CH621871A5 - - Google Patents
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Description
621 871
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REVENDICATIONS
1. Procédé enzymatique pour mesurer cinétiquement la concentration d'un substrat au moyen d'un analyseur de vitesse de consommation d'oxygène en utilisant un réactif enzymatique comprenant une solution tamponnée et un enzyme, caractérisé en ce qu'on ajoute audit réactif un sel ou un mélange de sels qui diminue la solubilité de l'oxygène dans ledit réactif d'au moins 30% comparée à la solubilité de l'oxygène dans l'eau.
2. Procédé selon la revendication 1, pour mesurer cinétiquement la concentration du cholestérol en utilisant un réactif contenant de la cholestéroloxydase, caractérisé en ce qu'on choisit ledit sel ou mélange de sels parmi les suivants :
a) un mélange de phosphate monopotassique et de phosphate disodique,
b) le sulfate d'ammonium,
c) le sulfate de sodium, et d) le chlorure de sodium.
3. Procédé selon la revendication 1, pour mesurer cinétiquement la concentration du glucose en utilisant un réactif contenant de la glucose-oxydase, caractérisé en ce que ledit sei ou mélange de sels est choisi parmi les suivants :
a) un mélange de phosphate monopotassique et de phosphate disodique,
b) le sulfate d'ammonium, et c) le sulfate de sodium.
4. Procédé selon la revendication 1, pour mesurer cinétiquement la concentration de l'acide urique en utilisant un réactif contenant de l'uricase, caractérisé en ce que ledit sel est le phosphate disodique.
5. Réactif enzymatique pour la mise en œuvre du procédé selon la revendication 1, comprenant une solution tamponnée et un enzyme, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un sel ou un mélange de sels qui diminue la solubilité de l'oxygène dans ledit réactif d'au moins 30% comparée à la solubilité de l'oxygène dans l'eau.
6. Réactif enzymatique selon la revendication 5, à utiliser pour la mesure cinétique de la concentration du cholestérol, caractérisé en ce que ledit enzyme est la cholestéroloxydase, et en ce que ledit sel ou mélange de sels est choisi parmi les suivants :
a) un mélange de phosphate monopotassique et de phosphate disodique,
b) le sulfate d'ammonium,
c) le sulfate de sodium, et d) le chlorure de sodium.
7. Réactif enzymatique selon la revendication 5, à utiliser pour la mesure cinétique de la concentration du glucose, caractérisé en ce que ledit enzyme est la glucose-oxydase, et en ce que ledit sel ou mélange de sels est choisi parmi les suivants :
a) un mélange de phosphate monopotassique et de phosphate disodique,
b) le sulfate d'ammonium, et c) le sulfate de sodium.
8. Réactif enzymatique selon la revendication 5, à utiliser pour la mesure cinétique de la concentration de l'acide urique, caractérisé en ce que ledit enzyme est l'uricase et en ce que ledit sel est le phosphate disodique.
Un procédé et un appareil particulièrement utiles pour mesurer la concentration des substrats enzymatiques dans des solutions d'échantillon sont décrits dans les brevets US Nœ 3857771 et 3933593. Notamment, ces brevets décrivent des analyseurs et des procédés pouf déterminer des concentrations du substrat enzymatique initial en mesurant la vitesse à laquelle l'oxygène est consommé dans une réaction chimique comprenant le substrat enzymatique.
Bien que cet appareil du brevet US N° 3933593 et d'autres analyseurs analogues de vitesse d'oxygène fournissent des moyens pour déterminer rapidement des concentrations du substrat enzymatique initial, les signaux engendrés dans ces analyseurs et indiquant ces concentrations sont souvent tout à fait petits. Dans de telles circonstances, on désire augmenter beaucoup la sensibilité de l'analyseur de vitesse de consommation d'oxygène, ce qu'on appelle le rapport signal:bruit.
