CH620196A5

CH620196A5 -

Info

Publication number: CH620196A5
Application number: CH207779A
Authority: CH
Inventors: Daniel Frank Veber; Frederick William Holly; Ruth Foelsche-Nutt; Sandor Lajos Varga
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1974-04-03
Filing date: 1979-03-02
Publication date: 1980-11-14
Also published as: CH617667A5; DE2514381A1; JPS5492957A; FR2266515A1; DE2514381B2; NL171700C; CY1071A; HK43480A; US3959248A; GB1473480A; SE7503366L; ES436027A1; AU7921575A; SE425659B; DE2514381C3; NL7503023A; NL171700B; FR2266515B1; KE3067A; JPS50154247A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Tripeptidestern mit antidepressiver und/oder die Schilddrüsenhormonabgabe stimulierender Wirkung.

Das natürliche, Thyrotropin (Thyreotropin) freisetzende Hormon (TRH) ist das Tripeptid L-Pyroglutamyl-L-histidyl-

L-prolinamid. Die Synthese dieses Peptids ist bekannt. Spezielle Herstellungsmethoden sind in den USA-Patentschriften 3 753 569, 3 746 697, 3 757 003 und 3 752 800 beschrieben. Homologe, Derivate und Isomere von TRH sind ferner in «Vitamins and Hormones, Advances in Research and Applications», Band 29 (1971), Academic Press, N.Y. und London, Seiten 1-39; «Chemistry and Biology of Peptides, Proceedings of the Third American Peptide Symposium» (1972), Ann Arbor Science Publishers Inc., Ann Arbor, Michigan, Seiten 601-608; Zh. Obshch, Khim 42 Nr. 2 (Februar 1972, Seite 483; J. Med. Chem. 15 (1972), Seiten 8, 219 und 479; J. Med. Chem. 16 (1973), Seiten 1137-1140; C.A. 75 (1971), 49 547 w, 49 548 x, 77 268 z und 88 942 r; C.A. 74 (1971), 13 401 m und C.A. 73 (1970), 21 767 c und 95 001 v beschrieben. Es wurde gefunden, dass TRH ausser seiner die Schilddrüsenhormonabgabe stimulierenden Wirksamkeit eine nahezu sofort einsetzende antidepressive Wirkung besitzt; vergi. Präge Jr. et al., LANCET (11. November 1972), Seite 999 und Plotnikoff et al., SCIENCE 178, 417 (1972).

Erfindungsgemäss werden neue Tripeptidamide hergestellt, welche antidepressive Wirksamkeit und eine entsprechende thyreotrope (Thyrotropin freisetzende) Hormonaktivität wie TRH aufweisen.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung eines Tripeptidesters der Formel

M!-M2-M3-OR (I)

sowie deren Säureadditionssalze, worin Mj der Rest einer Aminosäure aus Gruppe kic, kpc oder pca, M2 der Rest his oder N3im-substituiert-his ist, M3 den Rest einer Aminosäure aus der Gruppe L-pip, L-pro, L-tca, R einen Q-Qo-Alkylrest oder Cycloalkylrest bedeuten und his und L-pro im Tripeptid nicht gemeinsam auftreten, dadurch gekennzeichnet, dass man die entsprechenden Aminosäuren bzw. deren aktivierte Derivate in beliebiger zeitlicher Reihenfolge und unter intermediärem Schutz von jeweils von der Reaktion auszuschliessenden reaktiven funktionellen Gruppen miteinander kondensiert und dass man zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese die Carboxylgruppe des terminalen Aminosäureesters M3 entsprechend verestert.

Der Einfachheit halber werden die Aminosäuren bzw. deren Reste in der vorliegenden Anmeldung wie folgt abgekürzt:

Aminosäure

Abkürzung

Histidin his

Pyroglutaminsäure pca

Prolin pro

2-Ketoimidazolidin-5-carbonsäure kic

2-Ketopiperidin-6-carbonsäure kpc

Thiazolidin-4-carbonsäure tea

2-Pyrrolcarbonsäure prl

L-2-Piperidincarbonsäure

L-pip

2-Ketooxazolidin-4-carbonsäure koc

Die vorangestellten Buchstaben L- bzw. D, L- bezeichen einzelne Aminosäure-Stereoisomere bzw. Stereoisomergemische. Wenn kein Buchstabe vorangestellt wird, umfasst die Aminosäure sowohl das L-Stereoisomere als auch D,L-Mischungen. Somit umfasst pca beispielsweise L-pca und D,L-pca-Gemische einschliesslich racemischer Gemische, Im allgemeinen werden jene Tripeptide der Formel I bevorzugt, bei denen Mt, M2 und M3 sämtlich die L-Konfiguration aufweisen.

