CH637915A5 - Angiotensin-2-antagonistisch wirkende peptide und verfahren zur herstellung dieser verbindungen. - Google Patents
Angiotensin-2-antagonistisch wirkende peptide und verfahren zur herstellung dieser verbindungen. Download PDFInfo
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Description
Die Erfindung betrifft die Herstellung von neuen, angio-tensin-II-antagonistisch wirkenden Peptiden der allgemeinen Formel I
X-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Y (I)
worin
X den Rest einer in der a-Stellung eine Aminooxygruppe enthaltenden aliphatischen Carbonsäure, insbesondere eine Aminooxyacetyl- oder a-Aminooxypropionylgruppe und Y den Rest einer aliphatischen a-Aminocarbonsäure, insbesondere eine Leucyl-, Isoleucyl-, Alanyl- oder Threonylgruppe,
bedeuten, sowie von Säureadditionssalzen solcher Peptide.
Angiotensin-II ist ein blutdrucksteigend wirkendes Octa-peptid, welches im Organismus auf solche Weise entsteht, dass ein aus der Niere freigesetztes Enzym, das Renin, das durch die Leber produziert a-Globulin wird, in das Deca-peptid Angiotensin-I überführt und dieses dann im Organismus in Angiotensin-II überführt wird.
Im Jahr 1970 wurde das erste Angiotensin-II-Analogon beschrieben, eine Verbindung, welche sich sowohl in vivo, als auch in vitro als spezifischer kompetitiver Inhibitor von Angiotensin-II verhält [G.R. Marshall u. Mitarb., Proc. Nat. Acad. Sei USA 67,1624 (1970); P.A. Khairralah u. Mitarb., J. Med. Chem. 13, 181 (1970)]. Diese Beobachtung hat in breiten Kreisen grosses Interesse hervorgerufen; zahlreiche Forscher wurden dazu angeregt, neue antagonistisch wirkende Angiotensin-II-Analoga zu synthetisieren und zu untersuchen, welche zu der Diagnostizisierung und eventuell zur therapeutischen Behandlung von durch Renin beeinflus-sten Hypotensionen eingesetzt werden könnten. Es hat sich gleich am Anfang dieser Forschungsarbeit herausgestellt,
dass sich zu diesem Zweck diejenigen Angiotensin-II-Ana-loga am besten bewähren, in welchen die Phe-Gruppe in 8-Stellung des Angiotensin-II-Moleküls durch irgend eine aliphatische Seitenkette enthaltende Aminosäure ersetzt ist. Eine solche Abänderung des Moleküls bedeutet nämlich ein praktisches Aufheben der agonistischen Wirkung bei gleichzeitigem Auftreten einer starken antagonistischen Wirkung des Produkts [vgl.: D. Gagnon u. Mitarb., Br. J. Pharmacol. 43,409 (1971); D.T. Pals u. Mitarb., Circ. Res. 29,664 (1971)]. Die antagonistische Wirkung kann noch erheblich gesteigert werden, wenn man neben der oben erwähnten Abänderung der 8-Stellung des Moleküls auch die in der 1-Stellung befindliche Asp-Gruppe durch Sar ersetzt [vgl. D.T. Pals u. Mitarb., Circ. Res. 29,673 (1971)]. Das auf diese Weise hergestellte (Sar1, Ala8)-Angiotensin-II-Analogon wurde später unter dem Namen «Saralasin» auch in Verkehr gebracht. Seine vorteilhaften Eigenschaften wurden durch eine Herabsetzung des in vivo eintretenden enzymatischen Abbaus und durch die grosse Affinität des Moleküls zu den Rezeptorzellen erklärt.
Durch die auf diesem Gebiet durchgeführten klinischen Untersuchungen [H.R. Brunner u. Mitarb., Lancet 1973, 1045; A.J.M. Donker u. Mitarb., Lancet 1974,1535; T. Ogi-hara u. Mitarb., Lancet 1974,219; J.H. Laragh u. Mitarb., New Engl. J. Med. 292,695 (1975) W.A. Pettinger u. Mitarb., New Engl. J. Med. 292,1214 (1975); D.H.B. Streeten u. Mitarb., Circ. Res. 36, Suppl. 1,125 (1975); H.R. Brunner u. H. Gavras, Schweiz. Med. Wschr. 106,1971 (1976)] wurden s
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die schon am Anfang dieser Forschungsarbeit gemachten Annahmen, dass die antagonistisch wirkenden Analoga von Angiotensin-II in der Diagnose und in der Therapie von durch Renin beeinflussten Hypertensionen anwendbar sein werden, in vollem Umfang bestätigt [Vgl.: D. Ganton und F. Gross, Med. Klin. 71,2043 (1976); J.L. Marx, Sience 194, 821 (1976); P. Needleman u. G.R. Marshall, Fed. Proc. 35, 2486(1976)].
Ein Vergleich der Strukturen und biologischen Wirkungen der bis dahin hergestellten Angiotensin-II-Analoga hat zahlreiche wichtige Informationen zur Deutung der agonistischen bzw. antagonistischen Wirkung geliefert [M.C. Khosla u. Mitarb., Handbook of Expérimental Pharmacology, Vol. 37, I.H. Page u. P.M. Bumbus ed. 1974; G.R. Marshall, Fed. Proc. 35,2494(1976)].
In der letzteren Zeit steht besonders die Herstellung von nebenwirkungsfreien, längere biologische Halbwertzeiten zeigenden Antagonisten im Vordergurnd der Forschung [vgl.: M.C. Khosla u. Mitarb., J. Med. Chem. 19,244 (1976); ibid. 20,253(1977)].
