CH620671A5

CH620671A5 - Process for the preparation of a peptide

Info

Publication number: CH620671A5
Application number: CH1336376A
Authority: CH
Inventors: Yoshikazu Isowa; Muneki Ohmori; Hideaki Kurita; Tetsuya Ichikawa; Masanari Sato; Kaoru Mori
Original assignee: Sagami Chem Res
Priority date: 1975-10-23
Filing date: 1976-10-22
Publication date: 1980-12-15
Also published as: CA1059938A; NL8301093A; NL173979B; NL173979C; IT1077078B; FR2328694B1; GB1533129A; DE2647188A1; FR2328694A1; DE2647188C2; NL7611698A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids, insbesondere unter Verwendung eines spezifischen Enzyms als Katalysator.

Herkömmlicherweise stellt man Peptide nach der Azid-methode her oder nach der gemischten Säureanhydridmethode, der Carbodiimidmethode, der aktiven Estermethode oder der Säurechloridmethode oder dgl. Bei diesen herkömmlichen Verfahren treten jedoch verschiedene industrielle Probleme auf. So kommt es zu einer Razemisierung der Carboxylkomponente des C-Terminal-Aminosäurerests. Weiter muss mit Nebenreaktionen, mit Problemen der Temperatursteuerung, mit Problemen der Auswahl des Lösungsmittels und mit Schwierigkeiten hinsichtlich der Eigenschaften der Aminoschutzgruppen und der Carboxylschutzgruppen gerechnet werden, sowie~mit besonderen Effekten, welche durch die funktionellen Gruppen der Seitenketten der Aminosäuren hervorgerufen werden.

Die Fragmentkondensationsmethode zur Herstellung von Peptiden kann mit Vorteil bei Verbindungen angewandt werden, welche als Carboxylendgruppe Glycin aufweisen (die einzige Aminosäure, welche nicht razemisiert wird). Bei anderen Verbindungen mit anderen Aminosäuren als Carboxyl-endgruppen kann jedoch eine Razemisierung nicht verhindert werden. In der Tat stellt bei allen bisherigen Peptidsynthesen die Razemisierung ein schwieriges Problem dar. Wenn Razemisierung eintritt, so ist die Reinheit des Produktes sehr gering und es ist erforderlich, das verunreinigende Isomere aus dem Produkt abzutrennen. Dies ist äusserst nachteilig für die industrielle Durchführung des Verfahrens.

Unter allen herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von Peptidbindungen ist einzig und allein die Azidmethode weitgehend frei von Razemisierungsproblemen und diese Azidmethode ist somit die Methode der Wahl. Das Azidver-fahren erfordert jedoch komplizierte Reaktionsschritte und es werden im Wege einer Nebenreaktion Harnstoffderivate gebildet. Aus diesen Gründen ist die Azidmethode vom Standpunkt der Ausbeute ungünstig.

Es wurden ferner zusätzlich zu den verschiedenen organisch-chemischen Verfahren Peptidsyntheseverfahren unter Verwendung der Enzyme Papain und Chymotrypsin vorgeschlagen (J.S. Fruton «Advances in Protein Chemistry», 5, Academic Press Inc., New York, N.Y. 1949). Dabei treten die folgenden Reaktionen ein:

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(1) Bz-Leu-OH + H-Leu-NH0

(I) (II)

Papain

* 5 Bz-Leu-Leu-NH0

(III)

(2) Bz-Leu-OH + H-Gly-NH0

(I) (II)

Papain

5> Bz-Leu-Gly-NH0

(III)

(3) Bz-Tyr-OH + H-Gly-NH0

(I) (II)

Chymotrypsin

) Bz-T yr-Gly-NH0

(III)

(4) Z-Phe-Gly-OH + H-Tyr-NH2

(I) (II)

Papain

> Z-Phe-Gly-Tyr-NH3

(III)

Dabei muss die Phenylaminogruppe vom Peptid (III) unter recht drastischen Bedingungen entfernt werden, da die Phenylaminogruppe, welche an die C-terminale Gruppe der Aminkomponente (II) gebunden ist, nicht leicht vom Peptid abgespalten werden kann. So kommt es nachteiligerweise zu einer Spaltung der Peptidkette. Aus diesen Gründen wurde bisher dieses Peptidsyntheseverfahren praktisch nicht angewandt. Andererseits tritt bei der Reaktion (4) eine Transami-dierung und Transpeptidisierung ein, so dass auch diese Reaktion praktisch nicht verwendbar ist. [R.B. Johnston et al; J. Biol. Chem., 185, 629 (1950) und J. S. Fruton et al; J. Biol. Chem., 204, 891 (1953)].

Bei der Reaktion (4) ist die primäre Aminogruppe des Säureamids, welche mit der terminalen Gruppe der Aminkomponente verbunden ist, ein Promotor für die durch Papain katalysierte Amidasereaktion. Daher haben diese bekannten Verfahren nur theoretisches Interesse, indem sie zeigen, dass Papain und Chymotrypsin als Katalysatoren für die Synthese von Peptidbindungen eingesetzt werden können, bei denen Phenylaminogruppen als Schutzgruppen der terminalen Carboxylgruppe der Aminokomponente dienen. Es besteht daher ein erhebliches Bedürfnis nach wirksamen Verfahren der Peptidsynthese.

Es ist somit Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Synthese von Oligopeptiden oder Polypeptiden zu schaffen, welches bei ienfacher Arbeitsweise zu hohen Ausbeuten führt.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss durch ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids der Formel

X-A-B-Y

gelöst, wobei A und B gleich oder verschieden sind und einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest bedeuten und wobei X eine Aminoschutzgruppe bedeutet und wobei Y eine Carb-oxylschutzgruppe, nämlich eine substituierte oder unsubsti-tuierte tert-Alkoxy-, Benzyloxy-, Benzylamino- und Benz-hydrylaminogruppe bedeutet, wobei eine Aminosäure oder ein Peptid mit einer N-terminalen Schutzgruppe oder ein Salz derselben der Formel

X-A-OH

mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit einer C-termi-nalen Schutzgruppe oder einem Salz derselben der Formel

H-B-Y

umgesetzt wird, und zwar in Gegenwart von Thiolproteinase oder Serinproteinase in einer wässerigen Lösung, deren pH-Wert derart gewählt ist, dass die Enzymaktivität der Thiolproteinase oder der Serinproteinase aufrechterhalten bleibt. 5 Das Thiolproteinaseenzym umfasst die Enzyme Papain, Stembromelein, Ficin, Cathepsin B, Chymopapain, Strepto-coccal Proteinase, Asclepain, Clostridium histolyticum pro-tenase B und Hefeprotenase B. Thiolproteinase ist zur Hydrolyse einer Vielzahl verschiedenster Proteine geeignet, solo wie zur Förderung der Spaltung einer Vielzahl von Peptidbindungen, Aminobindungen und Esterbindungen, sowie zur Förderung der Zersetzung von Benzoylalginamid, Benzoyl-glycylleucylglycin und Benzoyltyrosylglycinamid. Die Thiolproteinase ist somit sowohl als Exopeptidase als auch als 15 Endopeptidase wirksam [J.R. Kimmel und E. L. Smith, Advance Enzymology, 19, 267 (1957)]. Serinproteinase umfasst die Enzyme Substilisin, Aspergillus alkalische Proteinase, Elastase, a-Lytinproteinase, Chymotrypsin, Metri-diumproteinase A, Trypsin, Thrombin, Alasmin, Kinino-20 genin, Enteropeptidase, Acrosin, Phaseolus protenase, Altemaria endopeptidase, Arthrobacter serinprotenase und Te-nebrio a-protenase. Es wurde berichtet, dass Serinproteinase eine beträchtliche Hydrolyseaktivität gegenüber der Leu (15) - Tyr (16)-Sequenz und gegenüber der Tyr (16) - Leu 25 (17)-Sequenz der Insolin-B-Kette aufweist und ferner auch eine grosse Esteraseaktivität gegenüber Acylaminosäure-estern. Das Subtilisin welches aus B. subtilis oder analogen Mikroorganismen gewonnen wird, umfasst Typen von Cars-bery, Novo, BPN' und dgl. Alkalische Proteinase, welche aus 30 Strahlenpilzen isoliert werden kann, ist ein bekanntes Material.