Ausser den Aminosäureabkürzungen werden in der vorliegenden Anmeldung folgende Abkürzungen für weitere bei der

5

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15

20

25

30

35

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45

50

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60

65

3

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Peptidherstellung angewendete Ausgangsverbindungen, Rea-gentien, Lösungsmittel, Schutzgruppen u.a. verwendet:

Verbindungen, Schutzgruppen, Lösungsmittel u.a. Abkürzung

Benzyloxycarbonyl 2,4 -D initrophenyl Dicyclohexylcarbodiimid D imethylformamid 1 -Hydroxybenzotriazol tert.-Butyloxycarbonyl T rifluoressigsäure Harze Azid

Z

DNP

DCC1

DMF

HBT

BOC

TFE

P

N3

R im Esterrest bedeutet einen Ci-C10Alkyl- oder Cycloalkylrest. Die Alkylreste umfassen unsubstituierte und substituierte lineare oder verzweigte Reste. Beispiele für bevorzugte Reste R sind die tert.-Butyl-, n-Decyl-, Cyclohexyl-, n-Nonyl- und 2,4-Dimethyl-n-heptylgruppe. Besonders bevorzugt wird die Methylgruppe.

10

15

20

Eine Gruppe von bevorzugten Tripeptiden sind jene, bei denen M, in der Formel I kic oder kpc ist. Beispiele für diese Tripeptide sind:

kpc-his-L-tca-OC4H9 D, L-kic-L-his-L-tca-OC2H5 D, L-kpc-D, L-his-L-pip-O-cyclohexyl L-kic-D, L-his-L-pip-OC9Hi9.

Besonders bevorzugt werden solche Tripeptide, bei denen M! in der Formel I den Rest einer einen ógliedrigen heterocy-clischen Ring enthaltenden Amonosäure darstellt.

Eine weitere Gruppe von bevorzugten Tripeptiden sind jene, bei denen M3 in der allgemeinen Formel I L-tca oder L-pip ist. Beispiele für diese bevorzugten Tripeptide sind: kic-his-L-pip-OCH(CH3)2 kic-D, L-his-L-tca-OC2H5 D, L-pca-his-L-tca-OC9Hlg.

Besonders bevorzugt werden pca-his-L-tca-OR und pca-his-L-pip-OR. Die am meisten bevorzugten Tripeptide dieses Typs sind L-pca-L-his-L-tca-OR (1) bzw. L-pca-L-his-L-pip-OR (2):

„NH

ÌÌ

-N

°h|:H2 0

uni H

C-N-C C

H

0 n

C - OR

N

S

0)

(2)

Eine weitere Gruppe von bevorzugten Tripeptiden sind jene, bei denen M2 in der Formel I N3,m-substituiert-his ist. «N3,'-substituiert» zeigt die Substitution des in 3-Stellung befindlichen Imidazolinstickstoffatoms von Histidin an, wie die nachstehende Formel erläutert:

N-rSubstituiert

-N

H ■N

CH2

C H

0

ti

-c-

50 Bevorzugte Substituenten sind Cj-Ce-Alkylreste und Reste der Formel -(CH2)bCOOH, wobei b eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist. Als Substituenten bevorzugt werden Alkylreste, wie die Methyl-, oder tert.-Butylgruppe und die Cyclohexalgruppe, sowie die Gruppe -CH2-COOH. Beispiele für bevorzugte 55 Tripeptide, bei denen M2 N3im-substituiert-his ist, sind: pca-N3,m-C5H11-his-L-tca-0-2-äthyl-n-hexyl L-kic-N3im-cyclohexyl-D, L-his-L-tca-OCH(CH3)2 und kic-N3im-(CH2)3-COOH-his-L-pip-O-cycl0pentyl. Ein besonders bevorzugtes Tripeptid dieses Typs ist: 60 pca-N3,m-CH3-his-L-tca-OCi0H2i.

Eine weitere Gruppe von bevorzugten Tripeptiden mit der Formel I sind solche, bei denen Mj kpc und M3 L-tca oder L-pip sind. Beispiele für diese Tripeptide sind:

kpc-D, L-his-L-tca-OC3H7 65 L-kpc-D, L-his-L-pip-OC10H2i und

D, L-kpc-N3im-CH(CH3)3-L-pip-0-cyclopentyl.

Die am meisten bevorzugten Peptide dieses Typs sind L-kpc-L-his-L-pip-OR mit der nachstehenden Formel:

Die erfindungsgemäss hergestellten Säureadditionssalze sind z. B. pharmakologisch verträgliche Salze von anorganischen Säuren, wie Salz-, Schwefel-, Bromwasserstoff- oder Phosphorsäure, sowie von organischen Säuren, wie Cyclohexyl-carbon-, Wein-, Oxal-, Fumar-, Zitronen-, Äpfel-, Ascorbin-, Essig- und Milchsäure, sowie Fettsäuren, z. B. Öl-, Pamoa-oder Palmitinsäure. Pharmakologisch verträglich bedeutet,

dass die Salze nichttoxisch sind und eine entsprechende pharmakologische Wirksamkeit wie das Tripeptide selbst aufweisen.