Es wurde nun gefunden, dass man durch die Ersetzung des in 8-Stellung befindlichen Phenylalanins durch den Rest einer aliphatischen a-Aminocarbonsäure und durch das Einführen des Restes einer in der a-Stellung eine Aminooxygruppe enthaltenden Carbonsäure in die 1-Stellung der Pep-tidkette solche angiotensin-II-kompetitive Inhibitoren herstellen kann, welche durch Angiotensin-II erzeugte Hypertension in vivo erheblich herabsetzten und diese Wirkung auch bei subcutaner Verabreichung ausüben können.
Die derartigen neuen angiotensin-II-antagonistsichen Peptide weisen die allgemeinen Formel I
X-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Y (I)
worin X und Y die oben gegebenen Bedeutungen haben, auf.
Wie schon weiter oben erwähnt, ist in den erfindungsge-mässen Verbindungen X vorzugsweise eine Aminoacetyl-gruppe oder eine a-Aminooxypropionylgruppe. Diese Gruppen leiten sich von den Säuren der folgenden Formeln ab:
H2N-O-CH2-COOH bzw. CHs-CH-COOH
I
O-NH2
reaktionsfähiges Heptapetpidderivat der allgemeinen Formel II
H-Arg(A)-Val-Tyr(B)-Ile-His(E)-Pro-Y-OG (II)
worin
A eine zum temporären Schutz des Guanidinorestes von Arg geeignete Schutzgruppe, vorzugsweise die Nitro- oder Tosyl-gruppe,
B eine zum temporären Schutz der aromatischen Hydroxylgruppe von Tyr geeignete Schutzgruppe, vorzugsweise die Benzyl- oder eine substituierte Benzylgruppe,
E eine zum temporären Schutz der Imidazolgruppe von His geeignete Schutzgruppe, vorzugsweise die Dinitrophenyl-gruppe,
G Wasserstoff oder eine zum Schutz der Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure geeignete, gegenüber schwach sauren Einflüssen widerstandsfähige, aber durch Behandeln mit stärkeren Säuren oder mit Alkalien abspaltbare Schutzgruppe vertreten und Y die oben angegebene Bedeutung hat,
mit einem reaktionsfähigen Aminooxycarbonsäurederivat der allgemeinen Formel III
637915
W-X-M (III)
worin
X die oben angegebene Bedeutung hat,
W eine durch Acidolyse abspaltbare Schutzgruppe, vorteilhaft die Benzyloxycarbonyl- oder tert.-Butyloxycarbonyl-gruppe und
M eine Hydroxylgruppe oder eine aktivierende Gruppe, vorteilhaft die Pivaloyloxy-, Nitrophenoxy-, 2,3,5-Trichlorphe-noxy-, Pentachlorphenoxy-, Pentafluorphenoxy-, N-Succini-midoxy- oder Azidogruppe vertreten, umsetzt und von der erhaltenen Verbindung der allgemeinen Formel IV
W-X-Arg(A)-Val-Tyr(B)-Ile-His(E)-Pro-Y-OG (IV)
worin W, X, Y, A, E und G die obigen Bedeutungen haben, die Schutzgruppen selektiv nacheinander oder auf einmal entfernt, und gewünschtenfalls das erhaltene Peptid der allgemeinen Formel I in ein Säureadditionssalz überführt.
Die im erfindungsgemässen Verfahren als Ausgangsstoffe einsetzbaren reaktionsfähigen Heptapeptidderivate der allgemeinen Formel II können nach beliebigen, in der Peptid-chemie üblichen Methoden, z.B. nach der in der ungarischen Patentschrift Nr. 168 431 beschriebenen, hergestellt werden. In diesem Herstellungsverfahren werden zum Schutz der funktionellen Seitengruppen zweckmässig solche Schutzgruppen eingesetzt, welche unter den Bedingungen des zum Abspalten der nach der Koppelungsreaktion zu entfernenden Schutzgruppen durchgeführten Acidolyse stabil bleiben.
Nach einer vorteilhaften Ausführungsweise des erfindungsgemässen Verfahrens wird zum temporären Schutz der Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure die p-Nitro-benzylgruppe (NB), zum Schutz der Hydroxylgruppe von Tyrosin die Benzylgruppe (Bzl), zum Schutz des Imidazol-rings von Histidin die Dinitrophenylgruppe (Dnp) und zum Schutz der Guanidinogruppe von Arginin die Tosylgruppe (Tos) eingesetzt. Diese Schutzgruppen sind gegenüber schwachen Säuren stabil, so kann die t-Butoxycarbonyl-gruppe (Boc) nach den Koppelungsreaktionen ohne Schädigung den genannten Schutzgruppen abgespalten werden. Die Dinitrophenylgruppe kann dann durch Thiolyse und die übrigen genannten Schutzgruppen mit flüssigem Fluorwasserstoff entfernt werden.
Die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen der allgemeinen Formel I können nach an sich bekannten Methoden, vorteilhaft durch Ionenaustauschchromatogra-phie an Carboxymethylcellulose gereinigt werden. Dabei werden die Produkte meistens in der Form von lyophilisierten Pulvern erhalten; solche Produkte können unmittelbar zur Bildung von verschiedenen Salzen eingesetzt werden.
Die antagonistischen Wirkungen der neuen Verbindungen der allgemeinen Formel I wurden an narkotisierten männlichen Katzen untersucht. Der Blutdruck der Tiere wurde an der Halsarterie gemessen. Die Untersuchungen wurden derart durchgeführt, dass in eine Schenkelvene Hypertensin in einer Dosierungsrate von 0,5 jig/kg/min infundiert wurde; nachdem sich die Blutdrucksteigerung stabilisiert hatte,
wurde die zu untersuchende Substanz in wässriger physiologischer Lösung, in einer einmaligen Dose intravenös oder subcutan verabreicht und dann wurde die durch den verabreichten Wirkstoff verursachte Verminderung des Blutdrucks gemessen.
