI | aBu |
| 64 | /3-D-2NAL | (IFor)D-Trp | Cys | (Pr)D-Arg | aBu |
| 65 | 0-D-2NAL | (IFor)D-Trp | aBu | (5NH2)D-Trp | D-Cys |
| 66 | dehydro-Pro | D-Trp | aBu | D-Tyr | aBu |
| 67 | dehydro-Pro | D-2PAL | GIu | D-NIe | D-daB |
| 68 | dehydro-Pro | (1Ac)D-Trp | GIu | (4F)D-Phe | Orn |
| 69 | Pro | D-3PAL | Asp | (8-D-1NAL | daß |
| 70 | (IFore)D-Trp · | D-3PAL | Asp | (4NHCH3)D-Phe | D-daP |
| 71 | j8-D-2NAL | D-3PAL | Cys | (Ac)D-Orn | Cys |
| 72 | /3-D-2NAL | D-3PAL | Cys | (4NH2)D-Phe | D-aBu |
| 73 | ' 0-D-1NAL | (6Br)D-Trp | Cys | (IFor)D-Trp | Cys |
| 74 | (6CH3)D-frp | D-4PAL | Asp | D-4PAL | D-daB |
| 75 | |||||
Die Untersuchung der in Tabelle V aufgeführten Peptide in vitrd und/oder in vivo zeigt, daß die in der Tabelle V aufgelisteten Peptide als wirksam eingeschätzt werden können, die durch GnRH induzierte LH-Sekretion in vitro bei geeigneten Konzentrationen zu blockieren. Eine Vielzahl dieser Peptide ist in vivo wirksamer als der gegenwärtige Standard. Alle Peptide werden als wirksam eingeschätzt, daß sie die Ovulation weiblicher Säugetiere bei niedriger Dosierung verhindern.
Peptide der Tabelle Vl mit der Formel
X-R1-(4F)D-Phe-D-Trp-R4-Tyr-R6-Leu-Arg-Pro-R10-NH2
werden nach dem Festphasenverfahren, wie es weiter oben beschrieben worden ist, hergestellt.
| Tabelle Vl | X | Ri | R4 | R6 | Rio |
| Nr. | Acr | dehydro-Pro | daP | al | Asp |
| 76 | Ac | dehydro-Pro | Asp | 0-D-2NAL | daP |
| 77 | Ac | /3-D-2NAL | Asp | D-Arg | daP |
| 78 | Acr | Pro. | GIu | D-Ser(Ot-Bu) | D-Orn |
| 79 | H | dehydro-Pro | daP | (imBzl)D-His | Asp |
| 80 | Bz | (4Br)D-Phe | daP | (5CI)D-Trp | D-GIu |
| 81 | Bz | D-p-Glu | daP | (6Br)D-Trp | D-GIu |
| 82 | For | /3-D-1NAL | daP | (Me)D-Arg | D-As ρ |
| 83 | For | dehydro-Pro | Cys | D-Har | aBu |
| 84 | Vac | i3-D-2NAL | Cys | (Bz)D-Lys | D-Cys |
| 85 | Vac | D-Phe | daß | D-IIe | Asp |
| 86 | H | dehydro-Pro | daß | D-AIa | GIu |
| 87 | |||||
Die Untersuchung der in Tabelle Vl aufgeführten Peptide in vitro und/oder in vivo zeigt, daß die in der Tabelle Vl aufgeführten Peptide als wirksam eingeschätzt werden können, die durch GnRH induzierte LH-Sekretion in vitro bei geeigneten Konzentrationen zu blockieren. Eine Vielzahl dieser Peptide ist in vivo wirksamer als der gegenwärtige Standard. Alle Peptide werden als wirksam eingeschätzt, daß sie die Ovulation weiblicher Säugetiere bei niedriger Konzentration verhindern.
Peptide der Tabelle VII mit der Formel Ac-Rr(4CI)D-Phe-R3-R4-Tyr-R6-Leu-Arg-Pro-R10-NH2
werden nach dem Festphasen-Verfahren, wie es weiter oben beschrieben worden ist, hergestellt.
