JP2000508535A - 固定化アリイナーゼおよびアリシンの連続生産 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 アリイナーゼを化学的に、物理的に、生物学的に固定化した固定化にんにくアリイナーゼは、アリシンの連続生産法として有用である。方法は、基質としてアリイン溶液を該固定化にんにくアリイナーゼを含むカラムに添加し、精製アリシンを回収することから成る。精製アリシンは食品添加物や、ウイルス、細菌、菌および寄生虫の感染、高レベルのコレステロールおよび血液脂質、高血圧および血栓症の治療のための医薬品組成物の調製に使用するものである。

Description

【発明の詳細な説明】 固定化アリイナーゼおよびアリシンの連続生産 発明の分野 本発明は、生物的に活性な形態にある固定化したにんにくアリイナーゼ、およ び医薬品組成物の活性成分および食品添加物として使用するために十分に精製さ れたアリシンの製造法における該固定化アリイナーゼの使用に関する。 発明の背景 にんにくとたまねぎはユリ科に属している。にんにくとたまねぎには多くの医 学的特性があるとされ、何千年もの間民間療法において使用されてきた。 にんにく、Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ、には広範囲の医学的特性があると されている（Ｂｌｏｃｋ，１９８５）。現代において、にんにくの治療特性に対 する関心が再び高まり、増大する多くの生化学的および臨床学的研究の対象とな っている。 にんにくの調製品としてはにんにくの油、抽出液、丸薬、錠剤が商品として売 り出されている。このようなにんにく調製品の調製法は一般には知られておらず 、これらの活性成分の組成および量は定められていない。にんにく中に存在する 活性本体は主として硫黄を含む化合物であることがわかっている。にんにくの抽 出液の蒸留から得られる無色の油の主成分は、化学式Ｃ₆Ｈ₁₀Ｓ₂Ｏ、アリシン （チオ−２−プロペン−１−スルフィン酸 Ｓ−アリルエステル）と命名された 珍しい硫黄化合物であることが示された（Ｃａｖａｌｌｉｔｏら，１９４４）。 アリシンは、にんにくの匂いと大部分の生物活性の元であると考えられている化 学的に不安定な無色の液体であることがわかった。 アリシンはにんにくの匂いの元とされているが、にんにくの鱗茎を切断または 破砕するまでは無臭かほとんど匂いがしない。にんにくの鱗茎そのものにはアリ シンは含まれておらず、アリイン リアーゼまたはアリイナーゼ［Ｅ．Ｃ．４． ４．１．４］と呼ばれる、にんにくの植物中に存在するＣ−Ｓ−リアーゼによっ てアリシン、ピルビン酸およびアンモニアに変換する無臭の前駆体アリイン（＋ ） （Ｓ−アリル−Ｌ−システインスルフォキシド）として存在する（Ｓｔｏｌｌと Ｓｅｅｂｅｃｋ，１９４９）。アリインとアリイナーゼはにんにくの鱗茎の別々 の区画に認められる。鱗茎を切断または破砕すると酵素がアリシンの前駆体に接 触できるようになる。 にんにくの調製物について行われた研究から、にんにくにある幾つかの医学的 な活性が確認された。にんにくの汁がスタフィロコッカス属、ストレプトコッカ ス属、ビブリオ属およびバシラス属の細菌、動物の病因菌および Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓを含む多くの酵母類を阻害することが示され （Ｂｌｏｃｋ，１９８５；ＡｐｐｌｅｔｏｎとＴａｎｓｅｙ，１９７５； ＢａｒｏｎｅとＴａｎｓｅｙ，１９７７）、アリシンが抗細菌、抗菌および抗ア メーバ活性を呈することが示された（Ｃａｖａｌｌｉｔｏら，１９４４； ＢａｒｏｎｅとＴａｎｓｅｙ，１９７７；Ｍｉｒｅｌｍａｎら，１９８７）。 最近数年間、多くの研究によって循環器系の危険因子、主に動物やヒトの高脂 血症と血栓形成に対するにんにくの有効な効果が報告されている。新鮮なにんに く、エーテル抽出物またはその活性成分アリシンを投与した結果も一致していた 。にんにくはフィブリン溶解活性の増大を誘導し（Ｂｏｒｄｉａら，１９７７； Ｋｉｅｓｗｅｔｔｅｒら，１９９０）、血小板の凝集を阻害し（Ｍａｋｈｅｊａ とＢａｉｌｅｙ，１９９０）、血清コレステロールレベルの減少を含む脂質成分 の様相を改善する（ＢｏｒｄｉａとＶｅｒｍａ，１９８０；Ｂｏｒｄｉａら，１ ９７５；ＫｎｉｐｓｃｈｉｌｄとＴｅｒ−Ｒｉｅｔ，１９８９；Ａｕｇｕｓｔｉ とＭａｔｈｅｗ，１９７４）。 これらの研究によってにんにくの非常に印象的な効果が実証されたが、ほとん どの研究が、対照となる方法や適切な二重盲検試験が不足していたり、活性成分 の量や化学的同定が不明である調製物を使用するというような幾つかの原因のた めに制限を受けることとなっていた。 アリシンがにんにくの有する有益な特性を呈することが示されたことから、医 薬品組成物の活性成分として使用するために、量を調節したり、定量したアリシ ンを生産することは有益なことになる。しかしアリシンは空気にさらされると容 易に置換される揮発性の化合物であり、今日知られている調整法は満足できるも のではない。化学合成には多くのステップを要し、複雑で労力とコストがかかり 、非常に非効率的である。酵素を用いた方法に興味が引かれるが、アリイナーゼ はいわゆる“自殺酵素”で、自身の反応生成物であるアリシンによって素早く不 可逆的に不活化される。そのためアリイナーゼと基質アリインまたはその生成物 アリシンを数分間インキュベーションすると１回もしくは非常に限られた回数の サイクルで、生物学的に不活性な酵素となってしまう。 発明の要約 前述した障害を解決するため、本発明はアリシンによって不活化されない形態 のアリイナーゼを提供する。ゆえに本発明によるアリイナーゼは生物活性を減じ ることなしにアリシンを連続的に調製するのに使用できることになる。 