CH637914A5 - Dipeptid-aminosaeureester-additionsverbindungen und verfahren zu ihrer herstellung bzw. zersetzung. - Google Patents
Dipeptid-aminosaeureester-additionsverbindungen und verfahren zu ihrer herstellung bzw. zersetzung. Download PDFInfo
- Publication number
- CH637914A5 CH637914A5 CH35378A CH35378A CH637914A5 CH 637914 A5 CH637914 A5 CH 637914A5 CH 35378 A CH35378 A CH 35378A CH 35378 A CH35378 A CH 35378A CH 637914 A5 CH637914 A5 CH 637914A5
- Authority
- CH
- Switzerland
- Prior art keywords
- acid
- group
- addition compound
- methyl ester
- ester
- Prior art date
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims description 152
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 44
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 title claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 2
- -1 aminocarboxylic acid ester Chemical class 0.000 claims description 65
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 52
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 50
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 47
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 44
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 40
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 claims description 34
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 30
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 22
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 20
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 19
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 17
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 17
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 claims description 17
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims description 16
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 14
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 13
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 13
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 claims description 13
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims description 13
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 12
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 10
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 10
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 10
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 claims description 10
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 10
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 9
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 claims description 7
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 7
- UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N serine phosphoethanolamine Chemical compound [NH3+]CCOP([O-])(=O)OCC([NH3+])C([O-])=O UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 6
- 125000001301 ethoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])O* 0.000 claims description 6
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 claims description 5
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 claims description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 5
- 229940055729 papain Drugs 0.000 claims description 5
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 claims description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 5
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 4
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000011260 aqueous acid Substances 0.000 claims description 4
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 claims description 4
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 claims description 4
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 claims description 4
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000007848 Bronsted acid Substances 0.000 claims description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 claims description 3
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 claims description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 125000000051 benzyloxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])O* 0.000 claims description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 claims description 3
- 125000001972 isopentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 3
- 125000005740 oxycarbonyl group Chemical group [*:1]OC([*:2])=O 0.000 claims description 3
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 claims description 3
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- 125000000475 sulfinyl group Chemical group [*:2]S([*:1])=O 0.000 claims description 3
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 claims description 3
- LBLYYCQCTBFVLH-UHFFFAOYSA-N 2-Methylbenzenesulfonic acid Chemical compound CC1=CC=CC=C1S(O)(=O)=O LBLYYCQCTBFVLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 claims description 2
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 claims description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 claims description 2
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000003495 polar organic solvent Substances 0.000 claims description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims 4
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 claims 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 150000003931 anilides Chemical class 0.000 claims 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims 2
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 claims 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 claims 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims 1
- 241000764238 Isis Species 0.000 claims 1
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 claims 1
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 claims 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 229940051881 anilide analgesics and antipyretics Drugs 0.000 claims 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 claims 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 claims 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 claims 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 claims 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims 1
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 claims 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 77
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 66
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 66
- VSDUZFOSJDMAFZ-VIFPVBQESA-N methyl L-phenylalaninate Chemical compound COC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 VSDUZFOSJDMAFZ-VIFPVBQESA-N 0.000 description 56
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 38
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 29
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 25
- XYXYXSKSTZAEJW-VIFPVBQESA-N (2s)-2-(phenylmethoxycarbonylamino)butanedioic acid Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OCC1=CC=CC=C1 XYXYXSKSTZAEJW-VIFPVBQESA-N 0.000 description 24
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 21
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 108090001109 Thermolysin Proteins 0.000 description 15
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 15
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 15
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 15
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 13
- SWVMLNPDTIFDDY-FVGYRXGTSA-N methyl (2s)-2-amino-3-phenylpropanoate;hydrochloride Chemical compound Cl.COC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 SWVMLNPDTIFDDY-FVGYRXGTSA-N 0.000 description 13
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 13
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 11
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 9
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 8
- VSDUZFOSJDMAFZ-SECBINFHSA-N methyl (2r)-2-amino-3-phenylpropanoate Chemical compound COC(=O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 VSDUZFOSJDMAFZ-SECBINFHSA-N 0.000 description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 8
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 description 7
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 7
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WORJRXHJTUTINR-UHFFFAOYSA-N 1,4-dioxane;hydron;chloride Chemical compound Cl.C1COCCO1 WORJRXHJTUTINR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 6
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 6
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 6
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- JHIVVAPYMSGYDF-UHFFFAOYSA-N cyclohexanone Chemical compound O=C1CCCCC1 JHIVVAPYMSGYDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 6
- MSHFRERJPWKJFX-UHFFFAOYSA-N 4-Methoxybenzyl alcohol Chemical compound COC1=CC=C(CO)C=C1 MSHFRERJPWKJFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 5
- OMSMPWHEGLNQOD-UWVGGRQHSA-N Asn-Phe Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OMSMPWHEGLNQOD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 4
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N Carbamic acid Chemical class NC(O)=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000009102 absorption Effects 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 4
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 4
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 4
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 4
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 description 4
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 3
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- CJGXMNONHNZEQQ-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-amino-3-phenylpropanoate Chemical compound CCOC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 CJGXMNONHNZEQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- SWVMLNPDTIFDDY-UHFFFAOYSA-N hydron;methyl 2-amino-3-phenylpropanoate;chloride Chemical compound Cl.COC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 SWVMLNPDTIFDDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 3
- 125000001570 methylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 description 3
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012223 aqueous fraction Substances 0.000 description 2
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 2
- 238000009903 catalytic hydrogenation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- FPFQPLFYTKMCHN-PPHPATTJSA-N ethyl (2s)-2-amino-3-phenylpropanoate;hydron;chloride Chemical compound Cl.CCOC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 FPFQPLFYTKMCHN-PPHPATTJSA-N 0.000 description 2
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 2
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- GSYSFVSGPABNNL-UHFFFAOYSA-N methyl 2-dimethoxyphosphoryl-2-(phenylmethoxycarbonylamino)acetate Chemical group COC(=O)C(P(=O)(OC)OC)NC(=O)OCC1=CC=CC=C1 GSYSFVSGPABNNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BBACSHIJBOGXKL-UHFFFAOYSA-N methyl 3-phenyl-2-(phenylmethoxycarbonylamino)propanoate Chemical compound C=1C=CC=CC=1COC(=O)NC(C(=O)OC)CC1=CC=CC=C1 BBACSHIJBOGXKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GRVDJDISBSALJP-UHFFFAOYSA-N methyloxidanyl Chemical compound [O]C GRVDJDISBSALJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KJIFKLIQANRMOU-UHFFFAOYSA-N oxidanium;4-methylbenzenesulfonate Chemical compound O.CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 KJIFKLIQANRMOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 2
- 238000007127 saponification reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- PVFCXMDXBIEMQG-JTQLQIEISA-N (2s)-2-(phenylmethoxycarbonylamino)pentanedioic acid Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OCC1=CC=CC=C1 PVFCXMDXBIEMQG-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- ULPMRIXXHGUZFA-UHFFFAOYSA-N (R)-4-Methyl-3-hexanone Natural products CCC(C)C(=O)CC ULPMRIXXHGUZFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SCYULBFZEHDVBN-UHFFFAOYSA-N 1,1-Dichloroethane Chemical compound CC(Cl)Cl SCYULBFZEHDVBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dichloroethane Chemical compound ClCCCl WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XYXYXSKSTZAEJW-UHFFFAOYSA-N 2-(phenylmethoxycarbonylamino)butanedioic acid Chemical compound OC(=O)CC(C(O)=O)NC(=O)OCC1=CC=CC=C1 XYXYXSKSTZAEJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JDDWQACHQPUIRR-OALUTQOASA-N COC([C@@H](NC([C@@H](NC(=O)OCC1=CC=C(C=C1)OC)CC(N)=O)=O)CC1=CC=CC=C1)=O Chemical compound COC([C@@H](NC([C@@H](NC(=O)OCC1=CC=C(C=C1)OC)CC(N)=O)=O)CC1=CC=CC=C1)=O JDDWQACHQPUIRR-OALUTQOASA-N 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N Ethyl urethane Chemical compound CCOC(N)=O JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- XMBSYZWANAQXEV-QWRGUYRKSA-N Glu-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102220506674 MKRN2 opposite strand protein_H26N_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 1
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 1
- YGYAWVDWMABLBF-UHFFFAOYSA-N Phosgene Chemical compound ClC(Cl)=O YGYAWVDWMABLBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 101710097834 Thiol protease Proteins 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 238000007259 addition reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003158 alcohol group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 229910001854 alkali hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000008044 alkali metal hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001509 aspartic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- OZPYEGOBGWQOSZ-VIFPVBQESA-N benzyl n-[(3s)-2,5-dioxooxolan-3-yl]carbamate Chemical compound C=1C=CC=CC=1COC(=O)N[C@H]1CC(=O)OC1=O OZPYEGOBGWQOSZ-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000005976 benzyloxycarbonylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004106 butoxy group Chemical group [*]OC([H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 150000008280 chlorinated hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000010931 ester hydrolysis Methods 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003810 ethyl acetate extraction Methods 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- HNTKETWAFIINPH-ASCMOBCVSA-N methyl (2S)-3-[1-[(2S)-2,4-diamino-4-oxobutanoyl]cyclohexa-2,4-dien-1-yl]-2-(phenylmethoxycarbonylamino)propanoate Chemical compound COC([C@@H](NC(=O)OCC1=CC=CC=C1)CC1(CC=CC=C1)C([C@@H](N)CC(N)=O)=O)=O HNTKETWAFIINPH-ASCMOBCVSA-N 0.000 description 1
- SWVMLNPDTIFDDY-SBSPUUFOSA-N methyl (2r)-2-amino-3-phenylpropanoate;hydrochloride Chemical compound Cl.COC(=O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 SWVMLNPDTIFDDY-SBSPUUFOSA-N 0.000 description 1
- VSDUZFOSJDMAFZ-UHFFFAOYSA-N methyl 2-amino-3-phenylpropanoate Chemical compound COC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 VSDUZFOSJDMAFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910000069 nitrogen hydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 229910000028 potassium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011736 potassium bicarbonate Substances 0.000 description 1
- 235000015497 potassium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011181 potassium carbonates Nutrition 0.000 description 1
- TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogencarbonate Chemical compound [K+].OC([O-])=O TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940086066 potassium hydrogencarbonate Drugs 0.000 description 1
- 125000002572 propoxy group Chemical group [*]OC([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000542 sulfonic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019605 sweet taste sensations Nutrition 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005809 transesterification reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003258 trimethylene group Chemical group [H]C([H])([*:2])C([H])([H])C([H])([H])[*:1] 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
- C07K5/06113—Asp- or Asn-amino acid
- C07K5/06121—Asp- or Asn-amino acid the second amino acid being aromatic or cycloaliphatic
- C07K5/0613—Aspartame
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Gegenstand der Erfindung sind Dipeptid-Aminosäure-ester-Additionsverbindungen der Formel I
Çi
O O NH O O
R3 -C -C H-NH2 ° HOC -<CH2 )n-C H-C -NH-C H-C-R3 (I
R2 R2
in der Rx eine aliphatische Oxycarbonylgruppe, Benzyloxy-carbonylgruppe, gegebenenfalls mit Kernsubstituenten, oder Benzoyl-, aromatische Sulfonyl- oder aromatische Sulfinyl-gruppe ist,
R2 eine Methyl-, Isopropyl-, Isobutyl-, Isoamyl- oder Benzylgruppe darstellt,
R3 eine Niederalkoxy-, Benzyloxy- oder Benzhydryloxy-gruppe bedeutet, und n den Wert 1 oder 2 hat.
Die Additionsverbindungen der Formel I enthalten Bausteine der Formel II
O NH O O
II I II II
HOC-(CH2)n-CH-C-NH-CH-C~R3 (Ii)
die in LL-Form vorliegen können, und der Formel III O
II
Rs—C—CH—NH2. (III)
r2
die in L-, D- oder hauptsächlich D-Form vorliegen können, wobei Rj, R2 und R3 in den Formeln (II) und (III) die gleiche Bedeutung wie in Formel (I) haben.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der Additionsverbindungen der Formel (I), das gekennzeichnet ist durch die in Patentanspruch 11 genannten Merkmale. Die dabei verwendete N-substituierte Monoaminodicarbonsäure der Formel (IV) und der Aminocarbonsäureester der Formel (V) können in L-Form oder DL-Form vorliegen.
Die Erfindung ermöglicht unter anderem die optische Spaltung von N-substituierten Monoaminodicarbonsäuren der Formel (IV) und von Aminocarbonsäureestern der Formel (V).
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Zersetzung der Additionsverbindungen mit den in Patentanspruch 22 angegebenen Merkmalen.
Die Additionsverbindungen, in denen Rx eine p-Methoxy-benzyloxycarbonylgruppe bedeutet, können mit Vorteil nach einem Verfahren mit den in Patentanspruch 25 genannten Merkmalen zersetzt werden.
Die Erfindung bietet unter anderem die Herstellung von a-L-Asparaginyl-L-phenylalaninalkylestern, die einen süssen Geschmack, wie Zucker, besitzen. a-L-Asparaginyl-L-phenyl-alaninmethylester besitzt eine Süsskraft, die das 200fache derjenigen von Zucker beträgt.
In der Formel I liegt das Asparaginsäuregerüst vor im Fall von n = 1, und das Glutaminsäuregerüst liegt vor im Fall von n = 2.
In der Formel I ist Rt z.B. eine aliphatische Oxycarbonylgruppe, z.B. eine tert.-Butyloxycarbonylgruppe [(CH3)3C-0-C0-] oder tert.-Amyloxycarbonylgruppe [(CH3)2C(C2H5)-0-C0- oder Benzyloxycarbonylgruppe (0-CH2-O-CO-), oder eine gegebenenfalls kernsubstituierte Benzyloxycarbonylgruppe, wie eine p-Methoxybenzyloxy-carbonylgruppe (p-CH3O-0-CH2-O-CO), 3,5-Dimethoxy-benzyloxycarbonylgruppe [3,5-(CH3O)2-0-CH2-O-CO-], 2,4,6-Trimethoxybenzyloxycarbonylgruppe [2,4,6-(CH3O)3-0--CH2-0-C0-], Benzoylgruppe (0-CO-) oder p-Toluolsulfonyl-gruppe (p-CH3-0-SO2-) oder eine aromatische Sulfinylgruppe, z.B. eine o-Nitrosulfinylgruppe.
In der Formel I hat man das Alaningerüst für R2 = Methyl, das Valingerüst für R2 = Isopropyl, das Leucingerüst für R^ = Isobutyl, das Isoleucingerüst für R2 = Isoamyl, und das Phenylalaningerüst für R2 = Benzyl.
In der Formel bedeutet R3 Alkoholreste, wie Nieder-alkoxyreste, z.B. Methoxygruppen (CHsO-), Äthoxygruppen (C2HsO-), Propoxygruppen (C3H20-) Butoxygruppen (C4H90-) und Benzyloxygruppen sowie Benzhydryloxygruppen. Typische Beispiele für Rj, R2 und R3 sind:
Rx = Benzyloxycarbonyl und p-Methoxybenzyloxycarbonyl; R2 = Benizyl;
R3 = Methoxy- oder Äthoxy.
Eine typische erfindungsgemässe Additionsverbindung, erhalten durch Umsetzung von N-Benzyloxycarbonyl-L--asparaginsäure und L-Phenylalaninmethylester, zeigt die nachfolgend wiedergegebenen IR- und NMR-Spektren.
