CH616942A5 - Method for suppressing the immunogenic action of a biocatalyst. - Google Patents

Method for suppressing the immunogenic action of a biocatalyst. Download PDF

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CH616942A5
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insulin
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Theodorus Van Es
Nicholas C Palczuk
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Unterdrückung der Immunogenwirkung eines Biokatalysators, d. h. eines Enzyms oder Hormons mit Polypeptidstruktur, ohne dass die biologische bzw. enzymatische Aktivität des Biokatalysators aufgehoben wird.
Die medizinische Verwendung von hormonellen Biokatalysatoren, die Polypeptide sind, für den Kreislauf zum Erzielen bestimmter physiologischer Effekte ist bekannt, z.B. im Fall des Insulins, das für die Behandlung von Diabetes verwendet wird. Eine andere Gruppe biokatalytischer Polypeptide, denen grosse therapeutische Fähigkeiten zugeschrieben werden, ist die der Enzyme verschiedener Klassen. Die therapeutische Verwendung insbesondere der enzymatischen Biokatalysatoren wird häufig dadurch beschränkt, dass diese Verbindungen im Kreislauf Immunogenreaktionen auslösen, und zwar als Folge der Erzeugung von Polypeptid-Antikörpern. Dies führt zur Inaktivierung oder Zerstörung der Polypeptide und kann unter Umständen gefährliche allergische Wirkungen auslösen.
Die Polypeptid-Zerstörung durch Antikörper ist wahrscheinlich auch der Grund für die relativ kurze Wirkungsdauer von Insulin im Kreislauf, weswegen Diabetes-Patienten in relativ kurzen Abständen Insulin verabreicht erhalten müssen. Bei enzymatischen Biokatalysatoren mit Polypeptidstruktur kommt zur Inaktivierung bzw. Zerstörung meist noch die Allergiereaktion hinzu.
Wenn es möglich wäre, enzymatische Polypeptide so zu modifizieren, dass deren erwünschte physiologische Aktivität ganz oder in einem erheblichen Masse erhalten bliebe und gleichzeitig die Immunogenreaktion ausgeschaltet würde, könnte man diese äusserst wertvollen Verbindungen vermehrt für die Human- und Tiermedizin ohne die genannten Nachteile und in weit geringeren Mengen als bisher möglich verwenden.
Die genannten Probleme der therapeutischen Verwendung von Biokatalysatoren sind bekannt und es hat nicht an Versuchen zur Lösung dieser Probleme gefehlt. Die Addition oder Anlagerung von Enzymen an unlösliche Substrate ist Gegenstand umfangreicher Arbeiten, siehe z.B. Ann. Rev. Biochem. 35 (1966), 873, und «Fermentation Advances», New York (1969), Seite 391. Injizierbare Polypeptide mit anhaltender Wirkung wurden hierbei aber nicht erhalten. Ein weiterer Vorschlag zur Gewinnung von enzymatischen Polypeptiden mit verlängerter in vivo-Aktivität beruht auf der Mikroverkap-selung, siehe z.B. Science, 146 (1964), 524; Trans. Am. Soc. 12 (1966), 13; Nature, 218 (1968), 243; Can. J. Physiol. Phar-macol., 47 (1969), 1043; Canad. J. Physiol. Pharmacol., 45 (1967), 705. Ein weiterer Vorschlag beruht auf der Wärmestabilisierung durch Anfügen von Carboxymethylcellulose an Enzyme, wie Trypsin (siehe Nature, 189 [1961], 576) bzw. auf der Vereinigung von Proteasen mit hydrophilen Substraten (siehe z.B. Eur. J. Biochem., 25 [1972], 129); bei beiden Methoden werden die Polypeptide aber nicht in löslicher Form erhalten, wie dies für injizierbare Therapiepräparate und deren Wirkungskontrolle allgemein wünschbar ist. Eine weitere bekannte Methode beruht auf der Anfügung oder Addition, auch Fixierung genannt, von synthetischen Polymeren an Polypeptide Proteine, wie in «Advances in Immunology», 5 (1966), 30 beschrieben; der eben genannten Arbeit ist dargelegt, dass Homopolymere von Aminosäuren zwar fast alle nicht immunogen sind, dass aber die immunogene Aktivität durch Fixieren dieser Polymeren an immunogene Proteine nicht abgeschirmt wird, was sich an der Bildung von Antikörpern in den für die Versuche verwendeten Kreislaufsystemen zeigt. Polyglycin ist z.B. selbst nicht immunogen; wenn es aber an einem Protein fixiert wird, entsteht als abgeleitetes Protein ein Hapten. In ähnlicher Weise ist z.B. auch Dextran selbst nur schwach immunogen; wird es aber an Insulin fixiert, so zeigt das mit Dextran verkoppelte Insulin eine erhebliche immunogene Wirkung.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Unterdrückung der Immunogenwirkung eines Biokatalysators, der eine Vielzahl von Peptidbindungen besitzt, unter mindestens teilweiser Erhaltung seiner physiologischen Aktivität durch Fixierung von Polymeren an dem Biokatalysator ermöglicht die Gewinnung von im wesentlichen nicht immunogenen Polypeptid-Biokatalysatoren, die einen erheblichen Teil der erwünschten physiologischen Aktivitäten des Ausgangs-Polypeptids bewahren, und ist dadurch gekennzeichnet, dass der Biokatalysator an einem praktisch linearen Polyalkyl- oder Polyalkoxypolymer über mindestens ein Endkohlenstoffatom desselben fixiert wird, wobei das Polyalkyl- oder Polyalkoxypolymer unsubstituiert oder mit einer weniger als 5 C-Atome enthaltenden Alkoxy- oder Alkylgruppe substituiert ist.