Im folgenden wird mit dem Ausdruck Säurekomponente die Aminosäure oder das Peptidausgangsmaterial der Formel

35

X-A-OH

bezeichnet, wobei X eine Schutzgruppe der terminalen Aminogruppe bedeutet und wobei A einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest bedeutet. Die Gruppe A bezeichnet einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest, wobei als geeignete 40 Aminosäuren vorzugsweise aliphatische Aminosäuren, wie Monoaminomonocarbonsäuren, z.B. Glycin (Gly), Alanin (Ala), Valin (Val), Norvalin (nor-Val), Leucin (Leu), Isoleucin (iso-Leu), Norleucin (nor-Leu); Oxyaminosäuren, wie Serin (Ser), Threonin (Thr), Homoserin (homo-Ser); schwefelhaltige 45 Aminosäuren, wie Methionin (Met) oder Cystin (CysS) und Cystein (CysH); Monoaminodicarbonsäuren, wie Asparagin-säure (Asp), Glutaminsäure (Glu), Asparagin (Asn) und Glutamin (Gin); Diaminomonocarbonsäure, wie Ornithin (Orn), Lysin (Lys), Arginin (Arg); aromatische Aminosäuren, 50 wie Phenylalanin (Phe) und Tyrosin (Tyr); u. heterocyclische Aminosäuren, wie Histidin (His), Tryptophan (Try). Diese Aminosäuren werden mit Symbolen bezeichnet, welche auf dem Gebiet der Proteine allgemein üblich sind. Peptide werden durch Kombinationen dieser Symbole bezeichnet. 55 Geeignete Schutzgruppen für die freie terminale Aminogruppe (N-terminale Schutzgruppe) der Säurekomponente sind tert-Alkoxycarbonylgruppen, wie t-Butyloxycarbonyl (BOC-), t-Amyloxycarbonyl (t-Aoc-); Benzyloxycarbonyl (Z-), p-Methoxybenzyloxycarbonyl (PMZ), 3,5-DimethoxybenzyI-60 oxycarbonyl (Z(OMe).,-}, 2,4,6-TrimethyIbenzyloxycarbonyl (TMZ-), p-Phenylazobenzyloxycarbonyl (PZ-); p-ToluoIsulfo-nyl (Tos-); o-Nitrophenylsulfenyl (Nps-); oder dgl. Die andere Aminosäure oder das andere Peptidausgangsmaterial hat die Formel

65

H-B-Y.

Diese Komponente wird im folgenden als Aminkomponente bezeichnet. In dieser Formel bezeichnet B einen Amino-

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4

säurerest oder einen Peptidrest, welcher der Definition des Rests A folgt.

Als Schutzgruppen für die Carboxylgruppe (C-terminale Schutzgruppen) der Aminokomponente kommen tert-Alkoxy-gruppen in Frage, wie t-Butoxy (-OBu'), Benzyloxy (-OBzl), p-Nitrobenzyloxy {-OBzl (p-N02)}, Benzhydryloxy (-OBzh), Benzylamino (-NHBzl), 2,4-Dimethoxybenzylamino (-NHDMB) und Benzhydrylamino (-NHBzh). Diese Schutzgruppen für die terminale Carboxylgruppe der Aminkomponente sind gegenüber Esterasereaktionen und Amidasereaktionen, welche durch die Thiolproteinaseenzyme und die Serinproteinaseenzyme verursacht werden können, resistent.

Als Säurekomponente und als Aminkomponente können bei dem erfindungsgemässen Verfahren auch Aminosäurereste und Peptidreste mit funktionellen Gruppen in den Seitenketten verwendet werden. In diesen Fällen ist es bevorzugt, auch diese funktionellen Gruppen mit Schutzgruppen zu schützen. Geeignete Schutzgruppen für die oo-Aminogrup-pe (N<°) sind NM-Benzyloxycarbonyl (Nc,-Z), t-Butoxycarbo-nyl (N°'-BOC) und Tosyl (NM-Tos). Geeignete Schutzgruppen für die N-Guanidinogruppe (NG) des Arg sind Nitro (NG-N02), N6-Benzyloxycarbonyl (NG-Z) und NG,NG-Dibenzyl-oxycarbonyl (NG-Z-Z). Geeignete Schutzgruppen für die Imid-azolringe (Nim) des His sind Nim-Benzyl (Nim-Bzl) und Tosyl (Nim-Tos). Geeignete Schutzgruppen für die w-Carboxyl-gruppe sind w-Benzyloxy (-OBzl). Geeignete Schutzgruppen für die Hydroxylgruppe der aliphatischen oder aromatischen Oxyaminosäuren sind Aralkylgruppen, wie Benzyl (Bzl). Geeignete S-Schutzgruppen für die Mercaptogruppe von CysH umfassen die Benzylgruppe (Bzl). Diese Schutzgruppen sollten unter den Bedingungen der Hauptreaktion stabil sein und andererseits vom Endprodukt leicht abspaltbar sein, ohne zu Nebenreaktionen zu führen. Die als Ausgangsmaterialien eingesetzte Säurekomponente und die Aminkomponente können Schutzgruppen aufweisen, oder die Na-Aminogruppe der Aminkomponente kann frei sein oder in Form eines anorganischen oder organischen Salzes, z.B. eines Hydrochlorids, eines Hydrobromids, Oxalats, p-ToluoIsulfonats oder Acetats vorliegen. Bei dem erfindungsgemässen Verfahren kann die Kondensationsreaktion, welche zu der Peptidbildung führt, in einer wässrigen Lösung durchgeführt werden, welche einen pH-Wert hat, bei dem die Enzymaktivität erhalten bleibt. Im Falle der Thiolproteinase beträgt dieser pH-Wert etwa 4 bis 7,5 und im Falle der Serinproteinase etwa 6 bis 9.

Es stehen zwei Verfahren zur Einhaltung des richtigen pH-Wertes für die Aufrechterhaltung der Enzymaktivität zur Verfügung. Das erste Verfahren besteht darin, die Kondensationsreaktion in einer Pufferlösung, z.B. einer Zitronensäurepufferlösung, einer Mcllvaine-Pufferlösung, einer Kolt-hoff-Pufferlösung, einer Tris-HCl-Pufferlösung oder einer Veronal-Pufferlösung durchzuführen, wobei die Säurekomponente und die Aminkomponente in der Pufferlösung aufgelöst werden und worauf das Enzym hinzugesetzt wird. Das andere Verfahren besteht darin, je nach dem gemessenen pH-Wert das Reaktionsgemisch während der Kondensationsreaktion mit der Säure oder der Base zu versetzen, um so den pH des Reaktionsgemisches in einem für die Aufrechterhaltung der Enzymaktivität erforderlichen Bereich zu halten.

Die Ausgangsmaterialien können in einem Verhältnis von 0,8 bis 2 Molen und vorzugsweise 1 bis 1,5 Molen der Säurekomponente pro 1 Mol der Aminkomponente eingesetzt werden. Wenn die Ausgangsmaterialien in der wässrigen Lösung nicht allzu löslich sind, so kann man zur Verbesserung der Löslichkeit der Reaktanten ein Lösungsmittel zusetzen, z.B. einen Alkohol, wie Methanol oder Äthanol; Dimethylform-amid; Dioxan; Tetrahydrofuran; Dimethylsulfoxid oder dgl. Die Menge des zugesetzten Lösungsmittels sollte beschränkt sein, so dass die Aktivität des Enzyms für die erfindungsge-

mässe Reaktion nicht beeinträchtigt oder inhibiert wird.

Wenn ein Lösungsmittel eingesetzt wird, so sollte dieses in Mengen von weniger als 1 Gew.-Teil und vorzugsweise 0,2 bis 1,0 Gew.-Teilen pro 1 Gew.-Teil Wasser eingesetzt werden. Die erfindungsgemäse Reaktion wird in einem wässrigen Lösungsmittel durchgeführt. Es ist erforderlich, die relative Löslichkeit der Reaktionsprodukte zu senken, so dass diese vorzugsweise im System schwach löslich oder unlöslich sind.

Die Menge des Thiolproteinaseenzyms oder des Serin-proteinaseenzyms liegt im Bereich von 10 bis 500 mg, vorzugsweise 10 bis 400 mg und speziell 50 bis 300 mg pro 1 mmol der Aminkomponente. Ferner kann der Lösung auch ein Enzymaktivator, wie CysH oder ein Salz desselben oder 2-Mercaptoäthanol oder ein Salz desselben zugesetzt werden. Die Reaktionstemperatur liegt gewöhnlich im Bereich von 20 bis 55°C und insbesondere im Bereich von 30 bis 40°C. Unter diesen Bedingungen bleibt die Enzymaktivität erhalten. Die Reaktion schreitet unter den genannten Bedingungen während 1 bis 24 h glatt voran. Das Reaktionsprodukt fällt aus dem Reaktionssystem aus und kann leicht isoliert werden.

