CH618091A5 - Method for the attenuation of virulent feline rhinotracheitis virus and use of this virus for the production of a vaccine - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstände.

Infektiöse virale Katzen-Rhinotracheitis ist eine speziell bei Katzen auftretende, verbreitete, ernsthafte Erkrankung, die durch den Katzen-Herpesvirus verursacht wird. Dieses Virus ist der Erreger der viralen Katzen-Rhinotracheitis (FVR = «feline viral rhinotracheitis»). In der Literatur wird darauf hingewiesen, dass etwa die Hälfte der Infektionen der Atmungswege bei Katzen auf diese Krankheit zurückzuführen ist. Dieses Virus infiziert die Epithelzellen der Nase, des Rachens, der Luftröhre und der Augen und ruft dabei Epitheliolyse und Nekrose hervor. Die an den Augen auftretenden Symptome betreffen vor allem die Bindehaut, es kann sich jedoch auch ulzerative Keratitis entwickeln. Das Virus wird während der Krankheit aus Nase, Augen und Mund, ausgeschieden. Durch das FVR-Virus hervorgerufene Infektionen sind oft schwerwiegend und verlaufen insbesondere bei Jungtieren signifikant tödlich. Werden trächtige Katzen von dem Virus befallen, so kommt es zu Aborten oder generalisierten Infektionen bei den neugeborenen Tieren. Die Übertragung des FVR-Virus auf gegenüber dem Virus anfällige Katzen geschieht im allgemeinen durch intranasale Instillation, z. B. durch beim Niesen ausgestossene Tröpfchen oder durch direkten Kontakt, im allgemeinen von Nase zu Nase. Die Resistenz bei Tieren, die sich von einer natürlichen oder experimentiellen Infektion erholt haben, ist nur von kurzer Dauer (1 bis 3 Monate).

Das die Katzen-Rhinotracheitis hervorrufende Virus wurde zuerst von infizierten Katzen isoliert; vgl. R. A. Crandell und F. D. Maurer, Proc. Soc. Exptl. Biol. and Med., Bd. 97 (1958), S. 487. Die Bezeichnung Katzen-Rhinotracheitis (feline viral rhinotracheitis) wurde von R. A. Crandell und E. W. Despe-aux, Proc. Soc. Exptl. Biol. and Med., Bd. 101 (1959), S. 494,

vorgeschlagen. Seit dieser Zeit sind eine Reihe von Arbeiten erschienen, die die Isolierung des FVR-Virus von Katzen bestätigen. In diesen Arbeiten wird dieses Virus als der Gruppe der Herpesviren zugehörig identifiziert und ferner werden Transmission, Epidemiologie und histologische Eigenschaften dieser Krankheit beschrieben; vgl. J. L. Bittie et al., Amer. J. Vet. Res., Bd. 21 (1960) S. 547; R. A. Crandell et al., J.A.V.M. A„ Nd. 138 (1961) S. 191; J. Ditchfield und I. Gri-nyer, Virology, Bd. 26 (1965) S. 504; R. H. Johnson und R. G. Thomas, Vet. Ree., Bd. 79 (1966), S. 188; R. C. Povey, Vet. Ree., Bd. 82 (1969), S. 335; T. E. Walton und I. H. Gil-lespie, Cornell Vet., Bd. 60 (1970), S. 232; Colloquium Report, J.A.V.M.A., Bd. 157 (1970), S 2043; R. A. Crandell, J.A.V.M.A., Bd. 158 (1971), S. 922; und S. I. Bistner et al., J.A.V.M.A., Bd. 159 (1971), S. 1223. Ferner findet sich in «Advances in Veterinary Science and Comparative Medicine», Herausgeber C. A. Brandly und C. E. Cornelius, Academic Press, Inc., New York, 1973, Bd. 17, S. 201 bis 224, ein Übersichtsartikel von R. A. Crandell mit der Kapitelüberschrift «Feline Viral Rhinotracheitis (FVR)».

In der Literatur wird über eine Reihe von Versuchen berichtet, eine Vaccine gegen das FVR-Virus herzustellen. Keiner dieser Versuche hat jedoch zum Erfolg geführt. Povey und Johnson, J. Small Anim. Pract., Bd. 11 (1970), S. 490, berichten, dass Immunisierungsversuche durch intramuskuläre Verabfolgung einer nicht-attenuierten FVR-Virus-Vaccine fehlschlugen. Obgleich diese Autoren beobachteten, dass sich bei Versuchskatzen bei Verwendung von FVR-Virus-Vaccinen, die durch Behandlung mit Formalin und /3-Propiolacton inaktiviert waren, Erfolge erzielen Hessen, mussten sie jedoch feststellen, dass mit Hilfe dieser Vaccinen kein signifikant verminderter Krankheitsbefall bei Katzenkolonien erreicht werden kann. Bisher gibt es somit keine wirksamen Vaccinen zum Schutz von Katzen gegen das FVR-Virus.

Aufgabe der Erfindung war es daher, eine Vaccine gegen Katzen-Rhinotracheitis zur Verfügung zu stellen.

