CH618345A5 - - Google Patents
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Description
L'invention a pour objet un procédé de préparation d'une forme pharmaceutique à base d'interféron.
L'interféron lui-même, ainsi que son activité thérapeutique, sont bien connus.
On rappelle qu'il s'agit d'une substance de nature protéique qui est synthétisée par la cellule et qui inhibe la réplication — c'est-à-dire la reproduction — intracellulaire d'une grande variété de virus antigéniquement distincts, ce grâce à quoi elle bloque toutes les manifestations lytiques ou cancérigènes desdits virus.
Il est également connu que l'exploitation pratique de l'effet thérapeutique de l'interféron est fortement entravée par la nécessité de disposer de grandes quantités d'interféron — nécessité due au fait que cette substance est facilement détruite par les cellules ou enzymes protéolytiques et qu'elle doit par conséquent être mise en œuvre en quantités importantes —, ce qui constitue un grave inconvénient du fait du caractère dispendieux de la fabrication de cette substance.
L'invention a pour but, surtout, de remédier à cet inconvénient et de fournir un procédé de préparation d'une forme pharmaceutique et, par conséquent, un médicament, autorisant la mise à profit sur un plan pratique des précieuses propriétés thérapeutiques de l'interféron.
La forme pharmaceutique obtenue selon le procédé de l'invention est constituée par de l'interféron insolubilisé par fixation sur un support constitué par du Polysaccharide.
Le nouveau médicament est constitué au moins partiellement par la susdite forme pharmaceutique.
L'interféron dans la nouvelle forme pharmaceutique est fixé sur un support par des liaisons covalentes, ce support ayant été activé préalablement par un halogénure de cyanogène.
D'autres caractéristiques apparaîtront dans le cours de la description qui suit et qui est relative à différents modes de réalisation illustrés par des exemples.
Comme il a été indiqué plus haut, de l'interféron, dont un exemple de préparation va être décrit ci-après, est insolubilisé par fixation sur un support, ce qui conduit à la forme pharmaceutique et, par conséquent, au médicament.
L'interféron utilisé peut être préparé au moyen des cellules de type L de souris ou cellules L.M. induites pendant 3 h par le virus de la maladie de Newcastle (N.D.V.) et dont le virus a été éliminé ensuite; ces cellules sont additionnées d'un milieu nutritif ne contenant pas de sérum, par exemple du milieu M.E.M. (minima essential milieu=milieu Eagle); au bout de 24 h, on prélève le liquide surnageant et on le maintient à pH 2 pendant 5 j ; le milieu ainsi obtenu contient l'interféron.
On trouvera de plus amples détails à propos de cette préparation dans le N° 3, vol. 132 de la publication «Proc. Soc. Exptl. Biol. and Med.», de décembre 1969.
On rapelle que l'interféron ainsi obtenu peut être mis en œuvre sur d'autres cellules du même type — dites cellules sensibles — chaque interféron étant spécifique à l'égard du type de cellules dont il provient.
Ainsi, pour le traitement de patients humains, on peut avoir recours à un interféron d'origine humaine. Cet interféron peut, par exemple, être produit à partir de leucocytes selon la technique décrite dans l'article d'Ernesto Falcoff, Rebecca Falcoff,
Françoise Fournier et Charles Chany («Annales de l'Institut Pasteur», tome 111, pp. 562-584, de novembre 1966) ou encore à partir de membranes amniotiques humaines, selon la technique de Françoise Fournier, Ernesto Falcoof èt Charles Chany («The Journal of Immunology», vol. 99, N° 5,1967).
L'interféron constitutif de la nouvelle forme pharmaceutique est fixé sur un support par liaisons covalentes et est ainsi insolubilisé.
Le support est avantageusement celui connu sous la marque Sépharose qui est constitué par un gel d'agarose.
La fixation par liaisons covalentes de l'interféron sur le Sépharose nécessite une activation préalable de celui-ci par un halogénure de cyanogène.
Cette activation peut être réalisée au moyen du bromure de cyanogène, la fixation de l'interféron étant réalisée avantageusement par mise en œuvre de la méthode de Porath qui va être décrite ci-après en référence à un exemple numérique.