In der beigeschlossenen Zeichnung sind Testergebnisse zusammengestellt, die weiter unten erläutert werden.
Zur Fixierung an einem oder beiden Endkohlenstoffato-m(en) des Polymers kann dessen Endgruppe geändert oder durch Anfügen einer Kopplungsgruppe modifiziert werden, die mit dem Polypeptid reaktionsfähig ist. Die erfindungsgemäss erhältlichen Polypeptide mit daran fixiertem Polyalkyl- oder Polyalkoxypolymer können als wässrige Lösungen den Kreislauf von Menschen und Säugetieren eingeführt, z.B. intramuskulär injiziert werden und verursachen praktisch keine Immunogenwirkungen.
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Die Grundkette der im erfindungsgemässen Verfahren verwendeten Polyalkyl- bzw. Polyalkoxypolymere ist eine praktisch lineare C-C-ICette bzw. eine Ätherkette. Es wurde gefunden, dass bei Verwendung von entsprechenden Polymeren mit stark verzweigten Ketten Produkte entstehen, die zu Immunogenwirkungen führen. Eine verhältnismässig geringe Substitution an der Grundkette ist aber zulässig, wenn diese Substitution auf substituierende Alkyl- oder Alkoxygruppen mit weniger als 5 und vorzugsweise 2 oder weniger C-Atomen begrenzt ist. Beispiele für brauchbare Polymere sind Polyethylenglycol, Polypropylenglycol; Polyethylenglycol wird besonders bevorzugt.
Vorzugsweise werden ferner Polymere dieser Art mit Kettenlängen zwischen 500 und 5000 Dalton, insbesondere von 750 bis 2000 Dalton, verwendet.
Im folgenden werden verschiedene Beispiele für die Art der Kopplung von Polymer mit Polypeptid beschrieben. Dabei ist zu berücksichtigen, dass die Anteile eines bestimmten Polypeptides, das eine gewünschte physiologische Wirkung hat, vom jeweils verwendeten Polypeptid abhängen können. So können bei bestimmten Enzymen hauptsächlich ein oder zwei Aminosäurereste für die gewünschte physiologische Aktivität verantwortlich sein. Bei Verwendung eines Kopplungsmittels wird dann zweckmässig ein solches gewählt, das keine Affinität zu diesen speziellen aktiven Gruppen hat. Wenn sich dies nicht völlig erreichen lässt, kann ein Kompromiss in dem Sinne geschlossen werden, dass man Aktivität zugunsten von Nicht-Immunogenizität opfert. Die jeweils erreichbaren Endergebnisse hängen aber meist nicht nur vom verwendeten Kopplungsmittel, sondern auch von den relativen Anteilen der Komponenten und vom Molekulargewicht des Polymers ab. Für die meisten Polypeptide ist es zweckmässig, mit 10 bis 100 Mol und vorzugsweise 15 bis 50 Mol Polymer pro Mol Polypeptid zu arbeiten. Mit diesen relativen Anteilen werden in der Regel mindestens 15% der physiologischen Aktivität bewahrt. Vorzugsweise wird aber so gearbeitet, dass mindestens 40% der physiologischen Aktivität des Polypeptides bewahrt bleiben.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist allgemein auf Biokatalysatoren mit einer Vielzahl von Peptidbindungen - hier kurz Polypeptide genannt - anwendbar. Von besonderem Interesse ist dabei aber die Anwendung auf enzymatische Polypeptide und auf Insulin. Beispiele geeigneter Enzymkategorien sind die folgenden (die System-Nummern entsprechen den EC-Num-mern gemäss IUP AC):
1. Oxidoreduktasen, z.B. Urat-Oxygen-Oxidoreduktase, System Nr. 1.7.3.3.„auch Uricase genannt; Hydrogenperoxid:-Hydrogenperoxid-Oxidoreduktase, System Nr. 1.11.1.6., auch Katalase genannt; und Cholesterin-red. NADP:Oxygen-Oxi-doreduktase, 20-ß hydroxylierend, System Nr. 1.14.1.9., auch Cholesterin-20-hydroxylase genannt.
2. Transferasen, z.B. UDP-Glucuronat-Glucuronyltransfe-rase mit unspezifischem Akzeptor, System Nr. 2.4.1.17., auch UDP-Glucoronyltransferase genannt, und UDP-Glucose-a-D-Galactose-l-phosphaturidylyltransferase, System Nr. 2.7.7.12.
3. Hydrolasen, z.B. Mucopeptid-N-acetylmuramylhydroIase, System Nr. 3.2.1.17., auch Lysozym genannt; Trypsin, System Nr. 3.4.4.4.; L-Asparaginaminohydrolase, System Nr. 3.5.1.1., auch Asparaginase genannt.