Es wurde erfindungsgemäss festgestellt, dass das FVR- Virus auf Katzengewebekulturen, vorzugsweise Nieren- und Zungengewebekulturen attenuiert werden kann und dass die Virulenz des Virus so verändert und vermindert werden kann, dass nach parenteraler Inokulation keine Krankheitssymptome mehr auftreten.

Demzufolge wird erfindungsgemäss ein modifizierter oder attenuierter Stamm von lebenden FVR-Viren zur Verfügung gestellt, der bei parenteraler, vorzugsweise intramuskulärer Verabreichung an Katzen eine Immunisierung gegen die virulente Katzen-Rhinotracheitis bewirkt, und zwar nach dem in Anspruch 1 definierten Verfahren.

Ferner wird erfindungsgemäss eine Vaccine zur Verfügung gestellt, die in einem solchen Ausmass attenuiert ist, dass bei ihrer Anwendung eine Antikörperreaktion hervorgerufen wird, die zu einer Langzeitimmunisierung von Katzen ausreicht.

Die erfindungsgemässe hergestellte Vaccine erlaubt eine sichere Anwendung und verursacht bei Katzen nach parenteraler Verabfolgung keine Erkrankung. Ausserdem findet keine Übertragung des modifizierten FVR-Virus von geimpften Tieren auf andere, mit diesen in Kontakt kommende Tiere statt. Dadurch wird die Möglichkeit einer erhöhten Virulenz des Virus nach einer Tierpassage ausgeschlossen. Dies stellt einen wesentlichen Vorteil zur Bekämpfung der viralen Katzen-Rhi-notracheitis dar.

Lebende, virulente FVR-Viren lassen sich nach üblichen Verfahren von mit viraler Katzen-Rhinotracheitis befallenen Katzen isolieren und sodann auf übliche Weise identifizieren; [vgl. R. A. Crandell und F. D. Maurer, Proc. Soc. Exptl. Biol. und Med., Bd. 97 (1958), S. 487; J. L. Bittie et al., Amer. J. Vet. Res., Bd. 21 (1960), S. 547 und J. Ditchfield und I. Gri-

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nyer, Virology, Bd. 26 (1965), S. 504]. Im allgemeinen wird das Virus durch Abtupfen der Nasen- und Bindehautmembranen von infizierten Katzen mit einem feuchten, sterilen, Wattetupfer gewonnen. Anschliessend wird das Virus in ein geeignetes Züchtungsmedium mit Katzengewebe gebracht. Zur Re-plikation und Isolation wird das Virus Standardserienpassagen unterworfen. Ein bevorzugt verwendetes Medium erhält man aus kortikalem Nierengewebe von 8 bis 12 Wochen alten Kätzchen, das gemäss dem von J. Youngner (Proc. Soc. Exptl. Biol. and Med., Bd. 85 (1954), S. 202, für Affennierenzellen beschriebenen Verfahren trypsinisiert worden ist.

Bezüglich der erfindungsgemässen Herstellung der Vaccinen wurde festgestellt, dass sich die Attenuierung und Modifikation des virulenten FVR-Virus leicht erreichen lässt, indem man relativ wenige, mindestens 7 Serienpassagen in Katzengewebe bei Inkubationstemperaturen von 30 ±2° vorzugsweise etwa 32° C, durchführt. Die Reinigung des Viruspräparats kann mit Hilfe von Standard-Grenzverdünnungen, beispielsweise nach dem Röhrchen- oder Plaqueverfahren, während oder anschliessend an die Serienpassagen durchgeführt werden.

Das FVR-Virus kann beispielsweise in folgenden Katzengewebe-Züchtungssystemen attenuiert werden: Lungen-, Hoden-, Nieren-, Thymus-, Zungen- und embryonalem Fetusgewebe, ferner Zelllinien, z. B. die Katzennieren-Zelllinie nach Crandell (CrFK), Katzenzungenzellen auf der Stufe der dritten Passage (Fc3Tg) und die Katzen-Neurofibrosarkom-Zelllinie (FNFS). Katzenzungen-Zellinien werden besonders bevorzugt.

Die Dauer der Passagen wird so gewählt, dass eine ausreichende Replikation des Virus zwischen den Passagen möglich ist, Bevorzugt werden Zeiträume von 2 bis 7 Tagen. Die optimale Dauer der Passagen lässt sich leicht nach üblichen Verfahren bestimmen, beispielsweise durch zytopathische Beobachtungen, in dem man z. B. das Virus während einer bestimmten Passage bis zu einem Stadium wachsen lässt, nach dessen Erreichen bei andauernder Inkubation ein starker zyto-pathischer Effekt (CPE) beobachtet werden kann.

