CH621629A5 - - Google Patents

Description

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PATENTANSPRÜCHE

1. Vorgefärbte Objektträger für die Blutuntersuchung, gekennzeichnet durch hochgereinigtes Methylenblau N und Kresylviolettacetat im Gewichtsverhältnis 1:1,5 bis 1:5.

2. Vorgefärbte Objektträger nach Patentanspruch 1, 5 dadurch gekennzeichnet, dass das Methylenblau N als Monohy-drochlorid vorliegt.

3. Vorgefärbte Objektträger nach Patentanspruch 1,

dadurch gekennzeichnet, dass die Farbstoffe aufgesprüht sind.

4. Verwendung des vorgefärbten Objektträgers nach 10 Patentanspruch 1 zur Blutuntersuchung.

Das sogenannte Differential-Blutbild gehört zu den am 15 häufigsten durchgeführten mikroskopischen Methoden. Hierbei werden die einzelnen Blutpartikel (Erythrozyten, Leukozyten und Thrombozyten etc.) mit Farbstoffen selektiv angefärbt, wodurch die mikroskopische Differenzierung und die Erkennung von pathologischen Veränderungen ermöglicht wird. Die 2o bisher üblichen Färbeverfahren (z.B. nach Wright, May-Grün-wald oder Pappenheim) beinhalten mehrere Arbeitsschritte wie z.B. Blutausstrich, Fixieren, z.T. mehrfaches Färben, Waschen und Trocknen und sind daher recht umständlich. Ausserdem ist die Qualität der Anfärbung stark von der Qualität der Färb- 25 stoffe, sowie von Übung und Erfahrung der damit befassten Personen abhängig.

Es hat daher nicht an Versuchen gefehlt, diese Verfahren zu vereinfachen. In jüngerer Zeit ist in der DOS 2 153 673 ein Verfahren beschrieben, welches sich sogenannter vorgefärbter 30 Objektträger bedient, die mit Methylenblau Kresylviolettacetat beschichtet sind. Wird auf diese Objektträger ein Tropfen Blut aufgebracht und mit einem Deckgläschen bedeckt, so kann nach ca. 5 Min. mikroskopiert werden. Hierbei ist neben der Differenzierung der verschiedenen Leukozytenformen und der 35 Thrombozyten, zusätzlich die Erkennung von jugendlichen Erythrozyten, der sogenannten Retikulozyten möglich. Dies ist,

neben der einfachen und sicheren Handhabung, ein weiterer Fortschritt gegenüber dem herkömmlichen Differentialblutbild.

Trotz des unbestreitbaren Fortschritts, den dieses Verfahren.«) erbrachte, weist es aber auch einige gravierende Nachteile auf.

So sind die Färbungen allgemein relativ stumpf, diffus und kontrastarm, ferner lassen sich die drei verschiedenen Formen der granulierten Leukozyten (Eosinophile, Neutrophile und Basophile) nur schwierig differenzieren.

Es wurde überraschenderweise nun gefunden, dass man vorgefärbte Objektträger erhält, die kontrastreiche und leuchtende Färbungen ergeben und die eine sichere Differenzierung der Granulozyten ermöglichen, wenn man die Farbstoffe Methylenblau N und Kresylviolettacetat in hochgereinigter Form in einem Gewichtsverhältnis von 1:1,5 bis 1:5 einsetzt. Vorzugsweise wird Methylenblau N als Monohydrochlorid anstelle des handelsüblichen Zinkdoppelsalzes eingesetzt.

Aus der DOS 2 153 673 geht nicht hervor, von welcher Qualität die verwendeten Farbstoffe waren. Die Tatsache, dass 55 bei der Herstellung der Farbstoff-Lösungen von ungelösten Rückständen abfiltriert werden soll, lässt auf handelsübliche Qualitäten schliessen. In der Tat wurden bei der Nacharbeitung der DOS mit handelsüblichen Farbstoffen vorgefärbte Objektträger erhalten, deren Färbeeigenschaften denen in der DOS (S. 60 5-6) entsprachen.

Die Reinigung von Mikroskopierfarbstoffen ist im allgemeinen nicht üblich. So werden oftmals schon seit Jahrzehnten Farbstoffe von zweifelhafter Reinheit benutzt, die sonst zur Textilfärbung verwendet werden. Bei vielen Farbstoffen ist 65 zudem nicht bekannt, ob und welche Verunreinigungen das Färbeergebnis beeinflussen. So ist es z.B. nicht verwunderlich, dass die amerikanische Biological Stain Commission als wichtig45

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stes Kriterium bei der Spezifikation eines Farbstoffs die Brauchbarkeit in bestimmten Färberezepturen ansieht und für die Gehaltsbestimmung lediglich photometrische und reduktome-trische, aber keine chromatographischen Methoden vorschreibt.

Diese photometrischen und reduktometrischen Methoden geben aber höchstens Aufschlüsse über den Gesamtfarbstoffgehalt und nicht über etwaige färbende Verunreinigungen.