4. Lyasen, z.B. Fructose-l,6-diphosphat-D-glyceraldehyd-3-phosphatlyase, System Nr. 4.1.2.12., auch Aldolase genannt.
5. Isomerasen, z.B. D-Xylose-keto-isomerase, System Nr. 5.3.1.5., auch Xyloseisomerase genannt.
6. Ligasen, z.B. L-Citrullin:L-Aspartatligase (AMP), System Nr. 6.3.4.5.
Die Nichtimmunogenizität der nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltenen Produkte konnte nach den üblichen immunologischen Methoden bestätigt werden. Beispielsweise kann man hierzu das freie Polypeptid zunächst einem Versuchstier injizieren und das so gebildete Antiserum gegen das erfindungsgemäss am Polymeren fixierte - im folgenden auch als «geschützt» bezeichnete - Polypeptid auf Antigenreaktion getestet werden, z.B. durch Geldiffusion, Komplementärfixierung o. dgl. Methoden. Bei intradermaler Injektion des geschützten Polypeptides konnte weder eine sofortige noch eine verzögerte Hypersensitivität festgestellt werden. Wenn den Versuchstieren dagegen geschütztes Polypeptid injiziert wird, zeigen die aus den Versuchstieren erhaltenen Antisera keine Reaktion im Geldiffusionstest oder im Komplementärfixierungstest, und die Injektion mit ungeschütztem Polypeptid zeigte weder eine sofortige noch eine verzögerte Hypersensiti-vitätsreaktion.
Wie weiter oben erwähnt, kann das Polymer nach verschiedenen Methoden am Biokatalysator fixiert werden. Bei der einen Methode wird die Polymer-Endgruppe mit einer Kopp-lungsgruppe versehen; bei einer anderen bevorzugten Methode wird eine Gruppe am endständigen C-Atom, beispielsweise die Hydroxygruppe, durch Umwandlung modifiziert und z.B. in eine Aminogruppe umgewandelt, die dann mit dem Polypeptid gekoppelt werden kann, beispielsweise mit an sich bekannten Kopplungsmitteln.
Beispiele geeigneter Kopplungsgruppen für die erste Methode sind Cyanurchlorid oder Cyanurfluorid. Das Polymer, vorzugsweise Polyethylenglycol, nachstehend PEG genannt, kann hierbei in einem geeigneten reaktionsinerten Lösungsmittel, wie Kohlenwasserstoff, zweckmässigerweise wasserfreiem Benzol, das eine geringe Menge einer schwachen Base, wie Natriumcarbonat enthält, aufgenommen und das Cyanurchlorid dann zugesetzt werden. Das Reaktionsgemisch kann dann in überschüssiges Wasser gegossen, von unlöslichen Anteilen getrennt und schliesslich von Lösungsmittel befreit werden, vorzugsweise unter vermindertem Druck; auf diese Weise wird 2-PEG-4-hydroxy-6-chlor-l,3,5-triazin erhalten. Das so erhaltene «aktivierte» Polymer kann dann mit einer Lösung des gewählten Polypeptides in einer geeigneten Pufferlösung zum Erzielen der gewünschten Fixierung umgesetzt werden. Danach kann das nicht umgesetzte Polymer entfernt werden, vorzugsweise durch Behandlung mit einem Gelper-meationsharz, wie «Sephadex»-G-50; das als Zielprodukt erhaltene geschützte Polypeptid kann dann nach an sich üblichen Methoden gereinigt werden, die eine Denaturierung der Polypeptidkomponente vermeiden. Zweckmässig wird das Zielprodukt in gepufferter wässriger Lösung belassen, kann aber nach schonenden Methoden auch in festem Zustand isoliert werden, z.B. durch Gefriertrocknung.
Eine andere geeignete Endgruppe ist die Acylazidgruppe. Zu deren Bildung kann endständiges Hydroxyl des Polymeren mit Chloressigsäureanhydrid umgesetzt und dann mit Diazo-methan zum Methylester des Carbomethoxyäthers umgesetzt werden, der durch Behandlung mit Hydrazin das entsprechende Hydrazid ergibt, welches bei Behandlung mit salpetriger Säure das gewünschte Acylazid liefert.
Auch die Succinatgruppe kann als Kopplungsgruppe verwendet werden. Hierzu kann das Polymerglycol, beispielsweise PEG oder PPG (Polypropylenglycol) in reaktionsinertem Lösungsmittel in Gegenwart einer milden Base, wie Natrium-bicarbonat, aufgenommen und mit einem Dihalogenbernstein-säureanhydrid, wie Dibrombernsteinsäureanhydrid, behandelt werden. Das so hergestellte PEG-dihalogensuccinat oder
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analog behandelte Polymer kann dann mit Polypeptid umgesetzt werden.
Auch die Anthranilatgruppe ist geeignet. Bei dieser Variante kann das Polymerglycol, wiederum in einem reaktionsinerten Lösungsmittel, mit Isatoinsäureanhydrid zum Anthranilatester umgesetzt werden, der dann ohne weitere Reinigung für die nächste Stufe, nämlich die Diazotierung, verwendet werden kann; diese kann in an sich üblicher Weise durchgeführt werden, z.B. durch Aufnehmen des Anthranilat-esters in Wasser, Ansäuern der Lösung, z.B. mit Eisessigsäure, Kühlung und Zusatz von Natriumnitrit. Das so erhaltene Diazoniumsalz kann mit dem Polypeptid umgesetzt werden.
Eine interessante weitere Variante unter Verwendung von Azidogritppen beruht auf der fotochemischen Addition einer Azid-Kopplungsgruppe, beispielsweise indem das Glycol in Pufferlösung mit 4-Fluor-3-nitrophenylazid behandelt und das nicht umgesetzte Azid entfernt wird, vorzugsweise durch Dialyse. Zur Fixierung am Enzym, beispielsweise Lysozym, kann dieses in Wasser aufgenommen, mit dem Reaktionsmittel zusammengebracht und zusammen mit diesem erneut bestrahlt werden, was beispielsweise das PEG-2-nitrophenyllysozym liefert.
