CH617775A5 - Process for the preparation of antigens from schistosomes - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Antigenen aus lebenden, vorzugsweise adulten, Schistosomen und deren Verwendung zum Nachweis der Bilharziose in vitro.
Die Bilharziose ist eine Erkrankung, die von Parasiten der Gattung Schistosoma hervorgerufen wird. Man schätzt, dass annähernd 200 Millionen Menschen, insbesondere in Asien, Afrika, Süd- und Mittelamerika, von menschenpathogenen Schistosoma-Arten infiziert sind, insbesondere von S. mansoni, S. haematobium und S^ japonicum.
Seit etwa 50 Jahren werden serologische Methoden für die Diagnose der Bilharziose angewandt, die gegenüber parasitolo-gischen Verfahren wegen der Einfachheit der Durchführung wesentliche Vorteile aufweisen. Die Spezifität dieser Testverfahren ist im weitesten Sinne abhängig von der Qualität des dafür verwendeten Antigenmaterials.
Es ist bekannt, dass Bilharziose-Patienten in einem frühen Stadium der Erkrankung eine spezifische Hautempfindlichkeit zeigen, die auf vorhandene Antikörper gegen den Erreger zurückzuführen ist und mit entsprechenden Antigenen provoziert werden kann, Eine intradermale Injektion eines Schistoso-men-Extrates führt zu einer nach wenigen Minuten auftretenden Rötung und Induration (Quaddelbildung) im injizierten Hautbereich.
In vitro lassen sich die Antikörper mit bekannten Testverfahren nachweisen, wenn geeignete Antigene benutzt werden.
Als Ausgangsmaterial für die Gewinnung der Antigene werden dabei u.a. bestimmte Entwicklungsstadien aus dem Lebenszyklus von Bilharziose-Erregern eingesetzt, vorzugsweise adulte, Schistosomen, die in einem Wirtstier am häufigsten in Nagern zur Entwicklung gebracht werden. Die Gewinnung der Organismen erfolgt mittels einer von Pellegrino und Siquera (1956) beschriebenen Perfusionstechnik. Die aus der Perfusionslösung zu gewinnenden Schistosomen werden mit isotonischer Kochsalzlösung gewaschen und anschliessend entweder sofort zur Antigenherstellung eingesetzt oder getrocknet und bis zum Bedarf in Ampullen aufbewahrt.
Für die Diagnostik einsetzbare Antigene werden entweder durch Extraktion der getrockneten Würmer mit isotonischer Kochsalzlösung hergestellt (Kochsalz-Extrakt) oder durch Extraktion mit Hilfe der Lösung nach Coca (Coca-Extrakt) s oder entsprechend dem Vorschlag Melchers durch Delipidisie-rung der Schistosomen mit Petroläther und anschliessender Extraktion mit Boratpuffer und einer Reinigung durch Säurefällung, wonach die säurelösliche Fraktion als sogenanntes Mel-chers-Antigen erhalten wird. Es sind mehrere Versuche unter-m nommen worden, um die im wesentlichen nach diesem Verfahren erhaltenen Antigene weiter zu reinigen. Es wurden dabei auch im Hauttest reaktive Fraktionen erhalten. Es konnte jedoch auch weiter gezeigt werden, dass der aktive Anteil des Hauttest-Antigens nicht auf die reinen Fraktionen zu beschrän-is ken ist. Vielmehr konnte ermittelt werden, dass die Reaktivität des Antigens mit dessen Stickstoffgehalt in Korrelation zu bringen ist. Dabei wird immer die Forderung nach Ausschaltung von unspezifischen Reaktionen erhoben, die durch den Einbau von wirts-spezifischen Bestandteilen in dem Organismus der Schi-stosomen hervorgerufen werden können.