Nach dem erfindungsgemässen Verfahren kann man ein Dipeptid, ein Oligopeptid oder ein Polypeptid der folgenden Formel

X-A-B-Y

auf einfache Weise erhalten, indem man die Gruppen A und B der Ausgangsmaterialien der Formeln

X-A-OH und H-B-Y

in geeigneter Weise auswählt.

Das Dipeptidderivat Lysyl-lysin kann gemäss folgender Reaktionsformel hergestellt werden.

Z-Lys(Z)-OH + H-Lys(Z)-OBul

> Z-Lys(Z)-Lys(Z)-OBut

Lysin, dessen w-Aminogruppe mit der Carbobenzoxyl-gruppe (Z-) geschützt ist (Z-Derivat), dient als Säurekomponente und ein t-Butylester dient als Aminkomponente. Man erhält Lysyl-lysin dessen Aminogruppe in der Seitenkette geschützt ist.

Das Arginin enthaltende Dipeptidderivat Arginyl-leucin wird durch folgende Reaktion erhalten

Z-Arg(Z,Z)-OH + H-Leu-OBzh

? Z-Arg(Z,Z)-Leu-OBzh.

Das Tri-Z-arginin wird erhalten durch Schutz der Guanyl-gruppe und der Aminogruppe des Arginins mit Z. Es dient als Säurekomponente. Der Benzhydrylester des Leucins dient als Aminkomponente. Man erhält auf einfache Weise ein Dipeptidderivat durch Umsetzung in Gegenwart von Papain. Wenn man eine Aminosäure mit einer funktionellen Gruppe in der Seitenkette verwendet, so kann die Aminosäure, deren funktionelle Gruppe geschützt oder ungeschützt ist, wie aus nachstehenden Beispielen hervorgeht, umgesetzt werden. Nachfolgend seien einige Reaktionen von Histidin erläutert.

BOC-His(Bzl)-OH + H-Leu-OBzh

} BOC-His(Bzl)-Leu-OBzh ...(a)

BOC-His-OH + H-Leu-OBzh

} BOC-His-Leu-OBzh ...(b)

Reaktion (a) bezeichnet den Fall eines Schutzes der Seitenkette während bei der Reaktion (b) die Seitenkette ungeschützt ist.

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5

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Vorstehend wurden die Verhältnisse der Dipeptidherstel-lung erläutert. Eine andere Situation besteht im Falle einer Säurekomponente mit einer Peptidbindung. In diesem Falle wird ein Acyldipeptid mit einem Aminosäureamidderivat umgesetzt. Die Reaktion geht in Gegenwart von Papain glatt vonstatten, ohne dass Nebenreaktionen eintreten. Sie kann durch die nachstehende Formel veranschaulicht werden:

Z-Pro-Gly-OH + H-Leu-NHBzh

■> Z-Pro-Gly-Leu-N HBzh

Man erhält Carbobenzoxy-prolyl-glycyl-leucin-benzhy-drylamid.

Beispiele der Synthese von Tripeptiden sind in Tabelle 3 zusammengestellt. Im folgenden sollen die Verhältnisse erläutert werden, welche bestehen, wenn die Säurekomponente ein Dipeptid ist und wenn die Aminkomponente ebenfalls ein Dipeptid ist.

Die folgende Reaktion kann zur Synthese des Fragment--(3,6)-Tetrapeptids von Val5-Angiotensin-II, welches als Poly-peptidhormon bekannt ist, verwendet werden.

BOC-Val-Tyr(Bzl)-OH + H-Val-His(Bzl)-OBzl

> BOC-Val-Tyr(Bzl)-Val-His(Bzl)-OH

Wenn als Aminkomponente der Reaktion der Valylhisti-dinester verwendet wird, und wenn die Reaktion in Gegenwart von Papain durchgeführt wird, so kann ein Tetrapeptid mit einer Benzylestergruppe nicht erhalten werden. Dies wird auf eine Esterasewirkung zurückgeführt, welche eine der Charakteristika des Papains ist. Die obige Reaktion ist insbesondere vorteilhaft, wenn das Tetrapeptid als Säurekomponente in der nächsten Stufe einer Polypeptidsynthese verwendet wird. Wenn die Carboxylgruppe der Aminkomponente das Benzhydrylamid ist, so kann man in hohen Ausbeuten ein Tetrapeptid-Benzhydrylamid-Derivat erhalten. Beispiele, bei denen ein Dipeptidderivat als Säurekomponente oder Aminkomponente eingesetzt wird, sind in Tabelle 4 zusammengestellt. Die gleiche Reaktion kann unter Verwendung von Serinproteinase, z.B. Subtilisin BPN', durchgeführt werden. Wie bereits erwähnt, gelingt die Synthese von Oligopeptiden und Polypeptiden durch Auswahl geeigneter Schutzgruppen für die Carboxylgruppe der Aminkomponente und durch Verwendung der Thiolproteinase oder der Serinproteinase, obwohl diese eine Esterase Wirkung und eine Amidasewirkung zeigen. Die katalytische Wirksamkeit dieser Enzyme für die Peptidsynthese ist völlig unerwartet.

Aus vorstehender Beschreibung geht hervor, dass das er-findungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Peptiden mit gewünschter Aminosäuresequenz durch Ausnutzung der Endopeptidase-Charakteristika gelingt. Schon katalytische Mengen des Enzyms sind ausreichend und das Enzym kann wiederholt eingesetzt werden. Die Reaktion schreitet unter milden Bedingungen in einer Pufferlösung oder in einer Lösung mit gewünschtem pH-Wert glatt voran. Die Ausbeute ist relativ hoch und das Produkt zeigt eine sehr hohe Reinheit. Das erfindungsgemässe Verfahren eignet sich sowohl zur stufenweise Verlängerung der Peptidketten als auch zur Kondensation von Peptidfragmenten. Beide Reaktionen sind für industrielle Zwecke geeignet. Darüber hinaus tritt keinerlei Razemisierung der Peptide ein, ein Ergebnis, welches mit herkömmlichen Peptidsynthesen nicht erreicht werden kann.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Eine Mischung von 20 ml Mcllvain-Pufferlösung von pH 6,2 und 3 ml Methanol wird zu 497 mg (1,20 mmol)

Z-Lys(Z)-OH und 366 mg (1,09 mmol) H-Lys(z)-OBu' gegeben. Sodann gibt man 130 mg Papain (Titer 1200 CSU/g, hergestellt von Green-cross K.K.) und 0,05 ml 2-Mercapto-äthanol unter Rühren bei 38°C zu der Mischung, worauf die 5 Reaktion während 24 h durchgeführt wird. Das erhaltene ölige Produkt wird mit Äthylacetat extrahiert und die Extraktlösung wird der Reihe nach mit Wasser, 0,5n HCl, 7 % Ammoniakwasser und wiederum Wasser gewaschen. Die Äthyl-acetatlösung wird eingeengt, worauf Petroläther hinzugege-io ben wird. Man erhält 385 mg (48%) rohe Kristalle von Z-Lys-(Z)-Lys(Z)-OBut. Ein Teil der Kristalle wird aus Äthyl-acetat/Petroläther umkristallisiert. Man erhält ein reines Produkt mit einem Schmelzpunkt von 62 bis 66°C und [a]D25 = -14,2° (C = 0,5 Methanol). 15 Elementar-Analyse

C H N

berechnet (%) 65,55 7,15 7,65

gefunden (%) 65,55 7,22 7,67

20 Beispiel 2

Eine Mischung von 20 ml Mcllvaine-Pufferlösung mit pH 7,0 und 4 ml Methanol wird zu 692 mg (1,20 mmol) Z-Arg(Z,Z)-OH und 470 mg (1,00 mmol) H-Leu-OBzh . TosOH gegeben. Sodann werden 150 mg Papain und 0,1 ml 25 2-Mercaptoäthanol unter Rühren bei 38°C zu der Mischung gegeben und die Reaktion wird während 10 h durchgeführt. Der erhaltene farblose Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 7% Ammoniakwasser und wiederum Wasser gewaschen, wobei man Z-Arg(Z,Z)-Leu-OBzh erhält. 30 Ausbeute 850 mg (99%).

Schmelzpunkt 161 bis 168°C.

[ajp25 = —9,4°C (C = 1,0 N,N-Dimethylformamid).