Du Sépharose de type 4 B — sous la forme de billes d'une taille d'environ 0,1 mm — activé par le CNBr, est mis en suspension à la concentration de 5 g pour 500 ml de HCl 10-3M. Après gonflement, les billes sont lavées avec la même solution de HCl, puis lavées deux fois avec 300 ml de tampon de bicarbonate de sodium 0,1 M, ajusté à pH 8 et contenant 0,5M de NaCl (ci-après appelé tampon A).
On obtient ainsi 17 ml de gel Sépharose tassé, qui est suspendu dans 30 ml de la susdite solution d'interféron (préparée selon la méthode sus-référencée, et dialysée pendant 18 h à 4°C, sur tampon A) contenant 105 unités de référence par ml (Institute of Health).
La suspension interféron+billes est agitée doucement à la température ambiante, pendant 2 h. Après centrifugation, le surnageant est recueilli et le culot de billes de Sépharose est lavé avec 50 ml de tampon A. Les billes sont incubées avec 50 ml d'éthanolamine 1M à pH 8, pendant 90 mn, à la température ambiante, en agitant doucement, puis elles sont lavées de la façon suivante:
— deux fois avec 80 ml de tampon A,
— deux fois avec 80 ml de tampon d'acétate de sodium 0,1 M contenant 1 M de NaCl, à pH 4 (tampon B),
— deux fois avec 80 ml de milieu M.E.M.,
— une fois avec 250 ml de tampon de borate de sodium 0,1 M contenant 1 M de NaCl à pH 8 (tampon C),
— une nouvelle fois avec 250 ml de tampon B, de nouveau avec 250 ml de tampon C et, finalement, trois fois avec 250 ml chaque fois de milieu M.E.M.
La préparation finale de Sépharose est suspendue dans un égal volume de milieu M.E.M.
Les billes de Sépharose ont fixé environ 90% de l'interféron présent dans la susdite solution.
Les préparations de contrôle de Sépharose inactivé sont obtenues à partir de Sépharose traité au CNBr et incubé avec
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l'éthanolamine puis avec l'interféron, la procédure employée étant exactement la même que celle décrite ci-dessus, seule l'incubation avec l'interféron et l'éthanolamine étant inversée. La concentration de protéines dans le surnageant, après incubation avec la solution d'interféron, est de 5 mg/ml et 105 unités d'inter-féron/ml, ce qui montre qu'aucune fixation détectable de protéines ou d'interféron au Sépharose n'a eu lieu.
Au lieu et à la place des billes de Sépharose, on peut fixer l'interféron — en ayant recours aux mêmes techniques que celles qui viennent d'être décrites — sur le dextran dont le poids moléculaire est égal à 150000-200000 et qui est préalablement activé au CNBr, les proportions interféron/support étant les mêmes que précédemment.
Dans une expérience particulière, on a fixé de l'interféron purifié, de souris, sur du dextran (poids moléculaire: 60000) par mise en œuvre du procédé Porath. L'interféron fixé a été purifié par Chromatographie sur Séphadex G. 100 et concentré par dialyse sous pression. Chaque millilitre contient 3200 à 6400 unités antivirales d'interféron. Il sera question plus loin de la préparation ainsi obtenue.
D'autres supports pouvant convenir dans le cadre de cette même technique sont les Polysaccharides suivants:
Homopolysaccharides
— polymères de D-glucose exemple: dextran maillon principal: a-l,6-D-glucosyl-D-glucose
— polymères de D-fructose exemple: lévane maillon principal: ß-2,6-D-fructosyl-D-fructose
— polymères de D-mannose exemple : mannane maillon principal: a-1,2-, 1,3- et 1,6-D-mannosyl-D-mannose
— polymères de D-galacturonate exemple: pectine maillon principal: a-l,4-D-galacturonosyl-D-galacturonate
— polymères de pentoses exemple: xylane maillon principal: ß-l,4-D-xylosyl-D-xylose
— polymères de D-galactose exemple: galactone maillon principal: ß-l,4-D-galactosyl-D-galactose
Hétéropolysaccharides
— contenant des sucres modifiés exemple: agarose maillon principal: ß-l,4-D-galactosyl-L-3,6-anhydrogalactose
— contenant des sucres substitués exemple : pectate de glycérine maillon principal: a-l,4-D-galacturonosyl-D-galacturonate
— contenant plusieurs types de groupement monosaccharide exemple: héparine maillon principal: a-l,4-D-2-deoxy-2-sulfoaminoglucosyl-6-sulfate-D-glucoronate.