Beim erfindungsgemässen Verfahren werden entspre-

O H

II II

chende Aminosäurebausteine über die Peptidbindung -C-N-miteinander verknüpft. Wenn das hergestellte Peptid linear ist, erfolgt die Verknüpfung durch Umsetzung zwischen einer ci-Aminogruppe und einer Carboxylgruppe verschiedener Aminosäuren. Gemäss allgemeiner Übung lenkt man diese Verknüpfung dadurch, dass man funktionellen Gruppen der Aminosäurebausteine, welche an der Errichtung der Peptidbindung nicht teilnehmen sollen, schützt bzw. blockiert. Wichtig für die Schutzgruppen ist, dass sie

1. die Verknüpfungsreaktion nicht stören und

2. bei der Peptidsynthese nach Bedarf leicht abspaltbar sind.

Es sind mehrere Arten von blockierenden Gruppen bzw. Schutzgruppen bekannt und verwendbar. Geeignete Schutzgruppen für die Aminogruppe sind z. B. Acylgruppen mit den allgemeinen Formeln.

O

II

Ra-C-, R-S02-, Ra-S- und (Ra0)2-P-0-,

wobei Ra ein Alkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Alkaryl- oder substituierter Alkyl- oder Arylrest ist, Gruppen vom Urethan-Typ mit der allgemeinen Formel

O O

. II II

R —O-C— und R -S-C-

wobei Rb z. B. ein Alkyl-, Aryl-. Alkaryl-, Aralkyl- oder substituierter Alkyl- oder Arylrest, ein Alkylaminorest oder ein heterocyclischer Rest ist, ferner Alkyl-, Aryl- und substituierte Alkyl- oder Arylreste sowie Arylidenreste mit der allgemeinen Formel pj

RC=C-

wobei Rc ein Aryl- oder substituierter Arylrest ist.

Typische Beispiele für Acylgruppen sind die Formyl-, p-ToluoIsulfonyl-, Chloracetyl-, Trifluoractyl-, Phthaloyl-, Phosphoryl-, Benzolsulfonyl-, o-Nitrophenoxy-, Acetyl-, o-Ni-trophenylsulfenyl- und Dibenzylphosphorylgruppe. Beispiele

0

II

C-OR

für Alkyl- und Aryl-Schutzgruppen sind die Triphenylmethyl-, Benzyl-, Benzylthiomethyl-, Dinitrophenyl- und Diphenyl-gruppe sowie Trialkylsilylreste. Beispiele für geeignete Arylidenreste sind die Benzyliden- und 2-Hydroxy-5-chIorbenzyli-dengruppe.

Die am besten geeigneten Schutzgruppen für die Aminogruppe sind die Urethangruppen der Formel

O

Rb_0—C—.

Beispiele für besonders geeignete Schutzgruppen vom Urethan-Typ sind solche, bei denen Rb eine Benzyl- oder substituierte Benzylgruppe, wie eine p-Methoxybenzyl-, p-Nitro-benzyl-, p-Phenylazobenzyl-, p-Brombenzyl- oder 2-Nitro-benzylgruppe, ein Cycloalkylrest, wie eine Methylcyclohexyl-oder Cyclopentylgruppe, ein substituierter Cycloalkylrest, wie eine Methylcyclohexyl-, Dodecylcyclohexyl- oder Isobutylcy-clopentylgruppe, eine Adamantyl-, Piperidino- oder Dimethyl-aminogruppe oder ein Alkylrest, wie eine n-Propyl-, tert.-Bu-tyl-, tert.-Amyl-, Octyl- oder Dodecylgruppe, ist.

Ausser mit Hilfe der vorstehend beschriebenen blockierenden Gruppen kann man die Aminogruppe auch durch Salzbildung schützen, vorausgesetzt, dass sie eine genügende Basizität aufweist.

Die Carboxylgruppen der Aminosäurebausteine werden im allgemeinen durch Veresterung, Amid- oder Hydrazidbildung und Salzbildung geschützt.

45 Beispiele für zum Schutz der Carboxylgruppe geeignete Ester sind Alkylester, wie Methyl-, Äthyl-, tert.-Butyl- und Decylester, Arylester, wie Benzyl-, Phenyl- und Benzhydryl-ester, substituierte Alkylester und substituierte Phenylester, wie Pentamethylbenzyl-, Pehnylazophenyl- und o-Cyanbenzyl-50 ester.

Die zum Schutz der Carboxylgruppe dienenden Hydrazide sind gewöhnlich substituiert, wie das Benzyloxyhydrazid, tert.-Butyloxycarbonylhydrazid, Phenylhydrazid und Tritylhy-drazid.