Elemen tar-Analyse C H N

35 berechnet (%) 68,76 6,24 8,18

gefunden (%) 68,43 6,18 8,38

Beispiel 3

20 ml Mcllvaine-Pufferlösung von pH 6,6 werden zu 40 691 mg (2,00 mmol) BOC-His(Bzl)-OH und 599 mg (1,80 mmol) von H-Leu-NHBzh . HCl gegeben. Sodann gibt man 250 mg Papain und 100 mg Cysteinhydrochlorid zu der Mischung unter Rühren bei 38°C und die Reaktion wird während 24 h durchgeführt. Der erhaltene farblose Nieder-45 schlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 7 % Ammoniakwasser und Wasser gewaschen. Man erhält 750 mg rohe Kristalle. Das Produkt wird in 50 ml heissem Methanol aufgelöst und die heisse Lösung wird mit Aktivkohle behandelt, um das Protein zu entfernen. Die Lösung wird dann so eingeengt und Wasser wird zu dem Rückstand gegeben und das Produkt wird umkristallisiert, wobei man ein kristallines Produkt, nämlich BOC-His(Bzl)-Leu-NHBzh erhält.

Ausbeute 686 mg (62%).

Schmelzpunkt 113 bis 115°C.

55 [a]D2r> = — 8,1° (C = 1,0 Chloroform).

Elemen tar-Analyse C H N

berechnet (%) 71,24 7,27 11,23

gefunden (%) 71,15 7,30 11,31

60

Beispiel 4

20 ml Mcllvaine-Pufferlösung von pH 6,6 werden zu 511 mg (2,00 mmol) BOC-His-OH und 599 mg (1,80 mmol) H-Leu-NHBzh . HCl gegeben. Sodann gibt man 250 mg 65 Papain und 100 mg Cysteinhydrochlorid unter Rühren bei 38°C zu der Mischung und die Reaktion wird während 24 h durchgeführt. Der erhaltene farblose Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 7 % Ammoniakwas-

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6

ser und Wasser gewaschen, wobei man ein kristallines Rohprodukt erhält. Dieses wird in Äthanol/Wasser aufgelöst und die heisse Lösung wird mit Aktivkohle behandelt, um das Protein zu entfernen. Sodann wird die Lösung eingeengt. Dabei erhält man das kristalline Produkt BOC-His-Leu-NHBzh.

Ausbeute 336 mg (35 %).

Schmelzpunkt 221 bis 223°C.

[«Jx,25 = -23,6"

berechnet (%) gefunden (%)

(C = 0,5 Chloroform). Elementar-Analyse C H N

67,25 7,37 13,12 67,39 7,38 13,21

Beispiel 5

40 ml Mcllvaine-Pufferlösung von pH 6,2 werden zu 531 mg (2,00 mmol) BOC-Phe-OH und 935 mg (2,00 mmol) H-His-(Bzl)-NHDMB . 2HC1 gegeben, worauf man 4 ml In NaOH zu der Lösung gibt. Sodann gibt man 480 mg Papain und 240 mg Cysteinhydrochlorid unter Rühren bei 38°C zu der Mischung. Sodann wird die Reaktion während 24 h durchgeführt. Der erhaltene farblose Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 7 % Ammoniak und dann wiederum mit Wasser gewaschen. Man erhält 960 mg eines kristallinen Rohprodukts. Diese wird in 100 ml heissem Methanol aufgelöst und die heisse Lösung wird mit Aktivkohle während 30 min behandelt, um das Protein zu entfernen. Die Lösung wird danach eingeengt und mit Wasser versetzt, wobei das kristalline Produkt BOC-Phe-His(Bzl)-NHDMB. ^H.O erscheint.

Ausbeute 650 mg (40%).

Schmelzpunkt 128 bis 132°C.

r«]D25 = +1,6° (C = 1,0 Chloroform).

Elementar-Analyse berechnet (%) gefunden (%)

C

66,44 66,34

H

6,82 6,66

N

10,76 10,78

Beispiele 6 bis 23 Das Verfahren des Beispiels 1 wird wiederholt, wobei jedoch als Säurekomponente die Ntt-Acylaminosäure und als Aminkomponente der Aminosäureester von H-Vol-OBzh gemäss Tabelle 1 verwendet wird. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Ferner wird das Beispiel 1 wiederholt, wobei jedoch als Säurekomponente die N"-Acylamino-säure des Z-Ala-OH eingesetzt wird und wobei als Aminkomponente der Aminosäureester oder das Amid gemäss Tabelle 2 eingesetzt werden. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 2 zusammengestellt.

15

20

25

30

35

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40

45

50

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60

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TABELLE 1 (Fortsetzung)

Bsp. Nr.

Säurekomponemte

Aminkomponente

Produkt

Ausbeute (%)

Schmelzpunkt (°C)

Elementar-Analyse

(1) berechnet (%>) (2) gefunden (°/o)

C

H

N S

12

Z-Glu-OH

H-Val-OBzh

Z-Glu-Val-OBzh

61

125-131

(1)

(2)

68,12 68,23

6,27 6,31

5,12 4,84

13

Z-Glu-OH

H-Val-OBzh

Z-Glu-V al-OBzh

69

178-183

(1)

(2)

68,24 67,94

6,47 6,39

7,74 7,74

14

Z-Arg(N02)-0H

H-Val-OBzh

Z-Arg(N02)-Val-0Bzh

83

139-142

(1)

(2)

62,12 62,98

6,19 6,21

13,58 13,40

15

Z-Lys(Z)-OH

H-Val-OBzh

Z-Lys(Z)-V al-OBzh

70

110-117

(1)

(2)

70,67 70,28

6,67 6,66

6,18 6,33

TABELLE 2

Bsp. Nr.

Säurekomponente

Aminkomponente

Produkt

Ausbeute (%)

Schmelzpunkt (°C)

Elementar-Analyse

(1) berechnet (°/o) (2) gefunden (°/o)

C

H

N

16

Z-Ala-OH

H-Val-OBzh

Z-Ala-Val-OBzh

80

92-96

(1)

(2)

71,29 71,28

6,60 6,54

5,73 5,82

17

Z-Ala-OH

H-Leu-OBu1

Z-AIa-Leu-OBu'

49

95,5-97,0

(1)

(2)

64,26 64,65

8,22 8,15

7,14 7,14

18

Z-Ala-OH

H-Phe-OBzh

Z-Ala-Phe-OBzh

89

123-125

(1)

(2)

73,86 73,97

6,01 6,01

5,52 5,11

19

Z-Ala-OH

H-Ile-OBzh

Z-Ala-Ile-OBzh

92

88-96

(1)

(2)

71,69 71,72

6.82

6.83

5,58 5,44

20

Z-Ala-OH

H-Ala-NHBzh

Z-Ala-Ala-NHBzh

61

230-232

(1)

(2)

70,57 69,48

6,36 6,10

9,14 9,24

21

Z-Ala-OH

H-Asn-NHBzh

Z-Ala-Asn-NHBzh

53

252-254

(1)

(2)

66,91 66,70

6,02 6,11

11,15 10,92

22

Z-Ala-OH

H-Arg(NO,,)-NHBzh

Z-Ala-Arg(N02)-NHBzh. Yz H20

52

123-125

(1)

(2)

60,19 60,06

6,06 6,10

16.38 16,42

23

Z-Ala-OH

H-Lys(Z)-OBu<

Z-Ala-Lys(Z)-OBu»

48

62-66

(1)

(2)

65,55 65,55

7,15 7,22

7,65 7,67

620 671

8

Beispiel 24

1,5 ml N,N-Dimethylformamid werden zu 370 mg (1,20 mmol) Z-Pro-Gly-OH und 305 mg (1,00 mmol) H-Leu--NHBzh . unter Rühren gegeben. Sodann gibt man

15 ml Zitronensäurepufferlösung mit einem pH von 5,5 zu der Mischung. Danach wird das Gemisch mit 200 mg Papain und 0,2 ml 2-Mercaptoäthanol unter Rühren bei 38°C versetzt und die Mischung wird während 24 h umgesetzt. Der erhaltene farblose Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, einer 5% igen wässrigen Zitronensäurelösung, Wasser und 7% Ammoniaklösung gewaschen. Man erhält 310 mg (51%) roher Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 146 bis 149°C. Das Produkt wird in Methanol aufgelöst und eine geringe Menge eines unlöslichen Materials wird durch Filtrieren abgetrennt. Die Lösung wird eingeengt und Wasser wird zu dem Rückstand gegeben. Man erhält als Produkt Z-Pro-Gly-Leu-NHBzh . H..O mit einem Schmelzpunkt von 148 bis 150°C und [a]D2' ="-41,0° (C = 0,5 Methanol).

Elementar-Analyse C H N

67,75 68,05

berechnet gefunden

(%)

7,02 6,96

9,30 9,24

Beispiele 25 bis 32 Das Verfahren des Beispiels 24 wird wiederholt, wobei man jedoch als Säurekomponente das N«-Acyldipeptid von Z-Phe-Ala-OH und als Aminkomponente die Aminosäure oder das Amid gemäss Tabelle 3 verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt.