On a trouvé que si on inclut, dans des réactifs enzymatiques qui réagissent avec l'oxygène, un sel ou un mélange de sels en des quantités suffisantes pour réduire la solubilité de l'oxygène dans le réactif d'au moins 30% comparée à la solubilité de l'oxygène dans l'eau, il en résulte une amélioration importante et inattendue du rapport signal:bruit (sensibilité) des signaux engendrés dans des analyseurs de vitesse de consommation d'oxygène et indiquant la concentration initiale du substrat. Il semble que, lorsque la solubilité de l'oxygène dans un réactif enzymatique diminue, moins d'oxygène est disponible pour réagir avec le réactif enzymatique. Dans des analyseurs de vitesse de consommation d'oxygène qui utilisent des sondes polarographiques et qui calculent les concentrations initiales du substrat, d'après la vitesse de changement de la consommation d'oxygène, cela signifie que la même vitesse de changement de la concentration d'oxygène donnera une vitesse plus grande de changement de consommation d'oxygène que précédemment. Lorsqu'on utilise des sondes polarographiques d'oxygène, on mesure la pression partielle plutôt que la concentration en oxygène dissous. Dans un milieu donné, la pression partielle est proportionnelle à la concentration. Si on réduit la solubilité de l'oxygène, la constante de proportionnalité devient plus grande et il en résulte qu'un changement plus grand de la pression partielle — et par conséquent une plus grande diminution du débit de la sonde — provient de la même diminution de concentration en oxygène. Cela produit un signal proportionnellement plus grand, et il en résulte une amélioration importante du rapport signal:bruit de l'analyseur sans aucune modification de sa partie électronique.
Par exemple, on a trouvé que, lorsqu'on inclut un phosphate en solution environ 1,0 molaire dans un réactif enzymatique utilisé dans le type précité d'analyseur de vitesse de consommation d'oxygène pour mesurer la concentration en cholestérol, la solubilité de l'oxygène dans le réactif est réduite de plus de 30% et le signal obtenu indiquant la concentration initiale en cholestérol est augmenté 10 fois, comparé au signal de sortie en l'absence du phosphate.
Des formes d'exécution de la présente invention sont décrites ci-après pour des dosages de substrats spécifiques. Cependant, il est entendu que l'invention n'y est pas limitée, mais comprend tous systèmes de réactifs enzymatiques qu'on peut utiliser avec un analyseur de vitesse de consommation d'oxygène pour mesurer les concentrations du substrat.
Dosage du cholestérol
Pour un réactif pour le dosage du cholestérol, les sels dont on a trouvé qu'ils réduisent de manière satisfaisante la solubilité de l'oxygène sont choisis parmi les suivants: un mélange de phosphate monopotassique et de phosphate disodique dans n'importe quel rapportale sulfate d'ammonium, le sulfate de sodium et le chlorure de potassium.
La réduction de la solubilité de l'oxygène dans le réactif devant être d'au moins 30% comparée à la solubilité de l'oxygène dans l'eau, on a trouvé que des concentrations des sels produisant de telles réductions de solubilité varient suivant les compositions particulières des réactifs de référence.
Pour illustrer l'invention, on indique dans le tableau I des concentrations de sels particuliers et l'effet qui en résulte sur la solubilité de l'oxygène dans un réactif de référence et l'augmenta5
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tion correspondante du signal dans un analyseur de vitesse de consommation d'oxygène du type des brevets cités plus haut. La composition du réactif de référence utilisé pour le dosage du cholestérol était une solution aqueuse comprenant 0,01 M d'une solution de phosphate de potassium ayant un pH de 6,0, 0,5 mg/ml de cholate de sodium, 0,02 g de Triton X-100 (marque déposée pour l'agent surfactif qui est l'isooctylphénoxypolyé-thoxyéthanol contenant approximativement dix molécules d'oxyde d'éthylène par molécule de polymère par 100 ml de solution), une solution 0,001 M d'azidure de sodium, une unité s internationale de cholestéroloxydase (Brevibacterium sp.), E.C.1.1.3.6 et 0,02 unité internationale de cholestérolestérase E.C.3.1.1.13.
Tableau I
Sels
Molarité
% de diminution
Augmentation
de la solution de la teneur de la grandeur
de réactif en oxygéné
du signal**
KH2P04 et Na2HP04
1,0*
60
10 fois
KH2P04 et Na2HP04
0,50*
40
4 fois
(NH4)2S04
0,75
35
10 fois
Na2S04
0,50
35
7 fois
KCl
1,50
35
4 fois
* La molarité de solution de réactif comprend la participation du phosphate de potassium présent dans la composition de réactif de référence.
** L'augmentation est comparée avec le signal produit en utilisant des réactifs identiques, mais sans la présence des sels indiqués dans le tableau.