IR-Spektrum
3260 cm"1 (N-H-Streckschwingung); 3000 bis 3200 cm"1 (C-H-Streckschwingung); 1740 cm"1 (C=0-Ester); 1720 cm"1 (C=0 Urethan); 1660 cm"1 (erste Amidabsorption); 1630 cm"1 (Carboxylat); 1540 cm"1 (zweite Amidabsorption); 1430 und 1.450 cm"1 (C-H-Deformations-schwingung); 1390 cm"1 (Carboxylat); 1220 bis 1290 cm"1 (C-O-C-Streckschwingung und dritte Amidabsorption); 1050 cm"1 (Phenylschwingung in der Ebene); sowie 740 und 695 cm-1 (Schwingung des monosubstituier-ten Benzolrings ausserhalb der Ebene).
s io
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
5
637914
NMR-Spektrum
(1)
■5
= 2,75 ppm (2H)
(2)
8
= 3,02 ppm (4H)
(3)
S
= 3,61 ppm (3H) 3,7 ppm (3H)
(4)
8
= 4,4 to 4,8 ppm (3H)
(5)
5
= 5,05 ppm (2H)
(6)
5
= 5,82 ppm (5H)
(7)
6
= 7,3 ppm 15H).
Die Ergebnisse der Elementaranalyse der Additionsverbindung sind im wesentlichen die gleichen wie die berechneten Werte für die Formel I, in der R1; R;, und R3 eine Benzyloxycarbonyl-, Benzyl- bzw. Methoxygruppe bedeuten, und n den Wert 1 hat.
Wenn die Additionsverbindung der Behandlung mit einer starken Säure, wie Chlorwasserstoffsäure, unterworfen und das Produkt mit einem organischen Lösungsmittel, wie Äthyl-acetat, extrahiert wird, erhält man aus der organischen Schicht eine saure Verbindung. Wenn man die vorgenannte typische Additionsverbindung in dieser Weise behandelt,
zeigt die erhaltene saure Verbindung charakteristische Eigenschaften, die für die Verbindung der Formel VI in LL-Form, in der R^ R2, R3 und n die gleiche Bedeutung wie in der vorgenannten typischen Additionsverbindung haben, erwartet werden können.
Wenn die aus der vorgenannten typischen Additionsverbindung erhaltene saure Verbindung der katalytischen Hydrierung mit Wasserstoff unterworfen wird, erhält man den bekannten LL-Asparaginyl-phenylalanin-methylester.
Alle Daten, einschliesslich der IR- und NMR-Spektren, sowie die für die Verbindungen erhaltenen Elementaranalysen in irgendeiner der vorgenannten Stufen, erhärten die in den Formeln gezeigten Strukturen.
Entsprechende Ergebnisse werden auch in dem Fall erhalten, wo die Verbindungen mit anderen Bedeutungen für Ri, R2, R3 und n im Rahmen von Formel I verwendet werden.
Unterwirft man die Additionsverbindungen der Erfindung in wässrigem Medium der Behandlung mit einer starken Säure, wie Chlorwasserstoffsäure, und extrahiert das Produkt mit einem organischen Lösungsmittel, so kann man die Verbindungen der Formel VI erhalten. Andererseits lassen sich aus der wässrigen Phase L-, D- oder hauptsächlich D-Aminocarbonsäureester der Formel III isolieren, wobei die optische Isomerie der isolierten Ester von derjenigen der in der Formel III der Additionsverbindungen gezeigten Grundbausteine abhängt.
In diesem Fall ist die Menge der Verbindung der Formel VI im allgemeinen dem erhaltenen Aminocarbonsäureester der Formel III äquivalent, wobei es klar ist, dass es sich bei der ursprünglichen Verbindung um die Additionsverbindung aus dem Dipeptidester und dem Aminocarbonsäureester (1:1) handelt, der die Formel I besitzt.
Die erfindungsgemässen Additionsverbindungen können Kristallwasser enthalten. Die Additionsverbindungen der Erfindung bieten wertvolle Zwischenprodukte für Peptidsynthesen.
Wie vorstehend dargelegt, lässt sich bei Behandlung der erfindungsgemässen Additionsverbindung mit einer starken Säure, wie Chlorwasserstoffsäure, und anschliesseide Extraktion des Produkts mit einem organischen Lösungsmittel das Dipeptid mit einer Schutzgruppe für die Aminogruppe erhalten.
Wird die Schutzgruppe für die Aminogruppe, d.h. Rls nach einer bekannten Methode abgespalten, z.B. durch ka-talytische Hydrierung, so lässt sich der Dipeptidester mit einer Aminogruppe und einer Carboxylgruppe erhalten.
Bei den erhaltenen Depiptidestern handelt es sich um sehr wertvolle Verbindungen.
So lassen sich z.B. a-L-Asparaginyl-phenylalanin-nieder-alkylester, insbesondere der Methylester, wobei n den Wert 1 besitzt, Ra eine Benzylgruppe ist und R3 eine Niederalkoxy-gruppe, vorzugsweise eine Methoxygruppe, ist, als Süssstoffe verwenden.
Peptide mit einer N-ständigen Schutzgruppe und einer freien C-ständigen Carboxylgruppe, die aus dem Dipeptidester mit einer Schutzgruppe für die Aminogruppe durch übliche Hydrolyse erhalten werden können, bieten ebenfalls wertvolle Eigenschaften. So kann z.B. N-Benzyloxycarbo-nyl-a-L-glutamyl-phenylalanin als Substrat zur Messung der enzymatischen Aktivität von Carboxypeptidasen verwendet werden.
Die Additionsverbindungen der Formel I können durch Umsetzung einer N-substituierten Monoaminodicarbonsäure mit einem Aminocarbonsäureester in Gegenwart einer Protease und Verknüpfung des erhaltenen Dipeptidesters mit dem Aminocarbonsäureester sowie Isolierung der Additionsverbindung erhalten werden.
Demgemäss geht man zur Herstellung der Additionsverbindung der Formel I aus einem Dipeptidester und einem Aminocarbonsäureester vorzugsweise so vor, dass man eine N-substituierte Monoaminodicarbonsäure der Formel IV mit einem Aminosäureester der Formel V in wässrigem Medium in Gegenwart einer Protease in einem pH-Bereich, in dem die Protease enzymatisch aktiv ist, zur Umsetzung bringt, den erhaltenen Dipeptidester mit dem Aminocarbonsäureester verknüpft, sowie die Additionsverbindung abtrennt.
Bei den als Ausgangsverbindungen verwendeten N-substituierten Monoaminodicarbonsäuren handelt es sich um N-substituierte Asparaginsäure für n = 1 und um N-substi-tuierte Glutaminsäure für n = 2.
Bei Rx handelt es sich allgemein um eine Schutzgruppe für die Aminogruppe, die die Aminogruppe in der Reaktion schützen und dementsprechend stabil sein soll. Ferner soll sich die Abspaltung von Rj von der Aminogruppe ohne Beeinträchtigung des Gerüstes des Reaktionsprodukts erzielen lassen.
Da die Abtrennung des Reaktionsprodukts aus dem wässrigen Medium meist durch Abscheidung erfolgt, sollte es keine Gruppen besitzen, die diese Abscheidung verhindern, wie Sulfonsäuregruppen, die die Wasserlöslichkeit des Reaktionsprodukts sehr stark vergrössern.
Erfindungsgemäss verwendbare N-substituierte Monoaminodicarbonsäuren lassen sich leicht durch Einführung der Schutzgruppe von Rj in die Monoaminodicarbonsäure nach herkömmlichen Verfahren herstellen.
Bei den als weitere Ausgangsverbindungen verwendeten Aminocarbonsäureestern handelt es sich um Aminosäureester mit einer hydrophoben Gruppe in der Seitenkette, wobei es sich um Alaninester für R2 = Methyl, um Valinester für R2 = Isopropyl, um Leucinester für R2 = Isobutyl, um Isoleucinester für R2 = sek.-Butyl, um Phenylalaninester für R2 = Benzyl handelt. Von diesen Gruppen R2 stellt die Benzylgruppe, die als Aminosäureester Phenylalaninester liefert, den typischsten Fall dar.
Bei den erfindungsgemäss verwendeten Proteasen handelt es sich vorzugsweise um Metalloproteasen, die ein Metallion im aktiven Zentrum besitzen. Geeignete Metalloproteasen sind aus Mikroorganismen herrührende Enzyme, wie neutrale Proteasen von Ray fungus, Prolisin, Thermolycin, Collagenase, Crotulus atrox-Protease usw. Es ist auch möglich rohe Enzyme, wie Thermoase, Tacynase-N, Pronase, usw. zu verwenden. Zur Dämpfung der in den rohen Enzymen enthaltenen Esterase wird es bevorzugt, einen Enzyminhibitor, z.B. einen Potato-Inhibitor, mit den rohen Enzymen zu
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
637914
6
verwenden. Es ist auch möglich, Thiolproteasen, wie Papain, oder Serinproteasen, wie Trypsin, zu verwenden, jedoch besitzen diese Esterase-Aktiviät. Man muss somit bei der Durchführung der Reaktion unter Verwendung dieser Enzyme auf die Verhinderung der Esterhydrolyse bzw. Verseifung achten.
Bei der erfindungsgemässen Synthese erfolgt die Bildung der Peptidbindung in wässrigem Medium, vorzugsweise wäss-riger Lösung, bei solchen pH-Werten, dass die Protease en-zymatisch aktiv ist.
Die Reaktion zur Bildung der Additionsverbindung aus Peptid und Aminocarbonsäureester ist somit pH-abhängig und erfolgt vorzugsweise bei pH-Werten von 4 bis 9, insbesondere 5 bis 8. Demgemäss können die Ausgangsverbindungen, nämlich die N-substituierten Monoaminodicarbon-säuren und die Aminocarbonsäureester, in freier Form oder in Salzform vorliegen. Wenn jedoch beide in dem wässrigen Medium gelöst werden, ist es erforderlich, den pH-Wert auf den genannten Bereich einzustellen.
Beispiele für geeignete pH-Regler sind anorganische oder organische Säuren und Basen, wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Essigsäure; Alkalihydroxide, wie Na-trium- und Kaliumhydroxid; Alkalicarbonate, wie Natrium-carbonat, Natriumhydrogencarbonat, Kaliumcarbonat und Kaliumhydrogencarbonat; sowie organische und anorganische Amine, wie Ammoniak, Trimethylamin, Triäthylamin und Äthanolamin.
Die Mengen an Wasserstoffionen und Hydroxylionen, die durch die Reaktion freigesetzt werden, sind äquivalent, wobei die Veränderung des pH-Wertes durch die Reaktion meist nicht gross ist. Zur Verhinderung einer pH-Änderung ist die Verwendung von Puffern möglich. Bei technischer Herstellung ist es vorteilhaft, den pH-Wert unter Verwendung eines pH-Reglers, der durch einen pH-Messer gesteuert wird, zu regeln.
Bei dem wässrigen Medium handelt es sich im allgemeinen um wässrige Lösungen. Man kann dem wässrigen Medium auch mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel in solchem Umfang zusetzen, wie das Lösungsmittel die Abscheidung des Reaktionsprodukts nicht verhindert.
Die erfindungsgemässe Reaktion wird vorzugsweise bei Temperaturen von 10 bis 90°C, vorzugsweise 20 bis 50°C, unter dem Gesichtspunkt der Erhaltung der Enzymaktivität durchgeführt. Die Reaktion ist im allgemeinen in etwa 30 Min bis 24 Std beendet, obwohl die Reaktionszeit an sich keiner Beschränkung unterliegt.
Die Konzentrationen beider Ausgangsverbindungen im wässrigen Medium unterliegen an sich keiner besonderen Beschränkung; um die Abscheidung des Reaktionsprodukts zu begünstigen wird aber vorzugsweise bei höheren Konzentrationen gearbeitet. Die Löslichkeiten der als Reaktionsprodukt anfallenden Additionsverbindungen in Wasser sind relativ gering. So beträgt z.B. die Löslichkeit der Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenyl-alaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester etwa 0,3 g/100 g Wasser bei 20°C. Demgemäss können geeignete Konzentrationen beispielsweise im Bereich von 0,001 bis 7molar, vorzugsweise 0,1 bis 4molar, liegen.
Das Verhältnis der Ausgangsverbindungen zueinander unterliegt an sich keiner besonderen Beschränkung. Erfindungsgemäss kommt es jedoch auf die Verbindung eines Moleküls der N-substituierten Monoaminodicarbonsäure mit 2 Molekülen des Aminocarbonsäureesters an, wobei das stö-chiometrische Molverhältnis der Ausgangsverbindungen 1 : 2 beträgt. In der Praxis angewendete Verhältnisse liegen im allgemeinen im Bereich von 100 : 1 bis 1 : 100, vorzugsweise 5 : 1 bis 1 : 5 und insbesondere 2 : 1 bis 1: 3.
Es ist nicht immer erforderlich, die gesamten Mengen der Ausgangsverbindungen im wässrigen Medium zu lösen; vielmehr kann man Teilmengen der Ausgangsverbindungen suspendieren, da die Konzentrationen der Ausgangsverbindungen mit zunehmender Reaktion abnehmen, wodurch die suspendierten Ausgangsverbindungen allmählich in Lösung gehen.
In diesem Fall kann eine Veränderung des pH-Wertes eintreten, wobei es erforderlich sein kann, den pH-Wert der Lösung mit fortschreitender Reaktion einzustellen.
Die Menge der erfindungsgemäss verwendeten Protease unterliegt an sich keiner besonderen Beschränkung. Bei hoher Konzentration des Enzyms kann die Reaktion in kurzer Zeit beendet sein. Bei geringer Konzentration des Enzyms ist die Reaktionszeit verlängert. Somit liegt die Konzentration im allgemeinen im Bereich von etwa 2 bis 400 mg (5 X 10~5 bis 1 X 10"2 mMol), pro 1 mMol der Ausgangsverbindungen, vorzugsweise etwa 5 bis 100 mg (1 X 10~4 bis 3 X 10~3 mMol), pro 1 mMol der Ausgangsverbindungen.
Erfindungsgemäss erfolgt die Ausbildung der Peptidbindung nur bei L-Isomeren, jedoch nicht bei D-Isomeren. Andererseits können die für die Durchführung der Additionsreaktion zur Bildung der Additionsverbindungen verwendeten Aminosäureester sowohl in L-Form, D-Form als auch als Gemisch vorliegen. Bei Verwendung von DL-Aminocarbon-säureestern wird das L-Isomere des DL-Aminocarbonsäure-esters in der Lösung durch die Peptidsynthesen verbraucht, wodurch der verbleibende Aminosäureester mit überwiegend D-Form die Bildung der Additionsverbindung aus Dipeptidester und Aminocarbonsäureester Verwendung findet.
Die erfindungsgemässe Umsetzung erfolgt im wesentlichen mit quantitativer Ausbeute, wenn die Konzentrationen der Ausgangsverbindungen hoch sind. Werden 2 Mol DL-Aminocarbonsäureester pro 1 Mol N-substituierte Monoaminodicarbonsäure in L-Form verwendet, so kann man die im wesentlichen aus LL-Dipeptidester und D-Aminocarbon-säureester aufgebaute Additionsverbindung erhalten. Die erhaltene Additionsverbindung lässt sich einfach in zwei Grundbausteine spalten, nämlich den LL-Dipeptidester und den D-Aminosäureester, wie vorstehend beschrieben. Demgemäss kann die Herstellung des Dipeptidesters und die optische Spaltung des DL-Aminocarbonsäureesters in diesem Verfahren gleichzeitig durchgeführt werden.
