CH621146A5

CH621146A5 -

Info

Publication number: CH621146A5
Application number: CH703875A
Authority: CH
Inventors: Dieter Dr Jaworek; Josef Maier; Michael D Nelboeck-Hochstetter
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1974-06-04
Filing date: 1975-05-30
Publication date: 1981-01-15
Also published as: JPS5112891A; US4038140A; IT1038261B; ATA339175A; AT336530B; DE2426988C2; FR2273816B1; FR2273816A1; GB1450519A; DE2426988A1; NL7506507A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bindung biologisch aktiver Proteine an einen unlöslichen Träger durch Umsetzung wenigstens eines derartigen Proteins in wässriger Phase mit einem aktivierten Trägermaterial.

Biologisch aktive Proteine gehören zu den aussichtsreichsten Substanzen für die Erschliessung neuer und verbesserter Technologien. So gehören beispielsweise die Enzyme zu den wirksamsten und spezifischsten Katalysatoren, die eine grosse Anzahl technisch äusserst interessanter Umsetzungen zu katalysieren vermögen. Einem Einsatz der biologisch aktiven Proteine in technischen Verfahren steht jedoch ihr hoher Preis und ihre geringe Stabilität hindernd im Wege. Diese Nachteile lassen sich jedoch im Prinzip durch die Bindung an unlösliche Träger ganz oder teilweise beseitigen. Insbesondere ermöglicht die Trägerfixierung eine vielfache Wiederverwendung und macht daher in vielen Fällen den Einsatz der biologisch aktiven Proteine in der Technik überhaupt erst möglich. Hinzu kommt, dass in vielen Fällen auch die Stabilität der aktiven Proteine durch eine Trägerbindung erhöht werden kann.

Bekannte Trägermaterialien, die sich zur Immobilisierung von biologisch aktiven Proteinen gut bewährt haben, sind solche auf Polyacrylamid- und Polydextranbasis. Wegen ihrer hydrophilen Eigenschaften, den geringen Wechselbeziehungen zwischen Träger und Protein sowie der Möglichkeit zur Beeinflussung des Porendurchmessers des Trägers durch entsprechende Vernetzung erfüllen sie die meisten Voraussetzungen, die an einen Proteinträger gestellt werden.

Durch Variation der Matrix derartige Träger lassen sich für spezielle Aufgaben optimale Eigenschaften erzielen. In vielen Fällen gelingt dies durch den Übergang auf Copolymerisate aiif Basis von Acrylamid. So ist eine vernetzte Polyacrylamidma-trix, die als Comonomer Maleinsäure oder Derivate davon enthält, bekannt. Sie lässt sich durch Vernetzer, wie N,N'-Methylen-bis-acrylamid, gut vernetzen, da derartige Vernetzer mit Acrylamid gut copolymerisieren und die Dicarbonsäure über das cyclische Anhydridderivat durch einfaches Erhitzen leicht aktivierbar ist. Bei derartigen Copolymerisaten ist der Einfluss der nach covalenter Bindung der aktiven Proteine noch gelandenen Gruppen gering, so dass auch die pH-Optima und die kinetischen Parameter der Enzyme fast unverändert bleiben. Derartige Träger haben auch den Vorteil, dass Substrat und Reaktionsprodukt sowie nicht covalent gebundenes biologisch aktives Protein kaum adsorbiert werden. Ein Nachteil derartiger Träger mit einer Anhydridgruppe zur Fixierung des Proteins besteht jedoch darin, dass mit empfindlichen, aus Untereinheiten bestehenden Proteinen, insbesondere mit vielen Enzymen in manchen Fällen keine befriedigenden Aktivitätsausbeuten, zu geringe spezifische Aktivitäten (U/g) und auch ungenügende Stabilität des trägergebundenen Proteins erhalten werden. Eine andere bekannte Methode ist der mechanische Einschluss von Proteinen in vernetztes Polyacrylamid. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist das langsame Ausbluten des Proteins aus der Gelmatrix, so dass sich dieses Verfahren nicht in breitem Umfange durchsetzen konnte. Das Ausbluten des einschlussfixierten Proteins ist abhängig von der Vernetzung des Trägers, der Porenstruktur, der mechanischen Belastung und der Ionenstärke der verwendeten Puffer. Ein Vorteil dieses Verfahrens besteht jedoch darin, dass auch empfindliche, aus Untereinheiten bestehende Enzyme, wie zum Beispiel Lactat-dehydrogenase, Katalase, Hexokinase und Glucose-6-phos-phat-dehydrogenase mit guten Aktivitätsausbeuten gebunden werden können. Auch bleiben bei einem derartigen Einschluss eines Proteins in ein vernetztes Polyacrylamidgel die kinetischen Eigenschaften des Enzyms, zumindest gegenüber niedermolekularen Substraten, weitgehend unbeeinflusst.

