CH616749A5

CH616749A5 -

Info

Publication number: CH616749A5
Application number: CH686175A
Authority: CH
Inventors: Shigeru Kurooka; Masahisa Hashimoto; Masatsugu Tomita; Akio Maki
Original assignee: Dainippon Pharmaceutical Co
Priority date: 1974-05-28
Filing date: 1975-05-28
Publication date: 1980-04-15
Also published as: FR2273283B1; CA1041409A; FR2273283A1; GB1486523A; AU8153775A; DE2523697C2; US3986930A; DE2523697A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Reagentiensatz zur diagnostischen Bestimmung der Lipaseaktivität in einem Lipase enthaltenden Material.

Der Reagentiensatz ist dadurch gekennzeichnet, dass er eine der S-Acylverbindungen der folgenden Formeln:

CHo-S-C0-C H0 1 2 n 2n+l

(I)

CH-X-CO-C H0 ^ j n 2n+l

CH„-0-C0-C ,H„ fl_ 2 n' 2n'+l

(CH2)2-S-00-CmH2m+1

Ï

(CH2)2-S-CO.-CmH2m+1 (II)

■S-C°-C,nH2mW

<CH2)y

~C0-0-Cm,H2m,+1 (III)

55

CHp-S-CO-C H„ ^ I ^ n 2n+l

CH5-0-C0-C ,H„ Iin

2 n' 2n'+l

(IV)

60

CHo-S-C0-C„H„ (n)

1 2 J 7

CH-0-C0-G^H„ (n)

1 5 7

CHo-0-C0-C„Hr, (n) 2 3 I

65

worin n die Zahlen 2 bis einschliesslich 4, n' die Zahlen 2 bis einschliesslich 4 oder 9 bis einschliesslich 13, m die Zahl 3,7 oder 11, m' entweder die Zahl 4 oder die Zahl 12, y entweder die Zahl 1 oder die Zahl 2, X das Schwefelatom oder das Sauerstoffatom und Y das Schwefelatom, das Sauerstoffatom oder die Äthylengruppe bedeuten mit der Bedingung, dass sie in jenen Fällen, in welchen y die Zahl 1 darstellt, das Symbol m' die Zahl 4 bedeutet, und in jenen Fällen, in denen das Symbol y die Zahl 2 darstellt, das Symbol m' die Zahl 12 bedeutet, b) ein Puffer, c) ein chromogenes Sulfhydrylreagens und d) einen Carboxylesterase- und/oder Arylesteraseinhibitor enthält.

3

616749

Mit diesen Wirksubstanzen kann man beispielsweise in weitem Ausmasse die Lipasewirkung in den Körperflüssigkeiten und in Extrakten verschiedener menschlicher oder tierischer Gewebe oder in Extrakten von Bakterien bestimmen. Insbesondere kann man die Lipaseaktivität im menschlichen Serum bestimmen. Bekanntlich ist die Serumlipaseaktivität bei Patienten, welche eine Erkrankung des Pankreas aufweisen, erhöht. Die im erfindungsgemässen Reagentiensatz verwendeten Wirksubstanzen eignen sich als klinische diagnostische Mittel. Dabei entwickelt sich die Farbintensität bei zunehmendem Serumlipasespiegel, so dass das aufgrund dieser neuen Methode erhaltene Material sich für eine rasche Diagnose akuter Pankreatitis im Stadium deren Auftreten eignet.

Bisher sind verschiedene Methoden für die Bestimmung der Lipaseaktivität und zwar die folgenden bekannt geworden:

1. Eine turbidimetrische Methode, dank welcher man Lipase mit Olivenöl zur Umsetzung bringt und hierauf in optischer Weise die Abnahme der Trübung misst (cf. P. A. Verduin et al., Clin. Chim., Acta., Bd.46,S. 11-19,1973).

2. Eine alkalimetrische Methode, welche darin besteht, dass man Lipase mit Olivenöl umsetzt und hierauf die in Freiheit gesetzte Fettsäure einer Alkalimetrie unterwirft (cf. J. H. Roe et al., Analytical Biochem., Bd. 6, S. 451-460,1963).

3. Eine kolorimetrische Methode, welche darin besteht, dass man Lipase mit Olivenöl umsetzt und hierauf die so erhaltene freie Fettsäure oder das Glycerin, beispielsweise durch Zugabe eines Kupfersalzes zur freien Fettsäure und durch Extrahieren des erhaltenen Materials mit n-Hexan, durch Zugabe von Natri-umdiäthylthiocarbamat zum Extrakt und hierauf durch kolorimetrische Messung bestimmt (cf. R. Fried et al., Z. Klin. Chem. Biochem., Bd. 11, S. 189-192,1973).

4. Eine kolorimetrische Methode, welche darin besteht, dass man Lipase mit einem synthetischen Substrat umsetzt und hierauf das so erhaltene hydrolysierte Produkt einer kolorime-trischen Kontrolle unterwirft, indem man Lipase mit a-Naph-thylpalmitat umsetzt und hierauf das in Freiheit gesetzte 5 a-Naphthol mit einem Diazoniumsalz kuppelt und hierauf das so erhaltene, gefärbte Material kolorimetrisch misst (cf. J. F. Whitaker et al., Clinica Chimica Acta, Bd. 44, S. 133-138,1973).

Bei allen diesen bekannten Methoden ist aber die Sensibilität nicht genügend hoch, wobei hinzukommt, dass man bei die-10 sen Methoden eine verhältnismässig grosse Menge an Testsubstanz benötigt. Überdies haben diese bekannten Methoden noch andere Nachteile, indem sie beispielsweise schwer durchzuführen sind oder die Stabilität des Substrates schlecht ist usw.