Eine endständige Hydroxylgruppe des Polymers kann für die Fixierung am Polypeptid in eine Aminogruppe umgewandelt werden. Hierzu kann man das Polymer an seiner endständigen Hydroxylgruppe entweder mit einem Sulfonierungsmit-tel, wie Toluolsulfonylchlorid. oder mit einem Halogenierungs-mittel, wie Triphenylphosphin in Tetrachlorkohlenstoff, oder Triphenylphosphin zusammen mit einem geeigneten N-Halo-genbernsteinsäureimid, umsetzen. Das auf diese Weise hergestellte Halogenid oder Tosylat kann dann nach Behandlung mit Natriumazid mit Lithiumaluminiumhydrid zum entsprechenden Polymer mit endständiger Aminogruppe reduziert werden.
Solche Polymeren mit endständiger Aminogruppe können dann über eine Carboxylgruppe des Polypeptides mit diesem nach an sich bekannten Methoden verkoppelt werden. Hierfür können z.B. wasserlösliche Carbodiimide, wie 1-Cyclohexyl-3(2-morpholinethyl)-carbodiimid, insbesondere Metho-p-toluol verwendet werden und es entsteht eine Amidobindung aus dem Stickstoff des Polymers und der Carbonylgruppe des Enzyms.
Anstelle der direkten Kopplung der Aminogruppe zur Bildung einer Amidobindung mit dem Polypeptid kann die Kopplung auch über eine Maleimidgruppe erfolgen; hierzu kann z.B. cu-Amino-PEG mit Maleinsäureanhydrid umgesetzt und das entstehende N-PEG-maleimid mit dem gewünschten Polypeptid zur Reaktion gebracht werden.
In den folgenden Beispielen beziehen sich die Zahlenwerte nach der Bezeichnung des Polymers (z.B. PEG 750) auf das Molekulargewicht des Polymers in Dalton. Angaben in Grad ° beziehen sich auf die Temperatur in °C.
Beispiel 1 Fixierung von Uricase an PEG
(A) Herstellung der PEG-Komponente (Stufen 1-3) 1. PEG 750 (2,0 g) wird in flüssigem Ammoniak (30 ml) gelöst; die Lösung wird mit Natrium behandelt, bis die blaue Farbe 5 min bestehen bleibt. Dann wird das Ammoniak mit einem trockenen Stickstoffstrom abgedampft. Der Rückstand wird mit Chloressigsäuremethylester (5 ml) behandelt, die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen und schliesslich 1 Std. auf 100° erhitzt. Nach Entfernung von überschüssigem Reagens unter vermindertem Druck bleibt der PEG-methylcarbomethoxyester zurück.
2. Der PEG-methylcarbomethoxyester (2,0 g) wird mit Methanol (300 ml) und Hydrazinhydrat (15 ml) über Nacht auf Rückflusstemperatur gehalten und die Lösung dann unter vermindertem Druck eingedampft, was das PEG-methoxycar-bohydrazid ergibt.
3. Das so erhaltene Hydrazid (1,0 g) wird in 2%iger Salzsäure (150 ml) gelöst und langsam unter Rühren mit 5%iger Natriumnitritlösung (9 ml) versetzt. Die Lösung wird dann 20 min auf Raumtemperatur gehalten. Die so gebildete Lösung von PEG-carboxymethylazid wird für die nachfolgend beschriebene Kopplung verwendet.
(B) Kopplung von Uricase mit der PEG-Komponente
Die in Stufe (A) 3 erhaltene Azidlösung (16 ml) wird durch Zusatz von Natriumphosphat auf pH 8,7 eingestellt. Uricase (25 mg) wird zugesetzt und die Lösung 2 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird die Lösung dialysiert und das geschützte Enzym durch Chromatographie an «Sephadex» G-50 isoliert. Durch Gefriertrocknung kann das Produkt auch in fester Form erhalten werden.
In analoger Weise, jedoch unter Verwendung von Aspara-ginase anstelle von Uricase, erhält man die entsprechende PEG-Asparaginase. Wird PPG anstelle von PEG verwendet, so erhält man PPG-Uricase bzw. PPG-Asparaginase.
Beispiel 2 Fixierung von Katalase an PEG
(A) Herstellung der PEG-Komponente
PEG 750 (30 g, 0,04 Mol) oder PEG 2000 (80 g, 0,04 Mol) wird in 150 ml wasserfreiem Benzol gelöst, das 8 g NaiCCb enthält. Die Lösung wird auf 10° gekühlt und mit Cyanurchlorid (7.38 g, 0,04 Mol) versetzt. Die Lösung wird über Nacht bei 10° gerührt. Dann wird Wasser (5 ml) zugesetzt, die Lösung einige Stunden auf Raumtemperatur gehalten und schliesslich über Nacht auf 40° erwärmt. Die unlöslichen Anteile werden dann abzentrifugiert und das Lösungsmittel in einem Drehverdampfer bei 40° unter vermindertem Druck entfernt. Geringe Anteile Niederschlag, die beim Konzentrieren auftreten, können durch Zugabe von etwas Benzol zur Verminderung der Viskosität, folgendem Abzentrifugieren und erneutem Eindampfen entfernt werden. Das Produkt ist PEG-4-hydroxy-6-chlor-l,3,5-triazin, eine bei 40" zähe Flüssigkeit, die bis zur Verwendung im Kühlschrank gelagert werden kann.
