CH619470A5 - Process for the preparation of 2-(2-acetamido-2-deoxy-3-O-D-glucopyranosyl)-D-propionyl-L-seryl-D-iso glutamine and 2-(2-acetamido-2-deoxy-3-O-D-glucopyranosyl)-D-propionyl-L-seryl-D-glu tamic acid - Google Patents

Description

L'invention est relative à la préparation de la 2-(2-acétamido-2-déoxy-3-0-D-glucopyrannosyl)-D-propionyl-L-séryl-D-iso-glutamine répondant à la formule:

ch20h h, oh nh-coch,

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désignée ci-après par l'abréviation Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln, et de l'acide 2-(2-acétamido-2-déoxy-3-0-D-glucopyrannosyl)-D-propionyl-L-séryl-D-glutamique répondant à la formule:

ch20h h, oh

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nh-cochj ch - co - nh - ch - co - nh - ch - cooh

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c00h désignée ci-après par l'abréviation Mur-NAc-L-Ser-D-Glu, ainsi que de leurs dérivés mono- et diesters, par exemple des groupes méthyliques, éthyliques ou propyliques, et de leurs dérivés amidés pouvant être substitués sur l'azote de l'amide, par exemple par des restes méthyle. Ces composés sont solubles dans l'eau et efficaces comme adjuvants immunologiques pour stimuler, chez 65 un hôte, les réponses immunitaires. Us servent notamment à renforcer l'action des immunogènes faibles. Plus particulièrement, lesdits agents sont utilisables pour l'immunisation de l'homme et des animaux à sang chaud contre des infections bactériennes,

3

619 470

virales et parasitaires, et contre différents antigènes tissulaires d'origine normale ou pathologique.

L'intérêt tout particulier des produits obtenus selon l'invention réside dans le fait qu'il n'est pas nécessaire d'avoir recours à des milieux particuliers d'administration, dont dépendrait la manifestation de l'action adjuvante, et les excipients auxquels on est conduit à les associer n'ont pour but que de faciliter l'utilisation de ces produits. En particulier, il n'est pas nécessaire,

lorsque l'un de ces produits est injecté, d'utiliser à cet effet une composition contenant une phase huileuse.

En outre, les agents adjuvants obtenus selon l'invention peuvent être administrés par voie orale ou parentérale, notamment par injection, scarification, ou par application sur des muqueuses.

Ces compositions médicamenteuses peuvent contenir un des agents obtenus selon l'invention et notamment le Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln en association avec un véhicule pharmaceutique-ment acceptable. Des compositions de ce type particulièrement préférées sont constituées par des solutions injectables contenant une dose efficace d'un produit obtenu selon l'invention. On utilise avantageusement, à cet effet, des solutions stériles dans une phase aqueuse de préférence isotonique, telles que des solutions isotoniques salines ou glucosées. Cela n'est bien entendu pas limitatif; on peut également utiliser une simple solution dans de l'eau distillée. Il est également possible d'utiliser des milieux d'injection contenant une phase huileuse, et notamment des émulsions eau dans l'huile. De telles émulsions sont obtenues en particulier avec des huiles végétales métabolisables, telles que décrites dans la demande de brevet français N° 75.04003.

Ces compositions médicamenteuses peuvent être présentées encore sous des formes variées, en utilisant à cet effet des excipients appropriés au mode d'administration choisi. On utilisera, par exemple, des compositions sous forme de cachets, comprimés ou gélules, pour l'administration orale, des aérosols ou des gels pour l'application sur les muqueuses.

Les agents adjuvants obtenus selon l'invention peuvent encore être sous forme lyophilisée pour permettre la préparation extem-poranée de solutions injectables, ou pour scarification.

Une forme pharmaceutique avantageuse pour la préparation extemporanée de solutions injectables comprend une dose d'environ 2 mg d'un produit adjuvant selon l'invention, à l'état lyophilisé, en association avec environ 10 mg de lactose comme excipient.

Un produit obtenu selon l'invention, et en particulier le Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln, peut aussi être un agent immunogène, notamment à un antigène vaccinant faible.

Les procédés selon l'invention sont définis dans les revendications. Selon l'un de ces procédés, on fixe à l'acide N-acétylmuramique la chaîne peptidique L-Ser-D-iso-Gln, L-Ser-D-Glu, ou à une chaîne estérifiée ou amidée correspondante dont sont bloqués les groupements réactifs, à l'exception du groupé amine devant réagir avec l'acide N-acétylmuramique. Après la fixation, on libère les fonctions protégées.