La forme pharmaceutique ainsi obtenue, dans laquelle l'interféron est fixé sur son support par liaisons covalentes, est remarquable notamment:
— par le fait qu'elle peut être mise en œuvre successivement plusieurs fois, l'activité de l'interféron étant conservée,
— par le fait que l'interféron ainsi fixé est très résistant aux effets de la chaleur en milieu acide,
— par le fait que l'interféron ainsi fixé agit sans qu'apparemment il pénètre dans les cellules, et
■— par le fait que, même si l'interféron est inactivé par le sérum anti-interféron spécifique — son effet antiviral étant alors inhibé —, il peut être réactivé si l'on coupe le complexe antigène/anticorps en traitant la forme pharmaceutique par un tampon à pH acide.
Du fait que l'activité de la forme pharmaceutique reste liée au support, il est possible d'avoir recours à des quantités de forme pharmaceutique relativement faibles par rapport au nombre de cellules à traiter puisque, par déplacement relatif, une particule de forme pharmaceutique peut être mise successivement au contact d'un grand nombre de cellules.
L'effet thérapeutique de l'interféron fixé peut être mis en évidence par le biais de l'expérience in vitro qui va être décrite.
Des cellules sensibles L de souris sont traitées par la forme pharmaceutique dont la préparation a été décrite plus haut et qui est constituée par de l'interféron fixé sur billes de Sépharose.
Dans le cadre de cette expérience, on traite lesdites cellules au moyen de l'interféron Sépharose à raison de 1 bille (diamètre # 0,1 mm) pour 4 cellules par mise en contact pendant 18 h.
Il est possible d'aller jusqu'à un rapport de 25 billes/1000 cellules.
Cette mise en contact peut être réalisée en recouvrant dans une boîte de Pétri une couche monocellulaire de cellules L d'une couche de billes.
Au bout de 18 h, les billes Sépharose sont enlevées par simple lavage au moyen de liquide M.E.M., car le contact entre les billes et les cellules est très lâche (les billes roulent sur la surface de la couche monocellulaire). Les cellules sont ensuite infectées par un virus révélateur, par exemple le virus de la stomatite vési-culaire (VSV), ou le virus de l'encéphalomyocardite (EMC) et le rendement, après le premier cycle de réplication, est mesuré suivant la technique des plages.
La protection obrenue dans ces conditions est tout à fait comparable à celle réalisée dans une expérience témoin avec de l'interféron soluble.
Cette expérience peut être répétée au moins 4 fois sans que l'activité de la nouvelle forme pharmaceutique accuse une baisse sensible. Cette possibilité est illustrée par les résultats consignés dans le tableau I.
Tableau I
Activité antivirale de l'interféron fixé sur Sépharose avant et après 4 transferts cellule à cellule
Liquide EMC PFU/0,5 ml
VSV PFU/0,5 ml
Interferon + Sépharose 4° C
1,5.10V
7,4-103
Interféron + Sépharose 37° C
3,7-107
1,2-104
Interféron+Sépharose après le 4e transfert
4-IO-?
2-104
Témoin (Contrôle Virus)
5,6.10»
1,2-107 ,
PFU = Unités formant plage.
Comme déjà souligné, l'interféron constitutif de la nouvelle forme pharmaceutique agit sans apparemment pénétrer dans les cellules traitées.
Cette particularité a été mise en évidence à l'aide d'un ensemble d'expériences effectuées comme suit.
Dans une première boîte de Pétri, a été déposée une couche monocellulaire de cellules sensibles à traiter et, dans cette couche, on a isolé une partie centrale, par exemple à l'aide d'une bague posée sur la couche monocellulaire.
La surface de la couche monocellulaire se trouvant à l'intérieur de la bague, et par conséquent isolée du reste de la couche, a été mise en contact avec un support en billes de Sépharose ayant fixé de l'interféron, par exemple celui dont la préparation est décrite plus haut.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
618 345
4
Après avoir laissé les billes en place pendant 24 h, on les enlève et on inocule l'ensemble de la couche monocellulaire recouvrant la surface de la boîte de Pétri par un virus, par exemple le virus VSV, puis on fixe l'ensemble par une couche de gélose.