(B) Kopplung von Katalase an der PEG-Komponente
Katalase (60 mg, 8,7xl(H Mol) wird in 3 ml 0,05-m Boratpufferlösung (pH = 9) gelöst. Dann wird die aus PEG 750 gemäss Absatz (A) hergestellte PEG-Komponente (470 mg) zugesetzt. Nach 3 Std. wird der pH-Wert mit Natriumhydroxid wieder auf 9,0 gebracht und die Lösung bei Raumtemperatur über Nacht stehengelassen. Dann wird der pH-Wert erneut auf 9,0 eingestellt und die nicht umgesetzte PEG-Komponente entfernt, indem die Lösung über eine Säule mit «Sephadex G-50» geführt wird. Die erhaltene PEG-HTA-Katalase wird in einem Rotationsverdampfer bis zu einer Konzentration von
1 mg Protein/ml eingeengt und im Kühlschrank gelagert (HTA = -4-Hydroxy-l,3,5-triazin-6-yI).
In analoger Weise, jedoch mit «Carbowax» 2000 - einem technischen PEG — wird ein ähnliches Produkt erhalten. Ferner wird bei analoger Arbeitsweise, aber mit D-Xyloseketoli-somerase (Xyloseisomerase) oder Insulin anstelle von Katalase, die entsprechende PEG-HTA-Xyloseisomerase bzw. das PEG-HTA-Insulin erhalten.
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Beispiel 3
Fixierung von Cholesterin-20-hydroxylase an PEG-maleimid
(A) Herstellung von N-PEG-maleimid Maleinsäureanhydrid (1,0 g, 0,001 Mol), Benzol (50 ml)
und co-Amino-PEG (0,005 Mol) werden 2 Std. auf Rückfluss gehalten. Die Lösung wird unter vermindertem Druck eingedampft und 2 Std. in trockenem Stickstoffstrom auf 200° erhitzt.
(B) Umsetzung von N-PEG-maleimid mit Cholesterin-20-hydroxylase
Das Enzym (25 mg) wird zu einer Lösung von N-PEG-maleimid (70 mg) in 0,1-m Phosphatpufferlösung (pH 7,0; 10 ml) gegeben und die entstandene Lösung bei Raumtemperatur 1 Std. stehengelassen. Die Lösung wird dann dialysiert und das Zielprodukt durch Chromatographie an «Sephadex» G-50 aus dem Dialysat in Form einer Lösung isoliert, die gegebenenfalls gefriergetrocknet werden kann.
Beispiel 4
Fixierung von UDP-Glycuronyltransferase an PEG-succinat
(A) Herstellung von PEG-dibromsuccinat (PEG-Komponente)
PEG (1,0 g) wird in trockenem Benzol (10 ml) gelöst, das Natriumbicarbonat (1,0 g) enthält. Dann wird Dibrombern-steinsäureanhydrid (0,5 g) zugesetzt, die Lösung über Nacht gerührt, dann filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck konzentriert. Dies ergibt PEG-dibromsuccinat.
In analoger Weise wird bei Verwendung von Dijodbern-steinsäureanhydrid anstelle von Dibrombernsteinsäureanhy-drid das entsprechende PEG-dijodsuccinat erhalten.
(B) Kopplung von UDP-Glucuronyltransferase mit PEG-succinat
Das Enzym (50 mg) wird in Pufferlösung (10 ml; pH 7,0) bei Raumtemperatur langsam mit PEG-dibromsuccinat (100 mg) in Wasser (5 ml) behandelt. Der pH-Wert wird zwischen 7 und 8 gehalten. Das Zielprodukt wird durch Chromatographie an «Sephadex» G-50 isoliert und durch Gefriertrocknung als Feststoff gewonnen.
Beispiel 5
Fixierung von UDP-Glucose-a-D-galactose-l-phosphat-turidyl-transferase (System Nr. 2.7.7.12.) an PEG-anthranilat
(A) Herstellung der PEG-Komponente
1. PEG (1,0 g) wird in trockenem Benzol (10 ml) gelöst, das Natriumbicarbonat (1,0 g) enthält, mit Isatoinsäureanhydrid (0,25 g) versetzt und über Nacht gerührt. Die entstandene Lösung wird filtriert und das Filtrat bei 40° unter vermindertem Druck eingedampft, Der so erhaltene PEG-anthranilat-ester wird ohne weitere Reinigung im nächsten Schritt verwendet.
2. der so erhaltene PEG-anthranilatester wird in Wasser (5,0 ml) gelöst und mit Eisessig (0,5 ml) versetzt. Diese Lösung wird auf 0-2° gekühlt und tropfenweise unter Rühren so lange mit einer konzentrierten Natriumnitritlösung versetzt, bis salpetrige Säure entsteht.
(B) Kopplung der Transferase (System Nr. 2.7.7.12.) mit PEG-anthranilatesterdiazoniumsalz
Das Enzym (25 mg) wird in Pufferlösung (5 ml; pH 7 bis 7,5) gelöst, die Lösung auf 0-2° gekühlt und tropfenweise zu der gemäss Absatz (A) 2 erhaltenen diazotierten Lösung gegeben, wobei man den pH-Wert auf 7 bis 7,5 hält. Nach 2 Std. wird die Lösung auf Raumtemperatur gebracht und filtriert. Das Zielprodukt wird durch «Sephadex»-Chromatographie isoliert und kann durch Gefriertrocknung in fester Form erhalten werden.