Der abgetrennte, in D-Form oder überwiegend D-Form vorliegende Aminosäureester kann nach herkömmlichen Methoden der Racemisierung unterworfen werden, und das Reaktionsprodukt kann als Ausgangsverbindung für das Verfahren der Erfindung Verwendung finden.
Verwendet man die N-substituierte Monoaminodicarbonsäure in DL-Form und den Aminosäureester in L-Form, so erweist sich das D-Isomere der DL-Form der N-substituier-ten Monoaminodicarbonsäure als inert und verbleibt in dem wässrigen Medium, wodurch die Additionsverbindung aus dem LL-Dipeptidester und dem L-Aminocarbonsäureester erhalten werden kann. Wird demgemäss die D-Form der N-substituierten Monoaminodicarbonsäure aus dem wässrigen Medium isoliert, so ist es möglich, gleichzeitig die Bildung der Additionsverbindung und die optische Spaltung der N-substituierten DL-Monoaminodicarbonsäure zu erreichen. Unterwirft man die isolierteN- substituierte D-Monoamino-dicarbonsäure nach herkömmlichen Verfahren der Racemisierung, so kann das Reaktionsprodükt als Ausgangsverbindung Verwendung finden.
Verwendet man die N-substituierte DL-Monoaminodicarbonsäure und den DL-Aminocarbonsäureester, so lassen sich die N-substituierte DL-Monoaminodicarbonsäure aus dem wässrigen Medium, und die Additionsverbindung aus dem LL-Dipeptidester und dem D-Aminocarbonsäureester
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
7
637914
erhalten, wobei die Additionsverbindung, wie vorstehend dargelegt, in die Komponenten zerlegt werden kann. Hierauf können die Herstellung des Dipeptidesters und die optische Spaltung der N-substituierten DL-Monoaminodicarbonsäure und des DL-Aminocarbonsäureesters gleichzeitig erreicht werden.
Erfindungsgemäss ist es möglich, die Stufen der Einführung und Abspaltung einer Schutzgruppe für die Carboxylgruppe in einer Seitenkette wegzulassen, was man bei den herkömmlichen Verfahren für unabdingbar gehalten hat. Demgemäss lassen sich Verluste an Ausgangsverbindungen vermeiden. Die Produktausbeute ist bei Auswahl entsprechender Bedingungen bemerkenswert hoch.
Bei dem Verfahren der Erfindung können DL-Ausgangs-verbindungen verwendet werden. Bei den herkömmlichen Verfahren unter Verwendung von Enzymen ist das D-Isomere der DL-Ausgangsverbindungen für die Reaktion nutzlos, was einen Verlust an Ausgangsverbindungen mit sich bringt, obwohl die Reaktion hierdurch nicht beeinträchtigt wird. Bei dem Verfahren der Erfindung können jedoch die D-Ausgangsverbindungen wirksam für die Abscheidung des Di-peptids verwendet und anschliessend wiedergewonnen werden.
Bei der Durchführugn des Verfahrens der Erfindung lassen sich die optische Spaltung der N-substituierten DL-Ami-nodicarbonsäure und des DL-Aminocarbonsäureesters gleichzeitig erreichen.
Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Zersetzung der Additionsverbindungen der Formel I indem diese mit einer wässrig-sauren Lösung vermischt und die Peptidester der Formel VI dann durch Abtrennung als verbleibender Feststoff isoliert werden.
Bei den sauren Komponenten der wässrig-sauren Lösung kann es sich um anorganische oder organische Säuren handeln. Beispiele für geeignete anorganische Säuren sind Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure. Beispiele für geeignete organische Säuren sind Ameisensäure, Essigsäure, Citronensäure, Toluolsulfon-säure usw. Die Konzentration der Säure spielt an sich keine besondere Rolle und kann sich nach den anderen Bedingungen richten.
Die saure Komponente in der sauren wässrigen Lösung für die Additionsverbindung der Formel I liegt meist in stö-chiometrischer Menge oder darüber, z.B. in einer Menge von 1 bis 100 Äquivalent, vorzugsweise 1 bis 20 Äquivalent, insbesondere 1 bis 10 Äquivalent, jeweils bezogen auf 1 Mol der Säureadditionsverbindung (I), vor, da die saure Komponente zur Ionisierung des Aminocarbonsäueesterbausteins und damit zu seiner Auflösung in der wässrigen Lösung in Form seines Salzes führt.
Für einige Zwecke muss der Dipeptidester (VI) nicht besonders rein sein. In solchen Fällen ist es möglich, geringere Mengen der sauren Komponente, als dem stöchiometrischen Verhältnis entspricht, zu verwenden, z.B. 0,5 Äquivalent pro 1 Mol der Additionsverbindung (I). Für einige praktische Zwecke kann man z.B. etwa 0,8 Äquivalent, pro 1 Mol der Additionsverbindung (I), verwenden.
Das Verhältnis der sauren wässrigen Lösung zu den Ausgangsverbindungen liegt vorzugsweise in einem Bereich, in dem der Dipeptidester (VI) in festem Zustand vorliegen kann, da der erhaltene Dipeptidester (VI) als Feststoff abgetrennt wird. Viele Dipeptidester (VI) besitzen jedoch eine geringe Löslichkeit in Wasser oder in der sauren wässrigen Lösung, z.B. im Fall des N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl--L-phenylalaninmethylesters, dessen Löslichkeit 0,028 g/ 100 g Wasser und 0,017 g/100 g verdünnter Salzsäure (10"2-molar) bei 25°C beträgt. Demgemäss kann der Anteil der sauren wässrigen Lösung relativ hoch sein. Andererseits wird bei dem Verfahren der Erfindung die Additionsverbin-dung (I) mit der sauren wässrigen Lösung vorzugsweise so in Berührung gebracht, dass man Bedingungen zur Feststoff-Flüssigkeits-Trennung vorliegen hat. Es ist somit nicht 5 zweckmässig, ein zu niedriges Verhältnis anzuwenden. Geeignete Mengen der sauren wässrigen Lösung liegen im Bereich von 1,5 bis 50 Gewichtsteile, vorzugsweise 2 bis 10 Gewichtsteile, jeweils pro 1 Gewichtsteil der Additionsverbindung (I).
io Die Temperatur zur Umsetzung der Additionsverbindung (I) mit der sauren wässrigen Lösung liegt im allgemeinen im Bereich von 0 bis 100°C, vorzugsweise 5 bis 80°C. Wenn man das Gemisch ausreichend rührt, ist die Zersetzung der Additionsverbindung (I) in etwa 10 Minuten 15 beendet.
Handelt es sich bei Rx um eine Schutzgruppe, die leicht hydrolysiert werden kann, z.B. um eine p-Methoxybenzyl-oxycarbonylgruppe, so ist es zweckmässig, Reaktionszeit und -temperatur sorgfältig zu überwachen, um eine Abspaltung 20 der Schutzgruppe zu verhindern.
Vorzugsweise erfolgt die Zersetzung der Additionsverbindung unter Bildung des Dipeptidesters (VI) und eines Salzes des Aminosäureesters (V) mit einer Säurekomponente der wässrigen Säurelösung. Ein erheblicher Teil des Dipeptid-25 esters (VI) liegt nach der Zersetzungsreaktion meist in festem Zustand vor, da er in der wässrigen Säurelösung nur eine geringe Löslichkeit besitzt, wie vorstehend dargelegt. Da sich das Salz in der Lösung gut löst, entsteht als Reaktionssystem ein Gemisch aus dem festen Dipeptidester und der Salzlö-30 sung, die einen Überschuss der Säurekomponente enthalten kann. Der erhaltene feste Dipeptidester kann in üblicher Weise, z.B. durch Filtration oder Zentrifugieren, abgetrennt werden. Aus der abgetrennten Salzlösung kann der Aminosäureester in üblicher Weise isoliert werden, z.B. durch Aus-35 kristallisieren oder durch Lösungsmittelextraktion nach der Freisetzung des Aminosäureesters.
Erfindungsgemäss kann der Dipeptidester (VI) in einfacher Weise hergestellt und abgetrennt werden durch Zersetzung der Additionsverbindung (I), und zwar ohne kompli-40 zierte Stufen, wie Extraktion und Ionenaustauscherharzbehandlung. Ausbeute und Reinheit das Dipeptidesters (VI)
sind meist bemerkenswert hoch. Nachfolgend ist die Herstellung von a-L-Asparaginyl-L-phenylalanin-alkylestern, die als Süssmittel Verwendung finden, beschrieben. 45 Das andere Verfahren zur Zersetzung der Additionsverbindung in einem besonderen Fall besteht darin, dass man die Additionsverbindung, in der Rj eine p-Methoxybenzyloxy-carbonylgruppe darstellt, vorzugsweise die Additionsverbindung aus einem N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl-a-asparagi-50 nylphenylalaninalkylester und einem Phenylalaninalkylester (1 : 1) in einem flüssigen Medium auflöst und mit einer Säure in dem flüssigen Medium unter Bildung des Dipeptidesters mit einer freien Aminogruppe der Formel (VII) zersetzt.
55 Geeignete flüssige Medien zur Auflösung der Additionsverbindung (I) sind organische Lösungsmittel, insbesondere Ketone, wie Aceton; Sauerstoff enthaltende organische Lösungsmittel, wie Dioxan und Tetrahydrofuran; chlorierte niedere Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, Methylendi-60 chlorid und Äthylendichlorid; nicht-protonische polare organische Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Dimethyl-sulfoxid, und flüssige Carbonsäuren, wie Essigsäure und Ameisensäure. Auch Gemische aus zwei oder mehr der vorgenannten Lösungsmittel können verwendet werden. 65 Des weiteren kann man auch Ester, wie Äthylacetat, und Alkohole, wie Methanol, Äthanol oder Propano!, verwenden. Bei Verwendung solcher Lösungsmittel ist die Produktausbeute normalerweise erniedrigt, und zwar wegen uner-
637914
8
wiinschter Nebenreaktionen, z.B. Umesterungsreaktionen oder Veresterung der Carboxylgruppe.
Die Additionsverbindung besitzt meist eine geringe Löslichkeit in Wasser. Demgemäss ist Wasser allein meist nicht als flüssiges Medium geeignet, obwohl es möglich ist, Wasser zu dem flüssigen Medium in solchem Umfang hinzuzusetzen, dass eine ausreichende Löslichkeit der Additionsverbindung in dem flüssigen Medium gewährleistet bleibt.
Die Menge des flüssigen Mediums richtet sich nach der Art des flüssigen Mediums und dem Lösevermögen für die Additionsverbindung. Die Menge ist im allgemeinen grösser als 10 Gewichtsteile und beträgt vorzugsweise 20 bis 100 Gewichtsteile, pro 1 Gewichtsteil der Additionsverbindung.
Bei den für die Zersetzung der Additionsverbindung verwendeten Säuren handelt es sich vorzugsweise um Br0nsted-Säuren, vorzugsweise anorganische Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure oder Perchlorsäure, und organische Säuren, wie Trifluoressigsäure oder p-Toluolsulfonsäure.
Das Verhältnis der Säure zur Additionsverbindung ist vorzugsweise mindestens stöchiometrisch; vorzugsweise finden 2 Äquivalent oder mehr Säure, pro 1 Mol der Additionsverbindung, Anwendung.
Die Konzentration der Säure in dem flüssigen Medium liegt im allgemeinen im Bereich von 0,1 bis 10 n, vorzugsweise 1 bis 5 n. Vorzugsweise wird die genaue Konzentration nach Massgabe der anderen Reaktionsbedingungen festgelegt, da die Reaktion unter anderem von der Reaktionszeit, der Reaktionstemperatur und der Art der Säure abhängt. Hohe Konzentrationen, die den vorgenannten Bereich übersteigen und zu unerwünschten Nebenreaktionen, z.B. der Hydrolyse der Ester führen könnten, sollten jedoch vermieden werden.
Bei der Säure kann es sich um wässrige oder wasserfreie Säure handeln. Wenn es sich bei dem flüssigen Medium um ein mit Wasser nicht mischbares Medium, z.B. einen chlorierten Kohlenwasserstoff handelt, wird die Verwendung wasserfreier Säuren bevorzugt, da die Verwendung wässriger Säuren zur Ausbildung von zwei Phasen führen würde, was eine sehr langsame Reaktion zur Folge hätte.
Reaktionstemperatur und -zeit unterliegen an sich keinen besonderen Beschränkungen. Die Reaktion erfolgt im allgemeinen bei 20 bis 100°C für eine Dauer von 10 Minuten bis 6 Stunden.
Bei Anwendung der Säure in geringerer Konzentration dauert die Reaktionszeit länger oder die Reaktionstemperatur ist höher. Bei höherer Säurekonzentration ist es von Vorteil, eine kürzere Reaktionszeit und eine niedrigere Reaktionstemperatur zu wählen.
Nach der Zersetzung der Additionsverbindung können der erhaltene Dipeptidester mit der freien Aminogruppe (VII), Anisalkohol und der Aminosäureester (V) nach nachfolgend beschriebenen Methoden getrennt werden. So kann man z.B. nach der Reaktion den Anisalkohol in eine Lösungsmittelphase extrahieren. Hierbei geht man so vor, dass man geeignete Mengen Wasser und Lösungsmittel, das eine separate Phase mit Wasser zu bilden vermag, wie Chloroform oder Diäthyläther, der Reaktionslösung zusetzt, anschliessend schüttelt und dann absitzen lässt, wobei eine Phasentrennung in eine Lösungsmittelphase und eine wässrige Phase erfolgt. Andererseits wird der pH-Wert der wässrigen Phase durch Zugabe einer Base, wie NaOH, NaHC03, Na2C03, Ammoniak oder Triäthylamin, auf einen Wert von 5 bis 6 eingestellt, worauf der abgeschiedene Dipeptidester mit der freien Aminogruppe (VII) durch Filtration oder dgl. abgetrennt wird. Der pH-Wert des Filtrats wird dann mit der Base auf einen pH-Wert von 8 bis 10 eingestellt, worauf der freie Phenylalaninalkylester mit einem Lösungsmittel, wie Chloroform, Diäthyläther oder Äthylacetat, extrahiert wird.
Der Dipeptidester mit der freien Aminogruppe und der Aminosäureester können auch in einfacher Weise durch die übliche Methode unter Anwendung eines Kationenaustauscherharzes isoliert werden.
Die oben beschriebenen Methoden zur optischen Spaltung können auch in diesem Fall Anwendung finden.
Dieses Verfahren ist höchst vorteilhaft anwendbar auf die Herstellung von a-L-Asparaginylphenylalanin-nieder-alkylestern aus der Additionsverbindung von N-p-Methoxy-benzyloxycarbonyl-a-L-asparaginyl-L-phenylalandn-nieder-alkylestern mit Phenylalanin-niederalkylestern, wobei R1; R2, R3 und n eine N-p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe, Benzylgruppe bzw. Niederalkylgruppe, vorzugsweise eine Methyl- oder Äthylgruppe, bedeuten und n den Wert 1 hat.
Erfindungsgemäss können die Abspaltung des Amino-carbonsäurebausteins und der N-ständigen Schutzgruppe der p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe von dem Dipeptidester gleichzeitig erfolgen. Der abgetrennte Anisalkohol kann wiedergewonnen und durch Umsetzung mit Phosgen in ein p-Methoxybenzyloxycarbonylierungsmittel überführt werden. Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
1335 mg (5 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagin-säure und 1078 mg (5 mMol) L-Phenylalaninmethylester-hy-drochlorid werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 20 ml Wasser versetzt. Bei der Auflösung wird der pH mit 7 %igen Ammoniakwasser auf einen Wert von 6 eingestellt.