また１つの側面として本発明は、酵素を化学的に、物理的にまたは生物学的に 支持担体に固定化した、酵素的に活性な固定化体としてにんにくの酵素アリイナ ーゼを提供する。 本発明による化学的固定化は、天然および合成の有機ポリマーと無機担体から 成る群から選択された担体に酵素を共有結合することによって行う。物理的な固 定化は、酵素をポリマーマトリックスやメンブランに包括（ｅｎｔｒａｐ− ｍｅｎｔ）するか、半透過性のポリマーメンブレン中にマイクロカプセルとする ことによって行う。生物学的な固定化はビオチン化アリイナーゼをアビジンカラ ムに結合するか、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）タンパク質で修飾したアリ イナーゼをセルロースカラムに結合することによって行う。 また別の側面として本発明は、化学的に、物理的にまたは生物学的に固定化し たにんにくアリイナーゼと、該カラムに基質アリインを添加して十分に精製され たアリシンを連続的に生産する方法を提供する。 さらに別の側面として本発明は、ウイルス、細菌、菌および寄生虫の感染、高 レベルのコレステールおよび血液脂質、高血圧および血栓症の治療用医薬品組成 物の調製のための本発明の方法によって生産される十分に精製されたアリインの 使用を提供する。 さらに別の側面として本発明は、食品添加物または調味料として使用するため の十分に精製されたアリシンを提供する。 図面の簡単な説明 図．１は可溶性アリイナーゼ（Ｅ₀−点付き四角）、Ｃｌ−セファロース４Ｂ に共有結合したアリイナーゼ（黒菱形）、寒天／グルタルアルデヒドで架橋結合 したアルギン酸ナトリウムビーズに包括したアリイナーゼ（黒四角）の酵素活性 に対するｐＨの影響を示す。 図．２は可溶性アリイナーゼ（Ｅ₀−点付き四角）、図．１と同様に共有結合 したアリイナーゼ（黒四角）、図．１と同様に包括したアリイナーゼ（黒菱形） の酵素活性に対する測定温度の影響を示す。 図．３は可溶性アリイナーゼ（Ｅ₀−黒四角）、図．１と同様に共有結合した アリイナーゼ（点付き四角）、図．１と同様に包括したアリイナーゼ（黒菱形） の酵素活性に対する、室温での活性測定前に各種温度で３０分間熱処理したとき の影響を示す。 図．４は図．１と同様に共有結合したカラムに添加するアリイン量（ｍｇ／ｍ ｌ）のアリシンの生産（ｍｇ／ｍｌ）に対する影響を示す。 発明の詳細な説明 本発明によってにんにくアリイナーゼは化学的に、物理的にまたは生物学的に 支持体に固定化される。にんにくアリイナーゼは天然または組換え型のいずれで もよく、酵素がその触媒活性を保持する限り使用することができる。 ＫｅｎｎｅｄｙとＣａｂｒａｌ（１９８３）およびＴｒａｍｐｅｒ（１９８３ ）に記載されている方法など、バイオテクノロジーに適用するため酵素を固定化 するのに開発されたいかなる適切な技術も本発明に使用することができる。 化学的固定化は、支持体の活性基と酵素のアミノ酸残基のうち１ないしそれ以 上の官能基との反応によって酵素を支持体に共有結合することによって行う。に んにくアリイナーゼの担体への結合は直接でもスペーサーを介してもよい。 担体は、ＫｅｎｎｅｄｙとＣａｂｒａｌ（１９８３）およびＴｒａｍｐｅｒ （１９８３）に記載される天然および合成有機ポリマーと無機化合物のように酵 素の固定化に適するものならばいずれでもよく、本発明に使用できる。 無機担体の例としては、これによって限定されるものではないが、チタニア、 ジルコニア、アルミナなどの孔調節セラミックス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｃｅｒａｍｉｃｓ）、珪藻土、アタプルジト白土（ａｔｔａｐｕｌｇ −ｉｔｅ ｃｌａｙｓ）、軽石、およびベントナイトのような天然由来の多孔性 鉱物、孔調節ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ，ＣＰＧ） 、ホウケイ酸塩ガラスから調製されたマクロ多孔性の高シリカガラス（ｍａｃｒ ｏｐｏｒｏｕｓ ｈｉｇｈ−ｓｉｌｉｃａ ｇｌａｓｓ）などがある。 本発明に用いられる有機担体には、これによって限定されるものではないが、 例えばセルロース、でんぷん、デキストラン、寒天、アガロース、キチン、キト サン、ペクチン、ペクチン酸、アルギン酸およびそれらの誘導体などの多糖体、 例えばコラーゲンや絹およびそれらの誘導体などのタンパク質、例えばポリスチ レンとその誘導体などの合成ポリマー、例えばポリアクリレート、ポリメタクリ レート、無水ポリメタクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリヒドロキシアルキル メタクリレート、ポリグリシジルメタクリレート、ポリアクリロニトリルなどの ポリアクリレート様ポリマー、例えば無水マレイン酸とエチレンの共重合体など の無水マレイン酸を骨格としたポリマー、例えばＬ−ロイシンと４−アミノ−Ｄ Ｌ−フェニルアラニンの共重合体などのポリペプチド、例えば化学的に修飾した ポリビニルアルコール、ポリアリルアルコールおよびビニルエーテル共重合体な どのビニルまたはアリルポリマー、および例えばナイロンなどのポリアミドがあ る。該担体の２つないしそれ以上の混合物の使用もまた本発明に含まれる。 酵素分子の支持体へのカップリングには酵素のアミノ酸残基と担体の官能基と の温和な反応が関与している。幾つかの担体は、無水マレイン酸を骨格とした共 重合体、無水メタクリル酸を骨格とした共重合体、硝酸処理フルオロアクリルメ タクリル共重合体およびヨードアルキル−メタクリレートなどの官能基を保持し ている。しかし一般に使用される支持材料にはこれらの官能基ではなく、酵素を 固定化するために活性化させなければならない水酸基、アミノ基、アミド基およ びカルボキシル基が保持されている。 結合様式によって、共有結合方法はジアゾ化、ペプチド（アミド）化およびア ルキル化法、多官能基試薬によるカップリングおよびその他の手段に分類される 。