Die durch die intravenöse Verabreichung von verschiedenen neuen Verbindungen erfolgte Verminderung des Blutdrucks wird durch die in der Tabelle I zusammengefassten Daten gezeigt. Diese Daten sind Durchschnittswerte von 6
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Messungen, mit Angabe der Streuung der Mittelwerte. Zum Tabelle I
Vergleich wurden auch die mit dem bekannten Saralasin, d.h. Änderung des Blutdruckes nach i.v. Verabreichung l-(N-Methyl-glycin)-5-L-valin-8-L-alanin-angiotensin-II verschiedener Angiotensin-II-Analoga unter i.v. Infusion unter den gleichen Bedingungen erhaltenen Werte ange- von Angiotensin-II
geben. s
Wirkstoff Veränderung des Blutdrucks (mm
Hg) nach i.v. Dosen von 10p,g/kg 20 jig/kg
(Aminooxyacetyl1, Leu8)-Ang-II -33±3,6 -42±4,2
(D-a-Aminooxypropionyl1, — 30±3,4 —38±3,8 Leu8)-Ang-II
(Aminooxyacetyl1, Ile8)-Ang-II -28±2,0 -40±5,7 Saralasin —41 ±2,5
Aus den Daten der obigen Tabelle ist es eindeutig ersichtlich, dass sämtliche in der 1-Stellung durch einen eine a-Aminooxygruppe enthaltenden aliphatischen Carbonsäurerest substituierte Angiotensin-II-Analoga sehr erhebliche blutdrucksenkende Wirkungen haben. Die Höhe dieser Wirkung ist proportional mit der Grösse der verabreichten Dosen.
Die Untersuchungen wurden auch auf die in der Literatur nicht übliche subcutane Verabreichungsweise ausgedehnt. In 20 diesem Fall wurde der die zu untersuchende Substanz enthaltenden physiologischen Kochsalzlösung auch noch Carboxy-methylcellulose oder Gelatine zugesetzt. Die in der nachstehenden Tabelle II zusammengefassten Versuchsergebnisse sind Durchschnittswerte von an je fünf Tieren durchge-2s führten Messungen, wobei die Streuungen der Mittelwerte ebenfalls angegeben sind.
Tabelle!!
Wirkstoff
Zusatz Blutdrucksenkung mm Hg, nach
Dose zur 15 30
Lösung Minuten
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(Aminooxyacetyl1, Leu8)-Ang-II (D-a-Aminooxypropionyl1, Leu8)-Ang-II
200 200 200 200
CMC Glt CMC Glt
-21 ±5,8 -23±2,0 -21±6,7 -24±5,7
—26+7,2 -21 ±2,2 —24±5,7 —21±5,6
-13±9,4 -10±2,8 -16±5,1 - 9±5,7
—5±7,8 — 1+5,1 —1±4,0 —3±8,8
CMC = Carboxymethylcellulose Glt - Gelatine
Die Daten dieser Tabelle zeigen, dass die neuen Verbindungen bei subcutaner Verabreichung den experimentell hervorgerufenen hohen Blutdruck auch nach 60 Minuten noch erheblich vermindern.
Aufgrund dieser Eigenschaften können die erfindungsge-mässen neuen Verbindungen sowie die physiologisch unbedenklichen Salze davon in der Therapie als blutdrucksenkende Mittel angewendet werden. Es können auch physiologisch unbedenkliche Komplexe dieser neuen Peptide verwendet werden, und unter solchen Komplexen sind Verbindungen zu verstehen, welche durch die Zugabe von gewissen, z.B. organischen Stoffen, entstehen und dem Wirkstoff eine retardierte Wirkung verleihen. Als solche komplexbildende Stoffe kommen z.B. Gelatine, Carboxymethylcellulose, Alginsäureester, Polyphloretinphosphate, Amionsäure-poly-mere, sowie andere Polymere und Kopolymere in Betracht. Als physiologisch unbedenkliche Salze der neuen Peptide können die üblichen, pharmazeutisch anwendbaren Säureadditionssalze, z.B. Acetate, hergestellt werden.
Die neuen Peptide, sowie deren physiologisch unbedenkliche Salze können in der Therapie in der Form von üblichen Arzneimittelpräparaten eingesetzt werden. Diese Präparate enthalten z.B. die neuen Verbindungen in Begleitung von zur enteralen oder parenteralen Verabreichung geeigneten anorganischen oder organischen Trägerstoffen. Die Arzneimittelpräparate können in Form von festen Lyophilisaten hergestellt werden; in diesem Fall kommen als Trägerstoffe vorzugsweise verschiedene, mit den Peptiden nicht reagierende Verbindungen, wie z.B. Kohlenhydrate, in Betracht. Ferner kann man konzentrierte oder verdünnte Suspensionen oder 43 Emulsionen als Arzneimittelpräparate herstellen, welche neben den üblichen flüssigen Trägerstoffen auch stabilisierende und konservierende Hilfsstoffe enthalten.
Solche Arzneimittelpräparate können in der Therapie zur Behandlung von allen solchen Syndromen verwendet so werden, in deren Ätiologie ein erhöhter Renin-Blutspiegel eine Rolle spielt; sie können ferner als Diagnostika zu einer differenzierten Unterscheidung von Hypertensionen renaler Herkunft dienen.
Die Herstellung der erfindungsgemässen neuen Peptide 55 wird durch die nachstehenden Beispiele näher veranschaulicht. Die in den Beispielen verwendeten Abkürzungen entsprechen den in der Fachliteratur üblichen Abkürzungen, vgl. J. Biol. Chem., 247,977 (1972). Die von a-Aminooxysäuren stammenden Gruppen werden durch ein dem üblichen 60 Symbol der entsprechenden Aminosäure vorgesetzten «O» bezeichnet; so bedeutet z.B. «OGly» Aminooxyessigsäure, «OALA» a-Aminooxypropionsäure usw. Als weitere Abkürzung wird «PFP» für die Bezeichnung von Pentafluorphenyl verwendet.