Die Tatsache, dass man bei den angegebenen niederen Temperaturen zu wertvollen Vaccinen gelangt ist überraschend in Hinblick auf die bekannte Tatsache, dass das Virus bzw. dessen Pathogenität bei Serienpassagen in Katzengewebe bei üblichen Inkubationstemperaturen von etwa 35 bis 37° C sich nicht verändert und zwar auch nach Durchführung von 100 Passagen; vgl. R. A. Crandell, J.A.V.M.A., Bd. 158 (1971), S. 922. Wie sich beispielsweise aus nachfolgendem Beispiel 2 ergibt, lässt sich erfindungsgemäss die Modifikation des Virus durch Serienpassagen bei niedrigeren Inkubationstemperaturen erreichen.

Das oben genannte neue Verfahren zum Attenuieren von virulenten Katzen-Rhinotracheitis-Viren (FVR-Viren), aus denen sich InjektionsVaccinen zur Immunisierung von Katzen gegen virale Katzen-Rhinotracheitis herstellen lassen, wird beispielsweise so ausgeführt, dass man ein Inokulum mit dem virulenten FVR-Virus in ein flüssiges Katzengewebe- Nährmedium, das für das Virus nicht toxisch ist, einbringt, das Virus durch 2- bis 7tägige Inkubation bei 30 ± 2° C attenuiert und anschliessend ein Inokulum des Virus abtrennt und dieses weiteren Serienpassagen an anderen Katzengewebekulturen unterwirft, wobei insgesamt mindestens 7 Passagen vorgenommen werden.

Die erfindungsgemäss hergestellten Viruspräparate können zur Einstellung ihrer Wirksamkeit verdünnt werden. Ausserdem können sie mit Stabilisatoren, wie Dextrose und Lactose, oder anderen nicht-toxischen Substanzen versetzt werden. Die Viruspräparate können auch in getrocknetem Zustand, beispielsweise gefriergetrocknet, gelagert und anschliessend zu flüssigen Vaccinen formuliert werden. Stabilisatoren, die beim Gefriertrocknen von Viren Verwendung finden, wurden von

W. A. Rightsel et al., Cryobiology, (1967), 3, S. 423 und D. Greiff et al., Advances in Freeze Drying, Herausgeber L. Rey, Hermann, Paris, 1966, S. 103 bis 122, angegeben. Ferner können die Vaccinen im Gemisch mit anderen immunogenen Kat-zenvaccinen verwendet werden. Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Eine Probe von lebenden, virulenten FVR-Viren, die gemäss dem von J. L. Bittie, Amer. J. Vet. Res., Bd. 21 (1960), S. 547, angegebenen Verfahren gezüchtet und isoliert worden ist, wird auf eine einschichtige Zellkultur einer diploiden Katzenzungen-Zelllinie in Gewebekulturröhrchen der Abmessungen 16 x 125 mm gegeben. Die Zellkulturröhrchen werden folgendermassen vorbereitet:

Als Zungen-Zellinie wird die Fe3Tg-Linie verwendet, die von K. M. Lee et al., Cornell Veterinarian, Bd. 59 (1969), S. 539, beschrieben worden ist. Jedes Röhrchen enthält 1 bis 2 ml eines Wachstumsmediums, das aus Eagle-Minimalmedium (MEM) besteht, das mit 10% fetalem Kälberserum, 0,1% Lac-talbuminhydrolysat, 30 Einheiten Penicillin, 30 /<g Streptomy-cin und 2,5 /.ig Amphotericin versetzt ist. Pro Röhrchen wird jeweils 1 ml der Katzenzungenzellen (200 000 Zellen/ml) zugegeben. Gegebenenfalls wird der pH-Wert mit Natriumbicar-bonat auf 7,2 bis 7,8 eingestellt. Man lässt die Zellen in den Röhrchen bei etwa 35 ± 2° C solange wachsen, bis eine einschichtige Zellkultur erreicht ist. Die Flüssigkeit wird sodann abgegossen. Hierauf werden 1 bis 2 ml eines Erhaltungsmediums zugegeben, das die gleiche Zusammensetzung wie das vorgenannte Medium aufweist, mit der Ausnahme, dass 1 bis 2% fetales Kälberserum verwendet werden. Pro Viruspassage werden etwa 4 bis 6 dieser Röhrchen eingesetzt.

Jedes Gewebekulturrörchen wird mit dem FVR-Virus-Ino-kulum versetzt. Die so angeimpften Röhrchen werden bei einer Temperatur von 30± 2° C stehengelassen, bis sich unter dem Mikroskop ein cytopathischer Effekt (CPE) beobachten lässt (nach etwa 2 bis 7 Tagen). Wenn der CPE etwa 75 bis 90% der einschichtigen Zellkultur erreicht, wird der Inhalt des Röhrchens geerntet und Proben von jeweils 0,2 ml des Inoku-lums werden weiteren 6 identischen Serienpassagen (insgesamt 7 Passagen) unterworfen. Nach der 7. Passage wird eine Stan-dard-Grenzverdünnungsreinigung unter Verwendung von Eagle-Minimalmedium (MEM), das mit den vorgenannten Antibiotika (kein Serum) ergänzt ist, als Verdünnungsmittel durchgeführt, wobei die Inkubationstemperatur auf 30±2° C gehalten wird. Nach 7 Tagen wird das letzte Röhrchen, das mit 75 bis 90% CPE positiv reagiert, geerntet, dieses ganze Verfahren wird zweimal mit insgesamt 10 Passagen wiederholt. Schliesslich wird eine 11. Passage mit dem Zweck der Volumenver-grösserung durchgeführt, indem man eine 0,5 ml-Probe von der 10. Passage auf Kolben überimpft, die einschichtige Zellkulturen von diploiden Katzenzungen-Zellkulturen enthalten, die durch die vorbeschriebene Vermehrung von Zungenzellen erhalten worden sind. Nach der 11. Passage wird die Gesamtmenge geerntet, identifiziert und nach üblichen Verfahren titriert.