Methylenblau N (Neumethylenblau, C.I. Basic Blue 24,3,7-Bis-(N-äthylamino)-2,8-dimethylphenothiazoniumchlorid) ist als ca. 50-70 %ige Ware im Handel erhältlich und weist nach unseren Befunden bei der dünnschichtchromatographischen Analyse 3-4 Nebenflecken in wechselnder Menge auf. Der Rest ist Zinkchlorid und Natriumchlorid. Es wurde von uns gefunden, dass eine ausgezeichnete Reinigung durch Lösen in Wasser und Ausfällen des Hydrochlorides mit Salzsäure erfolgen kann. Man erhält so ein chromatographisch reines Produkt, das nur noch ca. 0,5 % Zinkchlorid enthält und in Form des Monohy-drochlorids vorliegt.

Kresylviolettacetat (Cresylechtviolett, Cresyl Fast Violett Acetate, 5,9-Diaminobenzo(a)phenoxazonium-acetat) ist im Handel mit mehr oder weniger grossen Mengen Natriumacetat verunreinigt erhältlich. Auch hier weist die dünnschichtchroma-tographische Analyse 3 Nebenflecken in wechselnder Menge auf. Die Reinigung kann wie folgt vorgenommen werden:

Zuerst wird durch vorsichtiges Digerieren in Wasser das Natriumacetat entfernt. Danach wird in Methanol gelöst und mit Äther ausgefällt. Die Wiederholung dieser Prozedur liefert ein chromatographisch reines Produkt.

Die so gereinigten Farbstoffe lösen sich im Gegensatz zu den Handelsprodukten rückstandsfrei in Methanol und können in der in der DOS 2 153 673 (Seite 4) beschriebenen Weise auf Objektträger ausgestrichen werden. Sie können auch gemäss DOS 2 424 955 in Wasser gelöst und zusammen mit Polyoxy-äthylen-sorbitan-monopalmitat (Tween 80) aufgebracht werden.

Es ist weiterhin sehr erstaunlich, dass man nur dann brauchbare Objektträger mit den überraschend verbesserten Eigenschaften erhält, wenn man das Verhältnis der zwei Farbstoffe zwischen 1:1,5 und 1:5 wählt. Inder DOS 2 153 673 wird nämlich umgekehrt behauptet und beansprucht, dass das Verhältnis 3:1 bzw. gemäss DOS 2424955 2,5:1 sein soll und merkliche Abweichungen tunlichst zu vermeiden sind.

Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erhält man, wenn man die Farbstofflösung gemäss der Methode der DE-PS 2 515 869 auf die Objektträger aufsprüht.

Die gereinigten Farbstoffe werden dabei in Gesamtmengen von ca. 0,5 bis 10 7/crn2 auf die Objektträger aufgebracht. Das Verhältnis von Methylenblau N zu Kresylviolettacetat darf dabei zwischen den Werten von 1:1,5 bis 1:5 variieren.

Die erfindungsgemässen vorbeschichteten Objektträger werden wie in der DOS 2 153 673 (Seite 4—5) beschrieben, mit einem Blutstropfen und danach mit einem Deckgläschen versehen und nach ca. 3-5 Min. mit einem Ölimmersionsobjektiv mikroskopiert.

Die Färbungen sind ausserordentlich klar, kontrastreich und gut reproduzierbar. Gegenüber den in der DOS 2 153 673 (Seiten 5-6) beschriebenen Färbecharakteristiken treten folgende Besonderheiten auf:

a) Die Granula der Eosinophilen sind leuchtend gelb gefärbt, gegenüber einer dort beschriebenen Orangefärbung.

b) Die Granula der Basophilen sind orangerot gefärbt im Gegensatz zur dort beschriebenen Purpurfärbung. Die als Wirksames identifizierendes Merkmal bezeichnete Orangefärbung tritt dort nur am Rand der Zelle bei geeigneter Fokussierung auf.

c) Die Konturen der Kerne sind ausserordentlich klar erkennbar, was die Differenzierung von Lymphozyten, Mono-

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zyten und den verschiedenen Reifestadien der Granulozyten 3—5 % Wasser. Zink ist nur noch in Spuren vorhanden. Der sehr erleichtert. Farbstoff ist nach chromatographischer Untersuchung (DC-

Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemässen diagnostischen Fertigplatte Kieselgel 60 F 254 Merck, Laufmittelsystem n-

Mittel besteht darin, dass die Färbungen nicht mehr von den Butanol-Eisessig-Wasser 4:1:5) praktisch rein. RF-Wert: 0,5. Qualitätsschwankungen der handelsüblichen Farbstoffe abhän- 5

gen. Bei der technischen Herstellung grosser Stückzahlen ist die Beispiel 3

Reproduzierbarkeit bezüglich Farbstoffauftrag und -zusammen- Vorgefärbte Objektträger setzung von grösster Bedeutung. Es wird eine Lösung folgender Zusammensetzung unter