Beispiel 6
Fixierung von Lysozym an 4-Azido-2-nitrophenyl-PEG
(A) Herstellung der PEG-Komponente
PEG (1,0 g) wird in Boratpuffer mit pH 9,8 (100 ml) gelöst und die Lösung mit 4-FIuor-3-nitrophenylazid (1,0 g) in Aceton (10 ml) behandelt. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei 40° gerührt und filtriert. Das Filtrat wird gegen Wasser dialysiert, filtriert und gefriergetrocknet.
(B) Fotochemische Kopplung von Lysozym an der PEG-Komponente
Lysozym (60 mg) wird in 3 ml Wasser gelöst und mit 4-Azido-2-nitrophenyl-PEG (50 mg) gemäss Absatz (A) versetzt. Die entstandene Lösung wird 18 Std. bei 40° mit zwei Wolframlampen (je 125 W) bestrahlt, die in Natriumnitritlösung eingetaucht waren, um Strahlung mit Wellenlängen von weniger als 400 nm auszufiltrieren. Das Produkt wurde durch Chromatographie an «Sephadex» G-50 gereinigt, durch Eluie-ren als Lösung erhalten und konnte durch Gefriertrocknen aus der Lösung isoliert werden.
Beispiel 7 Fixierung von Trypsin an PEG-Amid
(A) Herstellung von co-Amino-PEG (PEG-Komponente)
1.a. Gewinnung der Azid-Vorstufe durch Tosylierung PEG 6000 (50 g) wird in Toluol (400 ml) gelöst und die
Lösung zur azeotropen Entfernung der Wasserspuren mit einer Teilmenge (60 ml) des Toluols erwärmt. Die abgekühlte Lösung wird mit wasserfreiem Triethylamin (5,5 ml) und dann mit p-Toluolsulfonylchlorid (3,4 g) versetzt. Die erhaltene Lösung wird über Nacht auf Raumtemperatur gehalten, dann filtriert und das Filtrat auf 5° gekühlt. Der dabei gebildete Niederschlag wird gesammelt, in absolutem Ethanol (200 ml) gelöst und mit Natriumazid (1,0 g) versetzt. Die Mischung wird 36 Std. auf Rückfluss erwärmt, was das PEG-Cü-Azid in ethanolischer Lösung ergibt.
1 .b. Gewinnung der Azid-Vorstufe durch Halogenierung
Es wird wie im Absatz l.a. gearbeitet, jedoch mitThionyl-bromid (2,5 ml) anstelle von p-Toluolsulfonylchlorid. Die Lösung wird 15 min nach der Zugabe von Thionylbromid unter Rückfluss gehalten und das erhaltene PEG-co-bromid wie oben in das Azid umgewandelt.
2. Umwandlung in co-Amino-PEG
Die gemäss 1 .a. oder 1 .b. gewonnene ethanolische Lösung von co-Azido-PEG wird mit Adams-Katalysator vermischt und mit Wasserstoff behandelt, bis kein Wasserstoff mehr aufgenommen wird. Das Hydrierungsprodukt wird filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt. Dann wird trockener Äther (150 ml) zugegeben und die Mischung über Nacht auf 3° gekühlt. Das Amino-PEG wird als Niederschlag gewonnen.
(B) Kopplung von Trypsin und co-Amino-PEG
Das gemäss Absatz (A) 2 erhaltene co-Amino-PEG (100 mg) wird in Puffer (10 ml; pH 6,0) gelöst und in der Folge mit Trypsin (50 mg) sowie Ethyldimethylaminopropyl-carbodiimid (200 mg) versetzt. Der pH-Wert wird auf 6 gehalten. Nach 1 Std. wird die Reaktion durch Zugabe von überschüssiger Acetatpufferlösung (pH 6) abgebrochen. Das Zielprodukt wird durch Chromatographie an «Sephadex» G-50 isoliert.
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Bei analoger Arbeitsweise wird unter Verwendung von AMP anstelle von Trypsin das L-Citrullin-L:Aspartatligase-PEG-amid erhalten.
Beispiel 8 Fixierung von Aldolase an PEG-amid
Aldolase (30 rag) wird in 2-m Natriumacetat (3 ml), 0,1-m Natriumglyoxylat (1,5 ml) und 10 mMol Kupfersulfat (1 ml) gelöst. Es wird genug 0,4-m Essigsäure zugesetzt, um den pH-Wert auf 5,5 zu bringen. Die Lösung wird 1 Std. auf 20° gehalten. Das so modifizierte Protein wird durch Gelfiltration an «Sephadex» isoliert und bei 37° über Nacht in Mischung mit 2-m Natriumacetat (3 ml) 2-m Essigsäure (1 ml) und co-Amino-PEG (100 mg) - hergestellt wie oben - inkubieren gelassen. Das Zielprodukt wird durch Chromatographien an «Sephadex» G-50 isoliert.
Beispiel 9 Fixieren von Insulin an PEG-HTA
(A) Herstellung der PEG-Komponente
Die PEG-Komponente, nämlich PEG-4-hydroxy-6-chlor-1,3,5-triazin, wird nach Beispiel 2, Absatz (A) aus PEG 2000 hergestellt.