Eine Verbesserung der bekannten Methoden zur Trägerfixierung biologisch aktiver Proteine gelang mit der Einführung eines Zweistufenverfahrens, bei dem in erster Stufe das Protein mit einer Brückenbildnerverbindung, welche mindestens eine zur Herstellung einer Bindung mit einem Träger geeignete funktionelle Gruppe und mindestens eine in wässriger Lösung Protein-acylierende oder -alkylierende Gruppe enthält, umgesetzt und anschliessend das gebildete Produkt entweder mit einem bereits vorgebildeten Träger verbunden oder als «Comonomer» in einer Polymerisationsreaktion unter Bildung des eigentlichen Trägers fixiert wurde. Dieses Verfahren der «Proteincopolymerisation» hat gegenüber dem mechanischen Einschluss von Proteinen in Träger den Vorteil, dass infolge der covalenten Bindung jedes Ausbluten vermieden wird, besonders hohe Aktivitäts- bzw. Proteinausbeuten erzielt werden und die covalente Bindung in statistischer Verteilung sowohl höherer als auch kleinerer Molekulargewichte erfolgt.

2

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

bO

65

3 621 146

Die nachstehende Tabelle zeigt am Beispiel der Enzyme Acrylamidpolymerisats beruhen, zu ganz unterschiedlichen Glucoseoxydase (GOD) und D-Hydroxynitril-Lyase (D-Hy-Ly), Aktivitätsausbeuten führen. Das Enzym-Trägerverhältnis wie unterschiedliche Trägermaterialien, die alle auf Basis eines betrug jeweils 0,033 :1 g.

Trägermaterial Art der Fixierung spez. Aktivität (U/g)

GOD D-Hy-Ly

Acrylamid-Maleinsäure-Copolymer Anhydrid 10 1,3

Polyacrylamid mechanisch 80 2,3

eingeschlossen

Polyacrylamid Protein-Copolymerisat 500 13

Eine weitere grosse Gruppe von Trägern für die Bindung 15 von biologisch aktiven Proteinen sind Polysaccharide. Sie wurden bisher im wesentlichen nach zwei Methoden eingesetzt:

1. Fixierung über aktivierte Polyaccharide, und

2. Einschluss in Zellulosederivate unter gleichzeitiger Formgebung (Mikroverkapselung, Nassspinnverfahren). 20

Um eine covalente Bindung herstellen zu können, musste das Polysaccharid aktiviert werden. Beispielsweise wurde Car-boxymethyl-Zelluloseazid verwendet, bei dem das Protein über eine Peptidverknüpfung mit einer aktivierten Carboxylgruppe gebunden wurde. Bei Einschluss in Zellulosederivate, zum Bei- 25 spiel Zellulosetriacetat, liegen die Proteine in Vakuolen gelöst vor.

Ein Nachteil der Bindung von aktiven Proteinen an aktivierte Polysaccharide, wie Zellulose, vernetztes Dextran, Agarose usw., besteht darin, dass nach vollzogener Proteinverknüp- 30 fung ein Teil der Gruppen hydrolysiert und somit geladen vorliegt. Diese Träger sind zum Teil so stark geladen, dass die zu immobilisierenden Enzyme zum grossen Teil adsorptiv festgehalten werden und das gebundene Protein in Abhängigkeit von dem polyvalenten Charakter des Trägers eine Verschiebung 35 des pH-Optimums erfährt. Ein weiterer Nachteil ist die starke Adsorption von Substrat und Reaktionsprodukt an derartigen geladenen Trägern.

Dieser Nachteil lässt sich zwar durch die Einschlussfixierung in regenerierte Zellulosederivate beseitigen, dieses Ver- 40 fahren erlaubt jedoch wegen der starken Diffusionsbehinderung nur den Einsatz relativ kleiner Substratmoleküle und die Aktivität geht zu rasch verloren.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Bindung biologisch aktiver Produkte an einen unlöslichen Träger 45 zu schaffen, welches die oben erwähnten Nachteile nicht aufweist und insbesondere auch besonders empfindliche und aus Untereinheiten bestehende Proteine mit hohen Ausbeuten zu fixieren gestattet, eine gute Stabilität der gebundenen Proteine liefert, hinsichtlich der mechanischen Eigenschaften anpas- 50 sungsfähig ist und den Anforderungen des technischen Einsatzes entspricht.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäss durch ein Verfahren zur Bindung biologisch aktiver Proteine an einen unlöslichen Träger durch Umsetzen wenigstens eines derarti- 55 gen Proteins in wässriger Phase mit einem aktivierten Trägermaterial auf der Basis eines Polysaccharids, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass als Trägermaterial ein aktiviertes Polysaccharid, auf welches hydrophile Comonomere aufgepfropft sind, verwendet wird. 6<>

Polysaccharidpfropfpolymerisate sind bekannt. Eine zusammenfassende Behandlung ihrer Eigenschaften und ihres Chemismus findet sich in «Advances in Makromolekular Chemistry», Vol. 2, Academic Press, London und New York, 1970. Polysaccharidpfropfcopolymerisate erwiesen sich als 65 besonders geeignete Trägermaterialien für die Bindung der biologisch aktiven Proteine. Vorzugsweise erfolgt ihr Verwendung als Träger derart, dass die Pfropfreaktion in Gegenwart des zu bindenden biologisch aktiven Proteins erfolgt, wobei je nach den gewählten Reaktionsbedingungen sowohl eine covalente Bindung des Proteins als auch eine reine Einschliessung erfolgen kann. Mit anderen Worten wird die Pfropfcopolymerisation des hydrophilen Monomeren auf dem Basispolysaccha-rid in Gegenwart des zu bindenden biologisch aktiven Proteins unter gleichzeitiger Bindung desselben durchgeführt.