Die so erhaltene Vaccine kann je nach ihrem Titer verdünnt werden oder mit Stabilisatoren oder anderen nichttoxischen Substanzen versetzt werden. Gegebenenfalls kann die Vaccine getrocknet oder in flüssiger Form verwendet werden. Zur Vermehrung und Attenuierung des Virus können alle nichttoxischen, flüssigen Gewebekultur-Nährmedien verwendet werden. Ausser dem vorgenannten, mit Zusätzen versehenen Eagles- Minimalmedium (MEM) können auch andere nichttoxische, flüssige Gewebekultur-Nährmedien verwendet werden.

1 ml der wie oben hergestellten Vaccine, die bei 35 ± 2° C auf einen Virustiter von 104'5 TCIDS0 /ml (50%-Wert der «tis-sue culture infective dosis»; bestimmt durch den CPE) titriert

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worden war, wird intramuskulär an drei empfindliche Katzen verabfolgt. Zwei weitere Katzen dienen als nichtgeimpfte Kontrolltiere. Bei sämtlichen 5 Katzen ist vorher festgestellt worden, dass sie gegenüber dem FVR-Virus seronegativ sind. Die Krankheit (FVR) lässt sich im allgemeinen etwa nach dem 4. bis 9. Tag nach dem normalen Kontakt oder der Challenge mit dem virulenten FVR-Virus beobachten. Am 4. Tag nach der Impfung wird ein Rachenabstrichtest durchgeführt, der bei allen 5 Katzen negativ verläuft, was zeigt, dass kein Virus ausge-stossen wird. Der Antikörpertiter von allen 5 Katzen ist vor der Impfung kleiner als 1:2, Ein Monat später, unmittelbar vor der Challenge, beträgt der Antikörpertiter der 3 geimpften Katzen durchschnittlich 1:18 im Vergleich zu weniger als 1:2 bei den 2 nicht geimpften Kontrolltieren. Ein Monat nach der Impfung werden alle 5 Katzen intranasal mit virulentem FVR-Virus infiziert, wobei in jedes Nasenloch Viruströpfchen gegeben werden (etwa 10 000 bis 20 000 TCIDS0/Katze). Die Katzen werden 2 Wochen lang beobachtet. Bei den 3 geimpften Katzen treten keine Krankheit oder Krankheitssymptome auf. Im Gegensatz dazu erkranken die 2 nicht geimpften Kontrolltiere schwer an der FVR-Krankheit und zeigen die typischen Symptome, wie Fieber, tränende Augen, laufende Nasen, fehlender Appetit und allgemeines Unwohlsein. 2 Monate nach der Challenge ist der Antikörpertiter von allen 5 Tieren etwa gleich hoch (1:54), was anzeigt, dass die geimpften Tiere geschützt sind und die Kontrolltiere erfolgreich infiziert worden sind.

Beispiel 2

Lebende, virulente FVR-Viren werden gemäss dem von J.L. Bittie et al., a.a.O., beschriebenen Verfahren gezüchtet und isoliert. Das dabei isolierte Produkt, das von den genannten Forschern mit «F—2» bezeichnet worden ist, wird 37 aufeinanderfolgenden Serienpassagen in primären Katzennieren-Gewebekulturen in Rollröhrchen unterzogen. Die Zeiträume betragen jeweils 2 bis 7 Tage. Es werden die von Bittie et al. beschriebenen Züchtungsmedien verwendet. Die Inkubationstemperaturen liegen bei 35 bis 37° C. Nach der 37. Passage stellt sich heraus, dass das Virus einen hohen Anteil seiner Pathogenität behalten hat und daher für Immunisierungszwecke ungeeignet ist. Jedoch lässt sich eine Attenuierung des Virus unter Gewinnung einer geeigneten Vaccine durch anschliessende Passagen bei niedrigeren Inkubationstemperaturen erreichen. Demzufolge werden anschliessend an die 37. Passage 44 weitere Serienpassagen (insgesamt 81 Passagen) bei Inkubationstemperatur von etwa 32° C durchgeführt.