(B) Kopplung von Insulin und PEG-Komponente Insulin (10 mg) wird in 1 ml 0,1-m Borat-Pufferlösung
(pH 9,2) gelöst und mit der PEG-Komponente (179 mg) versetzt. Nach 2 Std. Reaktion wird nicht-umgesetzte PEG-Komponente durch Chromatographie an «Sephadex» G-10 entfernt. Das PEG-HTA-Insulin wird im Rotationsverdampfer auf 1 Protein/ml konzentriert und im Gefrierfach gelagert (HTA = 4-Hydroxy-l,3,5-triazin-6-yl).
Bei analoger Arbeitsweise wird ausgehend von PEG 750 ein entsprechendes Produkt erhalten. Ferner werden bei Durchführung der Reaktion mit pH-Werten von 8,5 und 10 ähnliche Produkte erhalten.
Im folgenden werden Testmethoden und -ergebnisse beschrieben.
I. Enzymatische Aktivität von PEG-Katalase
Katalase wurde als solche und nach Fixierung an PEG entsprechend der Methode von Beers und Sizer (J. Biol. Chem. 195 [1952] 133) geprüft. Sowohl PEG 750-Katalase als auch PEG-2000-Katalase erwies sich als etwas aktiver als nicht modifizierte Katalase:
Nicht modifizierte Katalase: 41 500 Einheiten/mg Protein PEG 750-Katalase: 43 750 Einheiten/mg Protein
PEG 2000-Katalase: 43 500 Einheiten/mg Protein
Die Wärmestabilitätswerte von unmodifizierter Katalase und von PEG 750-Katalase waren bei 37° und 60° ähnlich.
II. Antigenizitätstest
(a) Immunisierung
Weisse, ausgewachsene weibliche Neuseeland-Kaninchen wurden intravenös mit einer 1,5 mg/ml-Stammlösung von Rindsleber-Katalase 4 Wochen immunisiert; am Ende der Immunisierung hatte jedes Tier insgesamt 55 mg Katalase erhalten; 7 und 14 Tage nach Abschluss der Immunisierung wurde den Tieren durch Herzpunktierung Blut abgenommen. Etwa 1 Monat später wurde den Tieren je 5 mg des entsprechenden Antigens injiziert; eine Woche später wurde wiederum durch Herzpunktierung Blut abgenommen.
(b) In vivo und in vitro Tests
Nach der letzten Blutabnahme gemäss II.a wurde den Tieren 0,1 ml des entsprechenden Antigens in boratgepufferter physiologischer Kochsalzlösung injiziert, um das Auftreten von sofortiger und/oder verzögerter Hypersensitivität festzustellen. Alle Tiere wurden während eines Zeitraumes von 96 Std. nach der Injektion auf Hautreaktionen beobachtet.
Die von den Tieren gewonnenen Antiseren nach Immunisierung gemäss Il.a wurden ferner in vitro auf Präzipitation (1) und auf Komplementärfixierungsaktivität (2, 3) untersucht. Jedes Antiserum (unverdünnt, Verdünnung V10, Verdünnung ■/so) wurde auf Geldiffusionsplatten (1,0% Agar in physiologischer Kochsalzlösung mit Zusatz von 1,0% Azid als Konservierungsmittel) sowohl gegen Katalase- als auch gegen PEG-HTA-Katalase-Lösungen getestet, und zwar bei Konzentrationen von 1000 Y/ml bis 5 y/ml. Die Platten wurden 48 Std. bei Raumtemperatur und 3-4 Tage bei 4° inkubiert. Die Komplementärfixierungsaktivität der wärmeinaktivierten, an Schafse-rythrozyten absorbierten Antiseren wurde nach dem Mikroliter-Komplementärfixierungstest bestimmt (Test-Satz der Cooke Engineering Co., USA). Die Antiseren wurden in 1:1-und l:10-Verdünnung gegen Katalase- und PEG-HTA-Kata-lase-Lösungen im Verdünnungsbereich von 1000 ylml bis 15 y/ml getestet. Die Platten wurden nach 30 min Inkubation bei 37° auf Vorhandensein oder Fehlen von Hämolyse getestet.
(c) Intravenöse Immunisierung mit Katalase
1. Geldiffusion
Das Kaninchen-Antiserum, unverdünnt und in '/m Verdünnung getestet, lieferte positive Ergebnisse der Antikörper-Präzipitation gegen Katalase. Die Prüfung des gegen natives Enzym hergestellten Antiserums gegenüber dem durch Poly-oxyethylenreste modifizierten Enzym ergab keinerlei Hinweise auf «Querreaktionen».
2. Komplementärfixierung
Sowohl die ersten als auch die zweiten Seren zeigten positive Komplementärfixierungsaktivitäten bei Prüfung gegen native Katalase. Bei Verwendung der erfindungsgemäss an Polymere fixierten Katalase als reagierendes Antigen waren die Ergebnisse dagegen negativ.
III. PEG-Immunotest von PEG-Insulin
Das gemäss Beispiel 2 hergestellte PEG-HTA-Insulin wurde im Vergleich zu Insulin nach den in der folgenden Tabelle genannten Verfahren auf Antigenwirkung getestet; die Ergebnisse sind in der Tabelle angegeben.
Test
(1)
(2)
Insulinaktivität
Insulin-Antikörper
ji-i;inheiten/ml aktivität
H-Einheiten/ml
Material
(Tierversuch)
(Radioimmunoassay)
Unmodifiziertes Insulin
137
127
PEG-HTA-Insulin (750)
72*
0
PEG-HTA-Insulin (2000)
90*
0
* Diese Zahlen sind Verdünnungszahlen, keine eigentlichen Testwerte.