Es wurde nun gefunden, dass die durch die Perfusion aus Nagerblut gewonnenen Schistosomen von einem grossen Anteil von wirts-spezifischem Material befreit werden können, wenn die Schistosomen in geeigneten proteinfreien Salzmedien mehrere Stunden gehalten werden, und dass diese vorgereinigten Schistosomen somatische Antigene erhöhter Spezifität liefern.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung von Antigenen aus lebenden, vorzugsweise adulten, Schistosmen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man aus infizierten Tieren gewonnene Schistosomen, 12 bis 96 Stunden in dem 10- bis 100-fachen ihres Volumens einer sterilen, Protein- und im wesentlichen Sticksofffreien, physiologisch verträglichen wässrigen Salzlösung bei 10 bis 40° C lebend erhält, anschliessend isoliert und die Antigene mit einem wässrigen Medium extrahiert.
Als Salzlösungen, in denen die Schistosomen nach ihrer Gewinnung einige Zeit lebend gehalten werden, können alle physiologisch verträglichen wässrigen Salzlösungen verwendet 4() werden, deren Osmolarität etwa 200 bis 450 Milliosmol/Ltr. beträgt. Neben physiologischer Kochsalzlösung gehören hierzu die bekannten Nährlösungen, beispielsweise nach Locke, Tyrode oder Ringer. Zusätze von etwa 0,5% Glucose und/oder etwa 1 % Asparagin, von denen bekannt ist, dass sie es ermögli-45 chen, Schistosomen in Nährlösungen 2 bis 12 Tage am Leben zu erhalten, sind auch bei dem erfindungsgemässen Verfahren vorteilhaft.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform werden die durch Perfusion gewonnenen Schistosomen in dem etwa 50-fachen ihres Volumens einer wässrigen Lösung enthaltend NaCI, KCl, MgS04, Glucose, NaHCOj, Na2HP04 und CaCI2 mit einer Konzentration von insgesamt 200 bis 450 Milliosmol/ Ltr. bei 35 bis 40° C gehalten, mit der Massgabe, dass mindestens die Hälfte der Osmolarität der Lösung durch den Gehalt ^ an Kochsalz bedingt ist und die übrigen Bestandteile jeweils 2 bis 50 Milliosmol/Ltr. zu dem Gehalt an dissoziierter Substanz in der Lösung beitragen. Dabei darf als bekannt vorausgesetzt werden, dass für die Herstellung einer optisch klaren Lösung die angegebenen Salze nicht in jedem beliebigen Mischungsverhält-1,1 nis dem Lösungsmittel Wasser zugegeben werden können. Beispielsweise kann die wässrige Lösung folgende Zusammensetzung haben :
0,120 Mol/Ltr entspr. 240 Milliosmol/Ltr/NaCI «s 0,004 Mol/Ltr entspr. 8 MilliosmoI/Ltr/KCI 0,0007 Mol/Ltr entspr. 2 Milliosmol/Ltr/MgS04 0,0055 Mol/Ltr entspr. 5 Miiliosmol/Ltr/Glukose 0,018 Mol/Ltr entspr. 36 Milliosmol/Ltr/NaHC03
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617 775
0,0035 Mol/Ltr entspr. 10 Milliosmol/Ltr/Na2HP04 0,001 Mol/Ltr entspr. 3 MiIIiosmol/Ltr/CaCI2
Es hat sich als zweckmässig erwiesen, die Lösung im Abstand von einigen Stunden mehrfach zu wechseln, beispielsweise bei einer 24stündigen Haltung der Würmer den Wechscl der Lösung alle 8 Stunden durchzuführen.
Es war bisher nicht bekannt, dass Schistosomen während der Inkubationszeit in den entsprechenden Medien die in ihrem Darm aufgenommen Nährsubstanzen freizugeben vermögen, und dass dadurch - wie erfindungsgemäss gezeigt werden konnte - ein wesentlicher Reinigungseffekt in der Herstellung der somatischen Antigene resultiert. Es kann nämlich gezeigt werden, dass das Feuchtgewicht der durch Perfusion aus einem Wirtstier gewonnenen Schistosomen durch die erfindungsgemäss vorzunehmende Inkubation um 10 bis 30 % abnimmt. Diese Abnahme des Wurmgewichtes führt zu einem spezifisch wesentlich reineren Ausgangsmaterial für die Herstellung der somatischen Antigene.