Gemäss einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung werden Proteine, aktiviertes Polysaccharid und aufzupfropfendes hydrophiles Monomer bzw. Monomere und gegebenenfalls Vernetzer in wässriger Phase zusammengebracht und dann wird die Pfropfcopolymerisation durchgeführt. Man erhält so einschlussfixierte biologisch aktive Proteine mit gegenüber bisher bekannten Methoden zur Einschlussfixierung verbesserter Aktivitätsausbeute, verbesserter Stabilität und verbesserter Zugänglichkeit für Substrate.

Gemäss einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird das Protein zusammen mit einer Brückenbildnerverbindung, die wenigstens eine copolymerisierbare Gruppe und wenigstens eine Protein in wässriger Lösung acylierende oder alkylierende Gruppe enthält, umgesetzt und das Umsetzungsprodukt mit dem aktivierten Polysaccharid und dem aufzupfropfenden hydrophilen Monomer bzw. Monomeren und gegebenenfalls Vernetzer in wässriger Phase zusammengebracht und dann die Pfropfcopolymerisation durchgeführt. Diese Verfahrensvariante führte zu covalent gebundenen Proteinen mit besonders hohen Aktivitätsausbeuten.

Beispiele für im Rahmen der Erfindung verwendbare biologisch aktive Proteine sind unter anderem Enzyme, Enzymverbände, Protein- und Peptidhormone.

Polysaccharide, die im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens verwendet werden können, sind beispielsweise Stärke, Zellulose und Zellulosederivate, wie Zelluloseacetat, Zellulosebutyrat, Allylzellulose, Carboxymethylzellulose, De-oxythiozellulose, Äthylätherzellulose, Methylätherzellulose, Hydroxyalkylätherzellulose, regenerierte Zellulose, Allyl-stärke, Carboxymethylstärke, Dialdehydstärke, entsprechende Dextranderivate, Polyglucoside und dergleichenn. Eine Zusammenstellung von zur Pfropfpolymerisation geeigneten Polysacchariden und geeigneten Pfropfpolymerisatrionsmethoden findet sich in der oben bereits zitierten Literaturstelle «Advances in Makromolekular Chemistry».

Die für die Pfropfpolymerisation erforderliche Aktivierung des Polysaccharids kann durch Einführung.einer Doppelbindung, beispielsweise durch Reaktion mit einer bifunktionellen Verbindung, die eine copolymerisationsfähige olefinische Doppelbindung und eine mit Hydroxylgruppen reaktive Gruppe enthält, beispielsweise eine Epoxydgruppe, Episulfidgruppe, Cycloimingruppe oder Lactamgruppe, oder durch ionisierende Bestrahlung unter Bildung langlebiger Radikale erfolgen oder durch Radikalbildung an den OH-Gruppen der Stärke mit einem 1-Elektronenacceptor wie Celv erfolgen. Wesentlich ist

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hierbei, dass die Aktivierung eine Propfcopolymerisation mit dem aufzupfropfenden hydrophilen Monomer und Monome-rengemisch in wässrige Phase ermöglicht. Vorzugsweise erfolgt dabei die Aktivierung durch Reaktion mit einer bifunktionellen Verbindung in der Weise, dass da Polysaccharid hierdurch wasserlöslich gemacht wird. Im Rahmen der Erfindung können jedoch auch wasserunlösliche aktivierte Polysaccharide als Grundkörper für das trägergebundene aktive Protein eingesetzt werden.

Besonders bevorzugte difunktionelle Verbindungen für die Aktivierung des Polysaccharids sind aktivierte Allylderivate wie Allylhalogenide, zum Beispiel Allylbromid, und aktivierte Acryl- bzw. Methacrylsäurederivate, wie die Säurechloride, Anhydride, Azide und dergleichen sowie aktivierte Dicarbon-säurederivate wie Chlormaleinsäure. Auch andere bekannte Alkylierungs- bzw. Acylierungsmonomere können verwendet werden.

Beispiele für zur Pfropfung geeignete Comonomere sind Acrylamid, Acrylnitril, Vinylacylate wie Vinylacetat, -propio-nat, -phosphat, Acrylate, Methacrylate, Allylzitrat, Polyalky-lenglykolacrylate und -methacrylate, N'-Vinyllactame wie N-Vinylpyrrolidon, N-substituierte Acrylamide und Metha-crylamide. Vorzugsweise besitzen die Monomeren wenigstens eine Carboxyl-Aminocarbonyl-, Sulfo- oder Sulfamoylgruppe, ganz besonders bevorzugt wird Acrylamid.