Die in der obigen Tabelle zusammengestellten Ergebnisse zeigen, dass das PEG-HTA-Insulin keine Antigenaktivität gegen Insulin-Antiserum hat.
IV. Blutzuckerwert
(a) Insulin und PEG-HTA-Insulin mit gleichem Insulingehalt
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wurde Kaninchen injiziert; die resultierenden Blutzuckerwerte wurden nach der Glucostat-Methode gemessen (Test der Worthington Biochemical Corporation, USA). Die Ergebnisse nach 3 Std. waren wie folgt:
Blutglucosewert
PEG-HTA-Insulin
50% des Normalwertes
Insulin
20 % des Normalwertes
10
Diese Ergebnisse zeigen, dass das PEG-HTA-Insulin eine Insulinaktivität hat, die etwa 50% derjenigen von Insulin entspricht, wenn auf das Gewicht des PEG-HTA-Insulins bezogen wird.
(b) Übliche Testratten (220/225 g) wurden nach der Methode von Goldner (Bull. N. Y. Acad. Med. 21, 44 [1945]) mit Alloxan-Injektionen diabetisch gemacht. Den Tieren wurde während der Testdauer keine Nahrung gegeben. Den Tieren wurden Insulin- bzw. PEG 2000-HTA-Insulin-Zubereitungen (hergestellt bei pH-Werten von 9,2 und 10,5) verabreicht. Das bei pH 10,5 hergestellte Produkt zeigte keine Senkung der Blutzuckerwerte. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt und in der Figur wiedergegeben.
Insulin (intramuskulär)
Zeit Blutglucosespiegel
Abfali gegen Anfangs
% Abfall
(Std.)
spiegel gegenüber mg/100 ml mg/100 ml
Kontrolle
0 410
1 295
135
32,9
2 270
140
34,1
4 290
120
29,2
6 400
10
2,4
Kontrolle (kein Futter während der Testzeit)
0 520
0
0
2 510
10
1,9
4 490
30
5,7
6 470
50
9,6
10 395
125
24,0
PEG-HTA-Insulin (ph-Wert 9,2) (Intravenös)
0 305
2 72,5
232
76,2
4 101,5
203,5
66,7
5*
8 230
75
24,6
* Tiere wurden nach diesem Punkt gefüttert.
Allgemein können die nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltenen nicht immunogenen Biokatalysatoren in gleicher Weise verarbeitet werden, wie die Biokatalysatoren, von denen sie abgeleitet sind. Derartige Produkte können bezüglich ihres Polypeptidgehaltes vor Gebrauch in vivo standardisiert werden. Die Stärke einer Verabreichung kann somit als bekannt vorausgesetzt werden. Die verabreichten Mengen können, bezogen auf das aktive Material, etwa gleich gewählt werden, wie dies für den Biokatalysator üblich ist. Wenn z.B.
40 die übliche Insulindosis 50 beträgt, so kann das erfindungsge-mäss erhaltene Produkt ebenfalls mit einem Insulingehalt von 50 verabreicht werden. Als Folge der Langzeitwirkung kann die erforderliche Dosis in Frequenzen verabreicht werden, die etwa die Hälfte oder ein Viertel der für das freie Material « üblichen Frequenz erforderlich ist. Wenn also z.B. Insulin in Abständen von 6 Std. verabreicht wurde, sind für das erfin-dungsgemäss erhaltene fixierte Material Intervalle von 12 bis 24 Std. zu empfehlen.
B
1 Blatt Zeichnungen

Claims (9)

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1. Verfahren zur Unterdrückung der Immunogenwirkung eines Biokatalysators, der eine Vielzahl von Peptidbindungen besitzt, unter mindestens teilweiser Erhaltung seiner physiologischen Aktivität durch Fixierung von Polymeren an dem Biokatalysator, dadurch gekennzeichnet, dass der Biokatalysator an einem praktisch linearen Polyalkyl- oder Polyalkoxypo-lymer über mindestens ein Endkohlenstoffatom desselben fixiert wird, wobei das Polyalkyl- oder Polyalkoxypolymer unsubstituiert oder mit einer weniger als 5 C-Atome enthaltenden Alkoxy- oder Alkylgruppe substituiert ist.
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyalkyl- oder Polyalkoxypolymer ein Molekulargewicht von zwischen 500 und 5000 Dalton hat.
2
PATENTANSPRÜCHE
3. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass 10 bis 100 Polymereinheiten pro Molekül des Biokatalysators an diesem fixiert werden.
4. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Polyalkoxypolymer Polyäthylenglycol verwendet.
5. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Biokatalysator eine Oxidoreductase, Transfe-rase, Hydrolase, Lyase, Isomerase, Ligase oder das Insulin verwendet.
6. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass man als Biokatalysator ein Enzym verwendet, und dass der Biokatalysator mit daran fixiertem Polymer mindestens 40% der Enzymaktivität des Biokatalysators ohne fixiertes Polymer pro Mol aufweist.
7. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Biokatalysator eine Hydrolase und als Polymer Polyäthylenglycol verwendet.
8. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Biokatalysator Asparaginase und als Polymer Polyäthylenglycol verwendet.
9. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass man als Biokatalysator Insulin und als Polymer Polyäthylenglycol verwendet.
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