65 Bei der Herstellung der verschiedenen Verbindungen wurde das Eindampfen von Lösungen immer mit dem Büchischen «Rotavapor»-Apparat durchgeführt. Die Schmelzpunkte wurden mit dem Dr. Tottolischen Apparat (Büchi)
bestimmt. Die Dünnschichtchromatogramme wurden auf «Kieselgel G nach Stahl» (E. Merck, Darmstadt) Platten aufgenommen; zu der Entwicklung der Chromatogramme wurden die folgenden Lösungsmittelsysteme verwendet:
1) Äthylacetat: (Pyridin-Essigsäure-Wasser 20:6:11) = 95:5
2) Äthylacetat: (Pyridin-Essigsäure-Wasser 20:6:11) = 90:10
3) Äthylacetat: (Pyridin-Essigsäure-Wasser 20:6:11) = 80:30
4) Äthylacetat: (Pyridin-Essigsäure-Wasser 20:6:11) = 70:30
5) n-Butanol : Essigsäure : Wasser = 4:1:5
6) n-Butanol : Essigsäure : Pyridin : Wasser = 30:6:20:24
7) n-Butanol : Äthylacetat : Essigsäure : Wasser = 1:1:1:1.
Bei den angegebenen Rf-Werten ist das zur Bestimmung verwendete Lösungsmittelsystem jeweils angegeben, z.B.
RPK
Die papierelektrophoretischen Untersuchungen wurden in einem «LMIM» horizontalen Mittelspannungsapparat, auf «MN 214» Papier, in einer Pufferlösung von pH = 1,9 neben Glutaminsäure durchgeführt. Die angewendete Stromspannung war 450 V, mit einer Zeitdauer von 3 Stunden.
Die Dünnschichtchromatogramme wurden einerseits mit Ninhydrinlösung, andererseits nach der üblichen Chlorierung, mit o-Tolidin-Jodkaliumlösung, entwickelt.
Die Endprodukte wurden nach der folgenden allgemeinen Methode gereinigt: Zuerst wurden die mit Fluorwasserstoff gebildeten Salze der freien Peptide an «Sephacryl S-200 Superfine» Harz (Hersteller: Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) durch Gradient-Elution mit 0,01 M (pH = 4,5) und 0,4 M (pH = 6,7) Ammoniumacetatlösungen gereinigt. Die Registrierung der Eluate erfolgte mit einem «LKB Uvicord II» Apparat (Hersteller: LKB, Uppsala, Schweden) mit Hilfe eines automatischen Fraktionensammlers.
Die weitere Reinigung der Hauptfraktion erfolgte an Carboxymethylcellulose in der folgendne Weise: 0,51 Carboxymethylcellulose (CMC-52) wurde in einer Säule mit der ersten Pufferlösung ins Gleichgewicht gebracht, dann wurde die Säule mit der Lösung von 0,5 g Peptid in 4 ml 0,01 M Ammoniumacetatlösung überschichtet und es wurde die Gra-dient-Elution mit den oben angegebenen Pufferlösungen begonnen. Die Strömungsgeschwindigkeit war 25 ml/
Stunde; es wurden Fraktionen von je 10 ml aufgefangen und diese wurden mit dem LKB Uvicord-II Apparat registriert. Das gereinigte Endprodukt wurde durch Lyophifisierung der Hauptfraktion erhalten.
Beispiel 1
(Aminoxyacetyl1, Ile8)-angiotensin-II Schritt 1:
Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-ONB
4,5g(15mMol) Ile-ONB • HCL wurden in 50 ml Chloroform gelöst und mit 2,1 ml Triäthylamin und3,81 g(10 mMol) Boc-Pro-POFP versetzt. Nach 20 Minuten Rühren bei Raumtemperatur wurde die Lösung mit Wasser und dann mit wässriger 10%iger Citronensäurelösung ausgeschüttelt. Das nach dem Trocknen und Eindampfen der Lösung als Rückstand erhaltene geschützte Dipeptid (Rr(l) = 0,8) wurde ohne Reinigung in 20 ml einer 8 M Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst; nach 10 Mintuen wurde die Lösung mit wasserfreiem Äther verdünnt und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene freie Dipeptid-hydrochlorid (Rf<3> = 0,44) wurde in 30 ml Chloroform gelöst, mit Triäthylamin auf pH = 8 gestellt und mit 8,8 g ( 15 mMol) Boc-His(Dnp)-OPFP versetzt. Nach 1,5 Stunden wurden 1,65 ml N,N-Dimethyl-aminoäthylamin der Lösung zugesetzt und nach weiteren 15 Minuten wurde die Lösung mit 10%iger wässriger Citronen-
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säurelösung, mit N Salzsäure, mit Wasser und mit 5%iger wässriger Natriumbicarbonatlösung in der angegebenen Reihenfolge ausgeschüttelt. Dann wurde die organische Phase getrocknet und eingedampft und das als Rückstand erhaltene rohe geschützte Tripeptid (Rr(1) = 0,50) ohne Reinigung in 20 ml 8 molarer Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst.