Ein 0,2 ml-Inokulum von der 81. Passage mit einem Titer von Iqs.o xCID50/ml, berechnet nach dem Reed-Muench-Verfahren, wird anschliessend auf einschichtige Zellkulturen von diploiden Katzenzungen-Zellinien in Gewebekulturröhrchen der Abmessungen 16 x 125 mm gegeben. Gemäss Beispiel 1 werden 7 weitere Serienpassagen und anschliessend 3 Grenzverdünnungen und eine Passage zur Volumensteigerung durchgeführt, so dass sich eine Gesamtzahl von 11 Serienpassagen ergibt. Nach der 11. Passage wird die gesamte Rohvaccine geerntet, identifiziert (durch Serum-Neutralisationstest mit spezifischem FVR-Ziegen-Antiserum) und titriert.

1 ml der gemäss Beispiel 2 hergestellten Vaccine mit einem Titer von 105,4 TCIDS0/ml bei 35° C (bestimmt durch den CPE), wird intramuskulär an drei empfindliche Katzen, die gegenüber dem FVR-Virus seronegativ sind, verabfolgt. Zwei weitere Katzen dienen als nicht geimpfte Kontrolltiere. Am 4. Tag nach der Impfung ergibt ein Rachenabstrich bei allen 5 Katzen ein negatives Ergebnis, was zeigt, dass keine Viren abgeschieden werden. Zwei Wochen nach der ursprünglichen Impfung erhält eine der drei geimpften Katzen auf intramuskulärem Wege eine zweite 1 mllnjektion. Ein Monat nach der Erstimpfung werden alle 5 Katzen intranasal mit virulentem FVR-Virus infiziert. Dabei werden Viruströpfchen in jedes

Nasenloch verabfolgt (10 000 bis 20 000 TCID50/Katze). Während der nächsten zwei Beobachtungswochen zeigen die drei geimpften Katzen keine Veränderungen im Gegensatz zu den zwei nicht geimpften Katzen, bei denen die Sympthome der FVR-Krankheit aufreten. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass durch eine Impfung mit der Vaccine eine minimale Antikörperreaktion hervorgerufen wird, während durch zwei Impfungen eine wesentlich stärkere Reakton erreicht wird. Folgende Antikörpertiter werden beobachtet:

Tabelle I

Antikörperreaktion

Vor der 1 Monat nach 2 Monate nach Impfung der Impfung der Challenge

Kontrolltier 1 0 0 1:54

Kontrolltier 2 0 0 1:54

Katze A 0 1:18 1:54

Katze B 0 1:18 1:54

Katze C* 0 1:54 1:162

* Die Katze C erhielt 2 Wochen nach der 1. Injektion eine 2. 1-ml-Injektion.

Beispiel 3

Grössere Mengen an Vaccinematerial werden nach der 11., in Beispiel 2 beschriebenen Passage an Katzenzungenzellen hergestellt, wobei das gleiche Verfahren in den dort beschriebenen Kolben mit insgesamt 17 aufeinanderfolgenden Serienpassagen an Katzenzungenzellen durchgefürt wird.

500 ml des nach der 7. Passage erhaltenen Virusmaterials werden zu 500 ml N—Z-Amin-Lactose-Glutamat-Stabilisator gegeben und anschliessend in Standard-Vaccinampullen (Titer 104'6 TCIDso/ml) verteilt. Anschliessend wird auf übliche Weise gefriergetrocknet. Für Impfzwecke werden die Ampullen jeweils mit 1 ml pyrogenfreiem, sterilem, destilliertem Wasser versetzt. An zwei empfindliche Katzen wird jeweils

1 ml der auf diese Weise hergestellten Vaccine auf intramuskulärem Wege verabfolgt. Eine weitere nicht geimpfte Katze dient als Kontrolltier. Eine Woche später erhalten die beiden geimpften Katzen auf intramuskulärem Wege eine identische Verstärkungsdosis. 9 Monate nach der Erstimpfung werden alle drei Katzen intranasal mit virulentem FVR-Virus infiziert. Dazu werden in jedes Nasenloch Viruströpfchen eingebracht (10 000 bis 20 000 TCID 50/Katze). Die Katzen werden anschliessend 13 Tage beobachtet. Die beiden geimpften Katzen zeigen an 2 von den insgesamt 13 Tagen leichte Symptome, während das nicht geimpfte Kontrolltier an 6 von 13 Tagen schwere Krankheitssymptome zeigt. Ein Jahr nach der Erstimpfung werden alle 3 Katzen wieder wie beim ersten Mal mit FVR-Virus infiziert, wobei keiner der Katzen die Krankheitssymptome auftreten. Daraus ergibt sich, dass bei den geimpften Katzen eine Langzeitwirkung eintritt. Die Tatsache, dass bei dem nicht geimpften Kontrolltier nach der 2. Challenge die Krankheitssymptome ausblieben, war zu erwarten, da auf Grund der durch die 1. Challenge hervorgerufenen natürlichen Infektion Immunität eintrat.

Ein weiterer Beweis für die Langzeitwirkung der Vaccinen ergibt sich aus der folgenden Ein-Jahres-Challenge-Untersu-chung. Jeweils 1 ml der gemäss Beispiel 3 hergestellten Vaccine wird intramuskulär an 8 empfindliche Katzen verabfolgt.

