CH617963A5

CH617963A5 -

Info

Publication number: CH617963A5
Application number: CH1426573A
Authority: CH
Inventors: Gianfranco Fedeli; Luigi De Ambrosi
Original assignee: Derivati Organici Lab
Priority date: 1973-10-05
Filing date: 1973-10-05
Publication date: 1980-06-30
Also published as: FR2246567A1; DD118654A1; DE2447050A1; JPS619286B2; CA1034495A; JPS5063186A; DE2447050C2; FR2246567B1; US4216293A; DK522174A; SU611595A3; AR200699A1; ES430685A1; DK139913C; NL7413127A; DK139913B

Description

La presente invenzione riguarda l'estrazione di inibitore delle proteasi, in particolare l'inibitore della callicreina e della tripsina, il cui impiego terapeutico risulta sempre più diffuso ed in taluni casi indispensabile, come ad esempio nelle pancreatiti gravi.

Come è ben noto, la presenza dell'inibitore delle proteasi è stata accertata in numerosi organi e tessuti animali come: il pancreas, il fegato, il polmone, i linfonodi, le parotidi, la milza, il sangue, le ghiandole seminali, ecc. (Kraut, H. e Coll. Z. Physiol. Chem. 192, 1—M. Kunitz e J.H. Northrop, J. Gen. Physiol. 19, 1 - Werle, E. e Coll., Z. Naturforsch. 14b, 385 -Astrup, T. Acta Physiol. Scan. 26.243); cosi come numerose sono anche le tacniche chimiche studiate per l'estrazione da questi tessuti, queste metodiche essendo per lo più basate sull'effetto estrattivo e selettivo di miscele acquose acide o alcaline, frazionamenti salini e/o idroalcoolici e su procedimenti cromatografici (cfr. brevetti tedeschi 1 084 433, 1 148 352, 1 011 576, 956 907, 950 959, 954 284, brevetto inglese 965 352, brevetto francese 1 566 777, brevetti giapponesi 43-7328 e 44-8563).

Tutti questi procedimenti presentano, oltre all'inconveniente di una notevole complicazione e di richiedere un elevato numero di passaggi, quello, molto importante dal punto di vista chimico industriale, di rese piuttosto basse accompagnate da costi rilevanti.

È ben noto che alcuni degli organi animali sopra menzionati contengono anche forti quantità di eparina, altra sostanza di grande produzione e di largo consumo ospedaliero, la quale veniva appunto estratta da questi organi ricorrendo all'azione solubilizzante di alcuni enzimi proteolitici con successiva precipitazione dell'eparina. Tale estrazione è stata tuttavia man mano soppiantata nella maggioranza dei casi da altri metodi di produzione basati su altre fonti e industrialmente più vantaggiosi. È anche degno di nota comunque il fatto che gli scarti della produzione dell'eparina, sotto forma di liquidi risultanti dalla precipitazione,, venivano scaricati in fogna e comunque non altrimenti utilizzati, costituendo al tempo stesso un problema non indifferente di inquinamento.

Scopo principale della presente invenzione è quello di fornire un procedimento chimico per la produzione di inibitore delle proteasi, eventualmente abbinato alla produzione di eparina, che risulti vantaggioso dal punto di vista industriale come rese e come costi, rispetto alle metodiche tradizionali.

Il procedimento secondo l'invenzione per l'estrazione di un inibitore di proteasi da organi animali che contengono tale inibitore, è caratterizzato dal fatto che comprende le seguenti operazioni: a) triturare detti organi animali; b) sottoporre detti organi triturati ad enzimolisi mettendoli a contatto, entro un veicolo acquoso, con almeno un enzima proteolitico non normalmente contenuto in detti organi animali ed inattivo verso l'inibitore di proteasi da estrarre; c) interrompere detta enzimolisi e raccogliere una soluzione acquosa di lisato sottoponendo a filtrazione il veicolo acquoso contenente detti organi triturati e detto almeno un enzima proteolitico; d) aggiungere una base ammonico-quaternaria a detta soluzione acquosa di lisato per ottenere la precipitazione di una frazione insolubile; e) eliminare per filtrazione detta frazione insolubile e raccogliere il filtrato che contiene l'inibitore, e 1) ricuperare detto inibitore delle proteasi da detto filtrato.