Die Stelle der Wirkung der Lipase befindet sich an der 15 Fläche zwischen der Ölphase und der wässrigen Phase. Verwendet man Olivenöl als Substrat, so ist es überdies erforderlich, die Reaktionsgeschwindigkeit der Lipase dadurch zu steigern, dass man die Substratkonzentration an der Fläche zwischen der wässrigen und der öligen Schicht erhöht. Zu diesem 20 Zwecke wird das Olivenöl in Form einer Emulsion durch Zugabe eines Emulgators, z. B. Gummiarabikum oder Salze der Gallensäure, hinzugegeben oder durch heftiges Rühren gebracht. Die so erhaltene Olivenölemulsion ist aber nicht beständig und kann selbst bei Temperaturen von ungefähr 0 °C 25 nicht länger als einige Wochen benützt werden.

Man kann dank der vorliegenden Erfindung die Lipaseaktivität leicht dadurch bestimmen, dass man als Substrat eine der S-Acylverbindungen der Formeln (I), (II), (III) und (IV) verwendet.

30

Geeignete Beispiele von S-Acylverbindungen der Formeln (I). (II), (III) oder (IV) finden sich in der folgenden Tabelle 1.

• Tabelle 1

X

Y'

n n'

m m'

y

Bemerk.

CHo-S-C0-C 1I0 ^ 1 2 n 2n+l

CH-X-CO-C H0 ^ 1 n 2n+l

CHo-0-C0-C ,H0

2 n 2n +1

S

3

*1

0

3

*2

S

3

11

(CIIo)o-S-C0-C ^ v | 2'2 m 2m+l

Y

(CH2)2-S-C0-CmH2m+1

-(ch2)2-

3

s

3.

___ -S-CO-C H0

(CHJ m 2m+1

^^co-o-c ,Hq , _

m' 2m'+1

3

12

2

11

12

2

ch„-s-c0-c h„ . 2 n 2n+l cho-0-c0-c ,h„ . , 2 n' 2n'+l

3

11

*3

3

2

11

*! die Verbindung wird nachstehend als «BALB» bezeichnet; *3 die Verbindung wird nachstehend als «BLME» bezeichnet. *2 die Verbindung wird nachstehend als «MPB» bezeichnet;

616749

Unter diesen Verbindungen eignen sich insbesondere die mit BALB und MPB bezeichneten Verbindungen.

Die Bestimmung der Lipaseaktivität kann, wie nachstehend beschrieben, geschehen. Eine Lösung eines solchen Substrats (eine S-Acylverbindung der Formeln (I). (II), (III) und (IV)] in einem Alkohol wird zur Reaktionspufferlösung gegeben, welche die Probe mit Lipase und ein chromogenes Sulfhydrylreagens enthält, welches mit einer eine SH-Gruppe enthaltenden und aus dem Substrat durch Lipase in Freiheit gesetzten Verbindung (nachstehend als «SH-Verbindung» bezeichnet) reagiert. Die Menge an in Freiheit gesetzter SH-Verbindung cho-s-c0-c kl ... | 2 n 2n+l

0h-0-00-0nh2n+1

ch2-0-c0-cn,h2n,+1

(S-acyl-Verbindung)

bzw. die Intensität des gefärbten Reaktionsgemisches ist proportional zur Lipaseaktivität in der Probe, so dass die Lipaseaktivität dadurch bestimmt werden kann, dass man das erhaltene gefärbte Reaktionsgemisch kolorimetrisch untersucht. Als Sulf-5 hydrylreagens verwendet man 5,5'-Dithiobis-{2-nitrobenzoe-säure), nachstehend als «DTNB» bezeichnet. Beim Messen der Lipaseaktivität unter Verwendung einer S-Acylverbindung der Formel I, worin X das Sauerstoffatom darstellt, und DTNB kann angenommen werden, dass die Reaktion nach dem folgen-10 den Schema verläuft.

Lipase ch2-sh ch-oh chp-oh

(SH-Verbindung)

co oh cVs-sf W

ch-oh ch2-oîi s

+

c00h (dtnb) cook

(gelbes Anion)

Eine Methode für die Bestimmung der Lipaseaktivität unter Verwendung eines synthetischen Substrats einer der Formeln I, II, III oder IV auf Basis des obigen Prinzips ist bisher nicht bekannt gewesen.

Mit dem Reagentiensatz gemäss vorliegender Erfindung lässt sich das Messen der Lipaseaktivität leicht so durchführen, dass man Probemengen von nur Vio bis Vioo jener Mengen, die bei den bekannten Methoden zur Anwendung gelangen mus-sten, verwendet. Überdies wird das Substrat durch blosses Vermischen und Schütteln mit einer Pufferlösung ohne Zugabe eines Emulgators oder ohne kräftiges Rühren mizellenartig, wobei hinzukommt, dass die Lösung des Substrates in einem Alkohol bei Zimmertemperatur während mehr als 6 Monaten beständig ist.

Man weiss auch, dass ein bestimmtes synthetisches Glyce-rid, wie Tributyrin, d. h. Glyceryltributyrat, welches eine ähnliche Struktur wie die oben erwähnten S-Acylverbindungen aufweist, für die Bestimmung der Lipaseaktivität verwendet wird. Diese Methode verfährt aber nach einem anderen Prinzip, wobei das Reagens eine schlechte Empfindlichkeit aufweist und keine Substratspezifität aufweist. Diese Methode ist daher in der Praxis nicht geeignet.