Nach 15 Minuten wurde das auf diese Weise erhaltene freie Tripeptid (Rf(4> = 0,25) durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und mit Äther gewaschen. Das Produkt wurde dann sofort im Gemische von 50 ml Chloroform und 20 ml Dimethylformamid gelöst, der pH-Wert der Lösung mit Triäthylamin auf 8 gestellt und dann wurden 6,0 g ( 15 mMol) Boc-Ile-OPFP zugesetzt. Nach 30 Minuten wurde das Lösungsmittel verdampft, der Rückstand wurde in 70 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung mit je 25 ml 10%iger wässriger Citronensäurelösung, mit normaler Salzsäure und mit Wasser ausgeschüttelt. Nach Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat und Eindampfen wurde das geschützte Tetra-peptid (Rt(2) = 0,65) mit Hilfe von 80 ml 1:9 Gemisch von Äther und n-Hexan isoliert. Dieses Produkt wurde in 25 ml 8 molarer Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst und nach 30 Minuten wurde durch die Zugabe von 120 ml trockenem Äther das freie Tetrapeptid (Rr<4) = 0,41) ausgefällt, abfiltriert und mit je 30 ml Äther zweimal gewaschen. Anschliessend wurde es in 70 ml 1:1 Gemisch von Dimethylformamid und Chloroform sofort gelöst, der pH-Wert der Lösung wurde mit Triäthylamin auf 8 eingestellt und es wurden 6,0 g (11,5 mMol) Boc-Tyr(Bzl)-OPFP zugesetzt. Nach 15 Minuten wurde das Lösungsmittel verdampft, der Rückstand in 100 ml Äthylacetat gelöst, die Lösung mit 0,66 ml N,N-Dimethylaminoäthylamin versetzt und nach 15 Minuten mit je 30 ml 10%iger wässriger Citronensäurelösung, mit normaler Salzsäure und mit Wasser ausgeschüttelt. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat und Eindampfen wurde das geschützte Pentapeptid (Rf*2) = 0,59) durch die Zugabe von 100 ml Äther ausgefällt, abfiltriert und mit je 30 ml Äther zweimal gewaschen. Das Produkt wurde in 20 ml 8 molarer Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst und nach 15 Minuten wurde durch die Zugabe von 120 ml trok-kenem Äther das freie Pentapeptid (Rf<4) = 0,4) gefällt, abfiltriert und mit je 30 ml Äther zweimal gewaschen. Es wird in 50 ml Dimethylformamid sofort gelöst, der pH-Wert der Lösung wurde mit Triäthylamin auf 8 eingestellt und es werden 4,62 g (12 mMol) Boc-Val-OPFP zugesetzt. Nach einer Stunde wurde das Lösungsmittel verdampft, der Rückstand in 10 ml Chloroform gelöst und die Lösung wurde mit je 30 ml 10%iger Citronensäurelösung, mit N Salzsäure und mit Wasser ausgeschüttelt.
Nach dem Trocknen und Eindampfen wurde das erhaltene geschützte Hexapeptid (Rf(2) = 0,56) mit Hilfe von Äther isoliert und mit Äther gewaschen. Dann wurde das Produkt in 30 ml 8 molarer Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst, und das auf diese Weise erhaltene freie Hexapeptid (Rf(4) = 0,47) durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und mit Äther gewaschen. Das erhaltene Produkt wurde sofort in 50 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung mit Triäthylamin auf pH = 8 gestellt und mit 7,2 g (12 mMol) Boc-Arg(Tos)-OPFP versetzt. Nach einer Stunde Rühren wurde das Lösungsmittel verdampft und durch Chloroform ersetzt und die Lösung wurde mit 10%iger wässriger Citronensäurelösung mit normaler Salzsäurelösung und mit Wasser in der angegebenen Reihenfolge ausgeschüttelt. Die abgetrennte organische Phase wurde getrocknet und eingedampft, der Rückstand wurde mit Äther verrieben und abfiltriert. Es wurden auf diese Weise 12,4 g geschütztes Heptapeptid Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Bnp)-Pro-Ile-ONB (80 d.Th. auf die Äusgangsverbindung Boc-Pro-OPFP berechnet) erhalten.
5
s
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60
65
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F. 189-192°C; (Rt® = 0,55.
Schritt 2:
Boc-OGly-Arg(Tos)-Val-Tyr-Ilo-His-Pro-Ile-OH
3,1 g (2 mMol) Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-ONB wurden in 5 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung mit 2,9 ml 2-MercaptoäthanoI versetzt. Nach einer Stunde wurde das Peptid durch die Zugabe von trok-kenem Äther gefällt, abfiltriert, mit Äther gewaschen und durch Umfällen aus Methanol/Äther gereinigt. Es wurden auf diese Weise 2,0 g (74% d.Th.) Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr-(Bzl)-Ile-His-Pro-Ile-ONB (Rr(2) = 0,1) erhalten. Dieses Produkt wurde dann in 30 ml des Gemisches Methanol-Essigsäure-Wasser 5:1:1 gelöst und mit 1,0 g 10%iger Palladium-Aktivkohle versetzt. Wasserstoffgas wurde 5 Stunden lang durch die Lösung geleitet, dann wurde der Katalysator ausfiltriert, das Filtrat eingedampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Es wurde auf diese Weise 1,22 g (75% d.Th.) partiell geschütztes Heptapeptid (Rr{S) = 0,8) erhalten. Dieses Produkt wurde in 5 ml 8 molarer Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst und nach 20 Minuten wurde durch die Zugabe von trockenem Äther das freie Heptapeptid (Rt<4) = 0,1) gefällt. Das erhaltene freie Heptapeptid wurde abfiltriert, mit Äther gewaschen und sofort in 15 ml Dimethylformamid aufgelöst. Der pH-Wert der Lösung mit Triäthylamin auf 8 eingestellt und 0,45 g ( 1,2 mMol) Boc-OGly-OPFP wurden der Lösung zugesetzt. Nach 30 Minuten wird das Reaktionsgemisch eingedampft, der Rückstand in 30 ml 3:1 Gemisch von Chloroform und Dimethylformamid gelöst und die Lösung mit 10%iger Citronensäurelösung und mit Wasser ausgeschüttelt. Nach dem Trocknen und Eindampfen der Lösung wurde der Rückstand mit Äthylacetat verrieben, abfiltriert und mit Äthylacetat gewaschen. Es wurden auf diese Weise 0,46 g Boc-OGly-Arg(Tos)-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile-OH (72% d.Th.) erhalten;
Rt<3> = 0,23; Rt<4> = 0,40.