Die erhaltene Lösung wird mit 50 mg Thermolysin vermischt und dann bei 38 bis 40°C über Nacht geschüttelt. Der Niederschlag wird abgetrennt, mit 40 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 1145 mg feine, nadeiförmige Kristalle vom F. 117 bis 120°C [eine Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L--phenylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester (1 : 1)]; Ausbeute 75,5%, bezogen auf L-Phenylalaninme-thylester-hydrochlorid.
Das Reaktionsprodukt wird aus einem Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat und n-Hexan umkristallisiert. Die physikalischen Eigenschaften und die Ergebnisse der Elementaranalyse sind nachfolgend zusammengestellt.
F. 120-124°C
[a]D25: + 7,1 (C = 1, Methanol)
Elementaranalyse: C32H37N309
berechnet: C 63,24 H 6,13 N 6,97 gefunden: C 63,15 H 6,15 N 7,00 Die IR- und NMR-Spektren des Produkts bestätigen die Struktur.
1145 mg des Reaktionsprodukts werden in 40 ml ln-HCl gelöst und dann 3mal mit 30 ml Äthylacetat extrahiert. Hierauf werden die Extrakte vermischt, mit jeweils 20 ml Wasser (3mal) gewaschen und dann mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Einengen der Lösung führt man durch Zugabe von n-Hexan Kristallisation herbei. Hierbei erhält man 640 mg eines kristallinen Produkts. Die physikalischen Eigenschaften und die Ergebnisse der Elementaranalyse sind nachfolgend angegeben.
F. 115-125°C
[a]D25: - 15,3 (C = 1, Methanol)
Elementaranalyse: C^H^NjO,
berechnet: C 61,97 H 5,65 N 6,54 gefunden: C 61,52 H 5,65 N 6,57 Die IR- und NMR-Spektren zeigen die für N-Benzyloxy-carbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester erwarteten Eigenschaften.
Die Ergebnisse stimmen mit denjenigen überein, die man bei Benzyloxycarbonylierung der Aminogruppe des L-Aspera-ginyl-L-phenylalaninmethylesters erhält.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
9
637914
Der L-Phenylalaninmethylester wird aus einem Gemisch der Salzsäurephase und der Waschwasserfraktion, die von der Äthylacetatextraktion herrühren, gewonnen.
Es bestätigt sich somit, dass die durch die vorgenannte Reaktion erhaltene Verbindung eine Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethyl-ester und L-Phenylalaninmethylester darstellt. Gleichzeitig bestätigt das NMR-Spektrum, dass das Molverhältnis 1 : 1 beträgt.
Beispiel 2
1335 mg (5 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagin-säure und 1078 mg (5 mMol) L-Phenylalaninmethylester-hy-drochlorid werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 10 ml Wasser versetzt. Bei der Auflösung wird der pH mit 7%igem Ammoniakwasser auf einen Wert von 6 eingestellt.
Die erhaltene Lösung wird mit 50 mg Thermolysin vermischt und dann bei 38 bis 40°C über Nacht geschüttelt. Der Niederschlag wird gesammelt, aus der Lösung abgetrennt und getrocknet. Hierbei erhält man 1504 mg einer Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginylphe-nylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester (1 : 1). Ausbeute: 99,1%, bezogen auf L-Phenylalaninmethylester--hydrochlorid; F. 104 bis 113°C.
Beispiel 3
Gemäss Beispiel 2, wobei jedoch die Mengen an N-Ben-zyloxycarbonyl-L-asparaginsäure und L-Phenylalaninmethylester auf 534 mg (2 mMol) bzw. 863 mg (4 mMol) verändert werden, erhält man 1068 mg einer Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninme-thylester und L-Phenylalaninmethylester (1:1) vom F. 116 bis 119°C. Ausbeute 70,4%, bezogen auf N-Benzyloxycar-bonyl-L-asparaginsäure.
Beispiel 4
534 mg (2 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagin-säure und 863 mg (4 mMol) L-Phenylalaninmethylester-hy-drochlorid werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 8 ml Wasser versetzt. Bei der Auflösung wird der pH mit 7%igem Ammoniakwasser auf einen Wert von 6,2 eingestellt.
Die erhaltene Lösung wird mit 50 mg Thermolysin vermischt und dann bei 38 bis 40°C über Nacht geschüttelt. Der Niederschlag wird gesammelt, aus der Lösung abgetrennt und getrocknet. Hierbei erhält man 1099 mg einer Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L--phenylaianinmethylester und L-Phenylalaninmethylester (1 : 1). Ausbeute 90,5%, bezogen auf N-Benzyloxycarbonyl--L-asparaginsäure.
Beispiel 5
267,2 mg (1 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagin-säure und 537,6 mg (3 mMol) L-Phenylalaninmethylester werden in 5 ml Pufferlösung (Mcllvain's Puffer, pH 7,0) gelöst.
Die erhaltene Lösung wird mit 100 mg Thermoase und 100 mg Potato-Inhibitor versetzt und dann 20 Stunden bei 38°C geschüttelt. Der Niederschlag wird gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 580 mg einer rohen kristallinen Additionsverbindung aus N-Ben-zyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester (1:1) vom F. 123 bis 125°C. Ausbeute 95,5%, bezogen auf N-Benzyloxycarbonyl-L--asparaginsäure.
Nachdem man das Reaktionsprodukt in 40 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Dimethylformamid und Wasser (1:1) gelöst hat, wird die Lösung unter gründlichen Rühren mit einem stark sauren Kationenaustauscherharz in der H-Form versetzt. Nach Abtrennung des Harzes wird das Filtrat unter vermindertem Druck eingeengt. Nachdem man den Rückstand in Dimethylformamid gelöst hat, wird die Lösung mit Wasser versetzt. Hierbei erhält man einen Niederschlag aus 330 mg N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl--L-phenylalaninmethylester vom F. 123 bis 125°C. Ausbeute 77,0%, bezogen auf N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagin-säure.
Beispiel 6
267,2 mg (1 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagin-säure und 358,4 mg (2 mMol) L-Phenylalaninmethylester werden in 5 ml Pufferlösung (Mcllvain's Puffer, pH 7,0) gelöst. Die Lösung wird mit 100 mg Tacynase N und 100 mg Potato-Inhibitor versetzt und dann 6 Stunden bei 38°C geschüttelt. Der Niederschlag wird gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 120 mg einer rohen kristallinen Additionsverbindung aus N-Benzyloxycar-bonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester (1 : 1) vom F. 119 bis 123°C. Ausbeute 19,7%.
Das erhaltene Reaktionsprodukt wird gemäss Beispiel 5 der Behandlung mit dem stark sauren Kationenaustauscherharz in H-Form unterworfen. Hierbei erhält man 50 mg N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethyl-ester vom F. 95 bis 105°C. Ausbeute 11,7%.
Beispiel 7
1335 mg (5 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagin-säure und 1078 mg (5 mMol) L-Phenylalaninmethylester werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 4 ml Wasser versetzt. Bei der Auflösung wird der pH mit Triäthylamin auf einen Wert von 6,8 eingestellt.
Die erhaltene Lösung wird mit 20 mg Thermolysin versetzt und dann 2 Tage bei 38 bis 40°C geschüttelt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit 40 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 475 mg einer Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phe-nylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester (1 : 1). Ausbeute 31,3%, bezogen auf L-Phenylalaninmethylester--hydrochlorid.
Das erhaltene Reaktionsprodukt wird aus einem Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat und n-Hexan umkristallisiert. Die physikalischen Eigenschaften und die Ergebnisse der Elementaranalyse sind nachfolgend angegeben.
F. 120 bis 124°C [a,]u25: + 7,2 (C = 1, Methanol)
Elementaranalyse:
berechnet: C 63,24 H 6,13 N 6,97
gefunden: C 63,52 H 6,22 N 7,04
Beispiel 8
Gemäss Beispiel 7, wobei jedoch der pH auf einen Wert von 5,2 eingestellt wird, erhält man 753 mg einer Additionsverbindung aus N-Benzyioxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenyl-alaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester (1: 1). Ausbeute 49,5%, bezogen auf L-Phenylalaninmethylester.
Beispiel 9
133,6 mg (0,5 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagin-säure und 89,6 mg (0,5 mMol) L-Phenylalaninmethylester werden in 2,5 ml Pufferlösung (Mcllvain's Puffer, pH 7,0) mit 0,07 ml Triäthylamin gelöst.
Die erhaltene Lösung, die einen pH-Wert von 6,7 besitzt, wird mit 50 mg Thermoase und 50 mg Potato-Inhibitor versetzt und dann 20 Stunden bei 38°C geschüttelt. Der Niederschlag wird abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Hierbei
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
637914
10
erhält man 130 mg einer rohen Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethyl-ester und L-Phenylalaninmethylester (1 : 1) vom F. 115 bis 124°C. Ausbeute 85,5%, bezogen auf L-Phenylalaninmethylester.
Das Reaktionsprodukt wird in 20 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Dimethylformamid und Wasser (1 : 1) gelöst und hierauf gemäss Beispiel 5 der Behandlung mit dem stark sauren Kationenaustauscherharz in H-Form unterworfen. Hierbei erhält man 75 mg N-Benzyloxycarbonyl-L--phenylalaninmethylester. Gesamtausbeute 70%, bezogen auf eine 50% ige Ausnutzung der Menge an Ausgangs-L-Phenyl-alaninmethylester.
Beispiel 10
Gemäss Beispiel 9, wobei jedoch 0,05 ml N-Methylmor-pholin anstelle von 0,07 ml Triäthylamin Verwendung finden, wird die Umsetzung mit einem pH-Wert von 6,4 zu Beginn durchgeführt. Hierbei erhält man 120 mg einer rohen kristallinen Additionsverbindung aus N-Benzyloxy-carbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester (1:1) vom F. 118 bis 124°C. Ausbeute 78,9%, bezogen auf L-Phenylalaninmethylester.
Das Reaktionsprodukt wird gemäss Beispiel 9 der Behandlung mit dem stark sauren Kationenaustauscherharz in H-Form unterworfen. Hierbei erhält man 70 mg kristallinen N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalaninmethylester. Gesamtausbeute 66%, bezogen auf eine 50% ige Nutzung der Menge des Ausgangs-L-Phenylalaninmethylesters.
Beispiel 11
Gemäss Beispiel 4, wobei jedoch die Umsetzung bei einem pH-Wert von 6,5 unter Schütteln für eine Dauer von
1 Stunde erfolgt, erhält man 920 mg einer Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin-methylester und L-Phenylalaninmethylester (1 : 1), Ausbeute 75,8%.
Beispiel 12
534 mg (2 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagin-säure und 863 mg (4 mMol) L-Phenylalaninmethylester-hy-drochlorid werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit
2 ml Wasser versetzt. Bei der Auflösung wird der pH durch Zugabe von 5,5 ml 1 n-NaOH auf einen Wert von 7 eingestellt.
Die erhaltene Lösung wird mit 50 mg Thermolysin versetzt und dann 2 Stunden bei 38 bis 40°C geschüttelt. Der erhaltene Niederschlag wird abgetrennt und getrocknet. Hierbei erhält man 734 mg einer Additionsverbindung aus N--Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester (1:1) vom F. 106 bis 118°C. Ausbeute 60,5%.
Beispiel 13
540 mg (2 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure und 863 mg (4 mMol) L-Phenylalaninmethylester-hydro-chlorid werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 7 ml Wasser versetzt. Bei der Auflösung wird der pH mit 7 %-igem Ammoniakwasser auf einen Wert von 6 eingestellt.
Die erhaltene Lösung wird mit 100 mg Thermoase versetzt und über Nacht bei 38 bis 40°C geschüttelt. Der erhaltene Niederschlag wird mit 70 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 550 mg einer Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenyl-alaninmethylester (1:1) vom F. 113 bis 116°C. Ausbeute 45,3%.
Beispiel 14
270 mg (1 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagin-säure und 432 mg (2 mMol) L-Phenylalaninmethylester wer- ' den in einem 30 ml fassenden Kolben mit 4 ml Wasser versetzt. Bei der Auflösung wird der pH mit 7 %igem Ammoniakwasser auf einen Wert von 6 eingestellt.
Die erhaltene Lösung wird mit 50 mg Thermoase versetzt und dann. 40 Stunden bei 38 bis 40°C geschüttelt. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert, vom Wasser abgetrennt und getrocknet. Hierbei erhält man 177 mg einer Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L--phenylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester (1 : 1) vom F. 103 bis 112°C. Ausbeute 29,1%.
Beispiel 15
Gemäss Beispiel 14, wobei jedoch der Reaktionslösung zusätzlich 50 mg Potato-Inhibitor zugesetzt werden, erhält man 381 mg des gleichen Produkts vom F. 105 bis 117°C. Ausbeute 62,7%.
Beispiel 16
534 mg (2 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagin-säure und 863 mg (4 mMol) DL-Phenylalaninmethylester-hy-drochlorid werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 7 ml Wasser versetzt. Bei der Auflösung wird der pH mit 7% igem Ammoniakwasser auf einen Wert von 6,2 eingestellt.
Die erhaltene Lösung wird mit 50 mg Thermolysin versetzt und dann bei 38 bis 40°C über Nacht geschüttelt. Der Niederschlag wird abfiltriert, vom Wasser getrennt und getrocknet. Hierbei erhält man 1045 mg Kristalle einer Additionsverbindung aus N-Benzoyloxycarbonyl-asparaginyl-phe-nylalaninmethylester und Phenylalaninmethylester (1 : 1) vom F. 104 bis 108°C. Ausbeute 86,1 %, bezogen auf N-Benzoyl-carbonyl-L-asparaginsäure.
Nach dem Umkristallisieren aus einem Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat und n-Hexan erhält man eine Substanz mit den nachfolgend angegebenen Daten.
F. 127-135°C
[a]D25: - 4,6 (C = 1, Methanol)
Elementaranalyse: C32H37N3Og berechnet: C 63,24 H 6,13 N 6,97 gefunden: C 63,52 H 6,19 N 6,92 Es handelt sich vermutlich um die Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninme-thylester und D-Phenylalaninmethylester (1 : 1), und zwar deshalb, weil das IR-Spektrum und das NMR-Spektrum der Substanz die gleichen Eigenheiten wie diejenigen von Beispiel 1 aufweisen.
800 mg des Reaktionsprodukts werden in 40 ml 1 n HCl gelöst und dann mit 30 ml Methylendichlorid 3mal extrahiert. Hierauf wird die Methylendichloridphase mit Wasser gewaschen und dann mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nachdem man das Methylendichlorid ab- ■ destilliert hat, wird der feste Rückstand aus einem Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat und n-Hexan umkristallisiert. Hierbei erhält man 450 mg Kristalle mit den nachfolgend angegebenen Eigenschaften.
F. 124-132°C
[a]t)23: — 15,3 (C = 1, Methanol)
Elementaranalyse: C^H^NjO,
berechnet: C 61,67 H 5,65 N 6,54 gefunden: C 61,38 H 5,58 N 6,29 Bei dem Reaktionsprodukt handelt es sich um N-Benzyl-oxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester.