Es wird also die Lipaseaktivität dadurch bestimmt, dass man das Substrat mit Lipase hydrolysiert und hierauf die Menge der in Freiheit gesetzten SH-Verbindung misst. Enthält die zu testende Lipase enthaltende Probe andere Enzyme, « welche das Substrat hydrolysieren, so lässt sich die Lipaseaktivität nicht bestimmen. Im allgemeinen lassen sich die Enzyme, welche einen Carbonsäureester zu hydrolysieren vermögen, wie folgt klassieren:

1. Carboxylesterase (Enzyme Commission No. [3.1.1.1]) so 2. Arylesterase (Enzyme Commission No. [3.1.1.2])

3. Lipase (Enzyme Commission No. [3.1.1.3]).

Enthält somit die zu testende Probe diese Carboxylesterase und/oder Arylesterase neben Lipase, so wird das Substrat ebenfalls durch diese anderen Enzyme unter Bildung einer SH-Ver-55 bindung hydrolysiert. Besteht der Fall, dass die Testprobe diese Carboxylesterase und/oder Arylesterase neben Lipase enthält, so ist erforderlich, der Testprobe einen Enzyminhibitor zuzusetzen, welcher sowohl Carboxylesterase als auch Arylesterase in spezifischer Weise zu inaktivieren vermag. Geeignete Bei-6o spiele solcher Enzyminhibitoren sind Phenylmethylsulfonylfuo-rid der Formel C6H5CH2SO2F; nachstehend als «PMSF» bezeichnet und Diisopropylfluorphosphat der Formel

0

65 (ch3)2cho-P-och(ch3)2,

F

5

616 749

wobei «PMSF» der bevorzugte Enzyminhibitor ist.

Enthält andererseits die Testprobe keine solche Carboxylesterase und/oder Arylesterase, wie dies bei einem Standardlipa-seprodukt der Fall ist, so ist es unnötig, einen solchen Enzyminhibitor zuzugeben.

Die Lipaseaktivität kann im allgemeinen nach den folgenden Angaben bestimmt werden.

Eine Pufferlösung wird mit einer Lösung eines chromoge-nen Sulfhydrylreagens, z. B. DTNB, und einer Lipase enthaltenden Lösung (Testprobe) und gegebenenfalls mit einer Lösung eines Enzyminhibitors, z. B. PMSF, in einem Alkohol, versetzt, wodurch die gleichzeitig vorhandene Carboxylesterase und/ oder Arylesterase in spezifischer Weise inaktiviert werden. Dieses Reaktionsgemisch wird hierauf mit einer Lösung eines Substrats, nämlich einer S-Acylverbindung einer der Formeln I, II, III oder IV, versetzt. Das Gemisch wird während einer geeigneten Zeit inkubiert und hierauf die Reaktion durch Zugabe von Aceton unterbrochen, wodurch das trübe Substrat klar wird. Das erhaltene Gemisch, welches das erzeugte gelbe Amion enthält, wird kolorimetrisch untersucht, d. h. man misst die optische Dichte des Gemisches bei 400 bis 420 mjj. und vorzugsweise bei 412 mjj,.

Diese Bestimmungsmethode lässt sich in der Regel unter den folgenden Bedingungen durchführen.

1. Puffer: man kann einen beliebigen Puffer verwenden, wie er bei einer üblichen enzymatischen Reaktion verwendet werden kann. Am geeignetsten ist Tris-HCl-Puffer.

2. pH-Wert: 7,5 bis 10, vorzugsweise 8,5 bis 9,0.

3. Inkubationstemperatur: 30 bis 40 °C.

4. Inkubationsdauer: nicht mehr als 120 Minuten.

5. Konzentration des Substrates: 1,3 bis 2,6 mM (die apparente Michaeliskonstante von BALB und MPB für Lipase: ungefähr 4x 10~4M).

6. Konzentration des Enzyminhibitors, z. B. PMSF: im allgemeinen 0,03 bis 3 mM, vorzugsweise 0,1 bis 1,5 mM und insbesondere 0,2 bis 0,8 mM.

Jedes für die Bestimmung der Lipaseaktivität verwendete Reagens wird in einer solchen Form gehalten, welche sich für die übrigen Reagentien eignet. So liegen die meisten Substrate der Formeln I, II, III und IV bei Zimmertemperatur in flüssiger Form vor und können in Form einer Lösung in einem Alkohol, z. B. Äthanol, gehalten werden.

Wird eine wässrige Lösung des chromogenen Sulfhydrylreagens, z. B. DTNB, während längerer Zeit stehen gelassen, so wird sie gelb, weswegen man das Reagens vorzugsweise in Form eines Pulvers aufbewahrt und die wässrige Lösung davon im Zeitpunkte der Verwendung herstellt. Das pulvrige DTNB kann mit einem inerten anderen Pulver, z. B. Mannitol, vermischt werden, um das Abwägen zu erleichtern.

Das Puffermaterial kann in Form einer Lösung aufbewahrt werden. Wegen der bakteriellen Verunreinigung und aus Zweckmässigkeitsgründen wird man das Reagens vorzugsweise in Pulverform aufbewahren und es im Zeitpunkte der Verwendung in Wasser auflösen.

Der Enzyminhibitor, z. B. PMSF, wird vorzugsweise in Form einer alkoholischen Lösung, z. B. einer äthanolischen Lösung, aufbewahrt. PMSF in einer alkoholischen Lösung ist selbst dann noch beständig, wenn diese Lösung während 30 Minuten auf 120 °C erhitzt wird. Wird die Lösung andererseits mit einem Substrat der Formel I, II, III oder IV in einem Alkohol vermischt, so findet zwischen dem PMSF und dem Substrat eine chemische Reaktion statt, wodurch die Wirkung als Esteraseinhibitor verloren geht. Daher muss man diese beiden Lösungen getrennt aufbewahren.