Schritt 3:
Das Entfernen der Schutzgruppen
0,46 g (0,35 mMol) Boc-OGly-Arg(Tos)-Val-Tyr-Ile-OH wurden in 2 ml flüssigem Fluorwasserstoff gelöst und mit 0,5 ml Thioanisol versetzt. Die Lösung wurde eine Stunde bei 0°C stehen gelassen, dann wurde das Peptid durch die Zugabe von Äther gefällt, abfiltriert und mit Äther gewaschen. Es wurden 0,35 g (Aminooxyacetyl1, Ile8)-angiotensin-II-hydrofluorid (100% d.Th.) erhalten; das Produkt wurde in der oben (vor den Beispielen) angegebenen Weise gereinigt. Charakteristika des reinen Produkts:
Rf*5) = 0,26; Rf(« = 0,56; Rt<7> = 0,57; Eoiu = 1,00.
Aminosäure-Analyse: Pro: 1,01 (1); Val: 1,0 (1); Ile: 1,98 (2); Tyr: 0,65 (1); His: 1,0 (1); Arg: 1,03 (1).
Beispiel 2
(L-a-Aminooxypropionyl1, Ile8)-angiotensin-II Schritt 1:
Boc-OAla-Arg(Tos)-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile-OH
0,6 g (0,5 mMol) Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile-OH (Beispiel 1, Schritt 2) wurden in 5 ml 8 molare Lösung von Salzsäure in Dioxan aufgelöst; nach 20 Minuten wurde das erhaltene freie Peptid (Rr(4) = 0,1) durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, filtriert und gewaschen. Das auf diese Weise isolierte Produkt wurde sofort in 20 ml Dimethylformamid gelöst, mit Triäthylamin auf pH = 8 gestellt und mit 0,7 g (1,9 mMol) Boc-OAla-OPFP versetzt. Nach 30
Minuten wurde die Lösung eingedampft, der Rückstand in 30 ml 3:1 Gemisch von Chloroform und Dimethylformamid gelöst und diese Lösung mit 10%iger wässriger Citronensäurelösung und anschliessend mit Wasser ausgeschüttelt. Die 5 organische Phase wurde getrocknet und eingedampft und der Rückstand mit Äthylacetat verrieben, abfiltriert und mit Äthylacetat gewaschen. Es wurden 0,55 g Boc-OAla-Arg(Tos)-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile-OH (84% d.Th.) erhalten; Rr<4) = 0,43; Rr(5) = 0,80.
10
Schritt 2:
Das Entfernen der Schutzgruppen
0,53 g (0,42 mMol) Boc-OAla-Arg(Tos)-VaI-Tyr-Ile-His-Pro-Ile-OH wurden in 2 ml flüssigem Fluorwasserstoff gelöst 1S und mit 0,55 ml Thioanisol versetzt. Die Lösung wurde bei 0°C eine Stunde stehen gelassen, dann wurde das Peptid durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und mit Äther gewaschen.
Es wurden auf diese Weise 0,41 g (QAla1, IIes-angio-20 tensin-II erhalten; das Produkt wurde in der oben beschriebenen Weise gereinigt.
Rf® = 0,32; Rt«5' = 0,58; RK7) = 0,59; Eciu = 1,0.
25 Aminosäure-Analyse: Pro: 1,0 (1); Val: 1,1 (1); Ile: 2,02 (2); His: 0,9 (1); Tyr: 0,95 (1); Arg: 1,05 (1).
Beispiel 3
(Aminooxyacetyl1, Leus)-angiotensin-II
30
Schritt 1:
Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Leu-ONB
4,2 g (12 mMol) Leu-ONB, HBr wurden in 50 ml Chloroform gelöst und dann wurden 1,68 ml Triäthylamin und 35 3,81 g (10 mMol) Boc-Pro-OPFP der Lösung zugesetzt. Das Gemisch wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur geführt und anschliessend mit 10%iger wässriger Citronensäurelösung und mit Wasser ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde getrocknet und eingedampft, das als Rückstand erhaltene 40 geschützte Dipeptid (Rr(n = 0,8) wurde ohne Reinigung in 20 ml 8 molarer Lösung von Salzsäure in Dioxan aufgelöst, nach 10 Minuten wurde die Lösung mit trockenem Äther verdünnt und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene freie Dipeptid (Rt<4) = 0,56) wurde ohne Reinigung in 50 ml Chlo-45 roform gelöst, die Lösung mit Triäthylamin auf pH = 8 eingestellt und mit 8,8 g (15 mMol) Boc-His(Dnp)OPFP versetzt. Nach 30 Minuten wurden 1,65 ml N,N-Dimethylamino-form-amid der Lösung zugesetzt und nach weiteren 10 Minuten wurde das Gemisch mit 10%iger wässriger Citronensäurelö-so sung, mit normaler Salzsäurelösung, mit wässriger Natrium-hydrogencarbonatlösung und mit Wasser in der angegebenen Reihenfolge ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde getrocknet und eingedampft, das als Rückstand erhaltene geschützte Tripeptid (Rt*0 = 0,65) wurde ohne Reinigung in 55 25 ml 8 molarer Lösung von Salzsäure in Dioxan aufgelöst und das erhaltene freie Tripeptid (Rt<4) = 0,47) durch die Zugabe von trockenem Äther ausgefällt. Dieses Tripeptid wurde nach dem Abfiltrieren und Waschen mit Äther sofort im Gemisch von 50 ml Chloroform und 20 ml Dimethylform-60 amid aufgelöst, die Lösung mit Triäthylamin auf pH = 8 eingestellt und mit 6,0 g (15 mMol) Boc-Ile-OPFP versetzt. Nach 30 Minuten wurde das Lösungsmittel verdampft und durch Äthylacetat ersetzt, die Lösung mit 10%iger wässriger Citronensäurelösung, mit normaler Salzsäurelösung und mit 65 Wasser ausgeschüttelt, die organische Phase getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene geschützte Tetra-peptid (Rf*11 = 0,65) wurde mit Hilfe eines 7:3 Gemisches von n-Hexan und Äther isoliert. Das erhaltene Produkt wurde in