Die rückständige wässrige Phase aus der Extraktion mit Methylenchlorid wird zur Einstellung des pH auf einen Wert von 8,7 mit Natriumhydrogencarbonat vermischt. Hierauf wird das Produkt mit 30 ml Methylenchlorid 3mal extra5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
11
637914
hiert. Nachdem man den Extrakt mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet hat, wird Chlorwasserstoffgas in den Extrakt für eine Dauer von etwa 10 Minuten eingeleitet. Nach dem Einengen wird die Methylenchloridlösung mit Äthyläther versetzt. Hierbei rekristallisiert das Produkt, und man erhält 29,0 mg D-Phenylalaninmethylester-hydrochlorid vom F. 149 bis 151°C.
[a]D25: - 15,1 (C = 1, Methanol)
Das IR- und NMR-Spektrum stimmt mit demjenigen der L-Form überein.
Die Annahme über die Additionsverbindung ist somit zutreffend. Bei dem durch die Umsetzung erhaltenen Produkt handelt es sich um die Additionsverbindung aus dem N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethyl-ester und dem D-Phenylalaninmethylester (1 : 1).
Beispiel 17
1069 mg (4 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-DL-asparagin-säure und 863 mg (4 mMol) L-Phenylalaninmethylester-hy-drochlorid werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 2 ml Wasser versetzt. Hierauf wird der pH mit 7 % igem Ammoniakwasser auf einen Wert von 6 eingestellt.
Die erhaltene Lösung wird mit 50 mg Thermolysin versetzt und dann 2 Stunden bei 38 bis 40°C geschüttelt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit 20 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 787 mg einer Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phe-nylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester (1:1) vom F. 105 bis 110°C. Ausbeute 64,8%, bezogen auf N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure.
Das Produkt wird aus einem Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat und n-Hexan umkristallisiert. Hierbei erhält man das gewünschte Produkt vom F. 121 bis 125°C.
[a]D25: 7,2 (C = 1, Methanol).
Die N-Benzyloxycarbonyl-asparaginsäure (hauptsächlich in D-Form) wird aus der restlichen Reaktionslösung isoliert.
Beispiel 18
Beispiel 17 wird wiederholt, wobei jedoch DL-Phenyl-alaninmethylester anstelle von L-Phenylalaninmethylester Verwendung findet. Hierbei erhält man 765 mg einer Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L--phenylalaninmethylester und D-Phenylalaninmethylester (1 : 1) vom F. 105 bis 111°C. Ausbeute 62,3%, bezogen auf N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure.
Beim Umkristallisieren aus einem Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat und n-Hexan erhält man das gewünschte Produkt vom F. 126 bis 134°C.
[a]D25: — 6,5 (C = 1, Methanol).
Die N-Benzyloxycarbonylasparaginsäure (hauptsächlich in D-Form) wird aus der verbleibenden Reaktionslösung isoliert.
Beispiel 19
5,34 g (20 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure und 7,53 g (42 mMol) L-Phenylalaninmethylester werden in einem 100 ml fassenden Kolben mit 70 ml Wasser versetzt. Hierbei erhält man eine Lösung mit einem pH von 6,2 bis 6,3.
Die erhaltene Lösung wird mit 200 mg Thermolysin versetzt und 4 Stunden bei 38 bis 40°C geschüttelt. Der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, mit 70 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 10,11 g Kristalle vom F. 117 bis 120°C. Bei diesem Produkt handelt es sich um eine Additions Verbindung aus N-Benzyloxycarbonyl--L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und L-Phenyl-alaninmethylester (1 : 1), und zwar aufgrund der nachfolgend angegebenen Eigenschaften (nach Umkristallisieren aus
Äthylacetat/n-Hexan).
F. 120-124°C
[a]D25: + 7,2 (C = 1, Methanol)
Elementaranalyse: C32H37N309
berechnet: C 63,24 H 6,13 N 6,97 gefunden: C 63,16 H 6,14 N 6,99 Die IR- und NMR-Spektren zeigen die gleichen Eigenschaften, die vorstehend für die 1 : 1-Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninme-thylester und L-Phenylalaninmethylester beschrieben sind.
Beim Behandeln mit starker Säure und Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, wie Äthylacetat, erhält man nach Abdestillieren des organischen Lösungsmittels den N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester.
1,00 g (1,65 mMol) der erhaltenen Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninme-thylester und L-Phenylalaninmethylester werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 2 ml Wasser und 2,0 ml 1-n HCl unter Rühren bei Raumtemperatur während 10 Minuten versetzt. Nachdem man die erhaltene Aufschlämmung filtriert hat, wird der Niederschlag mit 4 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 0,72 g Kristalle des N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninme-thylesters mit einer Ausbeute von 98,8%.
Nachdem man die erhaltenen Kristalle in Äthylacetat gelöst hat, versetzt man mit n-Hexan zur Rekristallisation des Produkts. Die physikalischen Eigenschaften und die Ergebnisse der Elementaranalyse des Endprodukts sind nachfolgend angegeben.
F. 121-124°C
[a]D25: - 15,4 (C = 1, Methanol)
Elementaranalyse: C22H24N207
berechnet: C 61,67 H 5,65 N 6,54 gefunden: C 61,58 H 5,64 N 6,56 Das IR-Spektrum des Produkts stimmt mit demjenigen der Standardverbindung überein.
Darüberhinaus wird die Identität des Produkts durch Vergleich einer wässrigen Lösung des Produkts mit derjenigen der Standardverbindung mittels Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie bestätigt.
Beispiel 20
1,00 g (1,65 mMol) der Additionsverbindung aus N-Ben-zyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester, hergestellt in Beispiel 19, werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 2 ml Wasser und 1,32 ml 1 n HCl versetzt. Nachdem man das Gemisch 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt hat, wird gemäss Beispiel 19 aufgearbeitet. Hierbei erhält man 0,70 g feine prismatische Kristalle vom F. 100 bis 126°C mit einem Gehalt an N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin-methylester von 96,8%.
Beispiel 21
0,534 g (2 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure und 0,863 g (4 mMol) DL-Phenylalaninmethylester-hydro-chlorid werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 10 ml Wasser versetzt. Bei der Auflösung wird der pH mit 7% igem Ammoniakwasser auf einen Wert von 6,0 eingestellt.
Die erhaltene Lösung wird mit 50 mg Thermolysin versetzt und dann bei 38 bis 40°C über Nacht geschüttelt. Der Niederschlag wird abgetrennt, mit 10 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 0,90 g Kristalle vom F. 120 bis 126°C.
Ein Teil der Kristalle wird aus einem Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat und n-Hexan umkristallisiert. Hierbei erhält man das gewünschte Produkt vom F. 128 bis 134°C;
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
637914
12
[a]D25 = — 6,3 (C = 1, Methanol). Die mit diesem Produkt erhaltenen IR- und NMR-Spektren sind im wesentlichen die gleichen wie diejenigen der Additionsverbindung aus N-Ben-zyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester (1 : 1).
Elementaranalyse: C^HjjNjOg berechnet: C 63,24 H 6,13 N 6,97 gefunden: C 63,42 H 6,17 N 6,95 Bei Behandlung mit Säure erhält man hieraus den N-Ben-zyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und den D-Phenylalaninmethylester im Molverhältnis 1:1.
Die Ergebnisse bestätigen, dass die erhaltenen Kristalle die Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-aspara-ginyl-L-phenylalaninmethylester und D-Phenylalaninmethyl-ester (1:1) darstellen.
0,50 g (0,82 mMol) der Additionsverbindung werden mit 4 ml Wasser und 0,26 g Citronensäure vermischt. Nachdem man das Gemisch bei Raumtemperatur 10 Minuten gerührt hat, erfolgt die Aufarbeitung gemäss Beispiel 19. Hierbei erhält man 0,35 g Kristalle des N-Benzyloxycarbonyl-L--asparaginyl-L-phenylalaninmethylesters mit einer Reinheit von 100% und einer Ausbeute von 99,3%.
Beispiel 22
0,50 g (0,82 mMol) der Additionsverbindung aus N--Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester, hergestellt gemäss Beispiel 19, werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 4 ml Wasser und 0,24 g (1,2 mMol) p-Toluolsulfonsäuremonohydrat versetzt. Bei der Aufarbeitung gemäss Beispiel 19 erhält man 0,33 g Kristalle des N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L--phenylalaninmethylesters mit einer Reinheit von 100% und einer Ausbeute von 93,6%.
Beispiel 23
0,45 g (8,2 mMol) 85% ige Ameisensäure und 8 ml Wasser werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 0,50 g (0,82 mMol) der Additions Verbindung aus N-Benzyloxy-carbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester, hergestellt in Beispiel 19, versetzt. Nachdem man das Gemisch 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt hat, wird das Reaktionsprodukt abfiltriert, mit 10 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 0,312 g weisse Kristalle des N-Benzyloxycarbo-nyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylesters mit einer Reinheit von 100% und einer Ausbeute von 88,6%.
Beispiel 24
0,47 g (8,2 mMol) Eisessig und 8 ml Wasser werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 0,50 g (0,82 mMol) der Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagi-nyl-L-phenylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethyl-ester versetzt. Nachdem man das Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt hat, wird das Reaktionsprodukt abfiltriert, mit 10 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 0,308 g weisse Kristalle des N-Benzyloxy-carbonyl-L-asparaginyl-L-phenyialaninmethylesters mit einer Reinheit von 100% und einer Ausbeute von 87,2%.
Beispiel 25
1,00 g (1,65 mMol) der Additionsverbindung aus N-Ben-zyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester, hergestellt in Beispiel 19, werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 2 ml Wasser und 2,0 ml 1 n HCl versetzt. Nachdem man das Gemisch 3 Minuten bei 60°C gerührt hat, erfolgt die Aufarbeitung gemäss Beispiel 19. Hierbei erhält man 0,35 g Kristalle des
N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethyl-esters mit einer Reinheit von 100% und einer Ausbeute von 100%.
Beispiel 26
0,594 g (2 mMol) N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl-L--asparaginsäure und 0,860 g (4 mMol) L-Phenylalaninme-thylester-hydrochlorid werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 1 n NaOH versetzt. Hierbei wird der pH auf einen Wert von 6,0 eingestellt.
Die erhaltene Lösung wird mit 50 mg Thermolysin versetzt und hierauf bei 38 bis 40°C über Nacht geschüttelt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit 10 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 0,928 g Kristalle vom F. 68 bis 74°C.
Die nachfolgenden Ergebnisse bestätigen, dass es sich bei dem Reaktionsprodukt um die Additionsverbindung aus N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenyl-alaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester (1 : 1) handelt.
Beim Umkristallisieren aus einem Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat und n-Hexan erhält man das gewünschte Produkt mit den nachfolgend angegebenen Eigenschaften. F. 72-76°C
[a]D25: + 6,5 (C = 1, Methanol)
Elementaranalyse: C33H3!)N3O10
berechnet: C 62,15 H 6,16 N 6,59 gefunden: C 61,85 H 6,04 N 6,46 Die IR- und NMR-Spektren zeigen, dass es sich bei dem Reaktionsprodukt um die Additionsverbindung der Formel I handelt, in der Rx, R^, R3 und n eine p-Methoxybenzyloxy-carbonylgruppe, Benzylgruppe, Methoxygruppe bzw. den Wert 1 bedeuten.
0,500 g (0,78 mMol) der Additionsverbindung aus N-p--Methoxybenzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin-methylester und L-Phenylalaninmethylester, die in vorgenannter Weise hergestellt worden ist, werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 2 ml Wasser und 0,94 ml (0,94 mMol) 1 n HCl versetzt. Hierauf wird das Reaktionsgemisch 3 Minuten bei 60°C gerührt.
Nach Filtrieren der erhaltenen Aufschlämmung, Waschen mit 6 ml Wasser und Trocknen erhält man 0,32 g Kristalle.
Die nachfolgenden Ergebnisse zeigen, dass es sich bei dem Reaktionsprodukt um N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl--L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester (Reinheit 100%, Ausbeute 89,1%) handelt.
Nachdem man die Kristalle in Äthylacetat gelöst hat, versetzt man mit n-Hexan zur Rekristallisation des Produkts. Die physikalischen Eigenschaften und die Ergebnisse der Elementaranalyse sind nachfolgend angegeben.
F. 128 bis 130°C [a]„25: - 15,1 (C = 1, Methanol)
Elementaranalyse: C23H26N2Ob berechnet: C 60,25 H 5,72 N 6,11 gefunden: C 60,30 H 5,74 N 5,99 IR- und NMR-Daten zeigen, dass es sich um ein Endprodukt der Formel VI handelt, in der Rl5 R2, R3 und n eine p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe, Benzylgruppe, Methoxygruppe bzw. den Wert 1 bedeuten.
0,2 Gewichtsteile des erhaltenen N-p-Methoxybenzyloxy-carbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylesters werden in 2 Gewichtsteilen Aceton gelöst. Nachdem man die erhaltene Lösung mit 1 Gewichtsteil 4 n HCl versetzt hat, wird das Gemisch auf dem Wasserbad 1,5 Stunden unter schwachem Rückfluss erhitzt. Hierbei findet vollständige Zersetzung unter Bildung einer Lösung statt, die als Hauptkomponenten L-Asparaginyl-L-phenylalaninmethylester, L-Phenylalaninmethylester und Anisalkohol enthält. Aus dieser
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
13
637914
Lösung erhält man den L-Asparaginyl-L-phenylalaninmethyl-ester.
Beispiel 27
0,562 g (2 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminsäure und 0,860 g (4 mMol) L-Phenylalaninmethylester-hydro-chlorid werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 1 n NaOH versetzt. Bei der Auflösung wird der pH-Wert auf 6,0 eingestellt.
Die erhaltene Lösung wird mit 50 mg Thermolysin versetzt und hierauf bei 38 bis 40°C über Nacht geschüttelt. Nach dem Abtrennen wird der Niederschlag mit 10 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 0,510 g Kristalle vom F. 80 bis 85°C.
Die nachfolgend angegebenen Ergebnisse bestätigen, dass es sich bei dem Reaktionsprodukt um eine Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-glutamyl-L-phenylalanin-methylester und L-Phenylalaninmethylester (1:1) handelt.
Beim Umkristallisieren aus Äthylacetat/n-Hexan erhält man das gewünschte Produkt. Die physikalischen Eigenschaften und die Ergebnisse der Elementaranalyse sind nachfolgend zusammengestellt.
F. 92-97°C
[aJD25: 0,1 (C = 1, Methanol)
Elementaranalyse: C33H39N309
berechnet: C 63,75 H 6,32 N 6,76 gefunden: C 63,61 H 6,31 N 6,65 IR- und NMR-Daten zeigen, dass es sich bei dem Reaktionsprodukt um die Additionsverbindung der Formel I handelt, in der R1; R2, R3 und n eine Benzyloxycarbonylgruppe, Benzylgruppe, Methoxygruppe bzw. den Wert 2 bedeuten.
0,001 g der Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbo-nyl-L-glutamyl-L-phenylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester werden in einem 15 ml fassenden Reagenzglas unter Rühren zu 2,3 ml (0,32 mMol) 0,14 n HCl hinzugefügt. Hierauf wird das Gemisch 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.
Der erhaltene weisse Niederschlag wird abfiltriert, mit 3 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 0,683 g Kristalle.
Die nachfolgend angegebenen Ergebnisse bestätigen, dass es sich bei dem Reaktionsprodukt um den N-Benzyloxycar-bonyl-L-glutamyl-L-phenylalaninmethylester (Reinheit 100%, Ausbeute 95,8%) handelt.