55 Von einem Schutz der Carboxylgruppe durch Amidbil-dung wird in der Regel nur selten Gebrauch gemacht, da sich die Amidgruppe nur schwierig abspalten lässt, ohne dass die Peptidbindung selbst aufgespalten wird. Wenn jedoch - wie im vorliegenden Fall - die Tripeptid-Endgruppe eine Amidgruppe 60 sein kann, lässt sich die Carboxylgruppe mit Vorteil auf diese Weise schützen.

Einige die Carboxylgruppe schützende Estergruppen weisen zusätzlich eine aktivierende Wirkung auf. Aufgrund der Aktivierung wird die für die Verknüpfung massgebliche Reak-65 tionsfähigkeit erhöht. Der Aktivierungsgrad hängt von der speziellen chemischen Struktur des Esters ab; dabei gilt allgemein, dass die Aktivierung durch das Ausmass bestimmt wird, mit welchem die Schutzgruppe die Empfänglichkeit der Car-

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boxylfunktion gegenüber einem nukleophilen Angriff erhöht. Beispiele für die Carboxylgruppe aktivierende Estergruppen sind die p-Nitrophenyl-, 2,4-Dinitrophenyl-, N-Hydroxysuccin-imidyl-, Perfluorphenyl-, Cyanmethyl-, Perchlorphenyl-, 2,4,5-Trichlorphenyl-, 4-Methylthiophenyl-, 8-Hydroxychino- 5 lyl- und 1-Hydroxybenzotriazolgruppe sowie Thioestergrup-pen, wie die p-Nitrobenzylthio-, p-Nitrophenylthio- und Phe-nylthiogruppe.

Die Verknüpfung der Aminosäurebausteine kann nach verschiedenen Methoden erfolgen. Beispiele für der Verknüp- 10 fung zugrundeliegende Umsetzungen sind:

(a) direkte Kondensation einer Na-geschützten Aminosäure mit einer Aminosäure mit geschützter Carboxylgruppe;

(b) Überführung einer Na-geschützten Aminosäure in das 15 Azid und Umsetzung des Azids mit einer Aminosäure mit geschützter Carboxylgruppe;

(c) Umsetzung eines Halogenids oder gemischten Anhydrids einer Na-geschützten Aminosäure mit einer Aminosäure mit geschützter Carboxylgruppe; 20

(d) Umsetzung eines aktiven Esters einer N"-geschützten Aminosäure mit einer Aminosäure mit geschützter Carboxylgruppe; und

(e) direkte Verknüpfung einer Na-geschützten Aminosäure mit einer eine geschützte Carboxylgruppe auf- 25 weisenden Aminosäure mit Hilfe eines Verknüpfungsmittels, z. B. mit einem Carbodiimid, einem Carbodiimid und einem Hydroxybenzotriazol, einem Carbodiimid und N-Hydroxybernsteinsäureimid, Tri-phenylphosphit und Imidazol, Triphenylphosphin und 30 Dipyridyl-2,2'-disulfid, oder Woodward-Reagens.

Von den Vernküpfungsverfahren sind die Azidmethode (b) und die mit Hilfe eines Carbodiimids durchgeführte Methode (e) besonders gut geeignet.

Die erfindungsgemäss hergestellten Peptide können durch 35 verschiedene Reaktionsfolgen hergestellt werden. Ein vorteilhaftes Syntheseschema beruht auf der stufenweisen Verknüpfung der einzelnen Aminosäuren, wobei zuerst ein Dipeptid als Zwischenprodukt und aus diesem das Tripeptid-Endprodukt hergestellt werden. 40

Bei der Durchführung der Verknüpfungsstufen wird die an der Carboxylgruppe reagierende Aminosäurekomponente im allgemeinen an der a-Aminogruppe geschützt, während die an der a-Aminogruppe reagierende Aminosäure gewöhnlich an der Carboxylgruppe geschützt wird. Wenn die betreffende 45

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

In der (den) nächsten Synthesestufe(n) wird das Tripeptid vom Harz (?) befreit. Abhängig vom angewendeten Reaktions- 60 system kann das freie Tripeptid eine Säure-, Ester- oder Amid-Endgruppe aufweisen. Wenn das Tripeptid nach der Harzabspaltung eine Säure-Endgruppe aufweist, kann man es nach herkömmlichen Methoden in den entsprechenden Ester oder das entsprechende Amid überführen. Ebenso kann man, 65 wenn das freie Tripeptid eine Ester-Endgruppe besitzt, diese nach Bedarf in herkömmlicher Weise durch eine Amidgruppe ersetzen.

Aminosäure auch eine sekundäre funktionelle Gruppe (wie die Imidazolgruppe bei Histidin) aufweist, kann diese ebenfalls geschützt werden. Die nachstehenden Gleichungen veranschaulichen eine derartige Stufensynthese. Y in den Gleichungen bedeutet eine Schutzgruppe für die Carboxylgruppe.