Als aufzupfropfendes Monomeres kann ein einziges hydrophiles copolymerisierbares Monomer oder eine Mischung mehrerer verwendet werden. Auch können difunktionelle Vernetzer zugesetzt werden, welche wenigstens zwei zur Copolymeri-sation befähigte olefinische Doppelbindungen aufweisen müssen und vorzugsweise ebenfalls hydrophil sind. Geeignete Vernetzer sind beispielsweise Diacrylate, Dimethacrylate, Di-acrylamide wie N,N'-Methylen-bis-acrylamid, die entsprechenden Methacrylverbindungen und ähnliches.

Wie bereits erwähnt, kann das erfindungsgemässe Verfahren so durchgeführt werden, dass zuerst das Pfropfcopolymeri-sat auf Basis eines Polysaccharids hergestellt und anschliessend das biologisch aktive Protein hieran fixiert wird. Beispielsweise kann zur Pfropfung eine Mischung von Acrylamid oder Methacrylamid und Maleinsäure oder Äthylenmaleinsäure eingesetzt werden. Durch Erhitzen des erhaltenen Pfropfpolymerisats bilden sich die Dicarbonsäureanhydride, die dann in wäss riger Lösung mit dem biologisch aktiven Protein zu kuppeln vermögen. Derartige Fixierungsmethoden sind beispielsweise beschrieben in der deutschen Auslegeschrift Nr. 1 935 711.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens, die bevorzugt wird, erfolgt die Pfropfcopolymerisation in Gegenwart des zu bindenden Proteins. Wie oben bereits erwähnt, kann dies unter covalenter Bindung oder unter Einschlussfixierung erfolgen.

Im Falle der Einschlussfixierung unter mechanischer Bindung des Proteins braucht lediglich eine Lösung des Proteins mit dem hydrophilen Monomer und dem aktivierten Polysaccharid hergestellt und dann die Copolymerisationsreaktion durchgeführt werden, beispielsweise durch Zugabe üblicher Radikal-bildender Starter und Beschleuniger. Durch Zusatz von Vernetzern lässt sich dabei die Porenweite des Produktes, welches sich als dreidimensionales Sieb darstellt, nach Wunsch regeln und beispielsweise der Grösse des zu fixierenden Proteins bzw. der Grösse seines Substrates oder seines Reaktionsproduktes anpassen. Besonders bevorzugte aktivierte Polysaccharide für diese Anwendungsweise sind die Allyläther, Acryl-säure-, Methacrylsäure- und Maleinsäureester von Stärke oder Dextranen. Es lassen sich jedoch auch andere aktivierte Derivate, insbesondere ionisierte Polysaccharide einsetzen.

Gemäss einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens erfolgt die Pfropfcopolymerisation nicht in Gegenwart des unmodifizierten biologisch aktiven Proteins wie bei der vorstehend beschriebenen Ausführungsform, sondern in Gegenwart eines Proteinreaktionsproduktes mit einer Brückenbildnerverbindung. Ein derartiger «Brückenbildner», auch als «Kupplungsverbindung» bezeichnet, weist wenigstens eine copolymerisationsfähige olefinische Doppelbindung oder eine andere, zur Ausbildung einer cova-lenten Bindung mit der aufgepfropften Seitenkette in wässriger Lösung geeignete Funktion und eine in wässriger Lösung Proteine acylierende oder alkylierende Gruppe auf. Bevorzugte acylierende oder alkylierende Gruppen im Sinne der Erfindung sind Epoxydgruppen, Äthylenimingruppen, durch Unsättigung aktivierte Halogenidgruppen, Säurehalogenidgruppen, Azid-gruppen, Säureanhydridgruppen, Aldehydgruppen, Oxazolon-gruppen sowie von Carboxylgruppen abgeleitete Derivate, in denen die OH-Gruppe durch eine der auf Seite 3 bis 5 der deutschen Offenlegungsschrift 2 260 185 aufgeführten Gruppen ersetzt ist.

Bevorzugte Kupplungsverbindungen sind beispielsweise Maleinsäureanhydrid und dessen Homologe, in denen die Wasserstoffatome der olefinischen Doppelbindung durch Acyl-gruppen mit 1 bis 6 kohlenstoffatomen ersetzt sind, Allylhalogenide, insbesondere Allylbromid und dessen Homologe, Acrylsäurechlorid und dessen Homologe, in denen die Wasserstoffatome durch ein oder mehrere Niedrigalkylgruppen ersetzt sind, die entsprechenden Methacrylsäureverbindungen, Maleinsäure- oder Fumarsäurechlorid und deren Homologe entsprechend der obigen Definition, wie Maleinsäureanhydrid, Maleinsäureazid, Äthyleniminverbindungen wie l-AlIyloxy-3-(aziridin)-propanol-(2), Epoxyde wie 2,3-Epoxypropoxyacrylat oder -methacrylat, Vinylsulfonsäurechlorid und ähnliche.