Diese Reagentien werden vorzugsweise während mehreren Monaten bei Zimmertemperatur in geeigneten Verpak-kungsgrössen, die zum Bestimmen von 50 bis 100 Proben geeignet sind, als Lipasetestmaterialien aufbewahrt.

Unter den in Frage kommenden S-Acylverbindungen sind jene Verbindungen der Formel I, worin X das Schwefelatom bedeutet, als Antituberkulosemittel (j. Chem. Soc., 2660,1960) 5 bekannt, doch war es bisher nicht bekannt, dass solche Verbindungen für die Bestimmung von Lipaseaktivitäten verwendet werden könnten. Die Verbindungen der Formel I, worin X das Sauerstoffatom, bedeutet und die Verbindungen der Formel II, III oder IV sind neue Verbindungen und können durch Acylie-10 rung der entsprechenden Thioalkohole mit einem Säurederivat, z. B. einer Säure, einem Säurehalogenid oder einem Säureanhydrid, in ähnlicher Weise, wie dies in J. Chem. Soc., 2660, 1960 beschrieben worden ist, erhalten werden.

Die Herstellung der in der vorliegenden Beschreibung 15 erwähnten Reagentien, die Methode für die Bestimmung der Lipaseaktivität mit solchen Verbindungen und die Herstellung der hier in Frage kommenden S-Acylverbindungen werden durch die folgenden Beispiele erläutert.

20 Beispiel 1 Herstellung des Reagens a) 20 mM BALB/Äthanollösung: BALB (669 mg) wird in Äthanol gelöst, um zu einem Endvolumen von 100,0 ml zu gelangen.

25 a') 20 mM MPB/Äthanollösung: MPB (636 mg) wird in Äthanol gelöst, um ein Endvolumen von 100,0 ml zu erhalten.

a") 20 mM BLME/Äthanollösung: BLME (660 mg) wird in ungefähr 50 ml Äthanol gelöst und die Lösung mit weiterem Äthanol versetzt, bis ein Endvolumen von 100,0 ml entstanden

30 'st-

b) 20 mM PMSF/Äthanollösung: PMSF (348 mg) wird in Äthanol gelöst, um ein Endvolumen von 100,0 ml zu erhalten.

c) 0,3 mM DTN B/0,1 Mol Tris-HCl (pH 8,5): DTNB (12,0 mg) wird vollständig in 1 Mol Tris-HCl-Puffer (10,0 ml) gelöst

35 und dann mit Wasser bis auf ein Volumen von 100,0 ml versetzt.

d) Aceton (analytisch rein).

Beispiel 2

Bestimmung der Lipaseaktivität (Substrat: BALB)

40 Reagens a) 20 mM BALB/Äthanollösung b) 20 mM PMSF/Äthanollösung c) 0,3 mM DTNB/0,1 Mol Tris-HCl (pH 8,5)

d) Aceton

45

Methode

Die Testrohre I und II werden mit (c) ( 1 ml) und mit einer Testprobe (10-1500 BALB-Einheit Lipase oder ungefähr 10 |il menschlichem Serum) versetzt und das Testrohr I wird mit (b) so (20 fil; die Konzentration von PMSF = 0,4 mM) versetzt und das Gemisch während 5 Minuten bei Zimmertemperatur stehen gelassen, um die bestehende Serumcarboxylesterase und/ oder Arylesterase zu inaktivieren.

Dem Testrohr I wird ferner 0,1 ml eines Substrates (a) hin-55 zugegeben. Die Testrohre I und II werden während 30 Minuten bei 38 °C stehen gelassen und hierauf wird das Testrohr II unverzüglich mit 0,1 ml des Substrates (a) versetzt, worauf diese Testrohre I und II mit 2 ml Aceton (d) versehen werden, um die Reaktion zu stoppen. Nach gründlichem Mischen wer-60 den die Rohre I und II (700xg während 10 Minuten) zentrifu-giert, um unlösliche Serumproteine zu entfernen und die durch die Serumlipide und das Substrat bedingte Trübung zu beseitigen. Die optische Dichte der im Rohr I oberen flüssigen Schicht wird bei 412 nm in einer Kuvette von 1 cm Lichtdurch-65 lass (OD4121 cm) im Vergleich mit dem Rohr II gemessen. Der Wert [ODWcm (I-II)xlOOO] zeigt BALB Einheit der Lipase.

Ausserdem wird das Testrohr III in der gleichen Weise wie das Testrohr I behandelt mit dem Unterschied aber, dass man

616 749

den Enzyminhibitor (b) weglässt. Der Wert [OD4121 cm (III— I)xl000] zeigt die Gesamtaktivität der Arylesterase und Carboxylesterase.

Beispiel 3

Bestimmung der Lipaseaktivität (Substrat: MPB)

Reagens a') 20 mM MPB/Äthanollösung b) 20 mM PMSF/Äthanollösung c) 0,3 mM DTNB/0,1 Mol Tris-HCl (pH 8,5)

d) Aceton

10

Methode

Die Bestimmung der Lipaseaktivität erfolgt in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 mit dem Unterschied, dass anstelle des Substrates (a) das Substrat (a') zur Anwendung gelangt.

Beispiel 4

Die Lipaseaktivität und die Gesamtaktivität der Carboxylesterase und Arylesterase in einer Serumprobe, welche man aus normalen Patienten mit Pankreatitis- und Hepatitiserkrankungen erhalten hat, werden in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 (Serum: 10 (xl, Substrat: BALB) gemessen. Die Resultate finden sich in der folgenden Tabelle 2.