Selon le second procédé, les deux aminoacides formant la chaîne peptidique sont fixés successivement. On fixe d'abord un dérivé adéquat de la L-sérine au dérivé de l'acide N-acétylmuramique, puis, sur le produit obtenu, on fixe le dérivé d'acide D-glutamique ou de l'isoglutamine à la L-sérine par formation d'une liaison peptidique.

D'autres caractéristiques apparaîtront au cours de la description d'un exemple de préparation du Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln selon l'invention, ainsi que des essais mettant en évidence les propriétés pharmacologiques de ce produit.

L'état de la technique est illustré par les brevets français N05 2248025 et 2292486 qui décrivent, d'une manière générale, des dérivés de muramyle efficaces comme adjuvants de l'immunité.

La nature du premier acide aminé de la chaîne de substitution n'est pas précisée. Or, en utilisant, conformément à l'invention, des dérivés comportant un groupement 1-séryle, on obtient de remarquables agents adjuvants, ce qui n'était pas suggéré par les brevets cités.

Exemple de synthèse du Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln

Ce composé, dont le nom suivant la nomenclature officielle est 2-(2-acétamido-2-déoxy-3-0-D-glucopyrannosyl)-D-propionyl-L-séryl-D-isoglutamine, est préparé en plusieurs étapes. Dans un premier temps, la chaîne peptidique est synthétisée puis, dans un second temps, cette chaîne est fixée au résidu muramyle. Pendant cette synthèse, les fonctions ne devant pas entrer en réaction sont protégées par des groupes de protection ou de blocage qui sont ensuite éliminés.

Dans la suite de cet exposé, les abréviations utilisées ont les significations suivantes:

Mur-NAc 2-acétamido-2-déoxy-3-0-(D-2-propionyl)-D-gluco-

pyrannose

Glu acide glutamique iso-Gin isoglutamine

Ser sérine

4,6-O-bzi 4,6-O-benzylidène

ß-bzl ß-benzyl

BOC t-butyloxycarbonyl

OBzl ester benzylique

OSu ester succinimidique

Bzl éther benzylique

BOC-L-Ser (Bzl)-D-iso-Gln-OBzl (I)

1,48 g (5 mmol) de BOC-L-Ser (Bzl) [E. Wünsch, A. Zwick, «Chem. Berg.», 97 (1964) 2497] est ajouté sous agitation à une solution dans le diméthylformamide de 1,64 g (6 mmol) du chlorhydrate de l'ester benzylique de la D-isoglutamine [P. Lefrancier, E. Bricas, «Bull. Soc. Chim. France», (1969) 3561] et de 0,66 ml (6 mmol) de N-méthylmorpholine. On ajoute 1,24 g (6 mmol) de NN'-dicyclohexylcarbodiimide, et le mélange réactionnel est laissé à la température ambiante pendant 12 h. Il est ensuite concentré et repris dans 50 ml d'acétate d'éthyle et la phase organique est lavée successivement avec une solution d'acide citrique à 10%, à l'eau, avec une solution N de bicarbonate de sodium, puis à l'eau jusqu'à pH neutre. La phase acétate d'éthyle est séchée sur MgS04, puis concentrée. Le produit est cristallisé dans le mélange éther/éther de pétrole. On obtient 1,40 g de produit, soit un rendement de 55%.

PF 65-66° C.

ccd25= +5,8° (méthanol absolu).

Analyse pour C27H35O7N3 (513,6) :

Calculé: C63,l H 6,9 N8,2 %

Trouvé: C63,2 H 7,1 N7,97%

Chlorhydrate de L-Ser (Bzl)-D-iso-Gln-OBzl (II)

1,3 g (2 mmol) de (I) sont traités pendant 30 mn par 5 ml d'une solution environ N d'acide chlorhydrique dans l'acide acétique. Le mélange réactionnel est concentré à sec et le produit cristallisé dans le mélange méthanol/éther. On obtient 765 mg de produit, soit un rendement de 85%.

PF 158-161° C.

<xd25= +8,2° (méthanol absolu).

Mur-NAc ($-bzl-4,6-bzi)-L-Ser (Bzl)-D-iso-Gln-OBzl (III)

Une solution de 471,43 mg (1 mmol) de Mur-NAc (ß-bzl-4,6-bzi) dans le mélange acétonitrile/diméthylformamide (2/1, v/v -10 ml) contenant 0,141 ml (1 mmol) de triéthylamine est versée dans une suspension, maintenue à 0°C, de N-éthyl-5-phénylisoxazolium-3'-sulfonate (253 mg -1 mmol) (réactif D de Woodward, Aldrich) dans 10 ml d'acétonitrile.

s

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

619 470

4

Le mélange est agité à 0°C jusqu'à l'obtention d'une solution limpide (90 mn environ), puis sont ajoutés 450 mg (1 mmol) de (II) en solution dans 10 ml du mélange acétonitrile/diméthyl-formamide (2/1, v/v) contenant 0,141 ml (1 mmol) de triéthyl-amine. Après une nuit d'agitation à la température ambiante, les s solvants sont évaporés sous vide et le produit précipité dans le mélange diméthylformamide/eau. On obtient 818 mg de produit,

soit un rendement de 94,3%.