7
637 915
25 ml 8 molarer Lösung von Salzsäure in Dioxan aufgelöst, nach 15 Minuten wurde das freie Peptid (Rf(4) = 0,65) durch die Zugabe von trockenem Äther ausgefällt, abfiltriert, mit Äther gewaschen und anschliessend sofort in 50 ml 1:1 Gemisch von Chloroform und Dimethylformamid aufgelöst. Die Lösung wurde mit Triäthylamin auf ph = 8 gestellt und mit 6,0 g (11,5 mMol) Boc-Tyr-OPFP versetzt. Nach 15 Minuten wurde das Lösungsmittel verdampft und durch Äthylacetat ersetzt, dann wurden 0,66 ml N,N-Dimethyl-amino-äthylamin zugegeben und nach 15 Minuten wurde das Gemisch mit 10%iger wässriger Citronensäurelösung, mit normaler Salzsäurelösung und zuletzt mit Wasser ausgeschüttelt. Nach dem Trocknen und Eindampfen der organischen Phase wurde das geschützte Pentapeptid (Rf(2i = 0,8) mit Äther isoliert und in 20 ml 8 molarer Lösung von Salzsäure in Dioxan aufgelöst. Das erhaltene freie Pentapeptid (Rf'4i = 0,8) wurde durch die Zugabe von trockenem Äther ausgefällt, abfiltriert mit Äther gewaschen und sofort in 50 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wurde mit Triäthylamin auf pH = 8 gestellt und mit 3,85 g (10 mMol) Boc-Val-OPFP versetzt. Nach einer Stunde wurde das Lösungsmittel abdestilliert und durch Chloroform ersetzt, die organische Lösung in der üblichen Weise mit 10%iger wässriger Citronensäurelösung, mit normaler Salzsäure und mit Wasser ausgeschüttelt, und dann wurde das erhaltene geschützte Hexapeptid (Rf(2) = 0,82) mit Hilfe von Äther isoliert. Dieses Produkt wurde in 20 ml 8 molarer Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst und nach 15 Minuten wurde das freie Hexapeptid (Rt(3) = 0,55) durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt. Das freie Hexapeptid wurde dann sofort in 40 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung mit Triäthylamin auf pH = 8 gestellt und mit 6,0 g (10 mMol) Boc-Arg(Tos)-OPFP versetzt. Nach 30 Minuten wurde das Lösungsmittel abdestilliert und durch Chloroform ersetzt und diese Lösung mit normaler Salzsäure und mit Waser ausgeschüttelt. Nach dem Trocknen und Eindampfen der Lösung wurde das erhaltene geschützte Heptapeptid Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Leu-ONB (Rt(2) = 0,62) mit Hilfe von Äthalon isoliert. Ausbeute: 7,5 g (50% d.Th., auf die Ausgangsverbindung Boc-Pro-OPFP berechnet);
F. 186-190°C.
Schritt 2:
Boc-OGly-Arg(Tos)-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Leu-OH
3,45 g (2,26 mMol) Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Leu-ONB wurden in 10 ml Dimethylformamid gelöst, mit 6,6 ml 2-Mercaptoäthanol versetzt und nach 2 Stunden wurde durch die Zugabe von trockenem Äther das partiell geschützte Heptapeptid gefällt. Nach Umfällen aus Methanol/Äther wurden 2,9 g gereinigtes Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-Pro-Leu-ONB (93% d.Th.) erhalten; Rr<2> = 0,12; Rt(3) = 0,26.
Dieses Produkt wurde im 5:1:1 Gemisch von Methanol, Essigsäure und Wasser gelöst, mit 1,0 g 10%iger Palladium-Aktivkohle versetzt und man leitete Wasserstoffgas 6 Stunden lang in die Lösung ein. Nach Abfiltrieren des Katalysators wurde die Lösung eingedampft und der Rückstand mit Äther verarbeitet. Es wurden auf diese Weise 2,15 g Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Leu-OH (89% d.Th.) erhalten;
durch die Zugabe von trockenem Äther ausgefällt, abfiltriert, mit Äther gewaschen und sofort in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wurde mit Triäthylamin auf pH = 8 gestellt und mit 0,54 g (1,5 mMol) Boc-OGly-OPFP versetzt, s Nach 30 Minuten wurde die Lösung mit 30 ml Chloroform verdünnt und mit Wasser ausgeschüttelt. Nach dem Trocknen und Eindampfen der Lösung wurde der Rückstand mit Äthylacetat verrieben, abfiltriert und mit Äthylacetat gewaschen. Es wurden auf diese Weise 1,05 g Boc-OGly-io Arg(Tos)-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Leu-OH (86% d.Th.) erhalten;
Rf(3> = 0,23; Rf<4» = 0,40.
Schritt 3:
15 Das Entfernen der Schutzgruppen
0,9 g (0,73 mMol) Boc-OGly-Arg(Tos)-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Leu-OH wurden in 5 ml flüssigem Fluorwasserstoff gelöst und mit 1,5 ml Thioanisol versetzt. Das Gemisch wurde 1,5 Stunden bei 0°C gehalten, dann wurde das Peptid 20 durch Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und mit Äther gewaschen. Es wurden auf diese Weise 0,55 g (OGly1, Leu8)-angiotensin-II (80% d.Th.) erhalten. Das Produkt wurde auf die oben angegebene Weise gereinigt;
25 Rf(5) = 0,33; Rt<6> = 0,60; Rt(7> = 0,55; Eciu =1,18.
Aminosäure-Analyse: Pro: 1,0 (1); Val: 1,0 (1); Ile: 1,0 (1); Leu: 1,1 (1); His: 0,95 (1); Arg: 1,0 (1); Tyr: 0,7 (1).