Die erfindungsgemäss verwendeten Polysaccharidpfropf-copolymerisate lassen sich zur Enzymfixierung auch nachträglich aktivieren, beispielsweise mittels Bromcyan. Auch bei dieser Ausführungsform des Verfahrens werden gegenüber den bisher bekannten ähnlichen Methoden weit überlegene Ausbeuten bzw. Aktivitäten erzielt. Beispielsweise wurde bei der Bindung des Enzyms Acylase an einem in bekannter Weise mit Bromcyan aktivierten Träger auf Polydextranbasis (Sephadex G-25) je nach der Korngrösse des Trägers bei einem Verhältnis Enzym zu Träger von 1:10 bezogen auf das Gewicht spezifische Aktivitäten zwischen 0,&und 2,2 U/g erzielt. Wurde dort stattdessen Stärkeallyläther-Acrylamidcopolymer, welches in gleicher Weise durch Bromcyan aktiviert wurde, eingesetzt, so betrug die spezifische Aktivität 120 U/g.

Weit überlegene Eigenschaften werden auch erzielt, wenn ein aktives Protein mit einem Brückenbildnercopolymer an das Pfropfpolymerisat auf Polysaccharidbasis gebunden wird im Vergleich zu einer Bindungsmethode, bei der vergleichbar vorgegangen wird, jedoch anstelle der Polysaccharidkompo-nente im Träger ein anderer Vernetzer für das Polymerisat des hydrophilen Monomeren eingesetzt wird. Allein durch diesen Austausch des «Vernetzers» aktiviertes Polysaccharid gegen üblichen difunktionellen Vernetzer ergeben sich wesentlich erhöhte Aktivitätsausbeuten und erhöhte spezifische Aktivitäten sowie verbesserte mechanische Eigenschaften.

Die nachstehende Tabelle zeigt für drei verschiedene Enzyme als biologisch aktive Proteine die erzielten Aktivitätsausbeuten und spezifischen Aktivitäten bei der Bindung an einen erfindungsgemässen Träger und einen damit vergleichbaren auf andere Weise vernetzten Träger nach dem Zweistufenverfahren unter Einsatz eines Brückenbildners:

4

5

1.0

15

20

25

30

35

40

45

50

55

bO

65

5

621 146

Enzym

Verhältnis der Co-

Verhältnis

Aktivi spez.

monomere im Träger

Poly

Enzym:

tätsaus

Aktivi

g/g mer : Enzym1

Brückenbild beute %

tät U/g

g/g ner3 mg/|il

D-Hydroxynitril-Lyase

Acrylamid : Stärke

1 :0,23

1 :0,05

20

41

aus Mandelkleie allyläther 1 :0,33

D-Hydroxynitril-Lyase

Acrylamid : N,N'-bis2

1 :0,25

1 :0,05

10

27

aus Mandelkleie

1 :0,057

Trypsin

Acrylamid : Stärke

1 :0,125

1 :0,25

33

30

allyläther 1 :0,2

Trypsin

Acrylamid :N,N'-bis2 1 • n 1

1 :0,16

14

12

Hexokinase,

1 . U, 1

Acrylamid : Stärke

75:1

1 :1

7

125

Hefe allyläther 1 :2

Hexokinase,

Acrylamid : N,N'-bis2

Hefe

1 :0,2

75:1

1 :1

2,5

46

1 bezogen auf das zur Immobilisierung eingesetzte Protein 2N,N'-bis = N,N'-Methylen-bis-Acrylamid 3 als Brückenbildner wurde Acrylsäurechlorid verwendet

Die verbesserten mechanischen Eigenschaften, die erfin- 25 folgenden Tabelle werden verglichen erfindungsgemäss an dungsgemäss erzielt wurden, zeigen sich beispielsweise in Stärkeallyläther/Acrylamidcopolymer gebundene Acylase mit höheren Durchflussgeschwindigkeiten bei Verwendung der in gleicher Weise an vernetztes Polyacrylamid gebundene Acy-

trägergebundenen aktiven Proteine in Säulenreaktoren. In der läse.

Träger spez.

Akt.

U/g

Korngrösse mm vernetztes Poly- 130 0,2-0,4 acrylamid

Stärkeallyläther/ 138 0,2-0,4 Acrylamid

Gelbett

Durchflussge

0

Höhe schwindigkeit1

cm cm ml/min

1

10

4

1

10

12

10,5 M d,l-N-Acetylananin

Im erfindungsgemässen Verfahren lässt sich durch geeignete Wahl der beiden Komponenten des Trägers, also des aktivierten Polysaccharids einerseits und des Pfropfcomonomers 45 bzw. der Pfropfcomonomermischung nicht nur das Bindungsverhalten gegenüber dem aktiven Protein nach Wunsch «mass-schneidern», sondern auch die physikalischen Eigenschaften lassen sich in ähnlicher Weise regeln. Im allgemeinen sollte das zur Kupplung verwendete Polysaccharidpfropfcopolymerisat m mindestens 20 Gew.-% aufgepfropfte hydrophile Comonomere-Einheiten enthalten, um eine für die normale Handhabung ausreichend stabile Trägersubstanz zu erzielen. In gewissen Sonderfällen können jedoch auch mehr als 80% Polysaccharidan-teil im Pfropfcopolymeriat zulässig sein, wenn besonders leicht 55 deformierbare und weiche Produkte gewünscht werden. Vorzugsweise enthält das Pfropfcopolymerisat 10 bis 70 Gew.-% Polysaccharidanteil.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Herstellung des aktivierten Polysaccharids 6o

Beispiel 1

Stärke-Allyläther

Ausgangsmaterial:

40 g Stärke, löslich b5

50 ml Aceton 150 ml NaOH, 5%ig 30 ml Allylbromid

Methode:

Die Stärke wird in 50 ml Aceton aufgeschlämmt und in die Natronlauge gegeben. Das Gemisch wird ausreichend mit Stickstoff durchlüftet und auf 40 °C geheizt.