| Tabelle VII | Ri | R3 | R4 | R6 | Rio |
| Nr. | dehydro-Pro | (6NO2)D-Trp | Orn | /3-D-2NAL | D-GIu |
| 88 | dehydro-Pro | (6NO2)D-Trp | Orn | D-VaI | Asp |
| 89 | dehydro-Pro | (6F)d-Trp | daP | . (4gua)D-Phe | Asp |
| 90 | dehydro-Pro | (6F)D-Trp | daP | (Bz)D-Om | GIu |
| 91 | dehydro-Pro | (50CH3)D-Trp | daP | (For)D-Lys | GIu |
| 92 | dehydro-Pro | (50CH3)D-Trp | daP | D-2PAL | GIu |
| 93 | /3-D-2NAL | (1Ac)D-Trp | GIu | D-H ar | D-daP |
| 94 | 0-D-2NAL | (IFor)D-Trp | GIu | (5CH3)D-Trp | daß |
| 95 | dehydro-Pro | (6Br)D-Trp | aBu | D-NIe | D-Cys |
| 96 | dehydro-Pro | (6Br)D-Trp | aBu | D-Leu | D-aBu |
| 97 | dehydro-Pro | (6CH3)D-Trp | aBu | j3-D-2NAL | Cys |
| 98 | dehydro-Pro | (6NH2)D-Trp - | Om | (4NH2)D-Phe | GIu |
| 99 | dehydro-Pro | (5NH2)D-Trp | Orn | (Acr)D-Lys | D-Asp |
| 100 | |||||
Die Untersuchung der in der Tabelle VII aufgeführten Peptide in vitro und/oder in vivo zeigt, daß die in der Tabelle VII aufgelisteten Peptide als wirksam eingeschätzt werden können, die durch GnRH induzierte LH-Sekretipn in vitro bei geeigneten Konzentrationen zu blockieren. Eine Vielzahl dieser Peptide ist in vivo wirksamer als der gegenwärtige Standard. Alle Peptide werden als wirksam eingeschätzt, daß sie die Ovulation weiblicher Säugetiere bei niedrigen Konzentrationen verhindern.
Die Peptide in der Tabelle VIII mit der Formel Ac-R1-(4F)D-Phe-D-3PAL-R4-Arg-R6-R7-Arg-Pro-R1o-NH2.
werden nach dem Festphasen-Verfahren, wie es weiter oben beschrieben worden ist, hergestellt.
| Tabelle VIII | Ri | R4 |
| Nr. | /3-D-2NAL | .Cys |
| 101 | /3-D-2NAL | Cys |
| 102 | /3-D-2NAL | aBu |
| 103 | /3-D-2NAL | aBu |
| 104 | dehydro-Pro | aBu |
| 105 | dehydro-Pro | daP |
| 106 | /3-D-2NAL | daß |
| 107 | /3-D-2NAL | daP |
| 108 | (3-D-2NAL | Om |
| 109 | /3-D-2NAL | Asp |
| 110 | /3-D-2NAL | GIu |
| 111 | /3-D-2NAL | GIu |
| 112 | /3-D-2NAL | GIu |
| 113 | (C3Me) | GIu |
| 114 | 4CI)D-Phe | |
| Pro' | Asp | |
| 115 | dehydroPro | Asp |
| 116 | dehydroPro | Asp |
| 117 | dehydroPro | Asp |
| 118 | dehydroPro | Asp |
| 119 | dehydroPro | Cys |
| 120 | dehydroPro | Cys |
| 121 | Pro | daP |
| 122 | ;3-d-2NAL | daP |
| 123 | 0-D-2NAL | daB |
| 124 | (4CI)D-Phe | daB |
| 125 | ||
| (5NO2)D-Trp | Leu |
| D-3PAL | Leu |
| 0-D-2NAL | Leu |
| (Me2)D-Arg | Leu |
| /3-D-2NAL | 3PAL |
| (4NO2)D-Phe | Tyr |
| D-3PAL | NML |
| /3-D-1NAL | 4PAL |
| (imBzl)D-His | Leu |
| (6NO2)D-Trp | Leu |
| D-Tyr | Leu |
| (IFor)D-Trp | Phe |
| (6F)D-Trp | NML |
| (4CI)D-Phe | NIe |
| (imBzl)D-His | Met |
| (6OCH3)D-Trp | Nva |
| (5-CH3)D-Trp | Nva |
| (1Ac)D-Trp | (4F)Phe |
| (Acr)D-Orn | NML |
| (Et2)D-Ar9 | NIe |
| /3-D-2NAL | Trp |
| (2,4CI2)D-Phe | Nva |
| /3-D-1NAL | Tyr |
| (5CI)d-Trp | Met |
| (4Br)D-Phe | 3PAL |
Cys Cys D-Cys D-aBu Cys GIu GIu D-GIu D-GIu daP daP D-daP D-daP D-Om
D-Om daB D-daP D-daP daP aBu D-Cys Asp Asp Asp Asp(Acetat)
Die in der Tabelle VIII beschriebenen Peptide werden in vivo untersucht, um ihre Wirksamkeit bei der Unterdrückung der Ovulation bei weiblichen Ratten zu bestimmen. Alle Verbindungen werden als wirksam eingeschätzt, die Ovulation bei weiblichen Ratten bei niedriger Dosierung zu verhindern. Eine vollständige Wirksamkeit wird bei einer Dosierung von etwa 500 Mikrogramm erreicht.