Als Material für die Objektträger kann Glas verwendet Verwendung der gemäss Beispiel 1 und 2 gereinigten Farbstoffe werden. Sofern die Farbstoffe gemäss der Methode der DE-PS 10 hergestellt:

2 515 869 aufgesprüht werden, können auch Kunststoffe verwendet werden, wobei die Farbstoffe natürlich auch auf Deck- Methylenblau N-Hydrochlorid 130 mg gläschen aus Glas oder Kunststoff aufgebracht sein können. Kresylviolettacetat 270 mg In den folgenden Beispielen soll die Erfindung näher erläu- Methanol ad 100 ml tert werden. 15

Diese Lösung wird mit einem Wattebausch auf Objektträger

Beispiel 1 als Film verstrichen und getrocknet oder aus einer 0,5 mm

Reinigung von Kresylviolettacetat Breitstrahldüse (SS 60 67228-45 der Fa. Spraying Systems) mit

50 g Kresylviolettacetat (Matheson Coleman & Bell) wer- einem Sprühwinkel von ca. 25° im Abstand von 20 cm durch den in 100 ml Wasser suspendiert und 15 Min. kräftig gerührt. 20 eine Maske in einer Breite von 3 cm auf Objektträger gesprüht,

Danach wird der Farbstoff abgesaugt und zweimal mit je 100 ml die mit einer Geschwindigkeit von 1,5 m/min unter der Düse eiskaltem Wasser gewaschen. Der Filterrückstand wird in 1,6 vorbeigeführt werden.

!tr. Methanol unter Erwärmen gelöst und bei ca. 30° von den Sprühdruck: 1,2 atü; Flüssigkeitsdurchsatz durch die Düse unlöslichen Anteilen abgesaugt. Das Filtrat wird langsam unter 10 ml/min.

Rühren mit 3,5 ltr. Äther versetzt und unter Eiskühlung 30 Min. 25 Bei einer mittleren Tröpfchengrösse von ca. 20 u beträgt die nachgerührt. Die gebildeten Kristalle werden abgesaugt, in aufgebrachte Farbstoffmenge ca. 3 [ig/cm2.

620 ml Methanol unter Erwärmen gelöst, die Lösung auf 30° Auf so hergestellte vorgefärbte Objektträger wird ein Blutsabgekühlt und der Farbstoff durch Zugabe von 1,85 ltr. Äther tropfen von ca. 5-10 |xl aufgebracht und mit einem Deckglas unter Rühren und Eiskühlung abgeschieden. Nach Absaugen bedeckt. Nach ca. 3-5 Min. wird die Anfärbung unter dem und Waschen mit dreimal 120 ml Äther-Methanol (3:1) erhält 30 Mikroskop bei ca. 800-facher Vergrösserung unter Verwendung man nach Trocknen über Diphosphorpentoxid 22 g Kresylvio- eines ölimmersionsobjektivs beurteilt.

lettacetat in Form dunkelgrüner Kristalle. Zusammensetzung: Die einzelnen Partikel des Blutes stellen sich in folgender ca. 82% Kresylviolettacetat, 8% Kresylviolettchlorid und 10% Anfärbung dar:

Wasser. Beim Erwärmen auf 150° tritt Zersetzung ein. Die Substanz ist nach chromatographischer Untersuchung (DC-Fer- 35

tigplatte Kieselgel 60 F 254 Merck, Laufmittelsystem Butanol- Retikulozyten:

Eisessig-Wasser 4:1:5) praktisch rein. RP-Wert: 0.6.

Neutrophile:

Beispiel 2

Reinigung von Methylenblau N 40 Eosinophile:

In einem 4 ltr.-Dreihalskolben werden 100 g Methylenblau

N (New Methylene Blue — Matheson Coleman & Bell) in 1 ltr. Basophile:

Wasser unter Rühren gelöst und mit 1 ltr. konzentrierter Salzsäure, d= 1,18, versetzt. Nach 4 Std. Rühren unter Eiskühlung,

8 Std. Stehen im Kühlschrank bei +5° saugt man die gebildeten 45 Lymphozyten:

Kristalle ab, wäscht mit 400 ml eisgekühlter 6 N Salzsäure und

500 ml Äther. Man erhält 36,5 g schwarze, metallisch glänzende Monozyten:

Kristalle, Zersetzung ab 253°. Der gereinigte Farbstoff besteht aus 95-97 % Methylenblau N-chlorid-Hydrochlorid und enthält Thrombozyten:

purpurfarbenes Netzwerk innerhalb der kaum angefärbten Erythrozyten.

purpurfarbener Kern innerhalb eines fein granulierten fast farblosen Plasmas, purpurfarbener Kern innerhalb eines grob granulierten gelben Plasmas, dunkelpurpurfarbener Kern innerhalb eines mittelgross kompakt granulierten orangerot-farbenen Plasmas.

purpurfarbener Kern mit hellpurpurfarbenem Plasma.

wie Lymphozyten, nur grösser und mit mehr Plasma.

kleine purpurfarbene Partikel.

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