Nachdem man die Kristalle in Äthylacetat gelöst hat, versetzt man zur Rekristallisation mit n-Hexan.
Die physikalischen Eigenschaften und die Ergebnisse der Elementaranalyse sind nachfolgend angegeben.
F. 97-99°C
[a]»25: - 11,0 (C = 1, Methanol)
Elementaranalyse: C2,H26N ,07
berechnet: C 62,43 *H 5,92 N 6,33 gefunden: C 62,63 H 5,92 N 6,24 IR- und NMR-Daten zeigen, dass es sich bei dem Endprodukt um die Verbindung der Formel VI handelt, in der Rt, R2, R3 und n eine Benzyloxycarbonylgruppe, Benzylgruppe, Methoxygruppe bzw. den Wert 2 bedeuten.
Der erhaltene N-Benzyloxycarbonyl-L-glutamyl-L-phenyl-alaninmethylester kann durch Reduktion bzw. Hydrierung mit Wasserstoff in den L-Glutamyl-L-phenylalaninmethyl-ester, und durch Hydrolyse bzw. Verseifung in das N-Ben-zyloxycarbonyl-L-glutamyl-L-phenylalanin überführt werden.
Beispiel 28
0,686 g (3,12 mMol) L-Phenylalaninmethylester-hydro-chlorid werden in einem 100 ml fassenden Kolben mit 25 ml Wasser versetzt. Bei der Auflösung versetzt man unter Kühlen mit Eis und unter Rühren mit wässrigem 2 n NaOH bis zum pH 7,5. Hierauf versetzt man die Lösung unter Rühren allmählich mit 0,360 g (1,44 mMol) N-Benzyloxycarbonyl--L-asparaginsäureanhydrid, wobei man den pH-Wert durch Zugabe von wässrigem 2 n NaOH auf 7,0 bis 7,5 hält. Nach beendeter Zugabe rührt man das Gemisch noch 2 Stunden und versetzt dann mit wässrigem 1 n HCl bis zum pH 6. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert, mit 50 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 0,416 g einer Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L--asparaginylphenylalaninmethylester (Gemisch aus 86% N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-(C0)-L-phenylalanin-methylester und 14% N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl--(C^-L-phenylalaninmethylester) und L-Phenylalaninmethylester (1 : 1) vom F. 108 bis 115°C. Durch die Reaktion entsteht eine erhebliche Menge N-Benzyloxycarbonyl-L-aspara-ginyl-C/;-L-phenylalaninmethylester, der grösste Teil der Verbindung verbleibt jedoch im Filtrat und im Waschwasser.
In einem 12 ml fassenden Becherglas werden 0,200 g (0,329 mMol) der erhaltenen Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-(CK und C^-L-phenyl-alaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester zu 1,7 ml (0,7 mMol) wässrigem 0,4 n HCl unter Rühren hinzugefügt. Hierauf wird das Reaktionsgemisch weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.
Der erhaltene weisse Niederschlag wird abfiltriert, mit
3 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 0,136 g (Ausbeute 96,3%) Kristalle des N-Benzyloxycarbo-nyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylesters (enthaltend
17 % N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyI-C„-L-phenylalanin-methylester) vom F. 110 bis 118°C.
Beispiel 29
In einem 30 ml fassenden Kolben werden 0,543 g (2 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure und 0,918 g (4 mMol) L-Phenylalaninäthylester-hydrochlorid in 5 ml Wasser gelöst. Hierauf versetzt man mit wässriger Lösung
4 n NaOH bis zum pH 6.
Die erhaltene Lösung wird mit 50 mg Thermolysin versetzt. Das erhaltene Gemisch wird dann bei 38 bis 40°C über Nacht geschüttelt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit 30 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 0,913 g Kristalle vom F. 85 bis 90°C.
Bei dem Produkt handelt es sich um die Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenyl-alaninäthylester und L-Phenylalaninäthylester (1 : 1).
Das Produkt wird aus einem Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat und n-Hexan umkristallisiert. Die physikalischen Eigenschaften und die Ergebnisse der Elementaranalyse sind nachfolgend angegeben.
F. 93-95°C
[a]D25: + 6,0 (C = 1, Methanol)
Elementaranalyse: C34H41N309
berechnet: C 64,23 H 6,50 N 6,61 gefunden: C 64,50 H 6,56 N 6,63 IR- und NMR-Daten zeigen, dass es sich bei dem Reaktionsprodukt um die Additionsverbindung der Formel I handelt, in der Rj, R2, R3 und n eine Benzyloxycarbonylgruppe, Benzylgruppe, Äthoxygruppe bzw. den Wert 1 bedeuten.
In einem 30 ml fassenden Kolben werden 0,125 g (0,197 mMol) der erhaltenen Additionsverbindung aus N-Benzyl-oxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninäthylester und L-Phenylalaninäthylester mit 2 ml Wasser und 0,24 ml 1 n HCl (0,24 mMol) vermischt. Das erhaltene Gemisch wird 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Nach Filtrieren der erhaltenen Aufschlämmung wird das Produkt mit 5 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 0,0807 g Kristalle des N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
637914
14
-L-phenylalaninäthylesters mit einer Reinheit von 100% und einer Ausbeute von 92,6%. Diese Kristalle werden aus Äthylacetat/n-Hexan umkristallisiert. Die physikalischen Eigenschaften und die Ergebnisse der Elementaranalyse des erhaltenen Produkts sind nachfolgend angegeben. F. 128-135°C
[a]D25: - 17,3 (C = 1, Methanol)
Elementaranalyse: C23H26N207
berechnet: C 62,43 H 5,92 N 6,33
gefunden: C 62,82 H 5,96 N 6,40
Beispiel 30
5,00 g (16,82 mMol) N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl-L--asparaginsäure und 7,26 g (33,64 mMol) L-Phenylalanin-methylester-hydrochlorid werden in einem 100 ml fassenden Kolben durch Zugabe von wässrigem 1 n NaOH gelöst. Der pH wird auf einen Wert von 6,0 eingestellt.
Die erhaltene Lösung wird mit 2,0 g Thermolysin und 0,4 g Potato-Inhibitor vermischt und dann 5 Stunden bei 38 bis 40°C geschüttelt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit 100 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 8,11 g Kristalle vom F. 88 bis 92°C. Die Ausbeute beträgt 75,6% als Additionsverbindung von N-p--Methoxy-benzyloxycarbonylasparaginyl-phenylalaninme-thylester und Phenylalaninmethylester (1 : 1).
Das Produkt wird aus Äthylacetat/n-Hexan umkristallisiert. Die physikalischen Eigenschaften und die Ergebnisse der Elementaranalyse der erhaltenen Kristalle sind im wesentlichen identisch mit denjenigen der in Beispiel 26 hergestellten Additionsverbindung.
0,3 g der Additionsverbindung aus N-p-Methoxybenzyl-oxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester werden in einem 20 ml fassenden Kolben in 3 ml Aceton gelöst. Nach Zugabe von 2 ml 2,4 n HCl lässt man 1 Stunde bei 60°C reagieren.
Ein Teil des Reaktionsgemisches wird mit Wasser, wässrigem 1,2 n NaHC03 und Cyclohexanon als innerem Standard zu einer Probe vermischt. Die Umwandlung zu a-L--Asparaginyl-L-phenylalaninmethylester wird durch Hochge-schwindigkeits-Flüssigchromatographie bestätigt. Die Ausbeute beträgt 72,7%.
Beispiel 31
0,3 g der in Beispiel 30 erhaltenen Additionsverbindung aus N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenyl-alaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester werden in einem 20 ml fassenden Kolben vorgelegt.
Gemäss Beispiel 30, jedoch unter Verwendung von Dioxan anstelle von Aceton, werden die Zersetzung der Additionsverbindung und die Analyse des Produkts durchgeführt.
Die Ausbeute an a-L-Asparaginyl-L-phenylalaninmethyl-ester beträgt 73,0%.
Beispiel 32
Beispiel 31 wird unter Verwendung von Methanol anstelle von Dioxan wiederholt. Die Ausbeute an a-L-Aspara-ginyl-L-phenylalaninmethylester beträgt 63,3%.
Beispiel 33
Beispiel 31 wird unter Verwendung von N,N-Dimethyl-formamid anstelle von Dioxan wiederholt. Die Ausbeute an a-L-Asparaginyl-L-phenylalaninmethylester beträgt 28,1%.
Beispiel 34
Beispiel 31 wird wiederholt, wobei jedoch 4 ml Dioxan, 1 ml einer HCl-Dioxan-Lösung (5,3 n) und Triäthylamin als Neutralisationsmittel, anstelle von 3 ml Dioxan, 2 ml 2,4 n HCl bzw. wässrigem 1,2 n NaHC03 Verwendung finden. Die
Ausbeute an «-L-Asparaginyl-L-phenylalaninmethylester beträgt 98,6%.
Beispiel 35
Beispiel 34 wird wiederholt, wobei jedoch die Reaktionsbedingungen 20 Minuten bei 90°C anstelle von 1 Stunde bei 60°C betragen. Die Ausbeute an a-L-Asparaginyl-L-phe-nylalaninmethylester beträgt 88,5%.
Beispiel 36
Beispiel 34 wird wiederholt, wobei jedoch 4,5 ml Dioxan und 0,5 ml HCl-Dioxan-Lösung (5,3 n) anstelle von 4 ml bzw. 1 ml verwendet werden, und wobei man die Umsetzung bei 90°C anstelle von 60°C durchführt. Die Ausbeute an a-L-Asparaginyl-L-phenylalaninmethylester beträgt 84,4%.
Beispiel 37
Beispiel 34 wird wiederholt, wobei jedoch 3 ml Dioxan und 2 ml HCl-Dioxan-Lösung (5,3 n) anstelle von 4 ml bzw. 1 ml verwendet werden, und wobei die Reaktionsbedingun-gen 120 Minuten bei 30°C anstelle von 1 Stunde bei 60°C betragen. Die Ausbeute an a-L-Asparaginyl-L-phenylalanin-methylester beträgt 98,6 %.
Beispiel 38
Das Verfahren von Beispiel 34 wird wiederholt, wobei jedoch 4,5 ml Dioxan und 0,5 ml 60%ige Perchlorsäure anstelle von 4 ml Dioxan bzw. 1 ml der HCl-Dioxan-Lösung (5,3 n) Verwendung finden. Die Ausbeute an a-L-Asparginyl--L-phenylalaninmethylester beträgt 65,5%.
Beispiel 39
Beispiel 34 wird wiederholt, wobei jedoch 4,85 ml Dioxan und 0,15 ml konzentrierte Schwefelsäure anstelle von 4 ml Dioxan und 1 ml der HCl-Dioxan-Lösung (5,3 n) verwendet werden. Die Ausbeute an a-L-Asparaginyl-L-phenyl-alaninmethylester beträgt 89,9%.
Beispiel 40
0,3 g der Additionsverbindung aus N-p-Methoxybenzyl-oxacarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester (1 : 1), hergestellt in Beispiel 30, werden in 2 ml Dioxan gelöst. Nachdem man mit 3 ml Tri-fluoressigsäure versetzt hat, lässt man 1 Stunde bei 60°C reagieren.
Nachdem man das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck eingedampft hat, versetzt man einen Teil hiervon mit Wasser, Triäthylamin und Cyclohexanon als innerem Standard. Die erhaltene Probe wird der Analyse mittels Hoch-geschwindigkeits-Flüssigchromatographie unterworfen. Die Ausbeute an a-L-Asparaginyl-L-Phenylalaninmethylester beträgt 96,4%.
Beispiel 41
1,000 g der Additionsverbindung aus N-p-Methoxy-benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester (1:1), erhalten in Beispiel 30, 14 ml Dioxan und 4 ml HCl-Dioxan-Lösung (5,3 n) werden in einem 50 ml fassenden Kolben 1 Stunde bei 60°C gerührt. Nachdem man das Dioxan aus dem Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck abdestilliert hat, versetzt man den öligen Rückstand mit 6 ml Wasser und 20 ml Diäthyläther unter Rühren. Anschliessend werden die beiden Phasen getrennt. Die wässrige Phase wird zusätzlich mit 10 ml Diäthyläther versetzt, um das Produkt in ähnlicher Weise, wie vorstehend beschrieben, zu extrahieren. Die letzte Extraktion wird 3mal wiederholt.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
15
637914
Die Diäthylätherphasen werden gesammelt, hierauf 2mal mit 5 ml einer 5%igen wässrigen Natriumhydrogencarbonat-Iösung gewaschen und dann mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Abdestillieren des Diäthyläthers unter vermindertem Druck erhält man 0,176 g (Ausbeute 81,2% an rohem Anisalkohol.
Die wässrige Phase wird mit 7%igem wässrigem Natriumhydroxid bis pH 6 neutralisiert und dann bei etwa 5°C über Nacht gehalten. Die erhaltenen ausgeschiedenen Kristalle werden abfiltriert, mit 2 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 0,316 g (Ausbeute 68,5%) rohen L-Asparaginyl-L-phenylalaninmethylester.
Das Filtrat mit der Waschwasserfraktion wird mit 7 %-igem wässrigem NaOH bis zum pH 9 versetzt; das Produkt wird hierauf mit 15 ml Dichlormethan 3mal extrahiert. Die Dichlormethanphasen werden gesammelt, mit 5 ml Wasser gewaschen und dann mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet.
Nach dem Abdestillieren des Dichloräthans unter vermindertem Druck erhält man 0,234 g (Ausbeute 83,4%) rohen L-Phenylalaninmethylester.
Beispiel 42
1,189 g (4 mMol) N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl-L--Asparaginsäure und 1,837 g (8 mMol) L-Phenylalaninäthyl-ester-hydrochlorid werden in einem 30 ml fassenden Kolben durch Zugabe von wässrigem 1 n NaOH bis zum pH-Wert 6,0 gelöst.
Hierauf versetzt man mit Wasser bis zu einer Gesamtmenge von 15 ml. Nachdem man die erhaltene Lösung mit 0,1 g Thermolysin versetzt hat, wird das Gemisch 7 Stunden bei 38 bis 40°C gerührt.
Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert, mit 30 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 2,401 g (Ausbeute 90,2%) der Additionsverbindung aus N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenyl-alaninäthylester und L-Phenylalaninäthylester (1 : 1). Dies wird durch die nachfolgend angegebenen Analysendaten bestätigt.
Das Produkt wird aus einem Lösungsmittelgemisch aus Methanol und Diäthyläther umkristallisiert. Die physikalischen Eigenschaften und die Ergebnisse der Elementaranalyse sind nachfolgend angegeben.
F. 82-87°C
[a] t)25: + 6,0 (C = 1, Methanol)
Elementaranalyse: C35H43N3O10
berechnet: C 63,14 H 6,51 N 6,31
gefunden: C 63,52 H 6,57 N 6,54
Diese IR- und NMR-Daten zeigen, dass es sich bei dem Produkt um die Additionsverbindung der Formel I handelt, in der Rj, R2, R3 und n eine p-Methoxybenzyloxycarbonyl-gruppe, Benzylgruppe, Äthoxygruppe bzw. den Wert 1 bedeuten.
Beispiel 34 wird wiederholt, wobei jedoch die erhaltene Additionsverbindung anstelle der Additionsverbindung aus N-p-Methoxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethyl-ester mit L-Phenylalaninmethylester verwendet wird. Hierbei erhält man den L-Asparaginyl-L-phenylalaninäthylester. Die Ausbeute an a-L-Asparaginyl-L-phenylalaninäthylester beträgt 95,5%.