4 nicht geimpfte Katzen dienen als Kontrolltiere. Alle 12 Kat zen erweisen sich bei einem vorhergehenden Test als seronega tiv gegenüber dem FVR-Virus. Eine Woche später erhalten die 8 geimpften Katzen eine identische Verstärkungsdosis auf intramuskulärem Wege. Ein Jahr nach der Erstimpfung erhalten 3 Katzen eine dritte identische Verstärkungsdosis auf intramuskulärem Wege. 5 Tage später werden alle 8 Katzen in-

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tranasal mit virulentem FVR-Virus infiziert. Dazu werden Viruströpfchen in jedes Nasenloch gebracht (10 000 bis 20 000 TCIDS0/Katze). Anschliessend werden die Katzen 13 Tage beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt:

Tabelle II

Klinische Symptome Stärke der am Tag Nr. Symptome

Kontrolltier 1

9

stark

Kontrolltier 2

8

stark

Kontrolltier 3

8

stark

Kontrolltier 4

9

stark

Katze A

3

leicht

Katze B

3

leicht

Katze C

4

leicht

Katze D

1

leicht

Katze E

6

leicht

Katze F*

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keine

Katze G*

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keine

Katze H*

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* Die Katzen F, G und H erhielten zwei Verstärkungsimpfungen.

Neben der vorbeschriebenen Herstellung der Vaccinen aus lebenden virulenten FVR-Viren, die aus infizierten Katzen erhalten werden, betrifft die Erfindung auch die Herstellung von FVR-Vaccinen unter Verwendung von FVR-Viren, die nach dem vorbeschriebenen Verfahren modifiziert worden sind. Vom wirtschaftlichen Standpunkt aus ist es unzweckmässig, zur Herstellung der Vaccinen jeweils als Ausgangsmaterial das lebende, virulente, FVR-Virus, das von infizierten Katzen gewonnen wird, zu verwenden, und es anschliessend der nötigen Anzahl von Serienpassagen zu unterwerfen, wodurch schliesslich das zur Verwendung in Vaccinen geeignete modifizierte Virus erhalten wird. Deshalb betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung von FVR-Vaccinen, bei dem als Ausgangsvirus ein bereits durch Serienpassagen modifiziertes Virus verwendet wird. Dies bedeutet, dass ein Anzuchtvirus aus bereits attenuiertem Virusmaterial eingesetzt wird.

Demgemäss betrifft die Erfindung auch.ein Verfahren zur Herstellung einer Vaccine gegen virale Katzen- Rhinotracheitis, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen auf die vorbeschriebene Weise attenuierten FVR-Virus durch eine ausreichende Anzahl von Serienpassagen bei Inkubationstemperaturen von 32 bis 37° C in einem flüssigen Katzengewebe-Nährmedium, das für das Virus nicht toxisch ist, solange vermehrt, bis das Medium 104 bis 107 TCID (infektiöse Dosis) des attenuierten Virus pro ml enthält, und anschliessend für flüssige Vaccine erntet.

Nach den hier beschriebenen Verfahren kann das modifizierte FVR-Virus leicht in grossen Mengen und grossen Konzentrationen gezüchtet werden. Bei Verwendung des auf Katzengewebekulturen vermehrten, modifizierten FVR-Virus in Konzentrationen von mindestens etwa 104, im allgemeinen etwa IO4 bis 107 und vorzugsweise etwa 104'5 bis 106'0 TCID des Virus pro 1,0 ml der endgültigen Vaccine ergibt sich bei parenteraler Verabfolgung von jeweils 1 ml an Katzen ein Stimulation der Bildung von schützenden FVR-Antikörpern, vergleichbar mit den Antikörpern, die bei natürlichen Infektionen gebildet werden, ohne dass aber die üblichen pathologischen Symptome von viraler Katzen-Rhinotracheitis auftreten. Die geimpften Katzen erweisen sich also gegen eine Infektion (Challenge) mit dem krankheitserregenden Virus resistent.

Eine deutlich erhöhte Antikörperreaktion lässt sich bei parenteraler Verabfolgung einer zweiten und sogar einer dritten oder weiteren Verstärkungsdosis der Vaccine beobachten. Beispielsweise wurde festgestellt, dass durch eine zweite intramuskuläre Injektion, die eine Woche nach der Erstimpfung vorgenommen wird, günstige Ergebnisse erzielt werden. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, ist es zu empfehlen, die zweite Injektion nicht früher als etwa 2 bis 3 Wochen nach der ersten Injektion vorzunehmen. Ausgezeichnete Ergebnisse lassen sich bei Vornahme einer Verstärkungsdosis bis zu 12 Monaten nach der Erstimpfung erzielen.

Ferner wurde festgestellt, dass die Verstärkung der Antikörperbildung ausser durch die vorerwähnte parenterale Verabfolgung von Verstärkungsdosen der Vaccinen auch dadurch erreicht werden kann, dass man Katzen, die vorher durch parenterale Verabfolgung der Vaccinen immunisiert worden sind, intranasal mit dem FVR-Virus infiziert, wobei entweder ein nach dem erfindungsgemässen Verfahren modifiziertes FVR-Virus oder ein nicht-modifiziertes, virulentes Virus verwendet wird.