Dapprima, va considerato che l'inibitore delle proteasi non viene attaccato dai più svariati enzimi proteolitici come: la pepsina, la tripsina, la chimotripsina, la callicreina, la plasmi-na, l'elastasi, la collagenasi, le carbossi-peptidasi A e B, la ficàia, la papaina, e la bromelina (B. Kassell e Coll. J. Biol. Chem. 219,203 -H. Kraut e Coll. Z. Physiol. Chem. 334,236 e 348, 1498). Inoltre è stato riscontrato dagli stessi autori e dalla Richiedente, che, in particolare, la pepsina, la papaina e la fi-cina non vengono inibite dall'inibitore delle proteasi. Ora è noto che alcuni di questi enzimi proteolitici vengono impiegati nelle fasi di estrazione dell'eparina dai tessuti e organi che la contengono.

Come seconda considerazione si osserva che, sebbene l'inibitore sia solubile nelle varie miscele deproteinanti, questa so5

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lubilità risulta alternata in varia misura dalle stesse proteine, presenti nei normali estratti grezzi, che devono essere eliminate all'atto della purificazione per ridurre al minomo le possibili conseguenze anafilattogene. Nell'esteazione del peptide dagli organi che lo contengono sussisteva quindi il problema di eliminare l'interferenza delle proteine sulla solubilità dell'inibitore stesso, riducendo al tempo stesso i rischi dell'anafi-lassi.

Da ultimo, la Richiedente ha potuto constatare che l'impiego di detergenti cationici, come le basi d'ammonio quaternario, in determinate condizioni, consente la purificazione dell'inibitore da contaminanti polianionici quali i mucopolisacca-ridi, gli acidi nucleici e numerose sostanze a carattere pirogenetico; pertanto può risultare utile l'impiego di detti detergenti, oltre che per la purificazione, anche per ridurre i rischi di pirogenicità del prodotto finale.

Ora è noto che anche per la produzione industriale dell'eparina si fa uso dei detergenti cationici per isolare la sostanza dai brodi di estrazione che la contengono.

Dalle considerazioni precedenti apparirà senza dubbio chiaro come sussista un certo parallelismo tra la produzione di eparina secondo la tecnica anteriore e quella trovata e proposta dalla Richiedente per l'ottenimento dell'inibitore delle proteasi, sebbene l'ottenimento dell'inibitore delle proteasi abbia un interesse prevalente.

La presente invénzione permette inoltre di abbinare l'estrazione dell'eparina a quella dell'inibitore delle proteasi.

La Richiedente ha inoltre potuto constatare e ciò è confermato dagli esempi che seguono, che il procedimento oggetto della presente invenzione risulta vantaggioso per il fatto che rese di inibitore risultano sostanzialmente superiori a quelle dei procedimenti noti e al tempo stesso si realizzano miglioramenti nella purificazione ed eliminazione delle sostanze contaminanti.

È opportuno a questo punto precisare che un elenco più completo degli enzimi proteolitici che possono essere usati nel procedimento della presente invenzione può essere dedotto da B. Kassell, «Methods Enzymology», Voi. 19, pag. 848-850.

Considerando ora più dettagliatamente il procedimento della presente invenzione si deve osservare che:

1) L'enzima proteolitico usato nella fase di estrazione e so-lubilizzazione è un enzima che non viene inattivato dall'inibitore in questione; più particolarmente questo enzima è scelto nel gruppo comprendente papaina, ficina, bromelina, sia in forma isolata sia in materiali e tessuti che li contengono.