本発明に用いる方法はいずれでもかまわないが、好ましい態様の１つはペプチ ド結合法に関するものである。この結合を行うために、カルボキシル基を有する 支 持体をアシルアジド、酸塩化物、酸無水物、イソシアネート、イミドカルボネー ト、環状カルボネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルやｐ−ニトロフ ェニルエステルなどの反応性誘導体に変換し、これらの誘導体が酵素の遊離アミ ノ基とペプチド結合を形成する。酵素の遊離カルボキシル基やアミノ基はそれぞ れ支持体のカルボキシル基やアミノ基との間に、カルボジイミドやＷｏｏｄ− ｗａｒｄ試薬Ｋなどの重合剤によってペプチド結合を形成する。 本発明によれば、セルロースやアガロース（セファロース^TM）などの多糖体担 体は、シアノエステルやイミドカルボネート活性基を形成するＣＮＢｒやＮ，Ｎ ’−スクシンイミジルカルボネート、または対応するカルボネート活性基を形成 するｐ−ニトロフェニルクロロフォーメートやＮ−ヒドロキシスクシンイミジル クロロフォーメートなどのクロロフォーメート誘導体によって活性化される。 本発明の別の態様として、ε−アミノ−カプロン酸などのω−アミノカルボン 酸のようなスペーサーとして供する分子をまずアミノ基を介して担体に付け、遊 離カルボキシル基を、カルボジイミドやＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどの適 当な縮合試薬との反応によってＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのような 活性エステルに活性化する。このような担体の例としては、これによって限定さ れるものではないが、セルロースやアガロース（セファロース^TM）などの多糖体 やＴｒｉｓａｃｒｙｌ^TM、Ｎ−アクリロイル−２−アミノ−２−ヒドロキシメチ ル−１，３−プロパンジオールのポリマーなどのポリアクリレートがある。 アリイナーゼの物理的固定化は、ＫｅｎｎｅｄｙとＣａｂｒａｌ（１９８３） およびＴｒａｍｐｅｒ（１９８３）に記載される方法などのいかなる標準的な手 段を用いて行ってもよい。この固定化は、例えばポリマーマトリックスやメンブ レンの格子のように酵素の漏出を防ぐのに十分な緻密さをもつ一方で基質が通過 できる構造中に酵素を物理的に包括することに基づいている。そしてアリイナー ゼはでんぷん、コラーゲン、ゼラチン、寒天、アルギン酸カルシウムおよびκ− カラゲナンなどの天然に由来する物質やそれらの架橋結合誘導体から成るポリマ ーマトリックスのように、架橋結合した水に不溶なポリマーゲルや、ポリアクリ ルアミド、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）および例えば ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）などのポリ（メタ）アクリレート のように、架橋結合した合成ポリマーに物理的に包括されることになる。包括酵 素の調製法には、Ｃａ²⁺やＡｌ³⁺のような多価イオンによってポリマーを架橋結 合する方法、例えばアルギン酸カルシウムゲルでの固定化など酵素−ポリマー溶 液でゲル化を起こす方法、またはグルタルアルデヒドなどの架橋結合剤の存在下 でモノマーまたはオリゴマーと酵素との水溶液を重合または縮合させる方法があ る。 さらに本発明の別の態様として、アリイナーゼをセルロースアセテートのよう なセルロースを骨格とした繊維などの合成繊維の微小穴中に物理的に包括するか 、アリイナーゼは漏出しない一方で基質はメンブレン中に拡散して固定化酵素に よって処理されるようにニトロセルロース、ナイロン、ポリウレアやポリスチレ ンなどの半透過性ポリマーメンブレン中にマイクロカプセルとして保持する。 アリイナーゼの生物学的固定化は、例えばセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ） タンパク質をアリイナーゼに結合してセルロースに吸着させたり、ビオチン化ア リイナーゼをアビジンカラムに結合させたり、またハプテンとしてアリイナーゼ を用いて、例えばジニトロフェノールやフルオレセインなどに対する抗体のカラ ムに固定化することによって行う。本発明に使用できるＣＢＤｓの例としては本 出願人が共願した、公開国際ＰＣＴ特許 出願Ｎｏ．ＷＯ９６／１３５２４に記 載されているものがある。 本発明はさらに、本発明によって固定化したアリイナーゼから成るカラムと、 アリイン溶液をこのカラムに添加して生産されたアリシンを回収することから成 る十分に精製されたアリシンの連続生産法を提供する。通常アリシンは回収され 、ｐＨ４．５の水溶液（クエン酸緩衝液）として保存される。 十分に精製されたアリシンは、例えばにんにくの風味をオイル、バター、チー ズなどにつけるための食品添加物や調味料として、また酪農業における自然食品 の保存剤として利用される。 さらに本発明は、これによって限定されるものではないが、ウイルス、細菌、 菌および寄生虫の感染、高レベルのコレステロールおよび血液脂質、高血圧およ び血栓症を含む幾つかの疾患の治療のための、ヒトや家畜用の医薬品組成物の製 造に使用される。これらの医薬品組成物は標準的な方法によって調製される。１ つの態様として、アリシンをクエン酸緩衝液ｐＨ４．５中に空気のない状態でカ プセルに包装して保存する。 本発明の医薬品組成物はスタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ビブ リオ属およびバシラス属による細菌感染や、例えばＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃ −ａｎｓによる菌感染の治療、抗アメーバ剤としておよび心臓疾患と動脈硬化症 の治療に使用することができる。 