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25

35

40

45

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55

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620671

Beispiel 33

Eine Mischung von 15 Mcllvaine-Pufferlösung mit einem pH von 8,0 und 15 ml Methanol werden zu 564 mg (1,2 mmol) BOC-Val-Tyr-(Bzl)-OH und 516 mg (1,0 mmol) H-Val-His(Bzl)-OBzl. 2HC1 gegeben. Sodann gibt man 300 mg Papain und 150 mg Cysteinhydrochlorid zu der Mischung unter Rühren bei 38°C, worauf die Reaktion während 24 h durchgeführt wird. Der erhaltene farblose Niederschlag wird abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Man erhält 450 mg rohe Kristalle. Das Produkt wird in 40 ml Äthanol aufgelöst und die heisse Lösung wird mit Aktivkohle behandelt, um das Protein zu entfernen. Sodann wird die Lösung abgekühlt und der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat wird eingeengt. Der Rückstand wird durch Zugabe von Äther zudem Rückstand umkristallisiert. Man erhält BOC-Val--Tyr(Bzl)-Val-His(Bzl)-OH.

Ausbeute 100 mg (12%).

Ninhydrintest: negativ.

Schmelzpunkt: 159 bis 165°C.

[a]D25 = —8,16°(C = 0,5 N,N-Dimethylformamid).

Elementar-Analyse C H N

berechnet (%) 63,44 7,26 10,00

gefunden (%) 63,67 7,04 10,24

Beispiel 34

Eine Mischung von 20 ml Mcllvaine-Pufferlösung mit pH 6,1 und 10 ml Methanol werden zu 518 mg (1,1 mmol) BOC-Val-Tyr(Bzl)-OH und 583 mg (1,0 mmol) H-Val-His-(Bzl)-NHBzh. 2HC1 gegeben, worauf man noch 2 ml In NaOH zu der Lösung gibt. Sodann versetzt man die Lösung mit 240 mg Papain und 120 mg Cysteinhydrochlorid unter Rühren bei 38°C. Sodann wird die Reaktion während 48 h durchgeführt. Der erhaltene farblose Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit 0,5n HCl, 7 % Ammoniakwasser und Wasser gewaschen. Man erhält 950 mg rohe Kristalle. Das Produkt wird in 300 ml Methanol aufgelöst und die heisse Lösung wird mit Aktivkohle behandelt, um das Protein zu entfernen. Die Lösung wird dann eingeengt und der Rückstand wird aus N,N-Dimethylformamid/Wasser umkristallisiert, wobei man BOC-Val-Tyr(Bzl)-Val-His(Bzl)--NHBzh erhält.

Ausbeute 410 mg (2%).

Schmelzpunkt 237 bis 239°C.

[«1d25 = —6,1° (C = 1,0 N,N-Dimethylformamid).

Elemen tar-A nalyse C H N

berechnet (%) 69,84 7,10 10,00

gefunden (%) 70,18 7,01 9,94

Beispiele 35 bis 41 Das Verfahren des Beispiels 34 wird wiederholt, wobei man als Säurekomponente das Ncl-Acyldipeptid gemäss Tabelle 4 und als Aminkomponente das jeweilige Dipeptidamid von H-Phe-Ser-NHBzh gemäss Tabelle 4 einsetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengestellt.

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20

25

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620671

10

Beispiel 42

Eine Mischung von 7,5 ml Mcllvaine-Pufferlösung mit pH 7,0 und 7,5 ml Methanol werden zu 282 mg (0,6 mmol) BOC-Val-Tyr-(Bzl)-OH und 345 mg (0,5 mmol) H-Val-His-(Bzl)-Pro-Phe-OEt. 2HC1 gegeben und dann wird das Gemisch noch mit 1 ml In NaOH versetzt. Sodann gibt man 150 mg Papain und 70 mg Cysteinhydrochlorid hinzu, worauf die Mischung bei 38°C während 24 h gerührt wird. Die erhaltenen farblosen Ausfällungen werden abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 0,5n HCl, 7%igem Ammoniakwasser und wiederum mit Wasser gewaschen. Man erhält 400 mg eines kristallinen Rohprodukts. Das Produkt wird in 50 ml Äthylacetat aufgelöst und die heisse Lösung wird mit Aktivkohle behandelt, um das Protein zu entfernen. Sodann wird die Lösung eingeengt und der Rückstand wird aus Methanol/ Wasser umkristallisiert. Man erhält BOC-Val-Tyr(BzI)-VaI--His(Bzl)-Pro-Phe-OEt.

Ausbeute 226 mg (42%).

Ninhydrintest: negativ.

Schmelzpunkt 167 bis 173°C.

[a]D25 = —34,0 (C = 1,0 N,N-Dimethylformamid) = -56,1 (C = 1,0 Methanol).

Elemen tar-A nalyse C H N

berechnet (%) 66,82 7,19 10,39

gefunden (%) 66,72 7,16 10,55

Das gleiche Produkt wird bei einem Lösungsverfahren erhalten. Dieses Produkt hat die folgenden Eigenschaften: Schmelzpunkt: 164 bis 174°C.

Mischschmelzpunkt: 161 bis 167°C.

[a]D25 = —35,3 (C = 1,0 N,N-Dimethylformamid)

= -59,2 (C = 1,0 Methanol).

Im Gegensatz zur Lösungsmethode wird bei der Enzymmethode keine Razemisierung festgestellt.

Beispiel 43

Ein Gemisch von 15 ml Mcllvaine-Pufferlösung mit pH 8,0 und 15 ml Methanol werden zu 943 mg (1,20 mmol) B0C-Asn-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-0H u. 690 mg (1,00 mmol) H-Val-His(Bzl)-Pro-Phe-OEt. 2HC1 gegeben. Sodann gibt man 300 mg Papain und 150 mg Cysteinhydrochlorid unter Rühren bei 38°C zu dem Gemisch und die Umsetzung wird dann während 4 h durchgeführt. Der erhaltene farblose Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 0,5n HCl, 7%igem Ammoniakwasser und dann wiederum mit Wasser gewaschen. Man erhält 1,20 g rohe Kristalle. Das Produkt wird in 200 ml Äthanol aufgelöst u. die Lösung wird mit Aktivkohle behandelt, um das Protein zu entfernen. Die Lösung wird sodann eingeengt und der Rückstand wird durch Zugabe von Äther umkristallisiert. Man erhält das kristalline Produkt BOC-Asn-Arg(NO.,)-Val-Tyr-(Bzl)-Val-His(Bzl)-Pro--Phe-OEt.

Ausbeute: 530 mg (37%).

Schmelzpunkt: 185 bis 197°C.

[a]w25 = -47,3° (C = 1,0 Methanol)

= —25,3 (C = 1,0 N,N-Dimethylformamid). Elementar-Analyse C H N

berechnet (%) 59,17 6,88 14,79

gefunden (%) 59,11 6,62 15,02

Das gleiche Produkt wird nach der Lösungsmethode hergestellt. Es hat die folgenden Eigenschaften:

Schmelzpunkt: 185 bis 198°C.

Mischschmelzpunkt: 185 bis 190°C.

ra|D2n = -48,4° (C = 1,0 Methanol)

= —26,5° (C = 1,0 N,N-Dimethylformamid). Im Gegensatz zur Lösungsmethode findet bei der Enzymmethode keine Razemisierung statt.

Beispiel 44

2 ml N,N-Dimethylformamid werden zu 420 mg (1,50 mmol) Z-Gln-OH und 480 mg (1,25 mmol) H-Leu-OBzh . (COOH), unter Rühren gegeben, worauf man noch 20 ml Zitronensäurepufferlösung mit einem pH von 5,5 zu der Mischung gibt. Sodann gibt man 300 mg Stembromelein und 0,2 ml 2-Mercaptoäthanol unter Rühren bei 38°C zu dem Gemisch, worauf die Reaktion während 24 h durchgeführt wird. Der erhaltene farblose Niederschlag wird abfiltriert und dann der Reihe nach mit Wasser, 5%iger Zitronensäure, Wasser, 7%igem Ammoniakwasser und wiederum mit Wasser gewaschen. Man erhält 680 mg (97%) des Produkts Z-Gln--Leu-OBzh mit einem Schmelzpunkt von 158 bis 163°C. Nach dem Trocknen wird das Produkt in Methanol aufgelöst und die heisse Lösung wird mit Aktivkohle behandelt. Sodann wird die Lösung eingeengt und der Rückstand wird durch Zugabe von Wasser zu dem Konzentrat kristallisiert. Man erhält ein reines Produkt mit einem Schmelzpunkt von 160 bis 163°C und [a]D25 = -38,1° (C = 1,0 Methanol).