Au bout de 48 li, l'attaque du virus est matérialisée par l'apparition de plaques, toutes localisées en dehors du cercle central dont l'intérieur correspond à la surface qui a été mise au contact des billes portant l'interféron.
Dans une deuxième expérience, on a mis au contact de la surface située à l'intérieur de la bague de l'interféron soluble; cet interféron diffuse dans toute la couche monocellulaire, même dans la partie de surface extérieure à la bague et, lorsque l'on applique sur cette couche le virus dont il a été question ci-dessus, on n'observa aucune apparition de plaques montrant l'attaque du virus, ce qui s'explique par le fait que l'interféron soluble a migré et s'est mis au contact de toutes les cellules.
Dans une dernière expérience, on a mis au contact de la partie de la surface de la couche monocellulaire située à l'intérieur de la bague des billes de Sépharose sans interféron; on constate alors que les plaques dues à l'attaque du virus apparaissent partout après l'inoculation.
La thermostabilité de l'interféron constitutif de la susdite forme pharmaceutique a été illustrée par deux expériences.
Tout d'abord, on a chauffé la forme pharmaceutique constituée par de l'interféron fixé sur billes de Sépharose à 56° C pendant 1 h; l'interféron insoluble garde toute son activité biologique alors que, dans les mêmes conditions, l'interféron soluble est presque entièrement détruit.
Dans le tableau II, on a résumé cette expérience:
Tableau II
Hémag
Rendement
glutination du virus EMC
EMC*
en PFU**
Interféron + Sépharose 4° C
64
2.1C
Interféron + Sépharose 56° C
128
4,6-107
Interféron soluble 4°C
256
6-107
Interféron soluble 56° C
2048
4,6-108
Témoin virus
4096
7,4-10»
* Hémagglutination EMC=activité hémagglutinante du virus EMC exprimée comme l'inverse de la dilution.
** Rendement du virus EMC en PFU=rendement en virus EMC de la cellule infectée en cycle unique exprimé en unités formant plage.
Dans une deuxième expérience, on porte l'interféron sur Sépharose à l'intérieur d'un autoclave, à une température de 110° C sous 1 bar, le pH de la solution (dans du tampon) dans laquelle se trouvent les billes de Sépharose ayant fixé l'interféron étant de 2,5 à 7,4.
La durée de l'expérience est de 30 mn et, à son issue, on constate que, lorsque le pH est de 4,6 ou plus petit, l'activité antivirale de l'interféron est pratiquement conservée en totalité, alors qu'il existe une baisse à pH 7,2.
Le tableau III montre le résultat des expériences effectuées en autoclave sur cellules L.
( Tableau en tête de la colonne suivante)
Dans le cas où de l'interféron soluble en solution à pH 7 est porté dans l'autoclave, il ne subsiste aucune activité.
L'intérêt de pouvoir porter l'interféron en autoclave aux susdites conditions de température et pression réside dans la possibilité de stériliser ainsi la forme pharmaceutique.
La faculté de l'interféron constitutif de la susdite forme pharmaceutique de recouvrer son activité thérapeutique par un
Tableau III
30 mn en autoclave 30 mn à 4° C
pH 2,6 pH 4,6 pH 7,2 témoin pH 2,6
Virus EMC+
Rendement
Témoin cellule: 0—Témoin virus: 2,4-107
traitement à pH acide (de l'ordre de pH 2), après avoir été inhibé par du sérum anti-interféron spécifique, apparaît à l'examen des expériences dont les résultats sont réunis dans le tableau IV.
Tableau IV
Hémagglutination EMC
Rendement du virus EMC en PFU
Interféron+Sépharose
2
4,9-105
Interféron+Sépharose +
antisérum
2048
2,2-108
Interféron+Sépharose
+
antisérum, mais traité à pH 2
4
2,1-106
Témoin virus
2048/4096
2,9-108
L'intérêt de la nouvelle forme pharmaceutique a été également démontré par des expériences in vivo.
Une première expérience a été effectuée sur deux groupes de 20 souris.