PF 180-186° C.

<xd25 = —17° (NN'-diméthylformamide). io

Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln (IV)

768 mg du composé (III) (0,88 mmol) sont traités par 30 ml d'une solution d'acide acétique à 60% pendant 1 h à 100°C.

Après refroidissement de la solution, l'acide acétique est évaporé is sous vide et le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice (35 g) (chloroforme/méthanol, 6/2, v/v). Les fractions pures sont jointes, évaporées sous vide, donnant un résidu chromatographiquement pur (plaque de gel de silice/chloroforme/ méthanol, 6/2, v/v). On obtient 287 mg de produit, soit un 20

rendement de 42%.

Ce produit, repris dans 20 ml d'acide acétique glacial, est ensuite hydrogéné pendant 10 h en présence de palladium sur charbon. Après filtration du catalyseur et concentration à sec du mélange réactionnel, le produit est obtenu par précipitation dans 25 un mélange éthanol/acétone/éther. On obtient 140 mg de produit, soit un rendement de 74%. Le pouvoir rotatoire est aD25= +47,1° (acide acétique glacial).

Le produit est chromatographiquement homogène sur plaques de gel de silice dans les mélanges n-butanol/pyridine/acide 30

acétique/eau (30/20/6/24, v/v) et n-butanol/acide acétique/eau (4/1/5, v/v - phase supérieure).

Analyse pour C19H32O12N4 (508,5):

Calculé: C 44,88 H 6,34 NI 1,02% 3J

Trouvé: C44,8 H 6,3 Nll,l %

Propriétés pharmacologiques

I. Détermination de l'innocuité du Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln

L'innocuité, ou au contraire la toxicité du produit selon 40

l'invention, est étudiée par injection intraveineuse sur des souris âgées de deux mois. En augmentant progressivement les doses administrées, on détermine celle pour laquelle la mortalité des souris d'un même lot s'établit à 50% (DL50).

Pour le produit étudié, on a montré que la DLso est supérieure à 1 g/kg d'animal, ce qui est de beaucoup supérieur aux doses pour lesquelles ce produit manifeste ses propriétés adjuvantes.

2. Caractère adjuvant en phase aqueuse

Dans les séries d'essais dont les résultats sont indiqués ci-après, on a étudié l'influence du Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln sur le taux des anticorps antialbumine dans les conditions suivantes.

Des groupes de 8 souris Swiss âgées de deux mois reçoivent, par injection sous-cutanée, 0,5 mg d'antigène constitué par de l'albumine de sérum bovin (BSA) et 0,1 mg de la substance essayée dans une solution saline isotonique. Cette dose élevée d'antigène, parce qu'elle se situe à la limite de la dose paralysante vis-à-vis de la réponse immunitaire, entraîne de ce fait une réponse faible ou nulle à l'antigène seul chez les témoins; elle constitue donc un critère sévère pour mettre en évidence l'activité d'une substance adjuvante. 30 j plus tard, les souris reçoivent un rappel contenant 0,1 mg du même antigène.

Le taux d'anticorps est déterminé par hémagglutination passive en utilisant des hématies de mouton traitées à la formaline et recouvertes de l'antigène étudié selon la méthode décrite par A.A. Hirata et M.W. Brandiss («J. Immunol.», 100, 641-648, 1968). Les prélèvements ont lieu 14,28, 34 et 36 j après la première injection.

A titre de comparaison, des souris reçoivent, à la place du Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln, soit des lipopolysaccharides (LPS) (extrait de S. enteritidis par la méthode eau/phénol), soit l'adjuvant désigné sous le nom WSA et décrit par Adam et coll. [«Infect. Immun.» (1973), 7, 855-861]. Les souris témoins ne reçoivent que l'antigène.

Les résultats de ces essais sont donnés dans le tableau 1.