Elementar-Analyse C H N

berechnet (%) 68,67 6,66 7,51

gefunden (%) 68,65 6,65 7,61

Beispiel 45

15 ml Zitronensäurepufferlösung mit pH 5,5 werden zu 403 mg (1,20 mmol) Z-Leu-Ala-OH und 310 mg (1,00 mmol) H-Phe-OBul. (COOH)o gegeben. Danach gibt man 200 mg Strembromelein und 0,2 ml 2-Mercaptoäthanol unter Rühren bei 38°C zu dem Gemisch, worauf die Reaktion während 24 h durchgeführt wird. Der erhaltene farblose Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 5 %iger Zitronensäure, Wasser, 7 %igem Ammoniakwasser und wiederum mit Wasser gewaschen. Man erhält 310 mg rohe Kristalle. Nach dem Trocknen wird das Produkt mit Äthylacetat aufgelöst und die Lösung wird mit Aktivkohle behandelt. Sodann wird die Lösung eingeengt und der Rückstand wird aus Petrol-äther umkristallisiert.

Man erhält Z-Leu-Ala-Phe-OBu1.

Ausbeute: 250 mg (4,6%).

Schmelzpunkt: 73 bis 77°C.

[a]D25 = -40,0° (C = 0,5 Methanol).

Elementar-Analyse C H N

berechnet (%) 66,77 7,66 7,79

gefunden (%) 66,76 7,71 7,90

Beispiel 46

2 ml N,N-Dimethylformamid werden zu 470 mg (1,40 mmol) Z-Leu-Ala-OH und 585 mg (1,25 mmol) H-Ue-OBzh . TosOH unter Rühren gegeben, worauf man noch 20 ml Zitronensäurepufferlösung von pH 5,5 zu dem Gemisch gibt. Danach wird das Gemisch mit 300 mg Stembromelein und 0,2 ml 2-Mercaptoäthanol gegeben worauf die Mischung noch bei 38°C während 24 h gerührt wird. Der erhaltene farblose Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 5 %iger Zitronensäure, Wasser, 7 %igem Ammoniakwasser und wiederum mit Wasser gewaschen. Man erhält 610 mg (79%) des Produkts Z-Leu-Ala-Ile-OBzh mit einem Schmelzpunkt von 167 bis 170°C. Das Produkt wird in Äthylacetat aufgelöst und die Lösung wird Aktivkohle behandelt. Sodann wird die Lösung eingeengt und der Rückstand wird durch Zugabe von Äther zu dem Konzentrat umkristallisiert. Man erhält ein reines Produkt mit einem Schmelzpunkt von 170 bis 171°C und mit [a]D25 = —60,2° (C = 1,0 Methanol).

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620671

berechnet (%) gefunden (%)

Elementar-Analyse C H N

70,22 7,37 6,82 69,95 7,40 6,91

Beispiele 47 bis 56 Das Verfahren des Beispiels 46 wird wiederholt, wobei man jedoch jeweils als Säurekomponente das Na-Acyldipeptid und als Aminkomponente den Aminosäureester oder das 5 Aminosäureamid gemäss Tabelle 5 einsetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengestellt.

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Beispiel 57

2 ml N,N-Dimethylformamid werden zu 380 ml (1,50 mmol) Z-Thr-OH und 480 mg (1,25 mmol) H-Leu-OBzh . (COOH)» unter Rühren gegeben, worauf man noch 20 ml Zitronensäurepufferlösung von pH 5,5 zu der Mischung gibt. Sodann wird das Ganze mit 300 mg Ficin und 0,3 ml 2-Mercaptoäthanol versetzt, worauf das Gemisch noch bei 38°C während 24 h gerührt wird. Der erhaltene farblose Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 5 %-iger Zitronensäure, Wasser, 7%igem Ammoniakwasser und wiederum mit Wasser gewaschen. Man erhält 330 mg (50%) des Produkts Z-Thr-Leu-OBzh mit einem Schmelzpunkt von 114 bis 117°C. Das Produkt wird in Äthylacetat aufgelöst und die Lösung wird eingeengt. Der Rückstand wird durch Zugabe von Äther zu dem Konzentrat umkristallisiert. Man erhält dabei ein reines Produkt mit einem Schmelzpunkt von 120 bis 122°C und [aJD25 = -41,4° (C = 1,0 Methanol).

Elementar-Analyse C H N

berechnet (%) 69,90 6,81 5,26

gefunden (%) 70,02 6,87 5,16

Beispiel 58

1,5 ml N,N-Dimethylformamid werden zu 320 mg (1,20 mmol) BOC-Met-OH und 254 mg (1,00 mmol) H-Ala-NHBzh unter Rühren gegeben. Sodann gibt man 15 ml Zitronensäurepufferlösung von pH 5,5 zu dem Gemisch. Danach gibt man noch 300 mg Ficin und 0,3 ml 2-Mercaptoäthanol unter Rühren bei 38°C zu der Mischung, wobei das Ganze während 24 h bei 38°C zur Umsetzung gebracht wird. Der erhaltene farblose Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 5%iger Zitronensäure, Wasser, 7%igem Ammoniakwasser und wiederum mit Wasser gewaschen. Man erhält 400 mg (82%) des Produkts BOC-Met-Ala-NHBzh mit einem Schmelzpunkt von 163 bis 164°C. Das Produkt wird mit Äthyläther aufgelöst und die Lösung wird eingeengt. Sodann wird der Rückstand aus Äther/Petroläther umkristallisiert. Man erhält ein reines Produkt mit einem Schmelzpunkt von 159 bis 161°C und [a]D25 = -29,6° (C = 1,0 Methanol).

Elemen tar-A nalyse C H N

berechnet (%) 64,30 7,26 8,65

gefunden (%) 64,13 7,20 8,77

Beispiel 59

2 ml N,N-Dimethylformamid werden in 516 mg (1,40 mmol) Z-Phe-Ala-OH und 480 ml (1,25 mmol) H-Leu-OBzh . (COOH). unter Rühren gegeben und dann wird das Ganze noch mit 20 ml Zitronensäurepufferlösung von pH 5,5 versetzt. Danach gibt man 200 mg Ficin und 0,2 ml 2-Mercaptoäthanol unter Rühren bei 38°C zu dem Gemisch und das Ganze wird dann noch während 24 h zur Reaktion gebracht. Der erhaltene farblose Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 5 %iger Zitronensäure, Wasser, 7%-igem Ammoniakwasser und wiederum mit Wasser gewaschen. Man erhält 540 mg (67%) rohe Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 156 bis 158°C. Das Produkt wird in Methanol aufgelöst und eine kleine Menge eines unlöslichen Materials wird entfernt. Die Lösung wird eingeengt und der Rückstand wird umkristallisiert durch Zugabe von Wasser zu dem Produkt. Man erhält Z-Phe-Ala-Leu-OBzh mit einem Schmelzpunkt von 151 bis 152°Cund [a]n25 = —47,4° (C = 0,5 Methanol).

Elemen tar-A nalyse C H N

berechnet (%) 72,09 6,67 6,47

gefunden (%) 71,84 6,66 6,63

Beispiel 60

Eine Mischung von 20 ml Mcllvaine-Pufferlösung von pH 6,2 und 3 ml Methanol wird zu 370 mg (1,26 mmol) Z-Phe-OH und 360 mg (1,07 mmol) H-Lys(Z)-OBul gegeben. Sodann gibt man noch 130 mg Papain und 0,05 ml 2-Mercaptoäthanol unter Rühren bei 38°C während 20 h zu der Mischung. Der erhaltene farblose Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 0,5 M Zitronensäure, 7 %igem Ammoniakwasser und wiederum mit Wasser gewaschen. Die erhaltenen rohen Kristalle werden in Äthylacetat aufgelöst und die Lösung wird mit Aktivkohle behandelt. Sodann gibt man n-Hexan zu dem Filtrat. Man erhält Z-Phe--Lys(Z)-OBut.

Ausbeute: 531 mg (80%).

Schmelzpunkt: 181 bis 121°C.

[a]D25 = —13,5° (C = 1,0 Methanol).