2) Nella interruzione della lisi si fa ricorso ai normali agenti deproteinanti e/o alla somministrazione di calore in modo da aumentare la temperatura della soluzione acquosa con le modalità ben note nella tecnica del ramo.

3) Per quanto riguarda le basi di ammonio quaternario, particolarmente vantaggioso è risultato l'uso di cetilpiridinio, e del cetil-trimetilammonio bromuro.

4) Per l'isolamento e la purificazione dell'inibitore, dopo la separazione di eparina e mucopolisaccaridi, si fa ricorso ad una acidificazione con acido tricloroacetico al 2-5%, con successivo frazionamento per aggiunta di solfato di ammonio fino ad una concentrazione compresa tra 0,45 e 0,9 di quella di saturazione.

L'ulteriore purificazione dell'inibitore può essere condotta per frazionamento alcoolico e/ o acetonico e gel filtrazione o gel cromatografia, secondo tecniche convenzionali.

Gli esempi che seguono hanno lo scopo di meglio illutrare il procedimento della presente invenzione.

Esempio 1

Kg 10 di polmone bovino macinato sono stati sospesi in 16 litri di acqua distillata. Dopo cauto riscaldamento della massa fino a 40°C, è stata aggiunta, sotto agitazione, una sospensione di 20 g di papaina in 4 litri di tampone citrato 0,25 M a pH 5,5 contenente 200 g di solfato di magnesio. La temperatura è stata regolata a 55 °C e la massa è stata mantenuta in queste condizioni per 4 ore. Quindi si è regolato il pH a 6,2 con aggiunta 5 di ammoniaca concentrata e si è riscaldata la massa a 90°C. Si è quindi filtrato il tutto per pressione scartando il residuo. Il liquido limpido è stato trattato con cetilpiridinio fino a completa flocculazione dei polianioni. Si è quindi proceduto alla filtrazione per raccogliere il precipitato, contenente eparina, io mentre il liquido è stato addizionato di acido tricloroacetico fino ad una concentrazione finale del 3%. Dopo 30 minuti si è filtrato nuovamente per pressione effettuando il lavaggio sul filtro con 4 litri di acido tricloroacetico al 3%. Si sono ottenuta così 32 litri di liquido limpido avente una attività di 610 U. I. 15 inibenti per cc (U. I.: unità di inibitore, cfr. Z. Physiol. Chem. 182,1 - 1930) pari ad una resa di 1,95 X 106 u. I. per kg di organo di partenza. Questa soluzione è stata poi sottoposta a frazionamento con solfato di ammonio fra 0,5 e 0,9 della saturazione raccogliendo il precipitato per centrifugazione. A questo 20 punto si sono ottenuti 85 g di precipitato contenente 1,9 X IO7 U. I. (ca. il 98% dell'attività totale ottenuta dalla lisi), mentre il contenuto in materiale proteico era del 36,5%, il che indica una purezza di 1,56 mcg per U. I. Le ulteriori purificazioni condotte su questo precipitato con i metodi noti nella tecnica 25 del ramo, hanno consentito di ottenere 465 cc di una soluzione apirogena avente un'attività di 32 000 U. I. per cc, un totale cioè di 1,49 x IO7 U. I., il che indica una resa del 76% rispetto all'attività iniziale. La purezza, riscontrata all'analisi del materiale proteico, è risultato di 0,143 mcg per U. I. 30 Una prova di confronto, su una corrispondente aliquota dello stesso organo macinato, mediante estrazione con alcool etilico al 70% in presenza di cloruro di calcio (cfr. brevetto tedesco 1 084 433) ha dato una resa di 0,875 X 106 u. I. per kg d'organo a livello di prodotto grezzo e di 0,322 X IO6 U. I. per 35 kg di organo, con purezza di 0,14 mcg perU. I., a livello purificato. Questi dati, confrontati con quelli ottenuti mediante la lisi papainica corrispondono a rese del 21,7% a livello del prodotto purificato e del 46% a livello del prodotto grezzo. Un'altra prova fatta sempre su una corrispondente aliquota dello 40 stesso organo macinato, applicando il procedimento descritto da B. Kassell su «Methods Enzymology», Voi. 19, pag. 845, ha dato una resa, in prodotto grezzo, di 1,020 X 106 U. I. per kg di organo e di 0,418 X IO6 U. I. per kg di organo, a livello di prodotto purificato. Questi dati confrontati con quelli ottenuti 45 mediante la lisi papainica corrispondono a rese del 53,6% a livello del prodotto grezzo e del 28% a livello del prodotto purificato.