On a administré par voie intrapéritonéale aux animaux traités 100000 billes de Sépharose sans interféron. 4 h après cette administration, le virus EMC est inoculé à tous les animaux (protégés et témoins). On a étudié la mortalité survenant après ce traitement (voir tableau V), et on constate que l'interféron fixé sur Sépharose assurait une bonne protection des animaux traités.
Tableau V
Délai
Animaux survivants
Animaux survivants
traités par interféron +
traités par Sépharose
Sépharose et inoculés au virus
et inoculés au virus
EMC
EMC
1er jour
20
20
4e jour
19
17
5e jour
16
8
6e jour
10
5
7" jour
5
3
8e jour
4
2
9e jour
3
2
10e jour
3
1
11e jour
2
0
12e jour
1
0
13e jour
1
0
s
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
5
618 345
Le fait que, au bout d'une durée relativement prolongée,
même les animaux traités finissent tous par mourir s'explique par le fait que, dans cette expérience, l'interféron fixé sur billes est localisé en un endroit de l'animal et ne peut franchir cet endroit; or, le virus, quant à lui, peut circuler et finit par se fixer en 5
d'autres endroits du corps où l'action de l'interféron ne peut plus l'atteindre.
Une deuxième expérience in vivo a été réalisée en utilisant la forme pharmaceutique pouvant être entraînée par le courant sanguin, constituée par l'interféron fixé sur dextran, dont il a été 10 question plus haut. Cette expérience est illustrée par la figure unique montrant l'évolution de la mortalité des animaux traités (pourcentage d'animaux morts en fonction du temps, exprimé en jours).
On a inoculé intracérébralement 0,2 ml de la préparation 15 ci-dessus mentionnée à des souris IC adultes. Chaque groupe était constitué de 20 souris. A titre de comparaison, de l'interféron purifié non fixé a été employé à une concentration 2 à 4 fois plus grande. On injecte par ailleurs à un groupe témoin un milieu de culture de tissus. On injecte par voie intra- 20 péritonéale à chaque souris 200 DL50 du virus de l'encéphalo-myocardite (EMC).
La figure montre que les animaux traités par l'interféron fixé sur dextran présentent une durée, pour 50% de survie,
accrue d'environ 48 h (Cl), tandis que l'interféron non fixé, bien qu'introduit en quantité bien supérieure, est inefficace (C2). (C3) correspond aux animaux témoins.
Cela étant, on souligne que la nouvelle forme pharmaceutique présente un intérêt multiple en ce sens qu'elle permet d'envisager:
— de véhiculer l'interféron dans l'organisme sans qu'il soit soumis à l'effet d'agents inactivants ;
— la circulation extra-corporelle de sang dans des récipients sur des parties constitutives desquels l'interféron serait fixé;
— l'étude d'une grande variété de techniques qui amélioreraient l'effet biologique de l'interféron.
Les domaines d'application à envisager sont tous ceux déjà connus pour l'interféron, à savoir notamment toutes les maladies virales, formes de cancers et leucémies chez l'homme et chez l'animal.
Comme indiqué plus haut, une voie d'administration particulièrement avantageuse est la voie intraveineuse, la forme pharmaceutique utilisée étant celle dans laquelle l'interféron est fixé sur un support tel que le dextran.
Enfin, en raison de la grande stabilité de l'interféron dans le cadre de la forme pharmaceutique préparée selon le procédé de l'invention, celle-ci peut jouer le rôle d'étalon international d'interféron.
1 feuille dessins
Claims (7)
1. Procédé de fabrication d'une forme pharmaceutique à base d'interféron, caractérisé en ce que l'on fixe ledit interféron par liaison covalente sur un support constitué pär Tin Polysaccharide, ce support ayant été activé préalablement par un halo-génure de cyanogène.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le support sur lequel est fixé l'interféron est constitué par un gel d'agarose.
2
REVENDICATIONS
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le support est constitué par du gel d'agarose dans lequel les chaînes de Polysaccharide forment une structure réticulée à trois dimensions grâce à des liaisons transversales entre les chaînes.
4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le gel d'agarose se présente sous la forme de billes, de 0,1 mm.
5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support est constitué par du dextran.
6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support est constitué par l'un des composés du groupe des homo- et hétéropolysaccharides suivants: lévane, mannane, xylane, galactane, agarose, p'ectate de glycérine, héparine.
7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support est activé par le CNBr.
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