Während nicht inkubierte Schistosomen nur durch sehr schonende Massnahmen von Extraktionsverfahren zur Gewinnung der Antigene eingesetzt werden können, erlaubt die erhöhte Reinheit des Ausgangsmaterials den Einsatz von intensiveren Scher- und Kavitationskräften, beispielsweise von'Ultra-schall, und führt danach zu einer höheren Ausbeute an spezifischem Antigenmaterial.
Die als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemässe Verfahren dienenden Schistosomen können auf an sich bekannte Weise z.B. mit Hilfe der Perfusionstechnik aus dem Blut von infizierten Tieren gewonnen werden. Geeignete Tiere sind z.B. Schweine oder vorzugsweise Nager, wie Kaninchen, Meerschweinchen, Goldhamster oder insbesondere Ratten oder Mäuse. Die Tiere werden zweckmässigerweise für die Schistoso-men-Gewinnung artifiziell infiziert, jedoch können auch natürlich infizierte Tiere in gleicher Weise zur Schistosomen-Gewinnung herangezogen werden, wobei man allerdings in Kauf nehmen muss, ein weniger homogenes Ausgangsmaterial zu erhalten.
Die aus den infizierten Tieren gewonnenen Schistosomen werden dann im allgemeinen, wie folgt behandelt: Sie werden, zweckmässigerweise auf einem Sieb geeigneter Maschenweite, gesammelt und, z.B. auf diesem Sieb oder auch durch Dekantieren nochmals gewaschen. Als Waschlösung dient eine gegenüber den Organismen isotonische wässrige Salzlösung, zweckmässig Kochsalzlösung.
Die so vorbereiteten Schistosomen werden in der bereits beschriebenen Weise in einer Salzlösung am Leben erhalten.
Die Isolierung der inkubierten Schistosomen kann in der Weise erfolgen, dass man sie von der Salzlösung durch Dekantieren oder Absieben abtrennt und gewünschtenfalls nochmals mit isotonischer Salzlösung oder mit reinem Wasser wäscht.
Für die nachfolgende Extraktion können als Extraktionsmittel die in der Technik bekannten und weiteroben beschriebenen Medien, die schon bisher für die Extraktion von nicht erfindungsgemäss vorbehandelten Schistosomen verwendet wurden, die aber mit den erfindungsgemäss vorbehandelten Schistosomen einen wesentlich verbesserten Extrakt liefern, eingesetzt werden.
Gewünschtenfalls können die aus der Salzlösung isolierten Schistosomen vor der Extraktion gefriergetrocknet und/oder mit dem mindestens 50fachen ihres Trockengewichts an Lipid-lösungsmitteln wie Diäthyläther delipidisiert werden. Vor oder während der Extraktion kann die Anwendung von Scher- oder Kavitationskräften zweckmässig sein, z.B. die Behandlung mit einem schnellen Rührer oder mit Ultraschall oder auch ein einfaches mechanisches Zerreiben. Im Anschluss an die Extraktion kann der erhaltene wässrige Extrakt gewünschtenfalls weiteren Reinigungsoperationen wie Dialyse oder Chromatographie unterworfen werden.
Das gereinigte Produkt kann entsprechend den Anforderungen der diagnostischen Testsysteme für den Nachweis der Bilharziose standardisiert werden.
Dabei hat es sich aufgrund von Versuchen als zweckmässig s erwiesen, in dem Antigenmaterial eine Stickstoffbestimmung durchzuführen und die Lösung der somatischen Antigene auf eine Endkonzentration von 0,03 mg Stickstoff pro ml mit Hilfe einer physiologisch verträglichen Salzlösung einzustellen.