(a) L-pca + L-his-Y VerknüPfu"g ,

L-pca-L-his-Y

(-Y)

(b) L-pca-L-his-Y > L-pca-L-his

(0 L-pca-L-his + L-tca-OR V"MP'""S , L.pca_L, his-L-tca-OR

Wenn Y in der Stufe (a) eine aktivierende Gruppe darstellt, können die Stufen (b) und (c) kombiniert werden. Ferner kann L-pca (obwohl dies im vorstehenden Reaktionsschema nicht angezeigt wird) an der Aminogruppe geschützt sein. In diesem Fall muss man die Schutzgruppe in einer zusätzlichen Verfahrensstufe abspalten, um L-pca-L-his-L-tca-OR zu erhalten.

Die durch die Gleichungen (a) bis (c) veranschaulichte Reaktionsfolge dient nur der Erläuterung und ist nicht im einschränkenden Sinne aufzufassen. Bei der Synthese kann man somit auch die Aminosäure M2 mit der Aminosäurekomponente M3-OR zum Dipeptid M2—M3—OR und dieses mit der Aminosäure Mi zum gewünschten Tripeptid Mi-M2-M3-OR verknüpfen.

Bei einer weiteren Methode zur Herstellung der Tripeptide verwendet man eine Harzmatrix, an welcher man das Peptid stufenweise aufbaut. Bei diesem Verfahren kann ein lösliches oder unlösliches Harz verwendet werden. Unlösliche Harze werden bevorzugt; die entsprechende Methode wird gewöhnlich als Festphasen- oder Merrifield-Synthese bezeichnet. Die unlöslichen Harze weisen im allgemeinen Stellen auf, an welche Carboxylgruppen gebunden werden können. Ein derartiges Harz ist beispielsweise das sog. «Merrifield-Harz». Eine Form dieses Harzes besteht aus einem Styrol/Divinylbenzol-Copolymeren, welches als reaktionsfähige Gruppierungen gegenüber Carboxylgruppen Chlormethylgruppen aufweist. Beim Peptidaufbau wird jeweils eine Aminosäure angefügt, bis man das gewünschte Tripeptid erhält. Dieses wird anschliessend vom Harz befreit.

Das Verfahren wird durch das nachstehende Reaktionsschema erläutert. In den einzelnen Gleichungen bedeutet P das Harz, während X und X1 Amino-Schutzgruppen darstellen.

Ein sehr zweckmässiges Verfahren zur Abtrennung des Tripeptids vom Harz (?) besteht in der Umesterung mit einem geeigneten Alkohol. Ein Vorteil dieser Methode besteht darin, dass der Ester direkt erhalten wird, der nach Bedarf leicht in das Amid umgewandelt werden kann. Das Verfahren erfolgt gemäss nachstehendem Reaktionsschema:

L-kic-L-his-L-pip-(p)-t- ROH —> L-kic-L-his-L-pip-OR

ObwoRl dies im vorstehenden Reaktionsschema nicht geX-L-pip +©—» X-L-pip-(p)

X-L-pip-©-Ä L-pip-©

X'-L-his + L-pip-@—VerknUptUng > X1-L-his-L-pip- © X^L-his-L-pip-^P) ^ ^ ^ > L-his-L-pip (?)

L-kic + L-his-L-pip- ®^L -kic-L-his-L-pip- (p)

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zeigt ist, können die Stickstoffatome von kic und der Histi-din-Imidazolgruppe nach Bedarf während der Umsetzung geschützt werden, wobei man die Schutzgruppen in einer geeigneten Stufe der Peptidherstellung abspaltet. N3lm-substitu-iert-his enthaltende Tripeptide können ebenfalls nach der j Festphasensynthesemethode hergestellt werden, wobei man den Substituenten entweder vor oder im Verlauf der Synthese einführt.

Bei der Peptidsynthese werden Schutzgruppen und/oder aktivierende Gruppen eingeführt und wiederum abgespalten. 10 Sowohl die Einführung als auch die Abspaltung der Schutzgruppen erfolgen nach herkömmlichen Methoden und unter Verwendung bekannter Reaktionssysteme. Beipiele für zur Schutzgruppenabspaltung herangezogene Umsetzungen sind die Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak, die Hy- i5 drogenolyse (z. B. mit Hilfe von Palladium-Aktivkohle als Katalysator), die Umsetzung mit Halogenwasserstoffsäure (z. B. Chlor- oder Bromwasserstoffsäure) in Essigsäure oder die Umsetzung mit Trifluoressigsäure. Das spezielle Reaktionssystem für die Abspaltung einer Schutzgruppe sowie ihre 2o Einführung in einen Aminosäurebaustein wird so gewählt, dass

1. die Abspaltung der Schutzgruppen nötigenfalls selektiv erfolgt und

2. die Peptidsynthese nicht gestört wird.

Die nachstehenden Beispiele erläutern die Herstellung von 25 Tripepdiden der Formel I und einiger Zwischenprodukte. Teile bedeuten stets Gewichtsteile, sofern es nicht anders angegeben ist.