Die erfindungsgemäßen Peptide werden oftmals in Form pharmazeutisch geeigneter, nichttoxischer Salze verabreicht, z. B. in Form der Salze mit Säuren, oder als Metallkomplexe, ζ. B. mit Zink, Barium, Kalzium, Magnesium, Aluminium oder dergleichen (die im Sinne dieser Anmeldung als Additionsverbindungen betrachtet werden), oder in Form der Kombination beider Varianten. Beispielhaft für solche Salze seien genannt: Hydrochloride, Hydrobromide, Sulfate, Phosphate, Nitrate, Oxalate, Fumarate, Glukonate, Tannate, Maleate, Acetate, Citrate, Benzoate, Succinate, Tartrate und ähnliche. Zum Beispiel kann eine wäßrige Lösung des Peptids mehrmals mit 1 N Essigsäure behandelt und danach lyophilisiert werden, so daß das essigsaure Salz davon erhalten wird. Wenn der aktive Bestandteil in Form von Tabletten verabreicht werden soll, kann die Tablette ein pharmazeutisch geeignetes Verdünnungsmittel enthalten, das nun wiederum ein Bindemittel, z. B-. Tragacanth, Maisstärke oder Gelatine, ein Verteilungshilfsmittel, z. B. Alginsäure, und ein Gleitmittel, z. B. Magnesiumstearat, enthält. Wenn die Verabreichung in flüssiger Form gewünscht wird, kann ein Zusatz von Süßungsmittel und/oder Geschmacksstoffen als Teil des pharmazeutisch geeigneten Verdünnungsmittels erfolgen. Eine intravenöse Verabreichung kann in isotonischer Kochsalzlösung, in Phosphatpufferlösungen oder ähnlichen ausgeführt werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen werden üblicherweise das Peptid zusammen mit einem üblichen, pharmazeutischen geeigneten Trägermittel enthalten. Die Dosierung beträgt üblicherweise von ungefähr 10 Mikrogramm bis zu ungefähr 2,5 Milligramm des Peptids je Kilogramm Körpergewicht des zu behandelnden Subjekts, wenn das Mittel intravenös gegeben wird. Obwohl die Dosierungen bei oraler Verabreichung höher sein werden, wird erwartet, daß die zyklische Art dieser Verbindungen eine wirksamere orale Verabreichung erlauben wird. Ganz allgemein wird die Behandlung von Subjekten mit diesen Peptiden in dergleichen Art und Weise durchgeführt werden wie die klinische Behandlung bei Verwendung anderer Antagonisten des GnRH, wobei ein geeignetes Trägermittel verwendetwird, in dem das Peptid löslich ist. Diese Peptide können den Säugetieren intravenös, subcutan, intramuskulär, oral, percutan,z.B. intranasal, oder intravaginal verabreicht werden, um eine Hemmung der Fruchtbarkeit und/oder deren Kontrolle zu erreichen sowie in Anwendungen, bei denen eine reversible Unterdrückung der gonadischen Aktivität, z. B. bei der Behandlung derfrühzeitigen Pubertät oder während einer Bestrahlungs- oder Chemotherapie, notwendig wird. Sie sind zur Behandlung von Steroid-abhängigen Tumoren ebenfalls geeignet. Wirksame Dosierungen sind von der Form der Verabreichung abhängig sowie von der zu behandelnden Art von Säugetier. Ein Beispiel für eine typische Dosierungsform ist eine bakteriostatische, wäßrige Lösung, die das Peptid enthält. Diese Lösung wird auf eine solche Art und Weise verabreicht, daß eine Dosierung im Bereich von ungefähr 0,1 bis 2,5mg/kg Körpergewicht eingestellt wird. Oral kann das Peptid'entweder in fester oder flüssiger Form gegeben werden. Obwohl die Erfindung hinsichtlich ihrer bevorzugten Ausführungsformen beschrieben worden ist, sollte es klar sein, daß Abweichungen und Modifizierungen, die für einen Fachmann auf diesem Gebiet naheliegend sind, möglich sind, ohne daß man sich vom Umfang der Erfindung entfernt, der in den nachfolgenden Erfindungsansprüchen dargelegt wird. Es können z. B. andere, nach dem Stand der Technik bekannte Substitutionen, die die Wirksamkeit der Peptide nicht signifikant beeinflussen, bei den erfindungsgemäßen Peptiden verwendet werden. D-2PAL und D-4PAL werden als dem D-3PAL äquivalent betrachtet. Substituiertes Phe, z. B. (4F)Phe, kann an Stelle des Phe in der Position 7 verwendet werden. In der Position 1 können auch andere hydrophobe Aminosäurereste verwendet werden, vorzugsweise in der Form des D-Isomeren. Diese werden als den beschriebenen gleichwertig eingeschätzt. Darüber hinaus können die Aminseitenketten von D-Lys oder D-Om in der Position 6 durch ein Dipeptid oder ein Tripeptid an Stelle der Substitution durch eine Acylgruppe subsituiert sein. Eine solche Substitution wird als gleichwertig betrachtet
Besondere Gesichtspunkte der Erfindung werden in den folgenden Erfindungsansprüchen ausgeführt.