Diese intranasale Instillation anschliessend an die parenterale Impfung erzeugt einen signifikant höheren Antikörperspiegel, der lange anhält. Ausserdem erweist sich der Schutz der so behandelten Tiere bei Infektion mit virulentem Virus als stärker, wie sich daraus ergibt, dass nach Infektion mit 250 000 TCIDS0/Katze des virulenten, nicht modifizierten FVR-Virus keine klinischen Krankheitssymptome auftreten. Zur Erzielung optimaler Ergebnisse wird empfohlen, eine ausreichende Zeit verstreichen zu lassen, um die Katze nach der parenteralen Erstimpfung zu sensibilisieren, damit wenigstens ein Mindestmass an Immunität erreicht wird, wie sich durch erhöhte Antikörperbildung zeigt, bevor das Tier dem anschliessenden intranasalen Kontakt mit FVR-Virus unterzogen wird. Vorzugsweise wird die internasale Instillation 2 bis 4 Wochen nach der ursprünglichen parenteralen Impfung vorgenommen, wenngleich sich auch gute Ergebnisse erzielen lassen, wenn die Instillation bis zu 12 Monaten nach der parenteralen Impfung erfolgt.

Intranasale Instillation wird leicht durch Inhalation des FVR-Virus erreicht, indem man entweder herkömmliche Äro-solpräparate in die Nasengänge sprüht oder Tröpfchen in die äusseren Nasenlöcher oder in die Nasengänge bringt. Eine entsprechende Konzentration des FVR-Virus entweder nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren modifiziert, oder in seiner lebenden, virulenten, nicht attenuierten Form) zur intranasalen Instillation anschliessend an die Erstimpfung durch parenterale Verabfolgung beträgt etwa IO3 bis 106 TCID/ml.

Die Erstimpfung auf parenteralem Wege unter nachfolgendem Kontakt mit FVR-Virus (modifiziert oder nicht) über die Atmungswege stellt ein neues Verfahren zur Immunisierung gegen virale Katzen-Rhinotracheitis dar. Dadurch wird beim Tier eine humorale Antikörperreaktion und eine lokale Immunität des Atmungstraktes hervorgerufen, so dass ein besserer Schutz gegen diese Krankheit erreicht wird. Es wird somit auf diese Weise ein wirksamer, langdauernder Schutz gegen die virale Katzen-Rhinotracheitis erreicht.

Jeweils 1 ml der gemäss Beispiel 2 hergestellten Vaccine mit einem Virustiter bei 35° C und 105'4 TCIDS0/ml wird intramuskulär an drei empfindliche Katzen verabfolgt, von denen zuvor festgestellt worden war, dass sie gegenüber dem FVR-Virus seronegativ sind. Zwei weitere Katzen werden als nichtgeimpfte Kontrolltiere verwendet. 11 Tage nach der Erstimpfung wird einer der drei geimpften Katzen eine zweite 1 ml-In-jektion auf intramuskulärem Wege verabfolgt. Etwa 1 Monat nach der Erstimpfung werden alle drei geimpften Katzen und die beiden nicht geimpften Kontrolltiere einer intranasalen Instillation mit einem entsprechend verdünnten Viruspräparat des lebenden, virulenten FVR-Virus unterzogen. Dabei wird der Kopf der Katzen nach rückwärts gehalten, und Virustropfen mit insgesamt 250 000 TCIDS0 werden unter Verwendung

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einer 26 «gauge»-Nadel und -Spritze in die Nasenlöcher eingebracht, Die in Tabelle III zusammengestellten Ergebnisse zeigen eine signifikant höhere Antikörperreaktion und das Fehlen von klinischen Krankheitssymptomen, wenn das Virus auf intranasalem Wege anschliessend an eine parenterale Impfung verabfolgt wird.

Tabelle III Antikörperreaktion sind in Tabelle IV zusammengestellt. Man ersieht daraus, dass durch die Kombination aus parenteraler Impfung und intranasaler Verabfolgung eine Langzeitwirkung erreicht wird.

Tabelle IV Antikörperreaktion

Titer bei der intranasalen

Titer nach der intranasalen

Klinische Symptome nach

10

Instillation

Instillation*

der intranasalen

Titer bei der

Titer nach der

Klinische

Instillation

intranasalen intranasalen

Symptome nach

Instillation

Instillation**

der intranasalen

Katze A

1:

:15

1:290

mild

Instillation

Katze B

1:

: 15

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mild

Katze C

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:7

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Katze A*

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Katze D

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Katze B

1:18

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Katze E**

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Katze C

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keine

Katze F**

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:46

1:290

keine

Kontrolltier 1

<1:2

1:54

stark

Katze G**

1

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sehr mild

Kontrolltier 2

<1:2

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stark

Kontrolltier 1

<1

:2

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Kontrolltier 2

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stark

* Die Katze A erhielt zwei Injektionen.