Beispiel 43
1,189 g (4 mMol) N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl-L--asparaginsäure und 1,725 g (8 mMol) DL-Phenylalaninme-thylester-hydrochlorid werden in einem 30 ml fassenden Kolben durch Zugabe von wässrigem 1 n NaOH bis zum pH-Wert 6,0 gelöst. Hierauf versetzt man mit Wasser bis zu einer Gesamtmenge von 15 ml. Nachdem man die erhaltene Lösung mit 0,1 g Thermolysin vermischt hat, wird das Gemisch 50 Minuten bei 38 bis 40°C gerührt.
Der Niederschlag wird abfiltriert, mit 30 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 2,109 g Kristalle vom F. 119 bis 128°C. Das Produkt wird aus einem Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat und n-Hexan umkristallisiert und dann 7 Stunden unter vermindertem Druck bei 80°C getrocknet. Bei dem Produkt handelt es sich um die Additionsverbindung aus N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl-L--asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und D-Phenylalanin-methylester (1 : 1) in Form des Halbhydrats. Dies wird durch die nachfolgend angegebenen Analysendaten bestätigt. F. 131 bis 133°C [a]D25: — 4,2 (C = 1, Methanol)
Elementaranalyse: (C33H39N3O10. ^ H20)
berechnet: C 61,29 H 6,23 N 6,50 gefunden: C 61,50 H 6,12 N 6,49 Das IR- und NMR-Spektrum zeigen die gleichen charakteristischen Merkmale wie bei der Additionsverbindung der Formel I, hergestellt in Beispiel 26, in der R1( R2, R3 und n eine p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe, Benzylgruppe, Methoxygruppe bzw. den Wert 1 bedeuten, wobei jedoch die Absorptionen infolge der Protonen des Wassers und infolge der Protonen der -NH- und NH3+-Gruppen nach 4,1 ppm verschoben sind, und zwar wegen der durch die Anwesenheit von Wasser verursachten Störungen, weil das Produkt Kristallwasser enthält, wie nachfolgend dargelegt. 1,5024 g des Produkts werden zur Trocknung dieser Probe 12 Minuten in einem Mikrowellenerhitzer mit einer Frequenz von 2,45 GHz und einer Leistung von 1,2 kW bestrahlt. Hierdurch vermindert sich das Gewicht der Probe auf 1,48152 g. Der Trocknungsverlust beträgt somit 0,02091 g.
Die Elementaranalyse der bestrahlten Probe bringt folgendes Ergebnis: für C33H39N3O10
berechnet: C 62,15 H 6,16 N 6,69 gefunden: C 62,07 H 6,17 N 6,69 Das IR- und NMR-Spektrum der bestrahlten Probe besitzt die gleichen charakteristischen Merkmale wie bei der Additionsverbindung der Formel I, hergestellt in Beispiel 26. 1,0 g der bestrahlten Probe werden mit 4 ml Wasser und
2 ml 1 n HCl vermischt. Das erhaltene Gemisch wird hierauf
3 Minuten bei 60°C gemischt. Nach der Fest-Flüssig-Tren-nung der erhaltenen Aufschlämmung isoliert man den N-p--Methoxycarbonyl-L-phenylalaninmethylester und den D-Phe-nylalaninmethylester im Molverhältnis 1 : 1 aus der festen bzw. der flüssigen Phase.
Beispiel 34 wird wiederholt, wobei jedoch 0,3 g der erhaltenen Additionsverbindung (Halbhydrat anstelle der in Beispiel 30 erhaltenen Verbindung) verwendet werden. Die Ausbeute an a-L-Asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und D-Phenylalaninmethylester beträgt 95,9%.
Beispiel 44
0,3 g der Additionsverbindung aus N-p-Methoxybenzyl-oxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester (1 : 1), hergestellt in Beispiel 30, werden in 10 ml HCl-Chloroform-Lösung (0,31 n) gelöst. Hierauf lässt man 2 Stunden bei 60°C reagieren. Nach Abdestillieren der flüssigen Bestandteile unter vermindertem Druck versetzt man den Rückstand mit Wasser, Triäthylamin und Cyclohexanon als innerem Standard. Die erhaltene Probe wird der Analyse mittels Hochgeschwindigkeits-Flüs-sigchromatographie unterworfen. Die Ausbeute an a-L--Asparaginyl-L-phenylalaninmethylester beträgt 94,3%.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
V
Claims (4)
1
O
NH O
20
H OC - (CH2 )n- CH - COH
mit einem Aminocarbonsäureester der Formel (V)
O
(IV)
25
H2N—CH—C—R3
(V)
R*
(in)
in wässrigem Medium in Gegenwart einer Protease in einem 30 pH- Bereich, in dem die Protease enzymatisch aktiv ist, zur Bildung der Additionsverbindung umsetzt und diese abtrennt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man als wässriges Medium eine wässrige Lösung verwendet.
35 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 und 12, dadurch gekennzeichnet, dass man die N-substituierte Monoaminodicarbonsäure und den Aminocarbonsäureester in einem Molverhältnis von 5 : 1 bis 1: 5 der Reaktion in einer Konzentration beider Ausgangsverbindungen von 0,1- bis 40 4molar, bezogen auf das Reaktionsmedium, unterwirft.
14. Verfahrennach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass man als Protease eine Metallo-protease verwendet.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeich-45 net, dass man die Metalloprotease in einer Menge von 2 bis
400 mg, pro mMol N-substituierte Monoaminodicarbonsäure und Aminocarbonsäureester, verwendet.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass man die Umsetzung bei einem
50 pH-Wert von 5 bis 8 und Temperaturen im Bereich von 20 Isis 50°C durchführt.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass man als wässriges Medium eine wässrige Lösung verwendet, in dem die N-substituierte Mo-
55 noaminodicarbonsäure und der Aminocarbonsäureester in einem Molverhältnis von 5 : 1 bis 1 : 5, bei Konzentrationen beider Ausgangsverbindungen von 0,1- bis 4molar, bezogen auf das Reaktionsmedium, vorliegen, als Protease eine Metalloprotease in einer Menge von 2 bis 400 mg, pro mMol 60 der beiden Ausgangsverbindungen, verwendet, und die Umsetzung bei Temperaturen von 20 bis 50°C in einem pH-Bereich von 5 bis 8 durchführt.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass man sowohl die N-substituierte
65 Monoaminodicarbonsäure als auch den Aminocarbonsäureester in L-Form einsetzt.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass man die N-substituierte Mono-
2. Additionsverbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Rn eine Benzyloxycarbonylgruppe, R2 eine Benzylgruppe und R3 eine Methoxygruppe bedeuten und n den Wert 1 hat.
2
PATENTANSPRÜCHE 1. Dipeptid-Aminosäureester-Additionsverbindung der Formel (I)
O
O
nho
O
Ii r3 -c -c h-nh2 °hoc-(ch2 )n-c h-c -nh-c h-c -r3
(I)
R2
r2
in der
R1 eine aliphatische Oxycarbonylgruppe, Benzyloxycar-bonylgruppe, die kernsubstituiert sein kann, eine Benzoyl-gruppe, aromatische Sulfonylgruppe oder aromatische Sulfi-nylgruppe bedeutet,
R2 eine Methyl-, Isopropyl-, Isobutyl-, Isoamyl- oder Benzylgruppe ist,
R3 eine Niederalkoxy-, Benzyloxy- oder Benzhydryloxy-gruppe darstellt und n den Wert 1 oder 2 hat.
3
637914
aminodicarbonsäure und den Aminocarbonsäureester in L-Form bzw. DL-Form einsetzt.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass man die N-substituierte Monoaminodicarbonsäure und den Aminocarbonsäureester in DL-Form bzw. L-Form einsetzt.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass man sowohl die N-substituierte Monoaminodicarbonsäure als auch den Aminocarbonsäureester in DL-Form einsetzt.
22. Verfahren zur Zersetzung der Additionsverbindungen der Formel I nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Additionsverbindung der Behandlung mit einer wäss-rig-sauren Lösung unterwirft und einen Dipeptidester der Formel (VI)
HOG-(CH0) -CH-G-NH-CH-C-Rz ^ 2 n , 3
als feste Komponente abtrennt.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass man als wässrig-saure Lösung eine Lösung aus Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Ameisensäure, Essigsäure, Citronensäure oder Toluolsulfonsäure, jeweils in einer Menge von 1 bis 20 Mol-Äquivalent, bezogen auf die Molmenge der verwendeten Additionsverbindung, anwendet.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 und 23, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Additionsverbindung mit dem Grundbaustein der Formel (III)
O
I!
R3—C—CH—NH2. (III)
R*
in D-Form oder in D-Form und L-Form verwendet, und auch einen Aminosäureester der Formel
O
II
R3—C—CH—NH2
; i r2
in D-Form oder in D-Form und L-Form isoliert.
25. Verfahren zur Zersetzung von Additionsverbindungen der Formel (I) nach Anspruch 1, in welcher Rj eine p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe ist, dadurch gekennzeichnet, dass man die Additionsverbindung in einem flüssigen Medium löst, die Additionsverbindung in dem flüssigen Medium mit einer Säure zur Zersetzung in Berührung bringt, und aus dem Reaktionsmedium einen Peptidester der Formel (VII)
0 NH20 0
HOC-(CH2)n-CH-C-NH-CH-C-R5 <VI1)
in der R2, R3 und n die gleiche Bedeutung wie in Formel (I) haben, isoliert.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass man als flüssiges Medium ein Keton, ein Sauerstoff enthaltendes organisches Lösungsmittel, einen chlorierten niederen Kohlenwasserstoff, ein nicht-protonisches polares organisches Lösungsmittel, eine flüssige organische Carbonsäure, oder ein Gemisch hiervon, und als Säure eine Br0nstedtsäure verwendet.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 und 26, dadurch gekennzeichnet, dass man das flüssige Medium in einer Menge von 20 bis 100 Gewichtsteilen, bezogen auf ein Gewichtsteil der Additionsverbindung, und die Säure in einer Menge von mindestens 2 Mol-Äquivalenten, bezogen auf ein Mol der Additionsverbindung, verwendet und die Reaktion bei Temperaturen von 20 bis 100°C durchführt.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 und 27, dadurch gekennzeichnet, dass man als Bronstedtsäure Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Perchlorsäure, Trifluoressigsäure oder p-Toluol-sulfonsäure verwendet.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Additionsverbindung der Formel I verwendet, in der R3 eine Methoxy- oder Äthoxygruppe ist und n den Wert 1 hat.
Es ist bekannt, dass Proteasen, wie Papain und Chymo-trypsin, zum Aufbau von Peptidbindungen als Umkehrreaktion der Proteinzersetzung Verwendung finden. So erfolgte z.B. nach Bergmann die Herstellung von Aniliden unter Verwendung von Papain, und die Peptidsynthesen unter Verwendung von Monoaminomonocarbonsäuren, wie Leucin mit N-ständiger Benzoylschutzgruppe und Leucin und Glycin, beide mit C-ständiger Amid- oder Anilidschutzgruppe, gelang Fruton mit Papain und Chymotrypsin (Advances in Protein Chemistry, Bd. 5, S. 33 (1949), Academic Press Inc. New York, N.Y.).
Kürzlich wurde von Peptidsynthesen unter Verwendung von Aminosäuren mit N-ständiger Benzyloxycarbonylschutz-gruppe und Aminosäuren mit C-ständiger Estergruppe mit Enzymen, wie Papain, Prolisin, Subtilisin BPN', usw. berichtet (Abstracts of the 35th Autumn Conference of the Chemical Society of Japan, S. 482 und 486 (1976).
In diesen Verfahren werden die Produkte in wässrigem Medium als wasserunlösliche Produkte abgeschieden, die durch den Verlust wasserlöslicher Gruppen entstehen (dies ist erforderlich, um die reversible Reaktion in Richtung der Peptidbildung zu zwingen). Wenn demgemäss eine wasserlösliche Gruppe in dem Reaktionsprodukt noch erhalten bleiben soll, wie dies z.B. der Fall ist, wenn man die Aminosäuren mit einer zweiten Carboxylgruppe in der Seitenkette (z.B. Asparaginsäure oder Glutaminsäure) als Ausgangsverbindung verwendet, scheint es erwünscht zu sein, die wasserlösliche Gruppe der Ausgangsverbindung mit einer weniger hydrophilen Schutzgruppe zu maskieren.
Erfindungsgemäss wurde nun gefunden, dass bei Verwendung von Monoaminodicarbonsäuren, wie Asparaginsäure und Glutaminsäure, die eine N-ständige Schutzgruppe besitzt, als Ausgangsverbindungen die erhaltenen Dipeptide selbst jedoch nicht abgeschieden werden, und dass bei Wahl bestimmter Aminosäuren mit einer C-ständigen Estergruppe (Aminocarbonsäureester) als andere Ausgangsverbindungen die Abscheidung von Additionsverbindungen aus den Di-peptiden, bei denen es sich um enzymatische Reaktionsprodukte handelt, und den Aminosäureestern erfolgt.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
637914
3. Additionsverbindung nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Grundbaustein der Formel (II)
O
Ri i *
. NH O
O
HOC-(CH2)n-CH-C-NH-CH-C-R3
(ii)
R:
in LL-Form vorliegt.
4. Additionsverbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Grundbaustein der Formel (III)
O
Rs—C—CH—NH2 .
(III)
R,
in L-Form vorliegt.
5. Additionsverbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Grundbaustein der Formeln (III)
O
Rs—C—CH—NHa. Rs
(iii)
in D-Form vorliegt.
6. Additionsverbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Grundbaustein der Formel (III)
O
R,—C—CH—NH,.
r,
überwiegend in D-Form und L-Form vorliegt.
7. Additionsverbindung nach einem der Ansprüche 1 und 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass Rj eine Benzyloxy-carbonyl- oder p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe bedeutet,
R2 eine Benzylgruppe ist und R3 eine Methoxy-, oder Äthoxy-gruppe darstellt.
8. Additionsverbindung nach einem der Ansprüche 1 und 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass n den Wert 1 hat. 5 9. Additionsverbindung nach einem der Ansprüche 1 und 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass n den Wert 2 hat.
10. Additions Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass Ri eine Benzyloxycarbonylgruppe ist und R3 die Methoxygruppe bedeutet, io 11. Verfahren zur Herstellung der Additionsverbindun-gen der Formel (I) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine N-substituierte Monoaminodicarbonsäure der Formel (IV)
15
R I
4
Es ist bekannt, dass Peptidderivate verschiedene physiologische Aktivitäten besitzen, und diese Peptidderivate können nach verschiedenen Methoden hergestellt werden. Die Peptide mit einem sauren Aminosäurerest, wie a-L-Aspara-ginylphenylalanin-niederalkylester, die sich als Süssmittel eignen, können aus einer Vorstufe mit einer Benzyloxycar-bonylgruppe als N-ständige Schutzgruppe durch Abspaltung der Schutzgruppe erhalten werden.
Die Peptide mit N-ständiger Schutzgruppe, wie N-Ben-zyloxycarbonyl-L-a-glutamylphenylalanin-niederalkylester, können leicht zu Peptiden mit freien C-ständiger Carboxyl-gruppe hydrolysiert werden, und diese hydrolysierten Peptide werden als Substrate zur Messung der enzymatischen Aktivität von Carboxypeptidasen verwendet.
Die N-geschützten oder -ungeschützten Dipeptidester können durch Umsetzung von sauren Aminosäureanhydriden mit einer geschützten oder ungeschützten Aminogruppe mit Aminosäurealkylestern erhalten werden (bekanntgemachte JA-PA 14217/74 und JA-OS 61451/73, 76835/73, 58025/75 und 71642/75).