Esempio 2

50 Si è proceduto come nell'esempio 1 sostituendo la papaina con la ficina. Le rese sono state 2,03 X 106 U. I. per kg di polmone a livello di prodotto grezzo e di 1,64 X 106 per kg di polmone a livello di prodotto purificato.

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Kg 5 di polmone bovino macinato sono stati sospesi in 8 litri di acqua e si sono aggiunti 2 litri di sospensione contenente 10 g di bromelina in tampone fosfato 0,1 M a pH 6 contenente l'l% di acido etilendiammino tetraacetico. Si è riscaldata cau-60 tamente la massa fino a 37 °C e in queste condizioni è stata mantenuta per 4 ore. Scaduto il tempo, si è elevata la temperatura fino a 90°C per 10 minuti. Successivamente si è filtrato per pressione lavando su filtro con 2 litri di acqua distillata. Il filtrato, dopo raffreddamento, è stato trattato con cetil-trime-65 tilammonio bromuro fino a completa flocculazione dei poli-anioni, che sono stati raccolti su filtro per la separazione dell'eparina. Il liquido filtrato limpido ha reso 16 litri con un'attività di 540 U. I. per cc il che corrisponde a una resa di

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1,735 X IO6 U. I. per kg d'organo di partenza. Si è quindi proceduto alla purificazione come citato nell'esempio 1. La resa finale del prodotto purificato è stata di 1,18 X 106 U. I. per kg di polmone. Una prova di confronto condotta mediante estrazione e frazionamento con solfato di ammonio, come descritto sul brevetto francese 1 566 777, ha dato una resa finale in prodotto purificato di 6,8 X 106 U. I. per kg di organo di partenza, il che corrisponde al 57,5% della resa ottenuta con la metodica descritta in questo esempio.

Esempio 4

Kg 2,5 di polvere di polmone bovino secca sono stati estratti secondo lo schema descritto nell'esempio 1. La resa finale è stata di 3,2 X IO6 U. I. per kg di polvere.

Esempio 5

Kg 2,5 di polvere di polmone bovino sono stati sospesi in 23,5 litri di acqua distillata. Dopo cauto riscaldamento fino a 40 °C, è stata aggiunta sotto agitazione, una sospensione di 40 g di pancreatina in 4 litri di tampone trietanolammina 0,2 M a pH 8 contenenti 30 g di cloruro di calcio. La temperatura è stata mantenuta a 40°C per 24 ore e quindi è stata innalzata a 90°C, dopo di che la massa è stata filtrata per pressione. Il filtrato è stato trattato successivamente come descritto nell'esempio 1. La resa finale è stata di 4,2 X IO6 U. I. per kg di polvere di polmone a livello di prodotto grezzo e di 2,8 X 106 U. I. per kg di polmone a livello di prodotto purificato.

Esempio 6

Kg 10 di polmone bovino sono stati sospesi in 16 litri di acqua bidistillata. Dopo cauto riscaldamento a40°C, sono stati aggiunti 500 g di pancreas bovino fresco, macinato e so-5 speso in 4 litri di tampone trietanolammina 0,2 M a pH 8, contenente 30 g di cloruro di calcio.

Si è proceduto poi come descritto nell'esempio 5. La resa finale è stata di 1,25 X 106 U. I. per kg d'organo, a livello di prodotte grezzo, e di 0,780 X 106 per kg d'organo a livello di io prodotto purificato.