Dann wird innerhalb von 15 Minuten das Allylbromid zugetropft, der Ansatz wird bis zur neutralen Reaktion (50 Minuten) bei 55 °C gehalten.

Zur Fällung der gebildeten Allylstärke wird die Lösung auf 10 °C abgekühlt und mit 11 Aceton versetzt.

Das so ausgefällte zähe Produkt wird zur Wasserentfernung unter intensivem Rühren mit einer weiteren Menge von 2 x 250 ml Aceton behandelt und anschliessend getrocknet. Ausbeute: 42 g (trocken)

Beispiel 2 Stärke-Acrylester Ausgangsmaterial :

10 g Zulkowsky-Stärke, NaOH, 2 n

4 ml Acrylsäurechlorid

5 ml Aceton

Methode:

Die Zulkowsky-Stärke wird in 50 ml H2O gelöst und mit der NaOH auf pH 9 eingestellt. Die Lösung wird auf 4 °C gekühlt und langsam innerhalb von 10 Minuten mit einer Lösung von Acrylsäurechlorid in 5 ml Aceton versetzt.

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6

Temperatur sowie pH werden während der Reaktion konstant gehalten. Der gebildete Stärkeacrylester wird mit Aceton gefällt, gewaschen und getrocknet.

Ausbeute: 12 g

Pfropfcopolymerisation und gleichzeitige Proteinbindung Beispiel 3

mechanischer Einschluss Ausgangsmaterial :

3 g Acrylamid 2 g Stärke-Allyläther 600 mg Acylase, spez. Akt. 20 U/mg 2 ml 5%iges Ammoniumperoxydisulfat (Starter)

2 ml 5%iges 3-Dimethylamino-propionitril (Starter)

Methode:

Acrylamid, Stärke-Allyläther und Acylase werden in 40 ml Phosphatpuffer, pH 7,5, gelöst.

Die Lösung wurde mit den Startern versetzt und mit Stickstoff durchlüftet. Nach 5 Minuten setzt die Gelierung ein. Das Gel wurde durch ein Sieb mit der Maschenweite von 0,4 mm gepresst und in einer Säule mit 510,3 M Kochsalzlösung eluiert. Spez. Aktivität: 26 U/g Ausbeute: 5 g

Beispiel 4

Protein-Copolymerisation (covalente Proteinbildung mit Brük-kenbildner)

Ausgangsmaterial :

6 g Acrylamid 2 g Stärke-Allyläther 1890 mg D-Hydroxynitril-Lyase, spez. Akt. 1 U/mg 0,1 ml Acrylsäurechlorid (Brückenbildner)

2 ml 5%iges Ammoniumperoxydisulfat (Starter)

2 ml 5%iges 3-Dimethylaminopropionitril (Starter) 50 ml Phosphatpuffer pH 7,5; 0,2 M

Methode:

Acrylamid und Stärke-Allyläther werden in 15 ml Phosphatpuffer gelöst (Lösung I).

Die Hydroxynitril-Lyase wird in 35 ml Phosphatpuffer gelöst, auf 4 °C abgekühlt und mit einer ebenfalls gekühlten Lösung des Acrylsäurechlorids in 5 ml Äther versetzt. Das Gemisch wird 30 Minuten intensiv gerührt und anschliessend zu Lösung I gegeben. Es wird mit Stickstoff durchlüftet, bis der grösste Teil des Äthers entfernt ist.

Dann werden die Starterlösungen zugesetzt. Nach etwa 5 Minuten beginnt der Ansatz zu erstarren.

Nachdem das Polymerisat mindestens 3 Stunden gestanden hat, wird es durch ein Sieb mit der Maschenweite 0,4 mm gepresst und in einer Säule mit 51 gepufferter Kochsalzlösung 0,5 M eluiert.

Ausbeute: 8,4 g

Spez. Aktivität: 41 U/g (Lyophilisat) = etwa 345 U = 18% Aktivitätsausbeute.

Vergleichsbeispiel A Protein-Copolymerisation Ausgangsmaterial:

7,5 g Acrylamid

0,4 g N,N'-Methylen-bis-acrylamid 1890 mg Hydroxynitril-Lyase, spez. Akt. 1 U/mg 0,1 ml Acrylsäurechlorid 2 ml 5%iges Ammoniumperoxydisulfat (Starter)

2 ml 5%iges 3-Dimethylamino-propionitril (Starter) 45 ml Phosphatpuffer pH 7,5; 0,2 M

Methode:

Acrylamid und N,N'-Methylen-bis-acrylamid wurden in

10 ml Phosphatpuffer gelöst.