Die gewünschten Dipeptidester können jedoch nicht in einfacher Weise nach den üblichen Verfahren erhalten werden, da nach diesen Verfahren neben den gewünschten Di-peptidestern zwangsläufig auch Dipeptidester mit Peptidbin-dungen an den seitenständigen Carboxylgruppen der sauren Aminosäuren entstehen.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP727977A JPS5392729A (en) | 1977-01-27 | 1977-01-27 | Adduct of dipeptide derivatives and amino acid derivatives and process for their preparation |
| JP52057036A JPS585038B2 (ja) | 1977-05-19 | 1977-05-19 | ジペプチドエステルの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CH637914A5 true CH637914A5 (de) | 1983-08-31 |
Family
ID=26341557
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CH35378A CH637914A5 (de) | 1977-01-27 | 1978-01-13 | Dipeptid-aminosaeureester-additionsverbindungen und verfahren zu ihrer herstellung bzw. zersetzung. |
| CH719382A CH643532A5 (de) | 1977-01-27 | 1982-12-10 | Verfahren zur herstellung eines dipeptidesters. |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CH719382A CH643532A5 (de) | 1977-01-27 | 1982-12-10 | Verfahren zur herstellung eines dipeptidesters. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US4165311A (de) |
| CA (1) | CA1101845A (de) |
| CH (2) | CH637914A5 (de) |
| DD (1) | DD136737A5 (de) |
| DE (2) | DE2801238C2 (de) |
| FR (1) | FR2378747A1 (de) |
| GB (1) | GB1548553A (de) |
| IT (1) | IT1091982B (de) |
| NL (1) | NL190413C (de) |
| UA (1) | UA8373A1 (de) |
Families Citing this family (39)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2801238C2 (de) | 1977-01-27 | 1986-06-05 | (Zaidanhojin) Sagami Chemical Research Center, Tokio/Tokyo | Verfahren zur Herstellung von Salzen aus L,L-Dipeptiden und Phenylalaninestern |
| JPS5411294A (en) * | 1977-05-23 | 1979-01-27 | Toyo Soda Mfg Co Ltd | Recovery of protease |
| JPS5411293A (en) * | 1977-05-23 | 1979-01-27 | Toyo Soda Mfg Co Ltd | Recovery of protease |
| JPS55135595A (en) * | 1979-04-03 | 1980-10-22 | Toyo Soda Mfg Co Ltd | Preparation of dipeptide |
| US4293706A (en) * | 1980-06-19 | 1981-10-06 | Ppg Industries, Inc. | Preparation of N-benzyloxycarbonyl aspartic acid |
| IE52242B1 (en) * | 1981-02-02 | 1987-08-19 | Searle & Co | Preparation of amino protected-l-aspartyl-l-phenylalanine alkyl ester |
| US4820729A (en) * | 1981-03-30 | 1989-04-11 | Rorer Pharmaceutical Corporation | N-substituted-amido-amino acids |
| DE3274985D1 (en) * | 1981-09-21 | 1987-02-12 | Toyo Soda Mfg Co Ltd | Process for recovering a dipeptide derivative |
| JPS5917997A (ja) * | 1982-07-23 | 1984-01-30 | Toyo Soda Mfg Co Ltd | ジペプチドエステルとアミノ酸エステルとの付加化合物の製造方法 |
| JPS5928493A (ja) * | 1982-08-06 | 1984-02-15 | Toyo Soda Mfg Co Ltd | アスパルチルフエニルアラニンアルキルエステルの製造法 |
| US5055399A (en) * | 1985-01-15 | 1991-10-08 | Genentech, Inc. | Enzymatic synthesis of alpha-L-aspartyl-L-phenyalanine lower alkyl esters |
| DE3532027A1 (de) * | 1985-09-09 | 1987-03-19 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von aspartam und mittel zu seiner durchfuehrung |
| US4810817A (en) * | 1985-10-21 | 1989-03-07 | W. R. Grace & Co. | Aspartyl-beta substituted phenylalanine dipeptides |
| US4873359A (en) * | 1985-10-21 | 1989-10-10 | W. R. Grace & Co. - Conn. | Process for preparing as partyl-phenylalanine dipeptides |
| FR2589479B1 (fr) * | 1985-11-05 | 1988-02-05 | Hoechst France | Nouvel enzyme, son procede d'obtention et son application a la preparation de n-(l-aspartyl-1)l-phenylalaninate de methyle |
| FR2589480B1 (fr) * | 1985-11-05 | 1988-09-16 | Hoechst France | Procede biologique de preparation de n-(n-benzyloxycarbonyl l-aspartyl-1) l-phenylalaninate de methyle |
| US4935355A (en) * | 1986-04-15 | 1990-06-19 | Synthetech, Inc. | Preparation of dipeptides |
| GB8621377D0 (en) * | 1986-09-04 | 1986-10-15 | Celltech Ltd | Enzymatic process |
| US5002872A (en) * | 1989-05-10 | 1991-03-26 | W. R. Grace & Co.-Conn. | Enzyme mediated coupling reactions |
| US5366862A (en) * | 1990-02-14 | 1994-11-22 | Receptor Laboratories, Inc. | Method for generating and screening useful peptides |
| DD295165A5 (de) * | 1990-06-13 | 1991-10-24 | ���������`��������`����@����k�� | Verfahren zur herstellung von peptiden |
| UA27035C2 (uk) | 1990-08-03 | 2000-02-28 | Вертекс Фармас'Ютікалс Інкорпорейтід | Кристал білка, зшитого багатофуhкціоhальhим зшивальним агеhтом (варіаhти), пристрій, що містить кристал білка та спосіб отримаhhя аспартаму |
| KR930002966B1 (ko) * | 1990-11-24 | 1993-04-16 | 주식회사 미 원 | 디펩티드의 제조방법 |
| EP0536671B1 (de) * | 1991-10-07 | 1996-03-06 | Hoechst Aktiengesellschaft | Carbonsäureester-Schutzgruppen, ein Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Kopplung an eine funktionelle Gruppe sowie ihre Verwendung |
| TW306932B (de) * | 1993-08-27 | 1997-06-01 | Holland Sweetener Co | |
| NL9400092A (nl) * | 1994-01-20 | 1995-09-01 | Holland Sweetener Co | Enzymatische koppeling van L-fenylalaninemethylester en N-benzyloxycarbonyl-asparaginezuur. |
| CA2189646C (en) * | 1994-06-24 | 1999-05-25 | Francis E. Dwulet | A purified mixture of collagenases and two other proteases obtained from clostridium histolyticum |
| DE69613305T2 (de) * | 1995-10-11 | 2002-05-02 | Holland Sweetener Co. V.O.F., Maastricht | Verbesserte enzymatische Kupplungsreaktion von N-geschützte L-Asparaginsäure und Phenylalaninmethylester |
| US5989888A (en) * | 1996-01-24 | 1999-11-23 | Roche Diagnostics Corporation | Purified mixture of collagenase I, collagenase II and two other proteases |
| US5830741A (en) * | 1996-12-06 | 1998-11-03 | Boehringer Mannheim Corporation | Composition for tissue dissociation containing collagenase I and II from clostridium histolyticum and a neutral protease |
| JP2005040037A (ja) * | 2003-07-25 | 2005-02-17 | Ajinomoto Co Inc | ジペプチドの製造方法、それに用いるペプチド生成酵素、およびペプチド生成酵素の製造方法 |
| DE102006047617B4 (de) * | 2006-10-09 | 2008-11-27 | Clariant International Limited | Verfahren zur Herstellung basischer (Meth)acrylamide |
| DE102008017216B4 (de) * | 2008-04-04 | 2013-08-14 | Clariant International Ltd. | Kontinuierliches Verfahren zur Herstellung von Fettsäureamiden |
| DE102009031057A1 (de) * | 2009-06-30 | 2011-01-05 | Clariant International Ltd. | Kontinuierliches Verfahren zur Herstellung von Amiden aliphatischer Carbonsäuren |
| DE102009031059A1 (de) | 2009-06-30 | 2011-01-05 | Clariant International Ltd. | Vorrichtung zur kontinuierlichen Durchführung chemischer Reaktionen bei hohen Temperaturen |
| DE102009042523B4 (de) | 2009-09-22 | 2012-02-16 | Clariant International Ltd. | Vorrichtung und Verfahren zur kontinuierlichen Durchführung heterogen katalysierter chemischer Reaktionen bei hohen Temperaturen |
| DE102009042522A1 (de) | 2009-09-22 | 2011-04-07 | Clariant International Ltd. | Kontinuierliches Umesterungsverfahren |
| DE102010056564A1 (de) | 2010-12-30 | 2012-07-05 | Clariant International Limited | Hydroxylgruppen und Estergruppen tragende Polymere und Verfahren zu ihrer Herstellung |
| DE102010056565A1 (de) | 2010-12-30 | 2012-07-05 | Clariant International Ltd. | Verfahren zur Modifizierung Hydroxylgruppen tragender Polymere |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3786039A (en) | 1969-04-30 | 1974-01-15 | Ajinomoto Kk | Method of producing alpha-l-aspartyl-l-phenylalanine lower alkyl esters |
| CH553751A (de) * | 1970-05-19 | 1974-09-13 | Stamicarbon | Verfahren zur herstellung von aspartylaminosaeure-estern. |
| CH508590A (fr) * | 1970-10-29 | 1971-06-15 | Ajinomoto Kk | Procédé de préparation des esters d'alcoyle inférieurs de l'a-L-aspartyl-L-phénylalanine |
| US3853835A (en) * | 1970-11-12 | 1974-12-10 | Searle & Co | Alkyl esters of aspartyl aliphatic amino acid dipeptides |
| US3972773A (en) * | 1975-04-29 | 1976-08-03 | Sagami Chemical Research Center | Process for producing peptide |
| DE2801238C2 (de) | 1977-01-27 | 1986-06-05 | (Zaidanhojin) Sagami Chemical Research Center, Tokio/Tokyo | Verfahren zur Herstellung von Salzen aus L,L-Dipeptiden und Phenylalaninestern |
-
1978
- 1978-01-12 DE DE2801238A patent/DE2801238C2/de not_active Expired
- 1978-01-12 DE DE2857828A patent/DE2857828C2/de not_active Expired - Lifetime
- 1978-01-13 CH CH35378A patent/CH637914A5/de not_active IP Right Cessation
- 1978-01-16 GB GB1646/78A patent/GB1548553A/en not_active Expired
- 1978-01-17 US US05/870,108 patent/US4165311A/en not_active Expired - Lifetime
- 1978-01-23 NL NLAANVRAGE7800767,A patent/NL190413C/xx not_active IP Right Cessation
- 1978-01-24 FR FR7801898A patent/FR2378747A1/fr active Granted
- 1978-01-25 DD DD78203419A patent/DD136737A5/de not_active IP Right Cessation
- 1978-01-26 UA UA2669397A patent/UA8373A1/uk unknown
- 1978-01-26 CA CA295,711A patent/CA1101845A/en not_active Expired
- 1978-01-27 IT IT19706/78A patent/IT1091982B/it active
-
1979
- 1979-03-13 US US06/020,058 patent/US4256836A/en not_active Expired - Lifetime
-
1980
- 1980-06-03 US US06/270,025 patent/US4436925A/en not_active Expired - Lifetime
-
1982
- 1982-12-10 CH CH719382A patent/CH643532A5/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE2801238C2 (de) | 1986-06-05 |
| FR2378747A1 (fr) | 1978-08-25 |
| NL190413B (nl) | 1993-09-16 |
| CH643532A5 (de) | 1984-06-15 |
| US4256836A (en) | 1981-03-17 |
| DE2857828C2 (de) | 1990-06-07 |
| UA8373A1 (uk) | 1996-03-29 |
| DE2801238A1 (de) | 1978-08-03 |
| GB1548553A (en) | 1979-07-18 |
| US4436925A (en) | 1984-03-13 |
| CA1101845A (en) | 1981-05-26 |
| DD136737A5 (de) | 1979-07-25 |
| IT1091982B (it) | 1985-07-06 |
| NL7800767A (nl) | 1978-07-31 |
| FR2378747B1 (de) | 1983-12-09 |
| NL190413C (nl) | 1994-02-16 |
| US4165311A (en) | 1979-08-21 |
| IT7819706A0 (it) | 1978-01-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CH637914A5 (de) | Dipeptid-aminosaeureester-additionsverbindungen und verfahren zu ihrer herstellung bzw. zersetzung. | |
| EP0236872B1 (de) | Hydroxylaminderivate, deren Herstellung und Verwendung für Heilmittel | |
| DE2366379C2 (de) | N&uarr;&alpha;&uarr;-geschützte N&uarr;G&uarr;-Nitro-L-arginyl-L-prolin-amide | |
| DE69602016T2 (de) | Herstellung von hydroxamsäurederivaten | |
| CH661931A5 (de) | N-substituierte amidoaminosaeuren, deren ester und amide. | |
| DD223148A5 (de) | Verfahren zur herstellung von gem-diaminoal-kanderivaten | |
| DE2647189A1 (de) | Verfahren zur herstellung eines peptids | |
| EP0312502A2 (de) | Dipeptide, verwendbar als Pflanzenwachstumsregulatoren | |
| DE2822528A1 (de) | Verfahren zur herstellung von protease | |
| BE897844A (fr) | Alkylamides de tripeptides et de tetrapeptides biologiquement actifs, procede pour leur preparation et compositions | |
| DE2632396A1 (de) | Bestatinderivate und verfahren zu ihrer herstellung | |
| DE69911061T2 (de) | N-3, 3-dimethylbutyl-l-asparaginsäure und ihre ester, verfahren zur herstellung dieser und das verfahren um daraus n-[n-(3,3-dimethylbutyl)-l-alpha-aspartyl)-l-phenylalanin-1-methylester herzustellen | |
| EP0010587B1 (de) | Adamantylalkyloxycarbonylderivate, deren Herstellung und Verwendung zur Darstellung von Peptiden | |
| DE3203292C2 (de) | ||
| DE2822527A1 (de) | Verfahren zur gewinnung von protease | |
| US6031112A (en) | Process for the production of alkoxycarbonyl-dipeptides intermediates in the synthesis of the lisinopril | |
| DE2245392C3 (de) | Verfahren zur Herstellung von N-tert-Butyloxycarbonyl-, N-tert-Amyloxycarbonyl- oder N-4-MethoxybenzyIoxycarbonylaminocarbonsäuren oder -peptiden | |
| DE68928249T2 (de) | Verfahren zur Trennung von Methylester von alpha-L-aspartyl-L-phenylalaninen | |
| DE60213880T2 (de) | Verfahren zur herstellung von lisinopril | |
| DE2647188C2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Oligopeptiden | |
| DE3421303A1 (de) | Salze aus 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-1,2,3-benzotriazin und amino-verbindungen | |
| DE602004001590T2 (de) | Verbessertes Verfahren zur Synthese von Diamidderivaten des Tripeptids KPV | |
| CH636877A5 (de) | Verfahren zur herstellung cyclischer ester von 3,4-dihydroxy-thiophen-1,1-dioxid und 3,4-dihydroxy-cyclopentadienon-verbindungen. | |
| DE2022032A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von Peptiden | |
| DE1668876C3 (de) | N-Acyl geschützte Aminosäuren und Peptide, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung bei Peptidsynthesen |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PL | Patent ceased | ||
| PL | Patent ceased |