** Die Messungen wurden 1 Monat nach der intranasalen Instillation durchgeführt.

Jeweils 1 ml-Injektionen der gemäss Beispiel 3 hergestellten Vaccine (Titer 104,6 TCIDSo/ml werden auf intramuskulärem Wege an 7 empfindliche Katzen verabfolgt, von denen vorher festgestellt worden ist, dass sie gegenüber dem FVR-Virus seronegativ sind. 15 Tage danach erhalten alle 7 Katzen eine zweite ähnliche Injektion. Drei der geimpften Katzen erhielten 5 Tage vor der intranasalen Instillation mit Lebendvirus eine identische dritte Injektion. Zwei weitere Katzen werden als nicht geimpfte Kontrolltiere verwendet. Etwa ein Jahr nach der Erstimpfung erhalten alle sieben geimpften Katzen und die zwei nicht geimpften Kontrolltiere eine intranasale Instillation eines entsprechend verdünnten Viruspräparats mit lebendem, virulentem FVR-Virus. Dabei werden jeder Katze in die Nasenlöcher 250 000 TCID verabfolgt. Die Ergebnisse

30

35

* Die Messungen wurden 6 Wochen nach der intranasalen Instillation vorgenommen

** Diese Katzen erhielten insgesamt 3 intramuskuläre Injektionen.

Jeweils 1 ml-Injektionen der gemäss Beispiel 3 hergestellten Vaccine (Titer 104,6 TCID50/ml) werden an zwei empfindliche Katzen verabfolgt, von denen vorher festgestellt worden ist, dass sie gegenüber dem FVR-Virus seronegativ sind. 15 Tage danach erhalten beide Katzen eine zweite ähnliche Injektion. Etwa 9 Monate nach der Erstimpfung wird beiden Katzen eine intranasale Instillation mit einem entsprechend verdünnten Viruspräparat mit lebendem, virulentem FVR-Virus verabfolgt. Jede Katze erhält Viruströpfchen in die Nasenlöcher mit insgesamt 100 000 TCID pro Katze. 3 Monate später werden sämtliche Katzen auf intranasalem Wege mit 250 000 TCIDso/Katze Lebend-FVR-Virus infiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengestellt:

Tabelle V

bei

Antikörper

Antikörper klinische

Antikörper

titer der titer zur

Symptome titer

intranasalen

Zeit der

14 Tage

6 Wochen

Instillation

Challenge nach der nach der

Challenge

Challenge

Katze A

1:7

1:45

keine

1:138

Katze B

1:7

1:66

keine

1:96

Die letzten drei Versuche zeigen, dass man eine Langzeit-Immunisierung gegen FVR bei Katzen erreichen kann, wenn man zunächst parenteral eine Vaccine mit mindestens etwa 104 TCID eines attenuierten FVR-Virus verabfolgt, der durch mindestens 7 zwei- bis siebentägige Serienpassagen an Katzengewebekulturen in einem flüssigen Nährmedium bei Inkubationstemperaturen von 30 ±2° C abgeschwächt worden ist, und anschliessend über den Atmungstrakt ca. 103 bis 106 TCID des FVR-Virus in lebender, virulenter, nicht attenuierter Form verabfolgt. Ähnliche Ergebnisse erhält man bei Verabfolgung 55 von ca. 103 bis 106 TCID des FVR-Virus, der erfindungsgemäss attenuiert worden ist, über den Atmungstrakt.

Claims (6)

618 091

1. Verfahren zum Attenuieren von virulentem Katzen-Rhinotracheitis-Virus, dadurch gekennzeichnet, dass man das Virus durch mindestens 7 Serienpassagen an Katzengewebe-kulturen in einer Nährflüssigkeit bei Inkubationstemperaturen von 30 ± 2° C attenuiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Inokulum von lebendem, infektiösem Katzen-Rhinotracheitis-Virus in ein flüssiges Nährmedium, das für das Virus nicht toxisch ist und lebende Katzenzungenzellen enthält, einführt, das Virus durch Inkubation bei Temperaturen von 30 ± 2° C 2 bis 7 Tage vermehrt und anschliessend davon ein Inokulum dieses Virus abtrennt und dieses weiteren Serienpassagen an anderen Katzenzungenkulturen unterwirft, wobei insgesamt mindestens 7 Passagen vorgenommen werden.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man lebendes, infektiöses Katzen-Rhinotracheitis-Virus bis zu einem Virustiter von mindestens IO4 TCID pro ml abschwächt und die flüssige Vaccine erntet.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Gewebekultur Katzenzungenzellen verwendet.

5. Attenuiertes Katzen-Rhinotracheitis-Virus, erhalten nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1.

6. Verwendung des attenuierten Katzen-Rhinotracheitis-Virus gemäss Anspruch 5, zur Herstellung einer Vaccine, dadurch gekennzeichnet, dass man das Virus Serienpassagen an Katzengewebekulturen in einer Nährflüssigkeit bei Inkubationstemperaturen von 32 bis 37° C unterwirft, bis ein Gehalt von 104 bis 107 TCID des attenuierten Virus pro ml erreicht worden ist, und die flüssige Vaccine erntet.