さらに本発明は、血栓症の治療のために固定化アリイナーゼから成るカラムで 構成される短絡循環（ｓｈｕｎｔ）およびこのカラムの血栓症治療や血液透析と 腹膜透析での生体外での（ｅｘ ｖｉｖｏ）使用を提供する。腹膜透析において は、予防的な抗細菌処理のために、透析装置の後に設置される固定化アリイナー ゼ含有チューブにアリインを添加する。 本発明を次の限定されない実施例で説明する。 実施例 材料および方法 実施例において以下の材料および方法を用いる。 （ｉ）材料 にんにくは地元のマーケットから購入した。架橋結合したアガロース（Ｃｌ− セファロース^TM４Ｂ）はファルマシア社から購入した。アガー、アルギン酸（ナ トリウム塩）、ビーズ状セルロース（５０−８０ｍｍ）、２，４−ジニトロフェ ニルヒドラジン、５，５’ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、 およびグルタルアルデヒドはシグマ社から購入した。Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ ＧＦ ２０００（ＬＫＢ社製）。ｐ−ニトロフェニルクロロフォーメート、４−（ジメ チルアミノ）−ピリジン（ＤＭＡＰ），Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルスク シンイミドウロニウム テトラフルオロボーレートおよび６−アミノカプロン酸 はフルカ社（Ｂｕｃｈｓ，スイス）から購入した。 （ｉｉ）アリインの合成 アリインはＬ−システインと臭化アリルをＳｔｏｌｌとＳｅｅｂｅｃｋ（１９ ５１）の方法に従って過酸化水素で酸化して合成した。得られた立体特異的な生 成物，（＋）Ｓ−アリル−Ｌ−システインスルホキシド（Ｍ．Ｐ．＝１６ ４°，水中での［α］_D＝＋６２．１°）は天然のアリインと一致した（収率１ ５．７％）。 （ｉｉｉ）にんにくアリイナーゼの調製 アリイナーゼは以前記載したように（Ｒａｂｉｎｋｏｖら，１９９５）にんに くの小鱗茎から分離した。簡単に説明すると、皮をむいたにんにくの小鱗茎１０ ０ｇを細かく刻んで抽出緩衝液［リン酸ナトリウム緩衝液０．０２Ｍ ｐＨ７． ４，グリセリン１０％，ピリドキサール−５’−リン酸０．０２ｍＭを含有］１ ５０ｍｌで抽出し、マグネチックスターラーで４℃、３０−４５分間撹拌した。 上清を遠心により集めた後、以下に示す方法のうち１つを用いて分画した。 （ｉ）０．６５容量の冷アセトンを加えてアセトン沈殿させ、遠心によってペレ ットを回収した。（ｉｉ）５０％飽和硫安で沈殿させ、遠心によりペレットを回 収した。（ｉｉｉ）終濃度２５％のポリエチレングリロール−８０００［ＰＥＧ ８０００］を用いて沈殿させ、遠心によりペレットを回収した。ＰＥＧによる 沈殿をする前に、ニッケルで平衡化した固定化イミノジ酢酸（ＩＤＡ）カラムで 処理をする場合もある。いずれの場合もペレットを抽出緩衝液５０ｍｌに溶解し 、透析またはＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（２５０ｍｌカラム）によるゲルろ過 を行った。ハイドロキシアパタイトカラム（Ｃｅｒａｍｉｃ ＨＡＰ，Ｂｉｏ− Ｒａｄ）によりさらに精製を行った。カラムを０．０５Ｍリン酸緩衝液で洗浄後 、アリイナーゼのピークは０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で溶出し、その溶液 をそのまま固定化に用いた。 （ｉｖ）タンパク質はＬｏｗｒｙら（１９５１）の方法に従って測定した。 （ｖ）アリイナーゼ活性 ａ）直接測定法 （１）Ｒａｂｉｎｋｏｖら（１９９４）によって示されたように、アリイナー ゼとアリインとの反応における副産物として生成するピルビン酸を測定すること による酵素的測定法。標準反応混合液は、リン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ， ｐＨ６．５）、ピリドキサール５’−リン酸（０．０２５ｍＭ）、ＮＡＤＨ （０．２ｍＭ）、乳酸脱水素酵素（１０Ｕ）、アリイン（６ｍＭ）およびアリイ ナーゼサンプルからなり、容量は合計１ｍｌとした。酵素活性は、光路長１ｃｍ のキュベットを用いて３４０ｎｍでの吸光度の減少を分光学的にモニターした。 １分間当たりに１μｍｏｌのピルビン酸を放出するのに必要な酵素量を１活性ユ ニットとした。 （２）以前記載した（ＦｒｉｅｄｅｍａｎｎとＨａｕｇｅｎ，１９４３）、ピ ルビン酸とジニトロフェニルヒドラジンとの反応で得られる生成物を５２０ｎｍ で分光学的に測定する方法。 （３）ＨＰＬＣによるアリシンの測定（Ｒａｂｉｎｋｏｖら，１９９４）。 ｂ）間接測定法 以前記載した（Ｈａｎら，１９９５）、アリシンと過剰量のシステインとの反 応後、残存するシステインをＤＴＮＢとの反応により測定することによるアリシ ンの分光学的測定法。 （ｖｉ）アリシンの解析 標準としてのアリシンの分離法はＪａｎｓｅｎら（１９８７）の方法に従って 行った。アリイン（３００ｍｇ）を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ６． ５，３００ｍｌに溶解し、精製したアリイナーゼ（３０ユニット／ｍｇ）ととも に３７℃でインキュベートした。２時間のインキュベーション後、溶液を２回エ ーテル抽出し、硫酸ナトリウム存在下で脱水した。エーテルは室温乾燥気流下で 除去した。アリシン（９２ｍｇ）は硫酸（９８％）存在下、冷却したデシケータ ー内で乾燥した。 （ｖｉｉ）薄相クロマトグラフィー（ＴＬＣ） Ｓ−アリル−Ｌ−システインとアリインのＴＬＣによる同定は、あらかじめセ ルロースをコートしたプレート（Ｍｅｒｃｋ社製，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ドイツ ）上で溶媒としてｎ−ブタノール−酢酸−水（４：１：１ ｖ／ｖ／ｖ）を用い て行った。