Elementar-Analyse C H N

berechnet (%) 68,05 7,02 6,80

gefunden (%) 68,19 6,98 6,85

Beispiel 61

Eine Mischung von 20 ml Mcllvaine-Pufferlösung von pH 6,2 und 3 ml Methanol wird zu 359 mg (1,20 mmol) Z-Phe-OH und 173 mg (1,00 mmol) H-Val-OBu1 gegeben. Sodann gibt man noch 130 mg Papain und 0,05 ml 2-Mer-captoäthanol bei 38°C zu dem Gemisch und das Ganze wird während 20 h zur Reaktion gebracht. Das erhaltene ölige Produkt wird in Äthylacetat aufgelöst und die Lösung wird der Reihe nach mit Wasser, 0,5n HCl, 7% igem Ammoniakwasser und wiederum mit Wasser gewaschen. Die Lösung wird getrocknet und mit Aktivkohle zur Entfernung des Proteins behandelt. Sodann wird die Lösung eingeengt und mit Petroläther versetzt, wobei Z-Phe-Val-OBu1 auskristallisiert. Ausbeute: 315 mg (69%).

Schmelzpunkt: 104 bis 106°C.

[a]D25 = — 19,0°C (C = 1,0 Methanol). Der Schmelzpunkt und [a]D25 stimmen überein mit den Daten gemäss Chem. Ber. 100, 160 (1967).

Die folgenden Referenzbeispiele beziehen sich auf die Umwandlung der mit dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltenen Peptide in die freien Verbindungen.

Referenzbeispiel 1 2,00 g (3,20 mmol) Z-Phe-Lys(Z)-OBu'- werden in 15 ml Äthylacetat aufgelöst und mit 20 ml 6,On HCl-Äthylacetat vermischt. Die Reaktion wird bei Zimmertemperatur während 2 h durchgeführt, worauf die Lösung eingeengt wird. Zu dem Rückstand gibt man trockenen Äther. Man erhält Z-Phe-Lys--(Z)-OH.

Ausbeute: 1,69 g (94%).

Schmelzpunkt: 94 bis 96°C.

[a]r)2n = —6,2° (C = 0,5 Methanol).

Elementar-Analyse C H N

berechnet (%) 66,29 6,28 7,48

gefunden (%) 65,93 6,02 7,71

Referenzbeispiel 2 909 mg (2,00 mmol) Z-Phe-Val-OBu' werden in einer Mischung von 8 ml Methanol und 0,12 ml Essigsäure aufgelöst und mit 100 mg 10% Pd-C vermischt. Die Reaktion wird während 2 h unter einer Wasserstoffatmosphäre durchgeführt und dann wird der Katalysator abfiltriert. Das Methanol wird durch Destillation entfernt und der Rückstand wird in Äthylacetat aufgelöst. Die Lösung wird sodann mit einer wässrigen Lösung von Natriumbicarbonat in Wasser und dann mit Wasser gewaschen. Die Äthylacetatlösung wird getrocknet

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und eingeengt und danach mit Petroläther versetzt, wobei H-Phe-Val-OBu' auskristallisiert.

Ausbeutle: 612 mg (96%).

Schmelzpunkt: 65 bis 67°C.

[a]D20 = -30° (C = 1,0 Methanol).

Der Schmelzpunkt und [a]D25 stimmen überein mit den Daten gemäss Chem. Ber. 100, 160 (1967).

Beispiel 62

20 ml Kolthoff-Pufferlösung von pH 8,5 werden zu 409 mg (1,10 mmol) BOC-Tyr(Bzl)-OH und 303 mg (1,00 mmol) H-Val-NHDMB . HCl gegeben und dann gibt man noch 1,0 ml In NaOH zu dem Gemisch. Danach gibt man 100 mg Serinproteinase (Titer 100 X 104 PUN/g; vertrieben durch Nagase Sangyo K.K.) unter Rühren bei 38°C zu dem Gemisch, wobei das Ganze während 24 h zur Reaktion gebracht wird. Der Gelniederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 0,5n HCl, 7 %igem Ammoniakwasser und wiederum mit Wasser gewaschen. Man erhält 361 mg eines kristallinen Rohprodukts. Dieses wird in Methanol aufgelöst und die heisse Lösung wird mit Aktivkohle behandelt, um das Protein zu entfernen. Die Lösung wird eingeengt und durch Zugabe von Wasser umkristallisiert. Man erhält reines BOC-Tyr(Bzl)-Val-NHDMB.

Ausbeute: 297 mg (48%).

Schmelzpunkt: 165 bis 168°C.

[aJD25 = -0,8° (C = 0,25 Chloroform).

Elementar-Analyse C H N

berechnet (%) 67,83 7,32 6,78

gefunden (%) 67,71 7,35 6,60

Beispiel 63

20 ml Zitronensäurepufferlösung von pH 7,5 werden zu 518 mg (1,10 mmol) BOC-Val-Tyr(Bzl)-OH und 517 mg (1,0 mmol) H-VaI-His(BzI)-OBzl. 2HC1 gegeben, worauf man noch 2,0 ml In NaOH zu der Lösung gibt. Sodann wird das Ganze mit 100 mg Serinproteinase des Beispiels 62 unter Rühren bei 38°C versetzt und das Ganze wird noch während 24 h zur Reaktion gebracht. Der erhaltene farblose Niederschlag wird abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Man erhält 620 mg rohe Kristalle. Das Produkt wird in 300 ml heissem Methanol aufgelöst und die heisse Lösung wird mit Aktivkohle während 1 h behandelt, um das Protein zu entfernen. Sodann wird die Lösung eingeengt und der Rückstand wird mit Wasser versetzt, wobei man kristallines BOC-Val-Tyr-(Bzl)-Val-His(Bzl)-OH. H20 erhält.

Ausbeute: 450 mg (56%).

Schmelzpunkt: 176 bis 180°C.

[a]D25 = -6,6° (C = 0,5 Methanol).

Elementar-Analyse C H N

berechnet (%) 64,84 7,17 10,31

gefunden (%) 64,84 7,16 10,90

Beispiel 64

7,5 ml Mcllvaine-Pufferlösung von pH 8,97 werden zu 282 mg (0,60 mmol) BOC-Val-Tyr(Bzl)-OH und 345 mg (0,50 mmol) H-Val-His(Bzl)-Pro-Phe-OEt. 2HC1, worauf man 1,2 ml In NaOH zu der Lösung gibt. Sodann gibt man 40 mg Serinproteinase unter Rühren bei 38°C zu dem Gemisch und das Ganze wird während 24 h unter Rühren zur Reaktion gebracht. Der erhaltene Gelniederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 0,5n HCl und wiederum mit Wasser gewaschen. Man erhält 400 mg rohe Kristalle. Das Produkt wird in heissem Äthanol aufgelöst und die Lösung wird mit Aktivkohle behandelt, um das Protein zu entfernen. Sodann wird die Lösung eingeengt und der Rückstand wird aus

Äthylacetat umkristallisiert, wobei man BOC-Val-Tyr(Bzl)--Val-His(Bzl)-Pro-Phe-OH . 2H,,0 erhält.

Ausbeute: 334 mg (62%).

Schmelzpunkt: 163 bis 168°C.

[aJD2" = —26,9° (C = 1,0 N,N-Dimethylformamid).

Elementar-Analyse C H N

berechnet (%) 64,66 7,11 10,40

gefunden (%) 64,87 6,80 10,52

Beispiele 65 bis 70 Das Verfahren des Beispieles 64 wird wiederholt, wobei man als Säurekomponente die Na-Acylaminosäure oder das Na-Acyldipeptid und als Aminkomponente den Dipeptid-t-Butylester gemäss Tabelle 6 einsetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 ebenfalls zusammengestellt.

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Bsispiel 71

In einen Kolben gibt man 280,2 mg (1 mmol) Z-Gln-OH und 368,5 mg (1 mmol) H-Phe-Phe-OBu1 zur Suspension in 10 ml Wasser. Sodann wird eine Glaselektrode eines pH-Me-j ters in die Suspension getaucht. 150 mg Papain und 0,1 ml 2-Mercaptoäthanol werden unter Rühren zu der Suspension gegeben, wobei der pH des Gemisches durch Zugabe von l/10n NaOH auf etwa 5,0 eingestellt wird, um die Feststoffkomponenten aufzulösen. Die Mischung wird bei 38°C wäh-io rend 20 h gerührt und dabei zur Reaktion gebracht. Während der Reaktion wird der pH-Wert des Reaktionsgemisches durch Zugabe von l/10n NaOH auf 5 bis 6 gehalten, wozu der pH-Wert der Reaktionsmischung mit dem pH-Meter laufend gemessen wird. Der erhaltene Niederschlag wird ab-15 filtriert und der Reihe nach mit Wasser, In HCl, Wasser, 7% igem Ammoniakwasser und wiederum mit Wasser gewaschen und dann getrocknet. Das Produkt wird aus Äthylacetat umkristallisiert. Man erhält 510 mg des Produktes Z-Gln-Phe-Phe-OBu' mit einem Schmelzpunkt von 197 bis 20 200°C.

Ausbeute: 80,8%.