Werden die erfindungsgemäss hergestellten Antigene für m den Nachweis der Bilharziose in vitro eingesetzt, so sind sie beispielsweise für die Durchführung des Haemagglutinationste-stes geeignet, wie er von Kagan 1955 für die Bilharziose-Diagnostik beschrieben wurde. Ebenso lässt sich das erfindungsgemäss gewonnene Antigen für die Komplementbin-i< dungsreaktion einsetzen, die als diagnostisches Verfahren für den Schistosoma-Nachweis in Wld.Hlth.Org.25 (1961) 611— 674, erläutert wurde.
Neben den hier aufgezählten Methoden sind die erfindungsgemäss gewonnenen Antigene für eine Reihe weiterer serologi-:n scher Testverfahren als Antigen in der Bilharziose-Diagnostik einzusetzen.
Die Wirksamkeit der erfindungsgemäss hergestellten Antigene lässt sich auch durch Intradermaltests nachweisen; so führt beispielsweise die intradermale Injektion von 0,05 ml einer standardisierten Antigenlösung nach etwa 15 Minuten zur Bildung einer Quaddel von mehr als 1 cm2 in der Haut an der Injektionsstelle, was als zuverlässiger Hinweis auf das Vorhandensein von Schistosomen-Antikörpern angesehen werden kann.
Die erfindungsgemäss erhältlichen Antigene sind ausserdem zur Gewinnung von Antiserum, das durch Immunisierung geeigneter Versuchstiere mit dem Schistosoma-Antigen erhalten werden kann, verwendbar. Dabei sind Seren zu gewinnen, die sich in immunologischen Systemen ähnlich denen verhalten, die ls von Bilharziose-erkrankten Patienten entnommen werden können.
Die Erfindung soll im nachstehenden Beispiel näher erläutert werden.
4" Beispiel
35 g feucht ausgewogene, mittels Perfusionstechnik aus den Blutgefässen des Mesenteriums experimentell infizierter Mäuse gewonnene Schistosomen werden unter sterilen Bedingungen auf einem Sieb mit einer Maschenweite von 0,5 mm mehrfach
•15
mit jeweils 100 ml steriler isotonischer Kochsalzlösung gewaschen. Die auf diese Weise von anhaftenden Fremdstoffen befreiten Würmer werden in 500 ml einer wie folgt zusammengesetzten und anschliessend keimfrei filtrierten Lösung gesù geben:
g/1
NaCl 7.4
KCl 0.75
CaCl2 0.55
s MgCl2. 6H20 0.2
55 Na2HP04 . Glukose 2.7
0.84
NaHC03 Na-Citrat Glukose pH-Wert
\ r
2.9 3.6 8.3
und insgesamt 24 Stunden bei 37° C gehalten. Nach jeweils 8 Stunden erfolgt ein Wechsel der Lösung durch weitere 500 ml.
Die Würmer werden sodann auf dem Sieb mit 100 ml «s steriler isotonischer Kochsalzlösung gewaschen, in etwa 100 ml sterilem destilliertem Wasser suspendiert und in einer Gefriertrocknungsanlage getrocknet. Es werden 6,25 g Trockenschisto-somen erhalten.