Analogiebeispiel (A) Herstellung von L-2-Ketoimidazolidin-5-carbonsäure 30

Eine Lösung von 25 g NaOH in 760 ml Wasser, die sich in einem in ein Kühlbad gestellten Gefäss befindet, wird unter Rühren mit 5 ml Brom versetzt. Wenn der Ansatz eine Temperatur von etwa 0° C erreicht hat, werden darin 26,6 g Na-Benzyloxycarbonylasparagin gelöst. Man erwärmt die 35 Lösung auf 75° C und hält sie 45 Min. bei dieser Temperatur. Anschliessend kühlt man die Lösung ab und extrahiert zweimal mit jeweils 150 ml Methylendichlorid. Der Extrakt wird zur Trockene eingedampft und der Rückstand über Nacht im Vakuum ofengetrocknet. Die trockene Festsubstanz wird mit Ätha- 40 noi extrahiert. Man dampft den Extrakt ein, bis die L-2-Ketoim-idazolidin-5-carbonsäure

HN

•N' H

-COOH

ausfällt.

Die Säure wird abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Man erhält etwa 4,20 g Säure vom Fp 166 bis 170° C.

Analyse:

ber.: C 36,93 H 4,65 N 21,53%

gef.: C 34,87 H 4,52 N 19,5%

(B) Herstellung von L-2-Ketoimidazolidin-5-carbonyl

-L-histidyl-L-prolin-OCH3 19,8 g (6,36 mMol) N"-tert.-Butyloxycarbonyl-N3,m-2,4-dinitrophenyl-L-histidyl-L-prolin- (P), 2 Äquivalente L-2-Ke-toimidazolidin-5-carbonsäure, 2 Äquivalente Dicyclohexylcar-bodiimid und 1,3 g 1-Hydroxy-benzotriazol werden in DMF gemischt und etwa 5 Std. bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Nach dieser Zeitspanne ist die Umsetzung im wesentlichen beendet; die Ausbeute an L-kic-N,m3-DNP-L-his-L-pro-(P) beträgt 98%. Man spaltet die Dinitrophenyl-Schutzgruppe mit HSC2H4OH/DMF ab und wäscht die erhaltene L-kic-L-his-L-pro- (P) mit Essigsäure, Methanol und Methylendichlorid.

Die gewaschene L-kic-L-his-L-pro- (P) (4,7 g) wird in ein Gemisch von 188 ml Methanol und 47,1 ml Triäthylamin eingetragen. Man rührt das Gemisch 5 Tage bei Raumtemperatur und lässt es dann etwa 6 Tage bei Raumtemperatur stehen. Anschliessend filtriert man, dampft das Filtrat zur Trockene ein und reinigt das Produkt durch Elution durch eine Kieselgelsäule (Verhältnis 200:1). Als Elutionsmittel verwendet man ein Gemisch aus 70 Vol.-Teilen Chloroform, 30 Vol.-Tei-len Methanol und 3 Vol.-Teilen Wasser. Das erhaltene L-kic-L-his-L-pro-OCH3 wird durch Gefriertrocknung isoliert. Die Ausbeute beträgt 1,54 g.

Beispiel 1

Analog wie vorstehend beschrieben werden erfindungsge-mäss nach der allgemeinen Methode von Analogiebeispiel (B) die folgenden Tripeptide hergestellt:

kpc-his-L-tca-OC2H5 D, L-pca-L-his-L-tca-OC6H12 kic-his-L-pip-OC(CH3 )3 und L-prl-D, L-his-L-tca-OC6Hi2.

Analogiebeispiel Herstellung von L-Pyroglutamyl-N3'm-carboxymethyl-

L-histidyl-L-prolinamid L-pca-L-his-L-pro-NH2 wird in eine Lösung von 1,1 Äquivalenten Monojodessigsäure in DMF eingetragen. Man rührt den Ansatz etwa 18 Stunden. Anschliessend dampft man die Lösung zur Trockene ein und chromatographiert den Rückstand an einer geeigneten, trockenes Kieselgel enthaltenden Säule unter Verwendung eines Gemisches von Chloroform, Methanol und Wasser (Volumenverhältnis 50:40:10) als Elutionsmittel, wobei man 5 ml-Fraktionen auffängt. Die Fraktionen mit dem ersten eluierten Hauptprodukt enthalten im wesentlichen reines L-pca-N3lm-Ch2COOH-L-his-L-pro-NH2. Weitere Produkte im Reaktionsgemisch sind L-pca-Nlim, N3im-di-CH2COOH-L-his-L-pro-NH2 und L-pca-Nlim-CH2COOH-L-his-L-pro-NH2.

In einigen Fällen kann das N3lm-substituiert-L-his enthaltende Produkt in Form des Jodids eluiert werden. Aus diesem erhält man das freie Tripeptid durch Neutralisation, beispielsweise mit Dowex 1 (Hydroxis).