[a]„25 = —18,3° (C = 1,0 N,N-Dimethylformamid).

Elementar-Analyse C H N

25 berechnet (%) 66,65 6,71 8,80

gefunden (%) 66,51 6,71 8,74

Beispiel 72

30 In einen Kolben gibt man 398,5 mg Z-Phe-Val-OH und 320,4 mg H-Phe-Val-OBu' zur Suspension in 10 ml Wasser. Eine Glaselektrode eines pH-Meters wird in die Suspension getaucht. 150 mg Papain und 0,1 ml 2-Mercaptoäthanol werden unter Rühren zu der Suspension gegeben, wobei der pH 35 des Gemisches auf etwa 4,5 bis 5,0 durch Zugabe von verdünnter Salzsäurelösung eingestellt wird und wobei die Feststoffkomponenten aufgelöst werden. Die erhaltene Mischung wird bei 38°C während 20 h gerührt. Während der Reaktion wird der pH der Reaktionsmischung durch Zugabe von ver-40 dünnter HCl-Lösung zum Reaktionsgemisch auf 4,5 bis 5,0 gehalten. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, In HCl, Wasser, 7% igem Ammoniakwasser und wiederum mit Wasser gewaschen, und dann getrocknet. Das Produkt wird aus Äthylacetat/Petroläther 45 umkristallisiert. Man erhält 30 mg (4,3% Ausbeute) Z-Phe--Val-Phe-Val-OBu1 mit einem Schmelzpunkt von 130 bis 145°C.

5of Beispiel 73

In einen Kolben gibt man 398,5 mg (1 mmol) Z-Phe-Val--OH und 320,4 mg (1 mmol) H-Phe-Val-OBu1, zur Suspension in 10 ml Wasser. Die Glaselektrode eines pH-Meters wird in die Suspension getaucht. Sodann gibt man 150 mg 55 Serinproteinase unter Rühren zu der Suspension, während der pH-Wert des Gemisches auf 7,5 bis 8,0 gehalten, indem man l/10n NaOH-Lösung tropfenweise zu der Lösung gibt. Dabei werden die Feststoffkomponenten aufgelöst. Das Gemisch wird bei 38°C während 20 h gerührt. Während der Reaktion 60 wird der pH-Wert des Gemisches durch Zugabe von l/10n NaOH auf 7,5 bis 8 gehalten. Hierzu wird der pH-Wert des Gemisches laufend mit dem pH-Meter verfolgt. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, In HCl, Wasser, 7% igem Ammoniakwasser und wiederum 65 mit Wasser gewaschen und dann getrocknet. Das Produkt wird aus Äthylacetat/Petroläther umkristallisiert. Man erhält 190 mg (Ausbeute 27,1%) des Produktes Z-Phe-Val-Phe-Val--OBu1 mit einem Schmelzpunkt von 130 bis 145°C.

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Beispiel 74

In einen Kolben gibt man 471,5 mg (1 mmol) Z-Phe-Tyr--OH und 320,4 mg H-Phe-Val-OBu4 zur Suspension in 10 ml Wasser. Eine Glaselektrode eines pH-Meters wird in die Suspension getaucht. 150 mg Serinproteinase werden unter Rühren zu der Suspension gegeben, während der pH des Gemisches auf 7,5 bis 8,0 eingestellt wird, indem man 1/lQn NaOH zu der Mischung gibt. Die Feststoffkomponenten werden aufgelöst. Das Gemisch wird bei 38°C während 20 h gerührt. Während der Reaktion wird der pH des Reaktionsgemisches durch Zugabe von 1/ lOn NaOH zu dem Gemisch auf 7,5 bis 8,0 gehalten. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, In HCl, Wasser, 7%-s igem Ammoniakwasser und wiederum mit Wasser gewaschen und dann getrocknet. Sodann wird das Produkt aus Äthylacetat/Petroläther umkristallisiert. Man erhält 230 mg (Ausbeute 30%) des Produktes Z-Phe-Tyr-Phe-Val-OBu1 mit einem Schmelzpunkt von 155°C.

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Claims

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1. Verfahren zur Herstellung eines Peptids der Formel

X-A-B-Y

wobei A und B gleich oder verschieden sind und einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest bedeuten, wobei X eine Aminoschutzgruppe bedeutet und wobei Y eine der folgenden Carboxylschutzgruppen bedeutet: tert.-Alkoxy-, Benzyloxy-, Benzylamino- und Benzhydrylamino-Gruppe, welche gegebenenfalls mit einem inerten Substituenten substituiert sein kann,

dadurch gekennzeichnet, dass man die Säurekomponente in Form einer Aminosäure oder eines Peptids mit N-terminaler Schutzgruppe oder ein Salz derselben der Formel

X-A-OH

mit einer Aminkomponente in Form einer Aminosäure oder eines Peptids mit C-terminaler Schutzgruppe oder einem Salz derselben der Formel

H-B-Y

umsetzt, und zwar in Gegenwart einer Thiolproteinase oder einer Serinproteinase in einer wässrigen Lösung, deren pH-Wert zur Aufrechterhaltung der Enzymaktivität der Thiolproteinase oder der Serinproteinase ausreicht.

2. Verfahrennach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Thiolproteinase Papain, Stembromelein, Ficin, Cathepsin B, Chymopapain, oder Streptococcal-proteinase einsetzt und dass man als Serinproteinase Substilisin, Aspergillus alkalische Proteinase, Elastase, a-Lytinproteinase oder Chymotrypsin einsetzt.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man den pH auf dem gewünschten Wert hält, indem man die Aminosäure- oder Peptitreaktanten in einer Pufferlösung von pH 4 bis 7,5 für die Thiolproteinase und 6 bis 9 für die Serinproteinase umsetzt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man den pH auf dem gewünschten Wert hält, indem man den pH des Reaktionsgemisches misst und eine Säure oder eine Base zu der wässrigen Lösung je nach dem gemessenen pH-Wert des Reaktionsgemisches gibt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die Reaktion bei einem Reaktan-ten-Verhältnis von 0,8 bis 2 Molen der Säurekomponente pro 1 Mol der Aminkomponente durchführt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man die Reaktion unter Zugabe von 10 bis 500 mg der Thiolproteinase oder der Serinproteinase zu der Lösung pro mmol der Aminkomponente durchführt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die N-terminale Schutzgruppe der Säurekomponente eine tert-Alkoxycarbonylgruppe oder eine Benzyloxycarbonylgruppe ist, welche mit einem inerten Substituenten substituiert sein kann oder p-Toluolsulfonyl oder o-Nitrophenylsulfenyl und dass die C-terminale Schutzgruppe der Aminkomponente eine tert-Alkoxy-, Benzyloxy-, p-Ni-trobenzyloxy-, Benzhydryloxy-, Benzylamino-, 2,4-Dimethoxy-benzylamino-, oder Benzhydrylamino-Gruppe ist, welche mit einem inerten Substituenten substituiert sein kann.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die tert-Alkoxycarbonylgruppe eine t-Butyloxycarbonyl-gruppe oder eine t-Amyloxycarbonylgruppe ist und dass die substituierte Benzyloxycarbonylgruppe die p-Methoxybenzyl-oxycarbonylgruppe, die 3,5-Dimethoxybenzyloxycarbonyl-gruppe, p-Phenylazobenzyloxycarbonylgruppe, oder die 2,4,6--Trimethylbenzyloxycarbonylgruppe ist und dass die tert-

Alkoxygruppe die t-Butoxy-Gruppe ist und dass der inerte Substituent der Benzhydrylamino-Gruppe 2,4-Dimethoxy-oxybenzylamino oder Benzhydrylamino ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass A und B gleich oder verschieden sind und einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest bedeuten, bei dem die Aminosäure eine aliphatische Aminosäure, eine Oxyaminosäure, eine schwefelhaltige Aminosäure, eine Mono-aminodicarbonsäure, eine Diaminomonocarbonsäure oder eine aromatische Aminosäure oder eine heterocyclische Aminosäure ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man als aliphatische Aminosäure eine Monoamino-monocarbonsäure und insbesondere Glycin, Alanin, Valin, Norvalin, Leucin, Isoleucin, und Norleucin einsetzt und dass man als Oxyaminosäure Serin, Threonin oder Homoserin einsetzt und dass man als schwefelhaltige Aminosäure Me-thionin, Cystin oder Cystein einsetzt und als Monoamino-dicarbonsäure Asparaginsäure oder Glutaminsäure und als Diaminomonocarbonsäure Ornithin, Lysin oder Arginin, als aromatische Aminosäure Phenylalanin oder Tyrosin und als heterocyclische Aminosäure Histidin oder Tryptophan.