617 775
4
Für die Gewinnung der somatischen Antigene aus den Schistosomen wird das getrocknete Wurmmaterial in einem Mörser fein pulverisiert und anschliessend portionsweise in einem Gewebehomogenisator nach Potter (hergestellt von der Firma B. Braun Melsungen) mit insgesamt 950 ml ml Diäthyläther homogenisiert. Das Homogenisatorgefäss wird dabei aussen mit einer Mischung aus Methanol und Trockenkohlensäure gekühlt. Die ätherunlöslichen Bestandteile werden durch Zentrifugation in einer explosionsgeschützten Kühlzentrifuge bei -10° C abgeschleudert. Der Überstand wird verworfen und der Rückstand in einem Exsiccator unter Vakuum vom restlichen Äther befreit. Die Gesamtmenge der erhaltenen Trockensubstanz wird in 625 ml einer mit Natriumborat gepufferten Kochsalzlösung (pH 7,4), bestehend aus 6,202 g H3B03,50 ml 1 n NaOH, 2.925 g NaCI, 46.5 ml 1 n HCl ad 1000 ml mit dest. Wasser aufgefüllt, suspendiert und mit dem erwähnten Gewebehomogenisator gleichmässig in der Lösung verteilt. Danach wird das Homogenat 10 Minuten lang einer Ultraschall-Behandlung bei 0,6 A, 220 V unterworfen (Hersteller des Gerätes: Schöllerschall). Anschliessend wird 1 Stunde bei 30.000 g zentrifugiert, das Sediment verworfen und der Überstand, der das somatische Antigen enthält, gegen das lOfache Volumen der genannten boratgepufferten Kochsalzlösung 10 Stunden dialysiert. Die im
Innendialysat erhaltenen somatischen Antigene können zur Herstellung von Diagnostika für Bilharziose-Infektionen eingesetzt werden.
Gewünschtenfalls können die Antigene durch geeignete s chromatographische Massnahmen auch weitergereinigt werden und für besondere Untersuchungen in Einzelkomponenten zerlegt werden.
Die Prüfung der biologischen Aktivität der erhaltenen somatischen Antigene erfolgt an Meerschweinchen, denen m Serum von Bilharziose-Patienten mit gesichertem parasitologi-schen Befund injiziert worden war, durch den Nachweis der passiv kutanen Anaphylaxie:
Wenn den mit diesen Patientenseren sensibilisierten Tieren i ^ 48 Stunden nach der Serumgabe das gemäss dem vorstehenden Beispiel hergestellte Antigen in einer Verdünnung von 1:50 intrakutan appliziert wird und gleichzeitig pro Tier 1,2 ml einer 0,12 %-igen Lösung von Evans blue intravenös verabreicht wird, erscheint an der Injektionsstelle ein blauer Hof.
:n Die serologische Aktivität wird bestimmt durch Titration mittels der passiven Hämagglutinationstechnik nach Kagan 1955, wobei als Serumstandard ausgesuchte Seren von Bilharziose-Patienten eingesetzt werden.
C
Claims (5)
1. Verfahren zur Herstellung von Antigenen aus Schistosomen, dadurch gekennzeichnet, dass man aus infizierten Tieren gewonnene Schistosomen 12 bis 96 Stunden in dem 10- bis 100-fachen ihres Volumens einer sterilen, Protein- und im wesentlichen Sticksoff-freien, physiologisch verträglichen wässrigen Salzlösung bei 10 bis 40° C lebend erhält, anschliessend isoliert und die Antigene mit einem wässrigen Medium extrahiert.
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Schistosomen vor der Extraktion gefriertrocknet, mit einem Lipidlösungsmittel behandelt, vor oder während der Extraktion Scher- oder Kavitationskräften unterwirft und/ oder dialysiert.
2
PATENTANSPRÜCHE
3. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man eine sterile Protein- und im wesentlichen Stickstoff-freie physiologisch verträgliche Salzlösung verwendet, welche Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Glucose, Natriumhydrogencarbonat, Dinatriumphosphat und Calciumehlorid in einer Konzentration von insgesamt 299 bis 450 Milliosmol/Ltr. enthält, mit der Massgabe, dass mindestens die Hälfte der Osmoralität der Lösung durch den Gehalt an Kochsalz bedingt ist und die übrigen Bestandteile jeweils 2 bis 50 Milliosmol/Ltr. zu dem Gehalt an dissoziierter Substanz in der Lösung beitragen.
4. Antigene aus Schistosomen, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1.
5. Verwendung der Antigene gemäss Patentanspruch 4 zum Nachweis der Bilharziose in vitro.
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