乾燥後、プレートにニンヒドリン（０．２５％）試薬を噴霧し、１１ ０℃、１０分間オーブン中に放置した。アリシン（Ｒｆ＝０．３７５）は、ベン ゼン−酢酸エチル（９０：１０）から成る溶媒系を用いてシリカゲルプレート上 でのクロマトグラフィーにより同定し、遊離ヨウ素蒸気でプレート上に検出した 。 （ｖｉｉｉ）アリインとアリシンの定量 アリインとアリシンの定量はＳＰ４２９０インテグレーター（Ｓｐｅｃｔｒａ −ｐｈｙｓｉｃｓ社製）を備えたＬＫＢ社製のＨＰＬＣシステムを用いて行った 。溶媒として０．１％ギ酸を含む（６０％）メタノール−水を用いてＬｉＣｈｒ −ｏｓｏｒｂ ＲＰ−１８カラムにより分離した。アリインは約４．５分で溶出 し、アリシンは約９分で溶出する。 実施例１ 固定化アリイナーゼの調製 （ａ）スペーサーとしてε−アミノカプロン酸を有するセルロース、Ｔｒｉｓａ −ｃｒｙｌ^TMおよびセファロース^TMをＷｉｌｃｈｅｋとＭｉｒｏｎ（１９８２） の方法に従って調製し、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，−テトラメチル（スクシンイミド ）ウロニウムテトラフルオロボーレート（ＴＳＴＵ）またはカルボジイミド、お よびヒドロキシスクシンイミドを用いてＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル に変換した。活性基の定量はＭｉｒｏｎとＷｉｌｃｈｅｋ（１９８２）の方法に 従って行った。 典型的な方法として、Ｎ−スクシンイミド活性基を有する活性化ゲル１０ｇを焼 結ガラスロート上で数分間冷水で洗浄し、リン酸緩衝液０．０２Ｍ ｐＨ７．４ で溶解したアリイナーゼ溶液（２−５ｍｇ／ｍｌ）１０−４０ｍｌに再懸濁した 。懸濁液は４℃で４−１６時間震盪した。 （ｂ）セファロースまたはビーズ状セルロースをＫｏｈｎとＷｉｌｃｈｅｋ（１ ９８２）に従ったＣＮＢｒ法またはＷｉｌｃｈｅｋとＭｉｒｏｎ（１９８５）の 方法に従ってＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボネート（ＤＳＣ）を用いるこ とによって、もしくはＷｉｌｃｈｅｋとＭｉｒｏｎ（１９８２）の方法に従って ｐ−ニトロフェニルクロロフォーメートまたはヒドロキシスクシンイミドクロロ フォーメートを用いることによって活性化した。活性基の定量はＭｉｒｏｎとＷ ｉｌｃｈｅｋ（１９８２）の方法に従って行った。これらの活性化された担体を 、スペーサーを用いずに直接アリイナーゼとカップリングするのに使用した。 セファロース^TMなどのＣＮＢｒまたはｐ−ニトロフェニルカルボネートで活性 化したゲルにアリイナーゼを共有結合的にカップリングするために、カップリン グ混合物を終濃度０．２ＭＮａＨＣＯ₃に調製し、カップリング時間は４℃で少 なくとも１６時間とした。結合物を濾過し、結合していないタンパク質の量と活 性を測定した。ゲルを０．１Ｍアンモニア、次にリン酸緩衝液ｐＨ７．４（０． ０５Ｍ）で洗浄した。 実施例２ 包括アリイナーゼの調製 アリイナーゼのアガービーズへの包括はＰｒａｂｈｕｎｅとＳｉｖａＲａｍａ ｎ（１９９０）の方法に従って行った。寒天（２．０ｇ）とアルギン酸ナトリウ ム（０．５ｇ）を水（５０ｍｌ）に懸濁し、沸騰水浴中で熱して溶解した。懸濁 液を５０℃まで冷まし、均一な懸濁液を形成するためアリイナーゼ（５０ｍｌ） を撹拌しながら添加した。懸濁液をグルタルアルデヒド（１％）を含有する塩化 カルシウム（２％，５００ｍｌ）にペリスタリックポンプで滴下した。塩化カル シウム／グルタルアルデヒド中で１時間撹拌し続けた。アルギン酸カルシウムの 除去は、ビーズをリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４（０．０５Ｍ）で洗浄液が 澄明になるまで洗浄することにより行った。ビーズをさらに水で洗浄し、４℃で 保存した。 実施例３ 固定化アリイナーゼの解析 実施例１および２の固定化アリイナーゼの調製において担体へ結合したタンパ ク質量は、カップリングに加えた量からカップリング溶液中の未結合のタンパク 質量を差し引いて測定した。 固定化アリイナーゼ活性の測定はバッチ様式で行った。アリイン５０μｌ（１ ００ｍｇ／ｍｌ測定緩衝液）をエッペンドルフチューブ（終容積１．０ｍｌ）中 の適量の固定化アリイナーゼゲル 湿重量５０ｍｇ／ｍｌ ０．２ｍＭピリドキ サール５’−リン酸含有０．０５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．５（測定緩衝液）に加 えた。撹拌しながら３−５分間反応を進め、上清を遠心または濾過により分取し た。上清サンプル５０μｌをピルビン酸またはアリシン濃度の測定に用いた。 可溶性酵素の活性測定も同様に行った。反応はトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を終 濃度５％まで加えることによって停止した。 ピルビン酸を測定するため、酵素反応液５０μｌのうちの適量に１０％ＴＣＡ ５０μｌ（固定化アリイナーゼの場合）または５％ＴＣＡ ５０μｌ（可溶性ア リイナーゼの場合）と、７％塩酸に溶解した０．１％２，４−ジニトロフェニル ヒドラジンを加えて混合し、室温で５分間放置した。そしてトルエン（水飽和） ０．２５ｍｌを加え、混合液を３０秒間ボルテックスして５分間室温放置した。 有機溶媒層のうち適量（２５−５０μｌ）に２．５％水酸化カリウム・エタノー ル溶液０．５５ｍｌを加えて１０分間室温放置した後、５２０ｎｍの吸光度を測 定した。キャリブレーションは１０ｍＭピルビン酸（１０−３０μｌ）サンプル を用いて行った。 アリシンの間接測定法は、酵素反応液５０μｌのうちの適量に用事調製したシ ステイン（０．０２Ｍ）・ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４（５０−５００ｍＭ）溶 液１５０μｌを加えて行った。