Claims (9)
- Erfindungsanspruch: .' .1. Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder eines nicht toxischen1 Salzes davon mit der FormelX-E1-C A)D-Plie-R3-RzrSs-E6-E7-I?8-(G)Pro~21 Q-HH2,worin X Wasserstoff odereine Acylgruppe mit biszu 7 Kohlenstoffatomen; R1 Dehydro-Pro, D-pGlu, (A)D-Phe, (B)D-Trp, Pro oder 0-D-NAL; A H, Cl, F, NO2, CH3, OCH3, CaMe/4CI, Cl2 oder Br; B H, NO2, NH2, OCH3, F, Cl, Br, CH3, N in For oder N in Ac; R3 D-PAL, jS-D-NAL oder (B)D-Trp; R4Cys, Asp, GIu, Om, daß, daPoderaBu; R5Tyr,(C)Arg,(A)Phe,(3l)Tyr, oder His; R6/8-D-NAL, (B)D-Trp, (A')D-Phe, (D)D-Lys, (D)D-Orn, D-Har, D-Tyr, (E)D-His, D-PAL oder (C)D-Arg; A'A, NH2, NHCH3, oder gua; C (niedere - Alkylgruppeln mit η gleich 0,1 oder2; DX odereine Arylgruppe; E Wasserstoff, imBzl oder Dinitrophenyl; R7 Nie, Leu, NML, Phe, Met, Nva, Tyr, Trp oder PAL; R8 Arg, Ser, Tyr, Thr oder PAL; G H, OH oder Dehydro und R10 cys, asp, glu, orn, dab, dap oder abu bedeuten, gekennzeichnet dadurch, daß (a) eine Zwischenstufe mit der Formel X^Rr(A)D-PhB-R3(X2I-Ri(X3I-R5(X4 oder X5I-R6(X4 oder Xs oder X6)-R7(X2 oder X7J-R8(X4 oder X5 oder X8)-(G)Pro-R10(X3-X9hergestellt wird, worin X1 Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für eine a-Aminogruppe; X2 Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für einen Indol-Stickstoff; X3 eine direkte Bindung, Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für Cys oder für eine Seitenkettenamino- oder carbonsäuregruppe; X4 Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für eine phenolische Hydrolgruppe von Tyr; Xs entweder Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für eine Guandio-oder Imidazol-Seitenkette; X6 eine Schutzgruppe für eine Aminseitenkette; X7 eine Schutzgruppe für Met; X8 eine Schutzgruppe für eine alkoholische Hydroxylgruppe des Ser oder Tyr; und X9 eine O-CH2-(polymerer Träger), -NH-(polymerer Träger), Ester- oder Amidgruppierung bedeuten;(b) eine oder mehrere der Gruppen X1 bis X8 abgespalten und/oder von einem polymeren Träger, der in X9 enthalten ist, abgespalten wird;(c) gegebenenfalls ein Ringschluß zwischen R4 und R10 durchgeführt wird, wenn er nicht bereits vorhanden ist; und(d) wenn erwünscht ein so erhaltenes Peptid in ein nicht toxisches Salz davon überführt wird.
- 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß A 4Cl oder 4F bedeutet.
- 3. Verfahren nach Punkt 1 oder Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß R4 daP, daß oder Om und R10 Asp oder GIu bedeutet.
- 4. Verfahren nach Punkt 1 oder Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß R4 Asp oder GIu und R10 daP, daß oder Orn bedeutet.
- 5. Verfahren nach Punkt 1 oder Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß R4 und R10 Cys, D-Cys, aBu oder D-aBu sind.
- 6. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß R4 Asp und R10 daP bedeutet.
- 7. Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß R1 0-D-2NAL oder Dehydro-Pro und R6 D-Arg oder 0-D-2NAL bedeuten.
- 8. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 7, gekennzeichnet dadurch, daß R3 D-Trp; R5 Tyr, R7Leu, R8 Arg und R9 Pro bedeuten.
- 9. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Peptid die Formel
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