Beispiel 2

45 Entsprechend dem vorstehenden, für das Amid beschriebenen Analogieverfahrens wird erfindungsgemäss der N3im-substituiert-his enthaltende Tripeptidester D, L-kpc-N3'm-C2-H5-his-L-pip-OC2-H5 aus dem entsprechenden Tripeptidester hergestellt.

50 Beispiel 3

Herstellung von L-Pyroglutamyl-histidyl-L-piperidin-

2-carbonsäuremethylester Man dispergiert 1,5 g L-pca-L-his-NH-NH2 in 40 ml DMF und kühlt die Dispersion unter Rühren auf -30° C ab. An-55 schliessend fügt man 4,08 ml 5,25 m HCL in THF hinzu. Hierauf werden innerhalb von etwa 40 Min. 0,77 ml Isoamylnitrit (zunächst 0,65 ml und anschliessend drei Portionen von 0,051 ml, 0,035 ml und nochmals 0,035 ml) eingetragen. Das erhaltene Gemisch wird mit 965 mg (5,37 mMol) L-Piperi-60 din-2-carbonsäuremethylesterhydrochlorid und anschliessend etwa 4,1 ml Triäthylamin versetzt. Man hält den Ansatz 96 Std. bei 5° C und lässt ihn dann über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Während dieser Zeitspanne fügt man drei weitere Portionen (0,2 ml, 0,4 ml und 0,2 ml) Triäthylamin hinzu, um 65 den pH-Wert bei etwa 7,2 zu halten.

Anschliessend filtriert man das Triäthylamin-hydrochlorid ab und wäscht den Rückstand mit DMF/Diäthyläther (125 ml/50-75 ml) aus. Die Waschflüssigkeit wird mit dem

Filtrat vereinigt. Die Filterrückstandswäsche wird zweimal wiederholt. Das letzte Filtrat und die Waschflüssigkeiten werden im Vakuum eingedampft, wobei man 2,87 g des rohen Tripeptids erhält. Man reinigt das Rohprodukt durch Elution an einer Kieselgelsäule mit Hilfe eines Chloroform/Metha-nol/Wasser-Gemisches (90:10:1 ). Als Produkte werden 787 mg L-pca-L-his-L-pip-OCHj und 671 mg L-pca-D, L-his-L-pip-OCH3 erhalten.

Weitere nach dem allgemeinen Verfahren von Beispiel 3 hergestellte Tripeptide sind:

L-pca-his-L-tca-OCH3

L-kpc-his-L-pip-OCH3

L-kic-his-L-pip-OC4H9

K-kic-his-L-pip-OC10H2i und

L-kpc-his-L-tca-OCH(CH3 )2.

Zur Herstellung von Tripeptiden eignen sich auch die im vorgenannten Schrifttum erläuterten Synthesemethoden für Tripeptide vom TRH-Typ. Auf die betreffenden Literaturstellen wird hier ausdrücklich Bezug genommen.

Die erfindungsgemäss hergestellten Tripeptide besitzen antidepressive Wirkung sowie eine Thyrotropinabgabe anregende Hormonaktivität. Die antidepressive Wirkung beruht auf einer Stimulierung des Zentralnervensystems und wurde durch einen an typischen erfindungsgemässen Tripeptiden vorgenommenem in vivo-Test, der auf der Wiederherstellung der antikonvulsiven Wirkung von Methazolamid bei mit Pico-linsäure behandelten Mäusen beruht, bestimmt. Die Bestimmung der die Thyrotropinabgabe stimulierenden Aktivität der erfindungsgemässen Tripeptide erfolgte nach einem in vivo-Test, wie er im wesentlichen von R.S. Harris et al. in «Vitamins and Hormone» 29 (1971), Seiten 3 und 4 beschrieben wird.

In einigen Fällen zeigten die erfindungsgemäss hergestellten Tripeptide im Gegensatz zu TRH eine Aktivitätsdifferenzierung; beispielsweise erwies sich ihre antidepressive Wirksamkeit als höher als die die Thyrotropinabgabe fördernde Hormonaktivität. Diese differenzierte Wirksamkeit bringt den Vorteil mit sich, dass sich die Tripeptide bei richtiger Dosierung besonders gut für die Behandlung von Depressionen eignen, ohne eine merkliche Thyrotropinfreisetzung zu verursachen, wenn eine solche nicht erwünscht oder nicht notwendig ist.

Tabelle I zeigt Wirksamkeitswerte für mehrere typische erfindungsgemässe Produkte. Die Werte wurden nach den vorstehend beschriebenen Testvorschriften erhalten. Die in

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den mit «TS» bzw. «AD» überschriebenen Spalten angeführten Ergebnisse stellen jeweils die Vielfachen der thyrotropin-stimulierenden Wirksamkeit bzw. der antidepressiven Wirksamkeit dar, wobei als Vergleichsbasis die betreffenden Aktivitäten von TRH (denen jeweils der Wert 1 zugeordnet wird) dienen. «N.F.» bedeutet, dass bei der getesteten Dosis nahezu keine Wirkung feststellbar ist.