Tabelle 2

Lipase

Carboxylesterase

Serum

Erkrankung

OD^°m(I-Il)x IO3 412

+ Arylesterase OdJJ^III- I) x 103

A

normal

18

68

B

tl

17

61

C

H

20

60

D

It

11

60

E

M

19

18

F

M

18

62

G

20

50

H

akute

Pankreatitis

379

120

I

Tumor des

290

45

Pankreasköpfes

J

ti

186

63

K

11

125

40

L

akute

Pankreatitis

85

87

M

127

61

N

187

136

0

akute Hepatitis

30

Ì

469

P

Hepatitis

17

198

Q

I!

.0

72

R

U

6

106

Wie aus den obigen Resultaten einwandfrei hervorgeht,

liegt die Lipaseaktivität im Serum normaler Patienten mit akuter Hepatitis bei weniger als 30 BALB-Einheiten und bei Patienten mit Pankreaserkrankung bei mehr als 85 BALB-Einheiten. Ausserdem ist die Gesamtaktivität der Carboxylesterase und 5 Arylesterase [OD4121 cm (III—I)x 1000] bei normalen Patienten mit Pankreaserkrankungen niedrig, wogegen.die entsprechenden Werte bei Patienten mit akuter Hepatitis abnormal hoch sind.

Bei Verwendung von MPB oder BLME als Substrat erzielt man ähnliche Resultate. 10

Beispiel 5

Die Bestimmung der Lipaseaktivität erfolgt mit menschlichem Serum (10 ßl), welches Lipase mit 30 000 BALB-Einhei-ten/ml (Substrat: BALB) enthält, in gleicher Weise wie in Bei- 15 spiel 2. Nachdem die Bestimmung 20mal durchgeführt worden

Tabellf

616749

ist, beträgt die durchschnittliche ± Standardabweichjung 298,4 ±9,7.

Beispiel 6

Die Bestimmung der Lipaseaktivität erfolgt mit menschlichem Serum (10 [il), welches Lipase mit 20 000 MPB-Einhei-ten/ml (Substrat: MPB) enthält, in gleicher Weise wie in Beispiel 3. Erfolgt die Bestimmung 20mal, so beträgt die durchschnittliche ± Standardabweichung 200 ±10.

Beispiel 7

Unter Verwendung von BLME als Substrat erfolgt die Bestimmung der Lipaseaktivität in einer menschlichen Serumprobe (20 jxl), enthaltend Lipase (ca. 4000 BLME-Einheiten/ml), zweimal täglich während 10 Tagen (insgesamt 20mal). Die Resultate finden sich in der Tabelle 3.

3

Tag

BLME-

Einheiten/20 Serum rag

BLME-

Einheiten/20 ul Serum /

1.Wert

2.Wert

Durchschnittswert

1.Wert

2. V/ert

Durchschnitts wert

1

83

70

76,5

6

75

80

77,5

2

77

76

76,5

7

78

85

81,5

3

77

80

78,5

8

73

78

75,5

4

77

72

74,5

9

77

78

77,5

5

80

68

74,0

10

77

75

76,0

Durchschnittswert: 76,8 Standardabweichung: 4,0 Schwankungskoeffizient: 5,2%.

Beispiel 8

Lipase mit 1100 BALB-Einheiten, Carboxylesterase mit 450 BALB-Einheiten bzw. Arylesterase mit 60 BALB-Einheiten wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 (Substrat: BALB) behandelt, wobei man die Konzentration an PMSF variiert. Dann misst mari1 die Geschwindigkeit der Hydrolyse von BALB (relative Aktivität). Die Resultate finden sich in Fig. 1.

Die 50%ige Hemmkonzentration von PMSF beträgt 4,2x10-3 M für Lipase, 3,5x10-5 M für Carboxylesterase und l,2xl0-5 M für Arylesterase. Somit liegt die 50%ige Hemmkonzentration für Carboxylesterase bzw. Arylesterase bei ungefähr V100 bzw. V300, bezogen auf den Wert für die Lipase. Selbst wenn die Menge an Lipase, Carboxylesterase und Arylesterase mehrere Male erhöht oder gesenkt wird, sind die Resultate meistens die gleichen.

Demzufolge liegt die übliche Konzentration PMSF bei 0,05-2 mM, vorzugsweise bei 0,3-1,5 mM und insbesondere bei 0,4-1,0 mM, sofern man im Falle der Bestimmung der Lipaseaktivität von BALB als Substrat Bedingungen zur Anwendung

45

bringt, welche nicht wesentlich von jenen, die in Beispiel 2 beschrieben worden sind, abweichen.

Beispiel 9

50 Lipase mit 1100 MPB-Einheiten, Carboxylesterase mit 140 MPB-Einheiten bzw. Arylesterase mit 68 MPB-Einheiten wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 3 (Substrat: MPB) behandelt, wobei die Konzentration an PMSF variiert wird. Hierauf wird der Verlauf der Hydrolyse von MPB (relative Aktivität) 55 gemessen. Die Resultate finden sich in der Fig. 2.

Die 50%ige Hemmkonzentration von PMSF liegt bei ca. 4x 10~3 M für Lipase, bei ca. 2x 10-5 M für Carboxylesterase um bei ca. 1 x lo-5 m Arylesterase. Die 50%ige Hemmkonzentration für Carboxylesterase bzw. Arylesterase liegt somit bei 60 ungefähr V200 bzw. V400, bezogen auf Lipase. Selbst wenn die Menge an Lipase, Carboxylesterase und Arylesterase mehrere Male erhöht oder gesenkt wird, gelangt man praktisch zu den gleichen Resultaten.

Die zweckdienliche Konzentration von PMSF liegt bei 65 0,05-1 mM, vorzugsweise bei 0,1-1,0 mM und insbesondere be: 0,2-0,8 mM, sofern man bei der Bestimmung der Lipaseaktiviti unter Verwendung von MPB als Substrat die in Beispiel 3 erwähnten Bedingungen nicht wesentlich ändert.