Die Hydroxynitril-Lyase wird in 35 ml Phosphatpuffer gelöst, auf 4 °C abgekühlt und mit einer ebenfalls gekühlten Lösung des Acrylsäurechlorids in 5 ml Äther versetzt. Das Gemisch wird 30 Minuten intensiv gerührt und anschliessend zu Lösung I gegeben.

Es wird mit Stickstoff durchlüftet, bis der grösste Teil des Äthers entfernt ist. Dann werden die Starterlösungen zugesetzt. Nach etwa 5 Minuten beginnt der Ansatz zu erstarren.

Nachdem das Polymerisat mindestens 3 Stunden gestanden hat, wird es durch ein Sieb mit der Maschenweite 0,4 mm gepresst und in einer Säule mit 51 gepufferter NaCl-Lösung, 0,5 M, eluiert.

Ausbeute: 8,5 g

Spez. Aktivität: 27 U/g (Lyophilisat) = 230 U = 12%. Beispiel 5

Protein-Copolymerisation Ausgangsmaterial:

8 g Acrylamid 1,6 g Stärke-Allyläther 1200 mg Trypsin (Schweinepancreas)

0,3 ml, Acrylsäurechlorid 1,5 ml 5%iges Ammoniumperoxydisulfat (Starter) 1,5 ml 5%iges 3-Dimethylaminopropionitril (Starter) 40 ml Phosphatpuffer pH 8,7 ; 0,4 M

Methode:

Acrylamid und Stärke-Allyläther werden in 60 ml H2O gelöst (Lösung I).

Das Trypsin wird im Phosphatpuffer gelöst, auf 4 °C abgekühlt und mit einer ebènfalls gekühlten Lösung des Acrylsäurechlorids in 40 ml Äther versetzt. Das Gemisch wird 30 Minuten intensiv gerührt und anschliessend zu Lösung I gegeben.

Es wird mit Stickstoff durchlüftet, wobei der grösste Teil des Äthers entfernt wird. Dann werden die Starterlösungen zugesetzt. Nach etwa 15 Minuten beginnt der Ansatz zu erstarren. Nachdem das Polymerisat mindestens 3 Stunden gestanden hat, wird es durch ein Sieb mit der Maschenweite 0,4 mm gepresst und mit 51 gepufferter 0,5 M NaCl-Lösung eluiert.

Ausbeute: 8,2 g

Spez. Aktivität: 30 UA g (Lyophilisat) 246 U = 41 % Ausbeute.

Vergleichsbeispiel B

Protein-Copolymerisation

Ausgangsmaterial :

500 mg Trypsin, spez. Akt. 0,5 U/mg

3 g Acrylamid 0,3 g N,N'-Methylen-bis-Acrylamid 0,1 ml Acrylsäurechlorid

0,5 ml 5%iges 3-Dimethylamino-propionitril (Starter) 0,5 ml 5%iges Ammoniumperoxydisulfat (Starter)

Methode:

Das Trypsin wird in 10 ml 1 M Triäthanolaminpuffer, pH 8,5, gelöst, auf 10 °C gekühlt und mit Stickstoff behandelt. Unter Rühren wird das Acrylsäurechlorid, gelöst in 5 ml Äther, zugegeben und eine halbe Stunde weitergerührt.

Anschliessend werden Acrylamid und N,N'-Methylen-bis-Acrylamid, gelöst in 10 ml Wasser, sowie Starter zum Reaktionsansatz gegeben. Die Lösung erstarrt zu einem Gelbrei, der nach Stehenlassen über Nacht durch ein Metallsieb mit 0,4 mm Maschenweite gedrückt wird.

Das Granulat wird in eine Säule überführt und mit 310,2 M Phosphatpuffer, pH 7,5 eluiert und anschliessend lyophilisiert.

Ausbeute: 3 g

Spez. Aktivität: 12 U/g

Aktivitätsausbeute: 14%

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

Beispiel 6

Protein-Copolymerisation Ausgangsmaterial :

2 g Stärke-Allyläther

1 g Acrylamid 5

40 mg Hexokinase 10 mg Glucose 0,04 ml Acrylsäurechlorid 0,5 ml 5°/oiges 3-Dimethylaminopropionitril 0,5 ml 5%iges Ammoniumperoxydisulfat io

Methode:

Wie in Beispiel 4 beschrieben.

Ausbeute: 2,5 g (Lyophilisat)

Spez. Aktivität: 80 U/g 15

Aktivitätsausbeute: 3,6%

Vergleichsbeispiel C Protein-Copolymerisation

Ausgangsmaterial: 20

3 g Acrylamid

0,15 g N,N'-Methylen-bis-Acrylamid 40 mg Hexokinase, spez. Akt. 140 U/mg 10 mg Glucose

0,04 ml Acrylsäurechlorid 25

0,5 ml 5%iges 3-Dimethylaminopropionitril 0,5 ml 5%iges Ammoniumperoxydisulfat

Methode:

Die Hexokinase wird abzentrifugiert mit der Glucose und 30 10 ml 0,3 M Triäthanolamin-Puffer, pH 8,0, aufgenommen, auf 10 °C gekühlt und mit Stickstoff begast.