１０分間室温放置後、５μｌ量をＤＴＮＢ（０． ２ｍｇ／ｍｌ ５０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４）で希釈し、４１２ｎｍ （Ｅ_M412＝１３６００）の吸光度を測定した。アリシンと反応したシステインは 、酵素無添加でのシステインのＡ₄₁₂（システイン＝１００％）から、測定され たＡ₄₁₂（未反応のシステイン）を差し引いて計測した。 活性ユニット：１分間当たりのピルビン酸のμｍｏｌｅ量として計測。比活性 ：１ｍｇ，１分間当たりのピルビン酸のμｍｏｌｅ量 アリインの直接測定法は溶出液中のアリシン濃度を希釈サンプル（移動層の緩 衝液で１：１００に希釈）５０−１００μｌを直接ＲＰ Ｃ−１８ＨＰＬＣカラ ムにアプライして測定することにより行った。アリシンとアリインの溶出位置は それぞれ約８．５分と４．５分であった。 ３（ｉ）．可溶性および固定化アリイナーゼの比活性とアリイナーゼの不溶性担 体への結合量 各精製アリイナーゼ調製品（方法ｉｉｉ）およびＣｌ−セファロースに固定化 したアリイナーゼの比活性を表１に示す。比活性はそれぞれの酵素の精製程度を 示している。興味深いことに幾つかの例で固定化アリイナーゼは可溶性の酵素よ り高い比活性を示しており、これは可溶性の酵素が保存上不安定であるためと考 えられる。 表１．可溶性および固定化アリイナーゼの比活性とタンパク質結合量 ^*可溶性酵素の比活性：μｍｏｌｅピルビン酸．ｍｉｎ^-1．ｍｇ^-1． ^**結合酵素の比活性：μｍｏｌｅピルビン酸．ｍｉｎ^-1ｍｇ^-1結合酵素． 固定化酵素の比活性は、酵素の調整法および可溶性酵素の比活性に依存すると 考えられる。可溶性酵素の比活性が高くなるにつれ、固定化した酵素の比活性も 高くなる。固定化による活性の損失がないのは明白である。 興味深いことに、使用した担体とその活性化法についてあまり差は認められない 。もちろん安定な結合、例えばアミド、ウレタン（カルバメート）を形成し、タ ンパク質の漏出が最少である方法が望ましい。この典型例として表２および３に 示すように、ＤＳＣとの活性化によって、最も高比活性を有する最も安定なアリ イナーゼ誘導体が得られる。 表２．各種方法で固定化したアリイナーゼの比活性およびタンパク質結合量 ^*異なった実験（異なった酵素調整法） ^**比活性：μｍｏｌｅピルビン酸．ｍｉｎ^-1．ｍｇタンパク質結合量^-1 表３．可溶性およびアリイナーゼおよび各種方法で固定化したアリイナーゼの 比活性 ^*可溶性酵素調製品の分析は低温室で１日放置後行った。 ３（ｉｉ）．アリイナーゼの酵素活性に対するｐＨの影響 アセトン沈殿によって調製された可溶性アリイナーゼ、Ｃｌ−セファロースに ６−アミノカプロイルで共有結合的に固定化したアリイナーゼおよびアガービー ズに包括したアリイナーゼの酵素活性に対するｐＨの作用を検討するために、共 有結合して、または包括して固定化した酵素のサンプルを、アセトン沈殿によっ て調製した可溶性酵素と同様に、ｐＨ４−９．５の範囲の緩衝液（０．０５Ｍ） 中でアリイン存在下、５分間室温でインキュベートした。反応混合液には酵素、 ＬＤＨ２．５−５．０Ｕ／ｍｌ、ＮＡＤＨ０．２ｍｇ／ｍｌ（０．２６ｍｍｏｌ ｅ／ｍｌ）が含まれていた。基質アリインを濃溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）として 終濃度２ｍｇ／ｍｌになるように添加することによって反応を開始した。室温で ５分間反応させた。活性は３４０ｎｍでの吸光度の減少として測定し、可溶性酵 素においてはそのまま記録した。固定化した（ｍｌ当たり０．５−１．０ｍｇの 結合）および包括した（ｍｌ当たり１ビーズ）酵素については、反応混合液を５ −１５分間震盪後、遠心して測定した。酵素反応は３４０ｎｍでの１分間当たり の光学密度の減少として評価した。活性の最高値を１００％とした。 図．１に示すように、可溶性アリイナーゼ（点付き四角）は包括アリイナーゼ（ 黒四角）と同様に至適ｐＨが６．５−７．０にあるベル型のグラフを示し、共有 結合したアリイナーゼ（黒菱形）は至適ｐＨ７．０−７．５を示していた。生成 物アリシンの安定性が酸性ｐＨで増大することから、固定化酵素との反応は以後 ｐＨ６．５で行うこととした。 ３（ｉｉｉ）．アリイナーゼの酵素活性に対する温度の影響 アリイナーゼの酵素活性（粗アセトン沈殿処理後に可溶化したペレット１−２ μｌ）、Ｃｌ−セファロースに共有結合的に固定化したアリイナーゼ（１μｇゲ ル）および寒天に包括したアリイナーゼ（１ビーズ約４０ｍｇゲル）について測 定温度の影響を検討した。可溶性酵素の量と同程度のＣｌ−セファロースに固定 化した酵素の懸濁液サンプルを、０．２ｍＭピリドキサール−５−リン酸含有０ ．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．５（０．８５ｍｌ）中のアリイン（２−５ｍｇ／ｍ ｌ）とともに、各温度で５分間インキュベートした。５０％ＴＣＡ ０．１ｍｌ を加えて反応を停止した。担体Ｃｌ−セファロース結合体も、寒天に包括したア リイナーゼと同様に遠心によって除去し、ピルビン酸濃度は、Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｎとＨａｕｇｅｎ（１９４３）の方法に従って、上清と２，４−ジニトロ−フェ ニルヒドラジンと反応させて測定した。各調製物の活性最高値 を１００％とした。 図．２に示したように、測定した温度範囲（＋／−１０％）において可溶性酵 素（点付き四角）と包括酵素（黒菱形）の活性について顕著な差は認められなか った。共有結合した酵素（黒四角）では４０℃以上の温度でかなり強い活性を示 すことがわかった。室温での活性は７０℃での約５０％であった。室温で反応が 行き着いてしまうという事実からほとんどの作業を室温で行った。 ３（ｉｖ）．アリイナーゼの安定性に対する温度の影響 ｐＨ６．５、室温での酵素活性測定は、酵素調製物（可溶性アリイナーゼ、 Ｃｌ−セファロース結合アリイナーゼおよび包括アリイナーゼ）を各種温度で測 定緩衝液ｐＨ６．５中、３０分間のプレインキュベーションをして行った。残存 する酵素活性はアリインとの５分間のインキュベーション後に測定した。酵素反 応をＴＣＡで停止し、ピルビン酸量を測定した。 結果を図．３に示す。可溶性アリイナーゼ（アセトン沈殿ペレットを３．８６ ｍｇタンパク質／ｍｌに溶解して調製）２μｌ／ｍｌ（点付き四角）、共有結合 したＣｌ−セファロース−６−アミノカプロイル アリイナーゼ（アセトン沈殿 によって調製した可溶性酵素５−６ｍｇ／ｇゲル）１ｍｇゲル／ｍｌ（黒四角） 、包括アリイナーゼ（アセトン沈殿によって調製し、実施例２記載の方法で包括 した）１ビーズ／ｍｌ（４０ｍｇゲル）（黒菱形）。各調製物の活性の最高値を １００％とした。図．３に示すように酵素本来の活性の損失は認められなかった 。包括酵素については２５−５６℃の温度範囲で活性に変化はないが、７２℃の 前熱処理後で活性の約５０％が損失した。共有結合した酵素の活性は２５−５６ ℃の温度範囲での熱前処理で増大するが、７２℃の熱前処理では室温での活性の ５０％を損失した。 実施例４．固定化アリイナーゼカラムにおけるアリシンの連続生産 各種比活性を有する固定化アリイナーゼを各種サイズのカラムに詰め、０．２ ｍＭピリドキサール−５−リン酸含有５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．５に溶解し た各種濃度（１０ｍｇ／ｍｌまで）のアリイン溶液を、室温で装填速度７ｍｌ／ ｈで添加した。例えば１−２Ｕｍｉｎ^-1ｍｌ^-1の低比活性の固定化酵素の場合に は、より大きなカラム（１ｘ１０ｃｍ）を用い、例えば〜１００μｍｏｌｅピル ビン酸ｍｉｎ^-1ｍｌ^-1の高比活性の固定化酵素の場合には、より小さいカラム（ １ｘ７ｃｍ）を用いた。カラムの流速は室温で７ｍｌ／ｈとした。アリシンの生 産効率は固定化アリイナーゼの比活性に比例していた。１−２ユニットの活性／ ｍｌ担体（１ｘ１０）のみを有するカラムでもアリイン溶液（５ｍｇ／ｍｌ）の ７０−８２％を連続的にアリシンに変換した。 特殊な例として、アリイナーゼを共有結合したＣｌ−セファロースをカラム （１．５ｘ７ｃｍ）に詰めた。０．２ｍＭピリドキサール−５’−リン酸含有５ ０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．５に溶解した各種濃度（１０ｍｇ／ｍｌまで）のア リインを室温、装填速度７ｍｌ／ｈで添加した。溶出液中のアリイン濃度を測定 した。図．４に示すように、この高比活性の固定化酵素を有するカラムの効率は 基質アリインの濃度に依存したほぼ直線性を示した。 実施例５．固定化アリイナーゼの長期安定性 ２週間のアリシン連続生産のために、１．５ｘ７ｃｍのカラムに詰めた固定化 Ｃ１−セファロース−６−アミノカプロイルアリイナーゼを、０．２ｍＭピリド キサール−５’−リン酸含有５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．５中のアリイン５ ｍｇ／ｍｌを装填速度７ｍｌ／ｈでアプライする条件下で使用した。この使用期 間中、カラムに活性の損失は認められなかった。カラムを４℃、２カ月間保存し ても、固定化アリイナーゼの効率に変化はなく、さらにアリシンの生産に使用す ることが可能であった。

【手続補正書】特許法第１８４条の４第４項 【提出日】１９９７年１０月９日（１９９７．１０．９） 【補正内容】 1. アリイナーゼを（ｉ）天然および合成の有機ポリマーと無機担体から成る 群から選択された担体に共有結合によって化学的に固定化すること、（ｉｉ）ポ リマーマトリックスまたはメンブレン中に包括するか、半透過性ポリマーメンブ レン中にマイクロカプセルとすることによって物理的に固定化すること、または （ｉｉｉ）セルロース結合ドメインタンパク質をカップリングしてセルロースに 吸着したり、ビオチン化してアビジンカラムに結合したり、ハプテンとして抗体 カラムに固定化することによって生物学的に固定化することを特徴とする、化学 的に、物理的に、または生物学的に固定化したにんにくアリイナーゼ。 3. 無機担体が（ｉ）チタニア、ジルコニアおよびアルミナから選択される孔 調節セラミックス、（ｉｉ）珪藻土、アタプルジト白土 （ａｔｔａｐｕｌｇｉｔｅ ｃｌａｙｓ）、軽石およびベントナイトから選択さ れる天然由来の多孔性鉱物、および（ｉｉｉ）孔調節ガラス（ＣＰＧ）である、 請求項１（ｉ）記載の化学的に固定化したアリイナーゼ。 4. 有機担体が、多糖類およびタンパク質とその誘導体から選択される天然の ポリマー、またはポリスチレン、ポリアクリレート型およびポリメタクリレート 型のポリマー、無水マレイン酸を骨格としたポリマー、ポリペプチド、ビニルお よびアリルポリマー、およびポリアミドから選択される合成ポリマーである請求 項１（ｉ）記載の化学的に固定化したアリイナーゼ。 5. 担体がセルロース、でんぷん、デキストラン、寒天、アガロース、キチン 、キトサン、ペクチン、ペクチン酸およびその誘導体から選択される多糖体であ るところの請求項４記載の化学的に固定化したアリイナーゼ。 6.合成ポリマーが（ｉ）ポリアクリレート、ポリメタクリレート、無水ポリメ タクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、 ポリグリシジルメタクリレート、ポリアクリロニトリルから選択されるポリアク リレート型のポリマー（ｉｉ）無水マレイン酸とエチレンの共重合体から成る無 水マレイン酸を骨格としたポリマー（ｉｉｉ）Ｌ−ロイシンと４−アミノ−ＤＬ −フェニルアラニンから成るポリペプチド（ｉｖ）化学的に修飾したポリビニル アルコール、ポリアリルアルコールおよびビニルエーテル共重合体から選択され るビニルまたはアリルポリマー、または（ｖ）ポリアミド、である請求項４記載 の化学的に固定化したアリイナーゼ。 