Tabelle I

Die Thyrotropinabgabe stimulierende Hormonaktivität und antidepressive Wirksamkeit

Peptid

TS

AD

TRH

1

L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-2-piperidin-

0.2

1

carbonsäuremethylester

L-2-Ketopiperidin-6-carbonyl-L-histidyl-

0,016

1

L-2-piperidincarbonsäuremethylester

L-Pyroglutamyl-D,L-histidyl-L-2-piperidin-

N.F.

1

carbonsäuremethylester

Die in Tabelle I aufgeführten Werte zeigen deutlich die pharmakologische Wirksamkeit und unerwartete Differenzierung der TS- bzw. AD-Aktivität der erfindungsgemässen Peptide.

Aufgrung ihrer in vivo-Wirksamkeit als Thyrotropinabga-be-Aktivatoren und als Zentralnervensystem-Stimulantien (infolge ihrer antidepressiven Wirkung) können die erfindungsgemässen Peptide erfolgreich zur Behandlung von Warmblütern eingesetzt werden, welche an einer Zentralnervensystemdepression leiden und/oder einer Aktivierung der Thyrotropinabgabe bedürfen. Die erfindungsgemäss hergestellten Peptide können auf beliebige herkömmliche Weise, beispielsweise oral, parenteral, intravenös, sublingual, durch Insufflation oder in Form von Suppositorien, verabfolgt werden.

Die Verabreichung erfolgt in zur Erzielung der gewünschten Wirkung ausreichenden Dosen. Im allgemeinen verwendet man - abhängig von der Verabreichungsmethode — Dosen von jeweils 0,05—100 mg. Die Zeitabstände zwischen den Verabreichungen hängen vom angestrebten therapeutischen Erfolg ab. Man kann die Tripeptide allein oder zusammen mit pharmakologisch verträglichen Trägern verabreichen. Nach Bedarf können auch Formulierungen mit anderen pharmakologischen Wirkstoffen angewendet werden.

7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Claims

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1. M2 über eine Peptidbindung mit M3-(P), wobei (P) ein geeigneter Harzträger mit carbonsäurebindenden Stellen ist, zu M2-M3- (P) verknüpft,

1. Verfahren zur Herstellung eines Tripeptidesters der Formel

M,-M2-M3-OR (1)

sowie dessen Säureadditionssalzen, worin Mj der Rest einer Aminosäure aus Gruppe kic, kpc oder pca, M2 der Rest his oder N3im-substituiert-his ist, M3 den Rest einer Aminosäure aus der Gruppe L-pip, L-pro, L-tca, R einen C1-C10-Alkylrest oder Cycloalkylrest bedeuten und his und L-pro im Tripeptid nicht gemeinsam auftreten, dadurch gekennzeichnet, dass man die entsprechenden Aminosäuren bzw. deren aktivierte Derivate in beliebiger zeitlicher Reihenfolge und unter intermediärem Schutz von jeweils von der Reaktion auszuschliessenden reaktiven funktionellen Gruppen miteinander kondensiert und dass man zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese die Carboxylgruppe des terminalen Aminosäureesters M3 entsprechend verestert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Mj, M2 und M3 stufenweise zu Mt—M2-M3 verknüpft und dieses anschliessend in Mi-M2-M3-OR überführt.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. M!-M2-M3- (P) mit ROH unter Bildung von Mi-M2-M3-OR und® -H umsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man M3OR herstellt und darauf Ma, M2 und M3-OR stufenweise zu Mi-M2-M3-OR verknüpft.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man M3-OR herstellt und dann zunächst M2 über eine Peptidbindung mit einer Komponente aus der Gruppe und M3-OR verknüpft und das erhaltene Dipeptid bzw. den Di-peptidester anschliessend über eine Peptidbindung mit dem noch fehlenden Baustein verbindet.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass in M2 und enthaltene Aminogruppen bei der zur Tripeptid führenden Verknüpfungsreaktion nach Bedarf intermediär geschützt werden.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in der letzten Stufe der Dipeptidester M2-M3-OR kondensiert wird mit einer Aminosäure Mt.

7. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung des Tripep-tids L-pca-L-his-M3-OR, dadurch gekennzeichnet, dass man einerseits L-pca-L-his-N3 und anderseits M3OR herstellt und diese beiden Verbindungen anschliessend miteinander kondensiert.

8. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die Verknüpfung gemäss Stufe (1) mit Hilfe einer Verbindung X-M2, wobei X eine Amino-Schutzgruppe darstellt, durchführt, und aus dem erhaltenen X-M2-M3- ® durch Abspaltung der Schutzgruppe M2-M3- (P) herstellt.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Schutzgruppe X eine Gruppe vom Urethan-Typ ist.