Dosage du glucose
Pour un réactif pour le dosage du glucose, les sels dont on a trouvé qu'ils réduisent de manière satisfaisante la solubilité de l'oxygène sont choisis parmi les suivants : un mélange de phosphate monopotassique et de phosphate disodique, le sulfate d'ammonium et le sulfate de sodium. Comme pour le dosage du cholestérol, on a trouvé que les concentrations de ces sels produisant la réduction de la solubilité de l'oxygène d'au moins 30% varient suivant les compositions des réactifs de référence.
A titre illustratif, on indique dans le tableau II des concentrations particulières en sels et l'effet résultant sur la solubilité de l'oxygène dans un réactif de référence et l'augmentation corres-30 pondante du signal dans l'analyseur de vitesse de consommation d'oxygène. La composition du réactif de référence utilisé pour le dosage du glucose était une solution aqueuse comprenant une solution 0,2M de phosphate de sodium ayant un pH de 6,0, une solution 0,01M d'iodure de potassium, une solution 0,0075M de 35 molybdate d'ammonium, une solution 0,0005M d'iode, 5% en poids d'éthanol et 150 unités internationales par millilitre de glucose-oxydase.
Tableau II
Sels Molarité % de diminution Augmentation de la solution de la teneur de la grandeur de réactif en oxygène du signal**
KH2P04etNa2HP04 1,5* 65 25
(NH4)2S04 1,5 50 35
Na2S04 1,25 60 53
* La molarité de la solution de réactif comprend la participation du phosphate de potassium présent dans la composition de réactif de référence.
** On compare l'augmentation au signal produit en utilisant des réactifs identiques, mais sans la présence des sels indiqués dans le tableau.
Dosage de l'acide urique
Comme réactif pour le dosage de l'acide urique, on a trouvé qu'un sel qui réduisait la solubilité de l'oxygène de manière satisfaisante est le phosphate disodique. La concentration de ce dernier varie suivant la composition particulière du réactif. Pour illustrer l'invention, on a trouvé qu'en ajoutant une quantité de phosphate disodique produisant une molarité de 0,75 avait pour résultat une diminution de 45% de la teneur en oxygène du réactif et une augmentation de 40% de la grandeur du signal de l'analyseur de la vitesse de consommation d'oxygène, comparé à un réactif identique, mais sans la présence de phosphate disodique. Le réactif spécifique utilisé pour le dosage d'acide urique avec le phosphate disodique est une solution aqueuse comprenant une solution de 0,1 M de tétraborate de sodium ayant un pH de 8,5, et 0,25 unité internationale d'uricase par millilitre.
En ajoutant soit du sulfate d'ammonium, soit du chlorure de potassium au réactif précité pour le dosage de l'acide urique, on a 60 trouvé que cela produisait une diminution de la teneur en oxygène du réactif, mais une diminution du signal de l'analyseur plutôt qu'une augmentation. On croit que cette diminution du signal était probablement causée par l'inhibition de l'uricase par la concentration du sulfate d'ammonium ou du chlorure de potas-65 sium.
Chacun des sels envisagés pour l'utilisation dans la présente invention agit sur chaque enzyme de manière spécifique pour cet enzyme. Il en résulte que l'effet du sel sur la teneur en oxygène et
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la réponse du signal peuvent être partiellement masqués par l'effet du sel sur l'enzyme elle-même. Par exemple, en ajoutant une solution 0,5M du phosphate cité dans le tableau I se rapportant au réactif pour le cholestérol, cela diminue la teneur en oxygène du réactif de 40% et il en résulte une multiplication par 4 du signal. Cependant, en ajoutant une solution 0,5M de sulfate de sodium au même réactif, cela diminue la teneur en oxygène de 35% et pourtant donne une multiplication par 7 du signal. On croit que ce phénomène est dû au fait que la teneur plus élevée en ion phosphate inhibe la vitesse réactionnelle de l'un ou des deux enzymes impliqués dans le dosage du cholestérol ou que la teneur augmentée en sulfate de sodium augmente la vitesse réactionnelle de l'un ou des deux enzymes.
A cause du grand nombre des sels disponibles pour l'évalua-5 tion en vue de l'utilisation dans le procédé selon la présente invention, les sels particuliers indiqués ici ne limitent pas l'invention, mais incluent l'utilisation de tous les sels dont on peut trouver, par des essais routiniers, qu'ils diminuent de manière importante la teneur en oxygène du réactif enzymatique particu-io lier auquel on l'ajoute et qui augmente la grandeur du signal de l'analyseur de vitesse d'oxygène avec lequel on l'utilise.
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| PL | Patent ceased |