Das Acrylsäurechlorid wird in 5 ml kaltem Äther gelöst und unter Rühren langsam zugetropft. Nach einer Inkubationszeit von etwa 30 Minuten werden Acrylamid und N,N'-Methylen- s5 bis-Acrylamid, gelöst in 10 ml 0,3 M Triäthanolamin-Puffer, pH

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8,0, zugegeben und die Polymerisation durch Zugabe der Katalysatoren gestartet. Nach Auspolymerisieren über Nacht wird das Gel durch ein Metallsieb mit 0,4 mm Maschenweite gedrückt, in eine Säule überführt und mit 0,2 M Phosphatpuffer, pH 7,5 eluiert und anschliessend lyophilisiert.

Ausbeute: 2,5 g (Lyophilisat)

Spez. Aktivität: 45 U/g Aktivitätsausbeute: 2P/o

Beispiel 7

Protein-Copolymerisation Ausgangsmaterial:

600 mg Acylase I, Schweinenieren, spez. Akt. 18 U/mg 3,5 g Acrylamid 1,5 g Stärke-Allyläther 44 ml TRIS-Puffer, pH 6,7,0,3 M 0,02 g C0CI2

0,8 ml Allyloxy-(3-Aziridin-propanol-2)

3,5 ml 5%iges Ammoniumperoxydisulfat 3,5 ml 5%iges 3-Dimethylaminopropionitril

Methode:

In 24 ml TRIS-Puffer werden Acrylamid, Stärke-Allyläther und C0CI2 gelöst (Lösung I).

Die Acylase wird in 20 ml TRIS-Puffer gelöst und auf 4 °C abgekühlt. Dazu wird innerhalb 10 Minuten das Allyloxy-(3-Azi-ridin-propanol-2) zugetropft. Nach 30 Minuten Rührzeit wird die Lösung I zu dieser Lösung gegeben. Nach Zugabe der Starterlösungen wird mit Stickstoff durchlüftet. Der Polymerisationsvorgang setzt nach etwa 5 Minuten ein. Das Gel wird nach mehrstündigem Stehen durch ein Sieb (0,4 mm Maschenweite) gepresst und mit 3 Liter 0,3 M NaCl-Lösung (gepuffert pH 7) in einer Säule eluiert.

Spez. Aktivität: 138 U/g Korngrösse: 0,2 bis 0,4 mm.

Der Schutzumfang wird durch Art. 2 aPatG beschränkt.

Claims

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Bindung biologisch aktiver Proteine an einen unlöslichen Träger durch Umsetzung wenigstens eines derartigen Proteins in wässrige Phase mit einem aktivierten Trägermaterial auf der Basis eines Polysaccharids, dadurch gekennzeichnet, dass als Trägermaterial ein aktiviertes Polyac-charid, auf welches hydrophile Comonomere aufgepfropft sind, verwendet wird.
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Pfropfcopolymerisation des hydrophilen Comono-mers auf dem Polysaccharid in Gegenwart des Proteins unter gleichzeitiger Bindung desselben durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass Protein, aktiviertes Polysaccharid und aufzupfropfendes hydrophiles Comonomer bzw. ein Gemisch von Comono-meren und gegebenenfalls Vernetzer in wässriger Phase zusammengebracht und dann die Pfropfcopolymerisation durchgeführt wird.
4. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass Protein und eine Brückenbildnerverbindung mit einer Protein in wässriger Lösung acylierenden oder alkylierenden Gruppe und einer copolymerisierbaren Gruppe umgesetzt und das Umsetzungsprodukt mit dem aktivierten Polysaccharid und dem aufzupfropfenden hydrophilen Monomer bzw. dem Monomerengemisch und gegebenenfalls Vernetzer in wässriger Phase zusammengebracht und dann die Pfropfcopolymerisation durchgeführt wird.
5. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Polysaccharid-Pfropfcopolymerisat verwendet wird, das unter Verwendung einer Comonomerenmischung erhalten wurde, welche einen kleineren Anteil eines zur direkten Bindung mit einem Protein befähigten Monomeren, wie eines Dicarbonsäureanhydrids, enthielt.
6. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Polysaccharid-Pfropfcopolymerisat verwendet wird, welches unter Einführung einer zur Proteinbindung befähigten Gruppe nachträglich aktiviert wurde.
7. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als aktiviertes Polysaccharid ein Polysaccharid-Allyl-äther, Polysaccharid-Acrylsäure- oder Methacrylsäureester oder Maleinsäurehalbester verwendet wird.
8. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Polysaccharid Stärke oder ein Zellulosederivat verwendet wird.
9. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Polysaccharid-Pfropfcopolymerisat verwendet wird, dessen hydrophiles gepfropftes Comonomer ganz oder überwiegend aus Acrylamid besteht.