8

Beispiel 10

Die Bestimmung der Lipaseaktivität erfolgt in der gleichen Weise wie in Beispiel 9 unter Verwendung von BLME als Substrat. Die Hemmung der Lipaseaktivität in Gegenwart von 0-2,0 mM PMSF ist unbedeutend, während die Carboxylestera-seaktivität um etwa 90% oder mehr in Gegenwart von 0,2 mM oder mehr PMSF gehemmt wird.

Beispiel 11

Gereinigte Lipase aus Schweinspankreas (Typus IV, ein Produkt der Firma Sigma Chemical Co.) wird in einer l%igen menschlichen Serumeiweisslösung gelöst, um eine Lösung (10 Hg/ml) zu erhalten. Die Lipaseaktivität in 10 jxl dieser Lösung (entsprechend 0,1 [ig Lipase) wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 (Substrat: BALB) in Abwesenheit von PMSF bestimmt. Die gemessene Lipaseaktivität liegt bei 800 BALB-Einheiten.

1 uMol der aus dem Substrat in Freiheit gesetzten SH-Gruppe gibt einen Wert von 4,75 von OD4121 cm unter den in Beispiel 11 beschriebenen Bedingungen. 1 mg der gereinigten Lipase aus Schweinspankreas mag somit die S-Acylgruppe von BALB unter Bildung einer freien SH-Gruppe mit einer Geschwindigkeit von 1670 [xMol/30 Minuten zu hydrolysieren.

Beispiel 12

Die nach den Angaben von Beispiel 11 hergestellte, gleiche Lipaselösung (10 ^.1) wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 unter Verwendung von verschiedenen S-Acylverbindungen als Substrat in Abwesenheit von PMSF behandelt. Die relative Aktivität der S-Acylverbindungen wird gemessen. Die Resultate finden sich in der Tabelle 4, worin die relative Aktivität von BLME für Lipase mit der Zahl 100 ausgedrückt wird.

Tabelle 4

.

X

Y

-

n'

m m'

1

y iRelat ive Akt ivit ät 47 !

{%)

Bemerk.

s

3

5

500

0

3

250

MPB

s

2

305

ÇH2-S-CO-CnH2n+1

s

4

135

CH-X-C0-CnH2n+1

s

3

11

420

CH2-0-C0-Cn,H2nl+1

s

0

s

1

i H

1

ii

10 5

1,5

■)r *X-

TV

-(OH2)2-

3

170

-(CH ) -

7

105

(ÇH2)2-S-C0-CmH2m+1

S

3

158

Y |

0

3

110

(CH2)2-S-CO-CmH2rri+1

0

-(CH2)?-

5 5

* *

Tabelle 4 (Portsetzung)

X

Y

n n1

m in'

y l

Relative Aktivität (ft)Bemerk.

f-C°-CaH2m+i

(f2)y

C0-°-Cx'H2m'+l

3 11 3 7 3

n

12 12 4 4 12 4

2 2 1 1

1

2

163 160 125

130 «

7,5

* •X*

0K2-S-00-CnH2n+1 0H2-0-C0-0n,H2n,+1

I

3

2

4

3

8

9

11 11 11 3 11 9

i |

i

{ 100.0 j 95 j 70

1 110

S 16

! 22

i

BLME !

Ì

i i

1

*

1 2 3 7

ch-o-go-c;?:,,

1

ch2-s-co-c5h7

i

35

•X*

Fussnote : Diese Verbindungen werden durch die allgemeinen Formeln I, II, III und IV nicht umfasst.

11

616 749

Wie aus den obigen Resultaten eindeutig hervorgeht, besitzen die S-Acylverbindungen der Formeln I, II, III und IV eine starke Aktivität für Lipase, wobei BALB unter diesen Verbindungen eine besonders hohe Aktivität zeigt. Andererseits zeigen unter den Verbindungen, welche nicht durch die Formeln I, II, III und IV umfasst werden, beispielsweise 2-Butyroyloxy-l,3-bis-butyroylthiopropan, ein Isomer von BALB, weniger als Vio der relativen Aktivität von BALB.

Beispiel 13

Herstellung einer Ausrüstung für Lipaseteste (50 Teste)

i) Puffer: Tris, d. h. 2-Amino-2-hydroxymethyl-l,3-propandiol (967 Gew.-Teile) und Tris-HCl (380 Gew.-Teile) werden gründlich miteinander vermischt, worauf man jeweils 1,6 g dieser Gemische in weisse Flaschen abfüllt. Zur Verwendung dieser Gemische werden sie in Wasser gelöst, bis ein Endvolumen von 120 ml (pH 8,4 bis 8,6) erzielt worden ist.

ii) DTNB: 54 Gew.-Teile DTNB und 486 Gew.-Teile Manni-tol werden gründlich miteinander gemischt, worauf man jeweils 110 mg der Gemische in 5 ml braune Flaschen einfüllt. Vor der Verwendung werden diese Gemische in Puffer (i) gelöst, um ein Endvolumen von 11 ml zu erzielen.

iii) 20 mM PMSF: 0,348% PMSF in äthanolischer Lösung wird hergestellt, wobei jeweils 1,1 ml dieser Lösung in 2,5 ml braune Flaschen eingefüllt werden.

iv) 20 mM BALB: 0,669% BALB in äthanolischer Lösung wird hergestellt, worauf man jeweils 11 ml solcher Lösungen in 25 ml braune Flaschen einfüllt.