Tableau 1

Titre d'anticorps

14e j

28e j

34= j

36e j

Témoin (BSA)

<3

<3

<3

<3

BSA+LPS (100 ng)

<3

6

50

1310

BSA+WSA (300 |ig)

<3

<3

<3

6

BSA+Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln (100 (J.g)

12

25

1600

1600

On a renouvelé ces essais en limitant la dose d'antigène de la première injection à 0,05 mg, les autres conditions étant identiques par ailleurs. Cette dose d'antigène plus faible donne par elle-même une réponse positive chez les témoins qui ont reçu l'antigène sans adjuvant. Elle permet donc de mettre en évidence une substance qui inhibe la réponse immunitaire humorale. Par ailleurs, une substance adjuvante, dans ces conditions, élève toujours le taux d'anticorps par rapport à celui des témoins.

Dans ces essais, la détermination du taux d'anticorps a été effectuée simultanément par hémagglutination passive (PA) et par la méthode de fixation de l'antigène par le sérum (ABC), telle que décrite par P. Minden et S. Farr («Handbook of Exp. Immunol.» P 463, Weir D.M. éd., Blackwell Scient. Pub. Oxford et Edimbourg, 1967).

55 Les résultats de ces essais figurent dans le tableau 2.

Tableau enfin de brevet)

Ces résultats montrent que le Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln, administré en solation isotonique saline, provoque un important so accroissement du taux d'anticorps formés, alors que, dans les mêmes conditions, le WSA est pratiquement inactif.

Dans la seconde série d'essais, pour laquelle la dose d'antigène, lors de la première injection, est faible, la présence de WSA semble même inhiber la formation d'anticorps, alors que le 65 Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln, au contraire, favorise l'apparition des anticorps.

Le Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln peut être considéré, de façon générale, comme comparable au LPS pour sa capacité de stimula-

5

619 470

tion de la formatioh des anticorps, mais, contrairement au LPS, Elles peuvent être utilisées notamment pour favoriser l'immu-

il est dépourvu de toxicité. nisation de l'hôte (patients humains ou animaux) à l'égard des

On obtient donc des compositions adjuvantes dépourvus de infections d'origine bactérienne ou virale, des antigènes des toxicité et qui peuvent être utilisées pour accroître l'efficacité de tumeurs, etc. Elles sont également efficaces pour la fabrication de vaccins d'origine bactérienne ou virale, notamment quand ceux-ci 5 sérums contenant des anticorps actifs à l'égard de ces antigènes,

sont faiblement immunogènes.

Tableau 2

Titre d'anticorps

14e j

28e j

34e j

36e j

42e j

PA

ABC

PA

ABC

PA

ABC

PA

ABC

PA

BSA (témoin)

<3

<20

<3

<20

6

<20

50

25

25

BSA + LPS

<3

<20

25

<20

400

300

3200

500

800

BSA + WSA (100 ng)

<3

<20

<3

<20

6

<20

3

<20

3

BSA + WSA (300 ng)

<3

<20

<3

<20

<3

<20

<3

<20

<3

BSA + Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln (100 (ig)

<3

<20

3

<20

50

<20

800

230

260

R

à

Claims (4)

1. 619 470

   2

   REVENDICATIONS

   1. Procédé de préparation de la 2-(2-acétamido-2-déoxy-3-0-D-glucopyrannosyl)-D-pyrannosyl)-D-propionyl-L-séryl-D-isoglutamine, de l'acide 2-(2-acétamido-2-déoxy-3-0-D-gluco-pyrannosyl)-D-propionyl-L-séryl-D-glutamique, et de leurs esters ou amides, caractérisé en ce que l'on fixe la chaîne peptidique L-séryl-D-isoglutamine, L-séryl-D-glutamique, ou une chaîne estérifiée ou amidée correspondante, les groupes réactifs de ces chaînes étant bloqués à l'exception du groupé amine devant réagir, à un dérivé adéquat de l'acide N-acétylmuramique, dont les groupes hydroxyles sont également protégés par des groupes de blocage, et que, une fois la fixation faite, on élimine les groupes de blocage.
2. 2. Procédé de préparation des composés énumérés à la revendication 1, caractérisé en ce que l'on fixe successivement sur le dérivé de l'acide N-acétylmuramique, la L-sérine, puis la D-isoglutamine, l'acide D-glutamique, ou leur dérivé estérifié ou s amidé correspondant, en bloquant préalablement à chaque fixation les groupes réactifs à l'exception de ceux devant intervenir dans cette fixation à liaison peptidique, puis, la fixation réalisée, l'on élimine les groupes de blocage.
3. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la io préparation est effectuée au moyen des esters comportant des groupes fonctionnels réactifs ou au moyen de NN'-dicyclohexyl-carbodiimide.
4. 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la préparation est effectuée au moyen des esters comportant des

   15 groupes fonctionnels réactifs ou au moyen de NN'-dicyclohexyl-carbodiimide.