30 Beispiel 4
(D-a-Aminooxypropionyl1, Leu8)-angiotensin-II
Schritt 1:
Boc-D-OAla-Arg(Tos)-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Leu-OH 35 1,1 g(l mMol) Box-Arg(Tos)-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Leu-OH wurden in 10 ml 8 molarer Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst und nach 30 Mintuen wurde das freie Peptid durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und mit Äther gewaschen. Das Produkt wurde sofort in 10 ml 40 Dimethylformamid gelöst, die Lösung mit Triäthylamin auf pH 8 eingestellt und mit 0,56 g (1,5 mMol) Boc-D-OAla-OPFP versetzt. Nach 30 Minuten wurde die Lösung mit Chloroform verdünnt und mit Wasser ausgeschüttelt. Nach dem Trocknen und Eindampfen der Lösung wurde der Rückstand 45 mit Äthylacetat verrieben, abfiltriert und mit Äthylacetat gewaschen. Es wurden auf diese Weise 0,95 g Boc-D-OAla-Arg(Tos)-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Leu-OH (77% d.Th.) erhalten;
Rf<4) = 0,29.
50
Schritt 2:
Das Entfernen der Schutzgruppen
0,95 g (0,77 mMol) Boc-D-OAla-Arg(Tos)-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Leu-OH wurden in 4 ml flüssigem Fluorwasserstoff ss gelöst und mit 1,2 ml Tioanisol versetzt. Die Lösung wurde 1,5 Stunden bei 0°C gehalten, dann wurde das Produkt durch die Zugabe von trockenem Äther gefällt, abfiltriert und mit Äther gewaschen. Es wurden auf diese Weise 0,6 g (D-OAla1, Leu8)-angiotensin-II (90% d.Th.) erhalten, welches dann auf so die oben beschriebene Weise gereinigt wurde.
Rf<5> = 0,33; Rr<6> = 0,61; Rf"> = 0,56; Eciu = 1,10.
Rt(5) = 0,75; Rr(4) = 0,20.
1,1 g (1 mMol) des erhaltenen Produkts wurden in 10 ml 8
molarer Lösung von Salzsäure in Dioxan gelöst, nach 30 Aminosäure-Analyse: Pro: 1,02 (1); Val: 1,0 (1); Leu: 1,02 (1);
Minuten wurde das erhaltene freie Heptapeptid (Rf<4) = 0,08) 65 Ile: 1,03 (1); His: 1,01 (1); Arg: 0,92 (1); Tyr: 0,8 (1).
B
Claims (8)
1. Peptide der allgemeinen Formel
X-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Y (I)
worin
X der Rest einer in der a-Stellung eine Aminooxygruppe enthaltenden aliphatischen Carbonsäure und
Y den Rest einer aliphatischen a-Aminocarbonsäure bedeuten, sowie Säureadditionssalze davon.
2. Peptide der Formel I nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X eine Aminooxyacetyl- oder a-Ami-nooxypropionylgruppe ist.
2
PATENTANSPRÜCHE
3. Peptide der Formel I nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Y eine Leucyl-, Isoleucyl-, Alanyl- oder Threonylgruppe bedeutet.
4. OGly-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Leu-OH als Verbindung nach Anspruch 1.
5. OAla-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Leu-OH als Verbindung nach Anspruch 1.
6. OGly-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile-OH als Verbindung nach Anspruch 1.
7. OAla-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile-OH als Verbindung nach Anspruch 1.
8. Verfahren zur Herstellung von Peptiden der allgemeinen Formel I
X-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Y (I)
worin
X den Rest einer in der a-Stellung eine Aminooxygruppe enthaltenden aliphatischen Carbonsäure
Y den Rest einer aliphatischen a-Aminocarbonsäure bedeuten, sowie von Säureadditionssalzen solcher Peptide, dadurch gekennzeichnet, dass man ein reaktionsfähiges Heptapeptidderivat der allgemeinen Formel II
H-Arg(A)-Val-Tyr(B)-Ile-His(E)-Pro-Y-OG (II)
worin
A eine zum temporären Schutz des Guanidinorestes von Arg geeignete Schutzgruppe,
B eine zum temporären Schutz der aromatischen Hydroxylgruppe von Tyr geeignete Schutzgruppe,
E eine zum temporären Schutz der Imidazolgruppe von His geeignete Schutzgruppe,
G Wasserstoff oder eine zum Schutz der Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure geeignete, gegenüber schwach sauren Einflüssen widerstandsfähige, aber durch Behandeln mit stärkeren Säuren oder mit Alkalien abspaltbare Schutzgruppe vertreten und
Y die oben angegebene Bedeutung hat,
mit einem reaktionsfähigen Aminooxycarbonsäurederivat der allgemeinen Formel III
W-X-M (III)
worin
X die oben angegebene Bedeutung hat,
W eine durch Acidolyse abspaltbare Schutzgruppe und M eine Hydroxylgruppe oder eine aktivierende Gruppe vertreten,
umsetzt und aus den erhaltenen Verbindung der allgemeinen Formel IV
W-X-Arg(A)-Val-Tyr(B)-Ile-His(E)-Pro-Y-OG (IV) worin W, X, Y, A, E und G die obigen Bedeutungen haben,
die Schutzgruppen selektiv nacheinander oder auf einmal entfernt, und gewünschtenfalls das erhaltene Peptid der allgemeinen Formel I in ein Säureadditionssalz überführt.
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