Die Reagentien werden in Form einer Ausrüstung gehalten. Jede Ausrüstung kann für 50 Lipaseaktivitätsbestimmungen in den Proben nach der Methode gemäss Beispiel 2 verwendet werden.

Beispiel 14

20

25

30

Präparat von MPB:

CH„-S-C0-C^H7 (n) 2 i> I

(n)

CH2-0-C0-C3H7 (n)

CH-0-C0-CTH7 3 l

3,8 g a-Monothioglycerin werden in 50 ml Pyridin gelöst und diese Lösung tropfenweise bei Zimmertemperatur unter Rühren mit 17,4 g n-Buttersäureanhydrid versetzt. Das Gemisch wird hierauf unter Rühren auf einem siedenden Wasserbade während 3 Stunden erhitzt und anschliessend unter vermindertem Druck eingeengt. Der entstandene Rückstand wird in Benzol gelöst und die Lösung anschliessend nacheinander mit verdünnter Salzsäure, Wasser und verdünnter wässri-ger Kaliumcarbonatlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und das Benzol entfernt. Der Rückstand wird unter vermindertem Druck destilliert, wobei man 9,4 g der oben erwähnten Verbindung in Form einer farblosen Flüssigkeit vom Siedepunkt 162 bis 167 °C/1 mm Hg erhält.

Beispiel 15

Beim Arbeiten in der gleichen Weise wie in Beispiel 14, kann man zu verschiedenen Verbindungen gelangen, welche in der Tabelle 5 aufgezählt sind.

Tabelle 5

Verbindung

Schmelzpunkt bzw. Siedepunkt

^__—SCOC5H7 (n)

(CHp )r

"^-SC0C5H7 (n)

Smp. 185 - 186°C/3 mmHg

^^SCOC^H-.^ (n)

(cipT 115 ,

" (n) l 15

ì

Smp. 40,5 - 41>0°C

(ÇH2)2SC0C3H7 (n) 1

0

1

(CH2)2SC0C5H7 (n)

Smp. 157 - l60°C/2 mmHg

(CHp)2SC0C5H7 (n) S

■(CH2)2SC0C5H7 (n)

Smp. 170 - 173°C/2 mmHg

616749

12

Verbindung

•Schmelzpunkt bzw. Siedepunkt

CH?SC0C5H7 (n) CHSCOCUHL (n)

1 5 7

CH20C0C5H7 (n)

Smp. !43 _ 146°G/0.15 mmHg

CH2SC0C5H7 (n) CH20C0C5H7 (n)

Smp. 112 - 114°C/3 mmHg

Beispiel 16 20 n-Butylalkohol eingerührt. Das Gemisch wird hierauf während

Herstellung der Verbindung: 30 Minuten bei 50 °C auf dem Wasserbade erwärmt. Nach dem

Kühlen wird das Gemisch mit kaltem Wasser und anschlies-,S-C0—C H (n) send mit wässrigerNatriumhydrogencarbonatlösunggewa-

3 7 sehen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und das

25 Benzol entfernt. Der Rückstand wird unter vermindertem Druck destilliert, wobei man 6,5 g der gewünschten Verbindung in Form einer farblosen Flüssigkeit vom Siedepunkt 122 bis ^COO-C^H^ (n) 124 °C/4 mm Hg erhält.

3o Beispiel 17

6 g a-n-Butyroylmercaptoessigsäure und 7 g p-Toluolsulfon- Arbeitet man in der gleichen Weise wie in Beispiel 16, so säurechlorid werden in 50 ml Benzol gelöst und in diese Lösung kann man zu den in der Tabelle 6 aufgezählten Verbindungen bei Zimmertemperatur 9,4 g Triäthylamin und hierauf 2,8 g gelangen.

Tabelle 6

^^-s-c0-c„h, f- (n) ch ' 15 ^C00-C4Hg (n)

b.p. 143 - 145°C/l mmHg

^^S-C0-C3H7 (n)

(ch?)2

C00-C12H25 (n)

b.p. 135 - 140°C/0.3 mmHg

Beispiel 18

Herstellung der Verbindung:

S-c°-ChH23 (n)

(CHp)p

I

COO-C12H25 (n)

4,0 g ß-Lauroylmercaptopropionsäure und 2,64 g p-ToIuol-sulfonylchlorid werden in 50 ml Benzol gelöst und diese Lösung mit 3,51 g Triäthylamin und hierauf mit 2,5 g n-Dodecylalkohol versetzt. Das Gemisch wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 16 behandelt. Der entstandene Rückstand wird aus Äthanol umkristallisiert, wobei man 5 g der gewünschten Verbindung vom Schmelzpunkt 36 bis 37 °C erhält.

Beispiel 19

Herstellung der Verbindung: 55 CHo-S-C0-C,H7 (n)

I 2 37

CH-S-CO-C,H7 (n)

1

60 CH2-0-C0-C1]LH23 (n)

12,0 g 2,3-Dimercaptopropanol werden in 75 ml Benzol gelöst und die Lösung tropfenweise unter Rühren mit 21,5 g Lauroylchlorid versetzt. Dann wird das Gemisch unter Rühren es während ungefähr 3lh Stunden solange unter Rückfluss zum Sieden erhitzt, bis die Entwicklung von Chlorwasserstoff aufgehört hat. Hierauf wird das Gemisch destilliert, um das Benzol zu entfernen, worauf der Rückstand destilliert wird. Auf diese

13

616749

Weise erhält man 11,5 g 2,3-Dimercaptopropyllaurat als gelbe, ölige Substanz vom Siedepunkt 167 bis 175 °C/1 mm Hg. Infrarotspektrum (Film): 2563,1738 (cm-1)-10 g 2,3-Dimercaptopropyllauraut und 11,8 g Pyridin werden in 50 ml Benzol gelöst und die Lösung tropfenweise bei Zimmertemperatur und unter Rühren mit 10,3 g n-Buttersäure-anhydrid versetzt. Hierauf wird das Gemisch unter Rühren während 4 Stunden unter Rückfluss zum Sieden erhitzt. Dann wird es mit einer wässrigen Kaliumcarbonatlösung geschüttelt und anschliessend mit Wasser gewaschen, getrocknet und destilliert, um das Benzol zu entfernen. Der Rückstand wird über einer Kieselgelsäule chromatographiert, wobei man die Säule mit n-Hexan wäscht und anschliessend mit Benzol eluiert, um 8,0 g der gewünschten Verbindung in Form einer gelben, öligen Substanz zu erhalten.