Esempio 7

Litri 20 di estratto liquido di polmone, residuo dalla separazione di eparina mediante basi d'ammonio quaternario, 15 vengono acidificati con acido tricloroacetico fino a una concentrazione finale del 3%. Dopo 60 minuti si filtra per pressione e si lava su filtro con 5 litri di acido tricloroacetico al 3%.

Si sono ottenuti così 23,2 litri di liquido limpido contenente 352 U. I. inibenti per cc. Il liquido viene ora frazionato me-20 diante salatura con solfato d'ammonio, fra lo 0,45 e lo 0,9 della saturazione, e il precipitato viene raccolto per centrifugazione. Si ottengono cisì 41 g di precipitato aventi una attività totale di 7,9 X IO6 U. I. e un contenuto in sostanze proteiche del 31,5%, il che corrisponde ad una attività specifica di circa 25 1,63 mcg per U. I.

Ulteriori purificazioni, condotte su questo precipitato, hanno consentito di avere una soluzione apirogena contenente 36 000 U. I. per cc ed una resa finale di 5,7 x 106 u. I., cioè il 70% dell'attività contenuta totalmente nella materia prima. 30 L'attività specifica è risultata essere 0,141 mcg per U. I.

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Claims

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1. Procedimento per l'estrazione di un inibitore di proteasi da organi animali che contengono tale inibitore, caratterizzato dal fatto che comprende le seguenti operazioni: a) triturare detti organi animali; b) sottoporre detti organi triturati ad en-zimolisi mettendoli a contatto, entro un veicolo acquoso, con almeno un enzima proteolitico non normalmente contenuto in detti organi animali ed inattivo verso l'inibitore di proteasi da estrarre; c) interrompere detta anzimolosi e raccogliere una soluzione acquosa di lisato sottoponendo a filtrazione il veicolo acquoso contenente detti organi triturati e detto almeno un enzima proteolitico; d) aggiungere una base ammonico-qua-ternaria a detta soluzione acquosa di lisato per ottenere la precipitazione di una frazione insolubile; e) eliminare per filtrazione detta frazione insolubile e raccogliere il filtrato che contiene l'inibitore; ed f) ricuperare detto inibitore delle proteasi da detti filtrato.

2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che l'enzima proteolitico è scelto fra papaina, fici-na e bromelina.

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RIVENDICAZIONI

3. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto inibitore delle proteasi viene raccolto da detto filtrato che lo contiene acidificando il filtrato stesso con dal 2% al 5% di acido tricloroacetico e successivamente frazionando detto filtrato acidificato aggiungendogli solfato ammo-nico sino ad concentrazione di (NH4)2S04 compresa tra il 45% ed il 90% della concentrazione corrispondente alla saturazione a temperatura ambiente.

4. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detti organi animali sono polmoni di bovini.

5. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta enzimolisi viene condotta usando la papaina come enzima proteolitico, ad una temperatura di 60°C ± 2°C, ad un pH tra 5,0 e 6,0 e per un tempo non superiore a quattro ore.

6. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta enzimolisi viene condotta usando la bromelina come enzima proteolitico, ad una temperatura di 37°C ± 2°C, ad un pH tra 5,0 e 6,0 e per un tempo non superiore a quattro ore.

7. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta enzimolisi viene condotta usando la fici-na come enzima proteolitico, ad una temperatura di 60 °C ± 2°C, ad un pH fra 5,0 e 6,0 e per un tempo non superiore a quattro ore.

8. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta enzimolisi viene interrotta riscaldando detto veicolo acquoso contenente detti organi triturati e detto almeno un enzima proteolitico ad una temperatura di 90°C ed oltre.

9. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta base ammonico quaternaria è scelta fra cetilpiridinio e bromuro di trimetilammonio.

10. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto inibitore delle proteasi è inibitore della tripsina e della callicreina.

11. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la frazione insolubile ottenuta al termine dello stadio e) viene raccolta ed inviata ad un processo per l'estrazione dell'eparina.