7. アリイナーゼがスペーサーを介して多糖体または合成ポリマーの担体に結 合する請求項１、４−６のいずれか１項に記載の化学的に固定化したアリイナー ゼ。 9. ポリマーマトリックスがでんぷん、コラーゲン、ゼラチン、寒天、アルギ ン酸カルシウムおよびκ−カラゲナン、およびそれらの架橋結合誘導体から選択 される天然由来のゲル、またはポリアクリルアミド、ポリ（ビニルアルコール） およびポリアクリレートから選択される架橋結合した合成ポリマーから作成され ている請求項１（ｉｉ）記載の物理的に固定化したアリイナーゼ。 10．請求項１および３−８のいずれか１項に記載の化学的に、物理的にまたは 生物学的に固定化したにんにくアリイナーゼ、またはその混合物から成るカラム 。 11．請求項１および３−８のいずれか記載の固定化アリイナーゼまたは請求項 １０記載のカラムの、アリインから十分に精製されたアリシンの連続生産法にお ける使用。 12．アリインの溶液を請求項１０記載のカラムに添加し、溶出液中に十分に精 製されたアリシンを回収することから成る十分に精製されたアリシンを連続的に 生産する方法。 16．アリイナーゼがスペーサーｅ−アミノカプロン酸を介してセルロース、ア ガロース、またはＮ−アクリロイル−２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１， ３−プロパンジオールのポリマーに結合する請求項７記載の化学的に固定化した アリイナーゼ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ミロン，タリア イスラエル国42945 イスラエル，クファ ル ハイム (72)発明者 ラビンコブ，アハロン イスラエル国76564 レホボト，ミルチェ ン ストリート ５ (72)発明者 シバラマン，ヘフツイバ インド国411007 プネ，アウンド，アナン ド パーク 111

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. アリイナーゼを化学的に、物理的に、または生物学的に固定化した固定化 にんにくアリイナーゼ。 2. アリイナーゼが天然および合成の有機ポリマーと無機担体から成る群から 選択された担体に共有結合した、請求項１記載の化学的に固定化したアリイナー ゼ。 3. 無機担体が（ｉ）チタニア、ジルコニアおよびアルミナから選択される孔 調節セラミックス、（ｉｉ）珪藻土、アタプルジト白土 （ａｔｔａｐｕｌｇｉｔｅ ｃｌａｙｓ）、軽石およびベントナイトから選択さ れる天然由来の多孔性鉱物、および（ｉｉｉ）孔調節ガラス（ＣＰＧ）である、 請求項２記載の化学的に固定化したアリイナーゼ。 4. 有機担体が、多糖類およびタンパク質とその誘導体から選択される天然の ポリマー、またはポリスチレン、ポリアクリレート型およびポリメタクリレート 型のポリマー、無水マレイン酸を骨格としたポリマー、ポリペプチド、ビニルお よびアリルポリマー、およびポリアミドから選択される合成ポリマーである請求 項２記載の化学的に固定化したアリイナーゼ。 5. 担体がセルロース、でんぷん、デキストラン、寒天、アガロース、キチン 、キトサン、ペクチン、ペクチン酸およびその誘導体から選択される多糖体であ るところの請求項４記載の化学的に固定化したアリイナーゼ。 6. 合成ポリマーが（ｉ）ポリアクリレート、ポリメタクリレート、無水ポリ メタクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、 ポリグリシジルメタクリレート、ポリアクリロニトリルから選択されるポリアク リレート型のポリマー（ｉｉ）無水マレイン酸とエチレンの共重合体から成る無 水マレイン酸を骨格としたポリマー（ｉｉｉ）Ｌ−ロイシンと４−アミノ−ＤＬ −フェニルアラニンから成るポリペプチド（ｉｖ）化学的に修飾したポリビニル アルコール、ポリアリルアルコールおよびビニルエーテル共重合体から選択され るビニルまたはアリルポリマー、または（ｖ）ポリアミド、である請求項４記載 の化学的に固定化したアリイナーゼ。 7. アリイナーゼがスペーサーを介して多糖体担体に結合するところの請求項 １−６のいずれか１項に記載の化学的に固定化したアリイナーゼ。 8. アリイナーゼがポリマーマトリックスまたはメンブレンに包括されている か、もしくは半透過性のポリマーメンブレン内にマイクロカプセルとしている請 求項１記載の物理的に固定化したアリイナーゼ。 9. ポリマーマトリックスがでんぷん、コラーゲン、ゼラチン、寒天、アルギ ン酸カルシウムおよびκ−カラゲナン、およびそれらの架橋結合誘導体から選択 される天然由来のゲル、またはポリアクリルアミド、ポリ（ビニルアルコール） およびポリアクリレートから選択される架橋結合した合成ポリマーから作成され ている請求項８記載の物理的に固定化したアリイナーゼ。 10．請求項１−９のいずれか１項に記載の化学的に、物理的にまたは生物学的 に固定化したにんにくアリイナーゼ、またはその混合物から成るカラム。 11．請求項１−９のいずれか記載の固定化アリイナーゼまたは請求項１０記載 のカラムのアリシンの連続生産のための使用。 12．アリインの溶液を固定化にんにくアリイナーゼから成るカラムに添加し、 溶出液中に回収することから成る十分に精製されたアリシンを連続的に生産する 方法。 13．請求項１２の方法により得られる十分に精製されたアリシン。 14．ウイルス、細菌、菌および寄生虫の感染、高レベルのコレステロールおよ び血清脂質、高血圧および血栓症の処置のための薬品の調製に関する請求項１３ 記載のアリシンの使用。 15．食品添加物としての請求項１３記載のアリシンの使用。