Infrarotspektrum (Film): 1742,1698 (cm-1).

Beispiel 20

Herstellung der Verbindung:

CH2-S-CO-C3H7 (n)

CH2-0-C0-C11H23 (n)

15 gThiolaurinsäure werden in 50 ml trockenem Äthanol gelöst, worauf man dieser Lösung eine Lösung von 50 ml Äthylenoxyd in 20 ml kaltem trockenem Äthanol zufügt. Dann wird das Gemisch über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelas-5 sen. Das Lösungsmittel wird anschliessend unter vermindertem Druck abdestilliert und der entstandene Rückstand aus Petrol-äther umkristallisiert, wobei man zu 8 g farblosen Schuppen, bestehend aus S-Lauroylmercaptoäthanol, Schmelzpunkt 45 bis 46 °C (SH-Test mit DTNB: negativ) gelangt. '.° 5 g S-Lauroylmercaptoäthanol werden in einem Ölbade während 3 Stunden auf 190°C erhitzt, um O-Lauroylmercapto-äthanol vom Siedepunkt 153 bis 155 °C/3 mm Hg (SH-Indika-tion: positiv) zu erhalten.

15 lg des so erhaltenen O-Lauroylmercaptoäthanols wird mit 4,5 ml n-Buttersäureanhydrid vermischt und das Gemisch in einem Ölbade während 2 Stunden auf 190 bis 200 °C erhitzt. Dann wird es unter vermindertem Druck eingeengt, um die n-Buttersäure und überschüssiges n-Buttersäureanhydrid zu 20 entfernen. Der erhaltene Rückstand wird gekühlt und die ausgefällten Kristalle werden aus Äthanol zweimal umkristallisiert, wobei man 1 g S-Butyroyl-O-lauroylmercaptoäthanol, Schmelzpunkt ungefähr 25 °C, Siedepunkt 190 bis 195 °C/3mm Hg, erhält.

G

1 Blatt Zeichnungen

Claims

616749

PATENTANSPRÜCHE 1. Reagentiensatz zur diagnostischen Bestimmung der Lipa-seaktivität in einem Lipase enthaltenden Material, dadurch gekennzeichnet, dass er folgende Bestandteile enthält: a) eine der S-Acylverbindungen der folgenden Formeln:

CHo-S-C0-C H„ ^ I 2 rr2n+l

CH-X-CO-C H0 I n 2n+l

CHo-0-C0-C ,H0 2 n 2n +1

(CHo)o-S-C0-C H0 j 2 2 m 2m+l

Y l

(CH0)o-S-C0-C H0 _ 2 2 m 2m+l

'S-CO-C H0 .

ra 2ra+l

(cn2)y

00-°-Cm'H2ra'+l oder

CHo~S-C0-C H0 _ j 2 n 2n+l

CIlo-0-C0-C ,H0 , ,n 2 n' 2n'+l worin n eine ganze Zahl von 2 bis einschliesslich 4, n' eine ganze Zahl von 2 bis einschliesslich 4 oder eine ganze Zahl von 9 bis einschliesslich 13, m die Zahl 3,7 oder 11, m' die Zahl 4 oder 12, y die Zahl 1 oder 2, X das Schwefelatom oder Sauerstoffatom 25 und Y das Schwefelatom, das Sauerstoffatom oder die Äthylengruppe bedeuten mit der Bedingung, dass in jenen Fällen, in welchen y die Zahl 1 darstellt, m' die Zahl 4 darstellt, und in jenen Fällen, in welchen y die Zahl 2 darstellt, m' die Zahl 12 bedeutet, b) ein Puffer, c) ein chromogenes Sulfhydrylreagens 30 und d) ein Carboxylesterase- und/oder Arylesteraseinhibitor.
2. Reagentiensatz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die S-Acylverbindung in Form einer Lösung in einem Alkohol vorliegt.
3. Reagentiensatz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich- 35 net, dass der Puffer (b) Tris-HCl-Puffer ist.
4. Reagentiensatz nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Puffer (b) in Form eines Pulvers vorliegt.
5. Reagentiensatz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das chromogene Sulfhydrylreagens (c) aus 5,5'-Dithio- 40 bis-(2-nitrobenzoesäure) besteht.
6. Reagentiensatz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das chromogene Sulfhydrylreagens (c) aus einem pulvrigen Gemisch von 5,5'-Dithio-bis-(2-nitrobenzoesäure) und einem inerten Pulver besteht. 45
7. Reagentiensatz nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das inerte Pulver Mannitol ist.
8. Reagentiensatz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Enzyminhibitor (d) aus Phenylmethylsulfonylfluo-rid besteht. 50
9. Reagentiensatz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die S-Acylverbindung folgende Formel hat:

CHo-S-C0-C,H„ (nJ I 2 3 7

CH-S-CO-C.,H„ (n)

1 3 7

CH0-0-C0-C(n)

2 3 7
10. Reagentiensatz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die S-Acylverbindung folgende Formel hat: