CH622269A5 - - Google Patents

Description

La présente invention est relative à un procédé pour la préparation de nouveaux supports solides insolubles porteurs de chaînes latérales portant au moins un — NH2 réactif, aux supports obtenus, à leur utilisation pour la fixation chimique de composés organiques comportant un résidu glucidique ainsi qu'aux produits résultant de ladite utilisation.

Il est connu de fixer des protéines biologiquement actives (telles qu'hormones, antigènes, enzymes, par exemple) sur des supports solides insolubles constitués par des sphères de latex porteuses de chaînes latérales se terminant par une fonction amine primaire, par réaction des groupements actifs des acides aminés de la chaîne protéique, avec les fonctions amine primaire du support. Il a également été proposé d'utiliser des antigènes fixés de la manière qui vient d'être très succinctement décrite, en tant que réactifs biologiques, mais en association avec des révélateurs.

La technique qui vient d'être mentionnée est décrite, notamment, par R. S. Molday, W. J. Dreyer, A. Rembaum et S. P. S. Yen dans «The Journal of Cell Biology», Vol. 64 (1975) 75-88 et par R. W. Lim, R. S. Molday, H. V. Huang et Shiado-Pin S. Yen dans «Biochimica et Biophysica Acta» 394 (1975), 377-387, qui préconisent la fixation d'anticorps sur des sphères de latex, par couplage des anticorps par l'intermédiaire de leurs fonctions amine primaire par liaison de covalence sur des sphères de latex, sur lesquelles ont préalablement été fixées des chaînes latérales se terminant par une fonction amine primaire activée par action d'activateurs tels que glutaraldé-hyde bromure de cyanogène ou carbodiimide hydrosoluble.

Un tel procédé de couplage des protéines par l'intermédiaire de leurs acides aminés, présente toutefois l'inconvénient de faire appel, pour la réalisation du couplage, aux groupements biologiquement actifs des acides aminés de la chaîne protéique et de réduire, de ce fait, dans certains cas, l'activité biologique de la molécule protéique fixée. De surcroît, les procédés préconisés, notamment, par R. S. Molday et Collaborateurs, donnent lieu à des couplages relativement peu stables et à des rendements relativement faibles, qui réduisent encore leur intérêt technique et économique.

La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à un procédé de fixation chimique de protéines biologiquement actives, sur un support porteur de chaînes latérales portant au moins un — NH2 réactif, et ne faisant pas appel, pour la réalisation du couplage, aux groupements biologiquement actifs des acides aminés de la chaîne protéique. En effet, les protéines, telles qu'anticorps, antigènes et un certain nombre d'hormones et d'enzymes, dont la fixation par couplage chimique sur des supports a été décrite dans l'art antérieur, sont des glycoprotéines dont le groupement prosthéti-que, à savoir le résidu glucidique, ne contribue en aucune manière à l'activité biologique de la molécule.

Ce but a été réalisé en utilisant de nouveaux supports obtenus selon la présente invention. Le procédé pour la préparation d'un support solide insoluble sur lequel sont fixées des chaînes latérales portant au moins un —NH2 réactif est caractérisé en ce que la fixation des chaînes latérales portant au moins un —NH2 réactif, sur le support solide insoluble susdit, est réalisée en fixant un composé choisi dans le groupe qui comprend les aminés, les polyamines, les diacides, les acides aminés, les hydrazines aliphatiques ou aromatiques comportant éventuellement une fonction acide, par liaisons de covalence sur ledit support, en présence d'un agent de condensation approprié.

Ces nouveaux supports sont utilisé pour la fixation chimique de composés organiques comportant un résidu glucidique par l'intermédiaire dudit résidu, qui, outre qu'il ne fait appel à aucun des groupements actifs du composé organique fixé, réalise ime fixation d'une très grande stabilité, avec des rende-satisfaisants, sans réduire, dénaturer, ni inactiver l'activité spécifique du composé organique fixé. L'on vient de se référer dans ce qui précède à la fixation d'un «composé organique comportant un résidu glucidique», et non plus seulement à la fixation d'un glycoportéine: en effet, en permettant de réaliser la fixation chimique du composé en cause par l'intermédiaire de son résidu glucidique, la fixation qui fait l'objet de la présente invention a une portée plus étendue que les procédés préconisés dans l'art antérieur, en ce qu'il est applicable non seulement aux glycoprotéines, mais à tous autres composés organiques biologiquement actifs ou présentant un intérêt industriel, lorsqu'ils sont couplés avec un support tel que défini plus haut, à condition que ces composés organiques comportent un résidu glucidique. Parmi de tels «composés organiques s

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comportant un résidu glucidique» on peut ranger, entre autres, non seulement les glycoprotéines, mais aussi les Polysaccharides et les glycolipides.

Selon la présente invention on fixe des composés organiques comportant un résidu glucidique, sur un support inventif comportant au moins un — NHz réactif en ce que l'on transforme, au cours d'un premier stade, au moins un groupement -CH2OH du résidu glucidique du composé organique, en un groupement-CHO, par oxydation, et en ce que l'on fait réagir, au cours d'un second stade, le(s) groupement(s) -CHO obtenu(s), au moins avec un-NHz réactif porté par des chaînes latérales fixées sur le support solide insoluble, réalisant ainsi la fixation chimique du composé organique sur ledit support, et, dans le cas où le —NH2 est une fonction amine primaire, l'on stabilise la base de Schiff formée, par réduction chimique.

Selon un mode de réalisation avantageux l'oxydation du groupement — CH2OH en groupement —CHO est réalisée à l'aide de periodate de sodium.

Selon un autre mode de réalisation avantageux l'oxydation du groupement — CH2OH en groupement —CHO est réalisée par voie enzymatique.

Selon encore un autre mode de réalisation avantageux le composé organique comportant un résidu glucidique est soumis, préalablement à la transformation d'au moins l'un de ses groupements — CH2OH en un groupement —CHO, par oxydation, à un traitement par la neuraminidase, lorsque le résidu terminal des chaînes glucidiques est un acide sialique, lequel traitement élimine ledit acide sialique.

Selon un mode de réalisation avantageux du stade d'oxydation du groupement — CH2OH en groupement —CHO par voie enzymatique, l'enzyme mise en œuvre est choisie, en fonction de l'avant-dernier résidu de la chaîne glucidique, dans le groupe qui comprend les oxydases qui oxydent les sucres, telles que, notamment, la glucose-oxydase, la fucose-oxydase et la galactose-oxydase, si l'avant-dernier résidu de la chaîne glucidique est respectivement du glucose, du fucose ou du galactose.

Lorsque la chaîne latérale du support susdit porte une fonction amine primaire terminale, la réaction entre le groupement -CHO du composé organique à fixer sur le support et ladite fonction — NH2, donne lieu à une base de Schiff, qui est stabilisée, au cours d'un troisième stade du procédé par réduction chimique, l'agent réducteur mis en oeuvre étant de préférence le NaBH4.

Une telle stabilisation n'est pas nécessaire dans le cas où les chaînes latérales se terminent par un groupement-NH-NH2, qui forme en présence du groupement—CHO, une hydra-zone stable, ni dans le cas où elles comprennent en même temps un -NH2 et un -SH, qui forment en présence du groupement-CHO, un hétérocycle, qui est un cycle thiazoli-dine dans le cas où le — SH est en position ß- par rapport au -NH2.

Le procédé de fixation chimique de composés comportant un résidu glucidique, sur des supports solides, insolubles, porteurs de chaînes latérales comportant au moins un — NH2 réactif donne lieu à des produits de couplage qui sont utilisables, en particulier, en tant que réactifs biologiques.

La réactivité et la stabilité des produits de couplage obtenus est d'autant plus grande que le composé organique est couplé au support par une chaîne latérale suffisamment longue. Les réactifs de diagnostic constitués par les produits de couplage susdits, présentent des qualités de sensibilité et de précision que ne présentent pas les réactifs de diagnostic du même type proposés conformément à l'Art antérieur.

Les supports utilisables pour fixer chimiquement des composés organiques porteurs d'au moins une fonction — CHO, sont des supports solides, insolubles, pris notamment dans le groupe qui comprend des sphères de latex, des billes de gel d'agarose ou de dextrane, des billes de verre activées, ou analogues, sur lesquels sont fixées par covalence des chaînes latérales portant au moins un — NH2 réactif, provenant de la fixation sur ledit support d'un composé choisi parmi les aminés, les polyamines, les diacides, les acides aminés, les hydrazines (aliphatiques ou aromatiques) comportant éventuellement une fonction acide.

Selon une disposition particulièrement avantageuse les chaînes latérales portées par les supports, sont couplées, par l'intermédiaire de leur — NH2 réactif, avec un composé azoté comprenant également au moins un—NH2 réactif et choisi notamment parmi les aminés aliphatiques ou aromatiques, les hydrazines aliphatiques ou aromatiques, ou les acides aminés, notamment les acides aminés comportant en même temps un groupement -SH et un groupement — NH2 susceptibles de former un hétérocycle en présence du groupement —CHO du composé organique à fixer.

Le support solide insoluble sur lequel sont fixées les chaînes latérales susdites, porte avantageusement des groupements carboxyle par l'intermédiaire desquels les chaînes latérales sont fixées sur ledit support.

L'on fixe avantageusement sur le support susdit:

- des diamines aromatiques;

- ou des polyamines contenant des groupements amine primaire et secondaire, répondant, par exemple, aux formules suivantes:

NH2(CH2)xNH(CH2)yNH2 où x 3= 3 et y & 3

NH2(CH2)xNH(CH2)yNH(CH2)zNH2 où x 5= 3, y 5= 4 et z 3

- ou des acides aminés ramifiés appropriés, au nombre desquels l'on compte, entre autres, la systéine de formule:

CH2-SH

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CH-NH2

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COOH

Conformément à un mode de réalisation avantageux les chaînes latérales fixées sur le support résultent du couplage d'une amine aliphatique ou aromatique, telle que diamine, polyamine, acide aminé, avec d'autres aminés aliphatiques ou aromatiques telles, en particulier, que: diamines, polyamines, hydrazines aliphatiques ou aromatiques ou leurs dérivés.

Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux le support solide insoluble porte des chaînes d'hexaméthylènedia-mine (HMD) avantageusement couplées par l'intermédiaire de leur — NH2 réactif, au dihydrazide adipique, à l'acide p-hydra-zino-benzoïque ou analogues.

Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux le support solide insoluble porte des chaînes de polyamine, telles que le spermidine, la diaminopropylamine, la spennine, par exemple, avantageusement couplées par L'intermédiaire de leur — NH2 réactif, au dihydrazide adipique, à l'acide p-hydrazino-benzoïque ou analogues.

Selon encore un autre mode de réalisation particulièrement avantageux le support solide insoluble porte des chaînes latérales constituées par un acide aminé tel que la ß-alanine ou l'acide s-amino-caproïque, par exemple, avantageusement couplé au diaminopropane, au dihydrazide adipique, à l'acide p-hydrazino-benzoïque ou analogues.

Le support solide insoluble peut porter des chaînes latérales se terminant par un acide aminé comportant un groupement —SH, comme la cystéine par exemple.

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L'acide aminé comportant un groupement —SH peut être couplé à une diamine aliphatique ou aromatique.

On utilise avantageusement comme agent de condensation et/ou de couplage, le glutaraldéhyde ou un carbodiimide totalement ou partiellement hydrosoluble, de formule générale:

R-N=C=N-R

dans laquelle R représente notamment un radical alcoyle comprenant de 2 à 12 atomes de carbone, en particulier un radical éthyle, n-propyle, iso-propyle, n-butyle, sec-butyle, tert-butyle, isobutyle, amyle, hexyle, heptyle, octyle, nonyle, décyle, undécyle et dodécyle; un radical cyclo-alcoyle comprenant de 5 à 6 atomes de carbone; un radical alcoyle inférieur monoaryl-substitué tel que, par exemple, un radical benzyle, a- ou p-phényléthyle un radical monoaryl tel que, par exemple, un radical phényle, morpholino-, pipéridyle; un radical alcoyle inférieur substitué par un reste morpholinyle, tel que, par exemple, un radical éthylmorpholinyle; un radical alcoyle inférieur substitué par un reste pipéridyle, tel que, par exemple, un radical éthylpipéridyle; un radical dialcoylamino-infé-rieur; un radical alcoyle inférieur substitué par un reste pyri-dyle, tel que, par exemple, un radical a-, ß- ou y-méthyl- ou éthyl-pyridyle; leurs sels d'addition avec des acides et leurs sels d'ammonium quaternaires, les deux radicaux R pouvant être identiques ou différents.

La réaction de fixation par covalence des chaînes latérales sur le support est réalisée avantageusement dans un tampon ne contenant pas de groupements — NH2 libres et dépourvus de propriétés agglutinantes, de pH 6,0-8,8.

Selon encore un autre mode de réalisation préféré la fixation par covalence est suivie d'une dialyse contre le même tampon que celui utilisé pour la réaction de fixation.

Les supports solides insolubles porteurs de chaînes latérales, obtenus conformément à la présente invention, constituent des produits nouveaux en eux-mêmes, qui sont susceptibles de nombreuses applications industrielles.

L'une de ces applications consiste à les utiliser comme supports de composés organiques portant au moins une fonction —CHO, fixés chimiquement sur lesdits supports par réaction entre leur fonction —CHO et le — NH2 réactif des chaînes latérales desdits supports.

Cette application présente un intérêt particulier dans le cas de la fixation de composés organiques comportant un résidu glucidique, qui est réalisée par l'intermédiaire dudit résidu glucidique, en modifiant tout d'abord par oxydation deux groupements fonctionnels adjacents portés par ce dernier, en fonctions —CHO, puis en amenant lesdites fonctions —CHO à réagir au moins avec un — NH2 réactif des chaînes latérales fixées au support solide insoluble.

La réaction d'oxydation du résidu glucidique du composé organique à fixer sur le support, est réalisée en générale aux environs de pH 6.

L'excès d'agent oxydant peut être éliminé, à la fin de la réaction d'oxydation susdite, par tous moyens appropriés, tels que dialyse ou addition d'un agent capable d'être oxydé par l'agent d'oxydation, tel que sulfite de sodium, glycérol, glucose et analogues.

L'intérêt de l'application susdite est accru lorsque les composés organiques comportant un résidu glucidique au moins partiellement oxydé en fonction aldéhyde, fixés sur les supports conformes à la présente invention, font partie du groupe qui comprend les glycoprotéines, les Polysaccharides et les glycolipides: en effet, les antigènes, les anticorps, un certain nombre d'enzymes et d'hormones, appartiennent au groupe des glycoprotéines et leur fixation au support solide insoluble par l'intermédiaire de leur résidu glucidique préalablement oxydé en fonction aldéhyde, permet d'utiliser leur partie protéique libre ou leur partie lipidique libre (pour les glycolipides) pour la réalisation de tests permettant des détections précises, d'une grande sensibilité, qui est de l'ordre du nanogramme d'antigène détectable, à l'aide des agents de diagnostic insolubles réalisés de la sorte.

On peut améliorer encore la facilité d'emploi des réactifs biologiques en couplant chimiquement les glycoprotéines, les glycolipides ou les Polysaccharides avec des supports solides, insolubles, porteurs de chaînes latérales comportant au moins un —NH2 réactif, choisies parmi les colorants basiques.

On obtient ainsi des réactifs biologiques colorés qui permettent la mise en évidence de réactions immunologiques (avec des antigènes ou des anticorps en particulier) par réaction directe, notamment dans les réactions d'agglutination, sans avoir désormais à recourir à l'intermédiaire des globules rouges, la lecture des résultats des réactions d'agglutination se trouvant ainsi grandement facilitée.

Ces supports solides, insolubles, colorés, sont préparés par fixation des chaînes latérales sur les supports, dans un tampon approprié, en présence d'un agent de couplage et/ou de condensation, ajouté en deux étapes successives, pris dans le groupe qui comprend, notamment, le glutaraldéhyde, le N-hydroxyl-succinimide et les carbodiimides, ce processus de fixation étant suivi d'un processus de désorption des réactifs substistants non couplés.

Ces supports colorés sont avantageusement conservés, avant utilisation, dans un tampon non-agglutinant.

De nombreux réactifs biologiques peuvent être préparés en mettant en œuvre la présente invention, lesquels réactifs se distinguent par leur excellente stabilité et leur très grande sensibilité.

Les produits de couplage résultant de la fixation chimique de composés organiques comportant un résidu glucidique, sur des supports solides, insolubles, porteurs de chaînes latérales comportant au moins un — NH2 réactif, conformément à la présente invention, peuvent également être utilisés en tant que catalyseurs dans de nombreuses réactions chimiques, biochimiques et biologiques.

L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples de réalisation des supports et des produits nouveaux conformes à la présente invention, ainsi qu'à des exemples de préparation d'agents de diagnostic dont les très grandes sensibilité et précision sont démontrées dans le cadre d'essais par agglutination, par radio-activité et par néphélométrie.

Exemples

I - Exemples de préparation de supports solides insolubles conformes à l'invention

A. Exemples de préparation de supports solides insolubles porteurs de chaînes latérales propres à être couplées avec un autre composé azoté porteur d'un — NH2 réactif.

Ai Préparation de supports en polystyrène carboxylé sphérique et calibré porteurs de chaînes latérales comportant un—NH2 réactif

Exemple 1

Préparation d'un support portant des chaînes latérales constituées par des hexaméthylènediamines

A12 mg d'«ESTAPOR PSIös» (marque déposée par Rhône-Progil pour désigner un polystyrène carboxylé sphérique et calibré de diamètre de l'ordre de 0,22 (x) comportant des groupements — COOH libres, en suspension dans du tampon borate de composition 0,14 M NaCl-0,01 M Borate-HCl, pH 8,1 (BBS), on ajoute 80 [«noies d'hexaméthylènediamine (HMD). Le mélange est agité à 20°C pendant 3 heures en présence de 0,02 M d'1 éthyl 3-(3-diméthylaminopropylcarbo-diimide)chlorhydrate (EDC). Au bout de ce temps, la suspension est dialysée contre le tampon BBS jusqu'à ce que sa D.O.

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à 230 nm soit égale à zéro. L'on obtient un support en «Esta-por» carboxylé-hexaméthylène diamine («Estapor»-HMD).

Exemple 2

Préparation d'un support portant des chaînes latérales constituées par des polyamines L'on procède comme décrit à l'Exemple 1, sauf en ce qui concerne l'HMD, qui est remplacée par la spermine.

Exemple 3

Fixation sur un support insoluble d'une chaîne latérale constituée par un acide aminé A 20 mg d'«ESTAPOR PSI42» portant des groupements -COOH libres, en suspension dans du tampon BBS pH 8,1, on ajoute 20 (xmoles d'acide s-aminocaproïque, dont le groupement amine primaire n'est pas en position a-. Le mélange est agité pendant 3 heures à 20°C environ, en présence de 0,02 M de EDC. Au bout de ce temps, la suspension est dialysée contre le tampon BBS jusqu'à ce que la D.O. à 230 nm soit égale à zéro. La fixation de l'acide aminé sur le support est réalisée par l'intermédiaire des groupements CONH(CH2)4COOH qui se forment au niveau des groupements -COOH libres du support.

Exemple 4 Fixation de violet de Crésyle ' A 10 mg d'«ESTAPOR» (marque de fabrique déposée par Rhône-Progil pour désigner un polystyrène carboxylé) comportant des groupements —COOH libres, en suspension dans 5 ml de 0,14 M NaCl-0,01 M Borate-HCl, pH 8,1 [BBS], on ajoute une solution de violet de Crésyle obtenue par filtration sur filtre «Millipore» 0,22 n d'une suspension de 20 mg de violet de Crésyle ultrasonnée. Le mélange est agité pendant 12 heures à 20°C en présence de 0,05 M de 1 éthyl 3-(3-dimé-thylaminopropylcarbodiimide) chlorhydrate [EDC]. A la fin de cette période, on renouvelle l'addition d'EDC et on poursuit l'agitation durant 12 heures.

Au bout de ce temps, la suspension est centrifugée à 20 000 g durant 1 heure et le culot est repris dans un tampon acétate 0,1 M à pH = 5,5, et on recentrifuge pour éliminer l'excès de violet de Crésyle. Cette opération est répétée jusqu'à ce que le surnageant soit clair. On élimine ensuite l'acétate par formation de chlorhydrate par trois lavages successifs par HCl 0,1 N, suivis de deux lavages NaOH 0,1 N, afin de régénérer les fonctions aminés, puis de deux lavages en BBS pH 8,8, pour éliminer l'excès de soude.

Le produit obtenu est conservé en tampon phosphate 0,1 M, pH 7.

Exemple 5 Fixation de la fuchsine basique On procède comme décrit dans l'exemple 4, mais à la place de 20 mg de violet de Crésyle, on ajoute 2 ml d'une solution saturée de fuchsine basique.

Exemple 6

Préparation de supports en polystyrène carboxylé DOW 816

Les réactions de couplage décrites précédemment sur les polystyrènes carboxylés «Estapor» en provenance de RHONE-PROGIL, ont également été effectuées sur des sphères de polystyrène carboxylé DOW 816 en provenance de DOW CHEMICAL CORPORATION, en procédant à des adaptations des modalités de mise en œuvre du procédé de couplage des chaînes latérales sur lesdites sphères, en tenant compte du nombre de —COOH disponibles sur ces sphères par rapport aux sphères d'«ESTAPOR».

A 180 mg de particules DOW 816, on ajoute 560 mg d'he-xaméthylènediamine (HMD) dans 20 ml final de 0,14 M NaCl,

0,01 M borate-HCl, pH 8,1. Du 1-éthyl 3-3 diméthylamino-propylcarbodiimide (EDC) est ajouté à une concentration finale de 0,05 M en deux additions successives. Après agitation à 4°C pendant 18 heures, les sphères de DOW ont été lavées par trois centrifugations successives à 20 000 g pendant 30 minutes avec le même tampon et suspendues finalement dans 13 ml du tampon phosphate 0,1 M pH 6.

A2 Préparation de supports en billes de verre porteurs de chaînes latérales comportant un-NH2 réactif

Exemple 7

Fixation d'une chaîne latérale de HMD sur billes de verre

A 1 g de billes de verre comportant des groupements -COOH libres (vendues sous la dénomination commerciale «CPG/carboxyl» par CORNING GLASS WORKS (dimension des pores: 550 Â; diamètre: 177—840 microns), l'on ajoute 5 ml de 0,1 M de tampon phosphate pH 7,0 et la suspension est dégazée sous vide. On ajoute 50 jimoles d'HMD en solution dans le même tampon, et le mélange est agité doucement à 4°C pendant 18 heures en présence de 0,05 M d'EDC. Au bout de ce temps, les billes de verre sont lavées avec le tampon phosphate.

Les groupements — NH2 terminaux des chaînes latérales d'HMD fixées sur les billes de verre sont couplés à une hydra-zine en mettant en œuvre la technique décrite à l'exemple 11 ci-dessous s'il s'agit d'une hydrazine aliphatique, ou la technique décrite à l'exemple 13 ci-dessous s'il s'agit d'une hydrazine aromatique.

Exemple 8

Fixation d'une polyamine sur une chaîne latérale se terminant par un groupement N-hydroxyl-succinimide porté par des billes de verre L'on utilise 2 g de billes de verre du commerce connues sous la dénomination commerciale de «CPG/N-OH succinimide» (vendues par CORNING GLASS WORKS), représentées par la formule:

(V) CH2-CH2-CH2-N-C-CH2-CH2-C-0-NC^3D

II

o en suspension dans 10 ml de tampon BBS pH 8,2 et dégazés sous vide, auxquelles on ajoute 40 immoles de spermine. Le mélange est agité doucement pendant 16 heures à 4°C, puis lavé avec du tampon BBS pour éliminer les produits de la réaction.

Les — NH2 terminaux des résidus polyamines sont eux-mêmes couplés à des hydrazines aliphatiques ou aromatiques selon les techniques décrites respectivement aux exemples 11 et 13 ci-dessous.

A3 Préparations de supports en billes de gel d'agarose portant des chaînes latérales comportant un —NH2 réactif

Exemple 9

Le «CH-SEPHAROSE» (marque déposée par PHARMACIA, Uppsala, Suède, pour désigner des billes de gel d'agarose) disponible dans le commerce comporte déjà des chaînes latérales d'acide e-amino-caproi'que.

B. Exemples de préparation de supports solides insolubles porteurs de chaînes latérales susceptibles de réagir avec les groupements —CHO des composés à fixer sur lesdits supports Bi Fixation de groupements fonctionnels terminaux constitués par des hydrazines

B.l.l. par des hydrazines aromatiques

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Exemple 10

Préparation d'un support en «Estapor»-HMD-p-hydrazino-benzoate

4 mg de l'«Estapor»-HMD de 0,22 [i de diamètre sont mis en suspension dans 2 ml de tampon borate comprenant 0,14 M NaCl, 0,01 M Borate-HCl, pH 8,8. A cette suspension sont ajoutées 22 [imoles d'acide p-hydrazino-benzoïque dissous dans du BBS. Le volume est ajusté à 4 ml avec du BBS. Après l'addition de 10 mg de l-éthyl-3-(3-diméthyl-amino-propyl)-carbodiimide, le tube est agité à la température du laboratoire (20°C) pendant 2 heures. Son contenu est ensuite transféré dans un sac à dialyse et dialysé à la température du laboratoire pendant 24 heures contre 300 ml de BBS (trois changements). L'on obtient ainsi un support en «ESTAPOR»-HMD-p-hydra-zino-benzoate.

Exemple 11

Fixation sur un support insoluble d'une chaîne latérale constituée par une polyamine couplée à une hydrazine aromatique.

A 7 mg d'«ESTAPOR»-spermine préparé à l'exemple 2 ci-dessus, de formule:

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«ESTAPOR»-C-N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH2

en suspension dans 15 ml de tampon BBS pH 8,1, l'on ajoute 100 [imoles d'acide p-hydrazino-benzoïque en solution aqueuse. Le mélange est agité pendant 24 heures, à la température ambiante (20°C environ) en présence de 0,05 M d'EDC. Au bout de ce temps, la suspension est dialysée contre du tampon BBS pH 8,8 jusqu'à ce que la D.O à 230 nm soit égale à zéro.

Exemple 12

Fixation d'hydrazine aromatique AIO mg d'«ESTAPOR» sous forme—NH2 (amine aromatique) en suspension dans 10 ml de phosphate 0,1 M pH 7, on ajoute 50 immoles d'acide p-hydrazinobenzoïque en solution dans du borate 0,1 M pH 8. Le mélange est agité à 20°C pendant 12 heures en présence de 0,05 M d'EDC. A la fin de cette période, on renouvelle l'addition d'EDC et on poursuit l'agitation durant 12 heures. A la fin de cette seconde période, la suspension est centrifugée à 20 000 g pendant 1 heure et le culot est repris dans du borate 0,1 M pH 8,1 et recentrifugé pour éliminer l'acide p-hydrazinobenzoïque non couplé. Ce lavage est suivi de deux autres lavages (borate 0,01 M pH 8,1), puis de deux lavages au phosphate 0,1 M pH 7. Le produit obtenu est conservé dans ce dernier tampon.

B.1.2. par des hydrazines aliphatiques

Exemple 13

Fixation sur un support insoluble d'une chaîne latérale constituée par une diamine aliphatique couplée à une hydrazine aliphatique 6,0 mg de l'«ESTAPOR»-HMD préparé à l'exemple 1 ci-dessus, de formule:

O H

II I

«ESTAPOR»-C-N-(CH2)6NH2

en suspension dans 0,1 M de tampon phosphate pH 7, sont agités à 20°C pendant 1 heure en présence de glutaraldéhyde à une concentration finale de 1,25%. Au bout de ce temps, la suspension est dialysée contre 0,1 M de tampon phosphate pH 7,0 pendant 18 heures. A la suspension obtenue après dialyse, sont ajoutés 20[xmoles de dihydrazide adipique en solution aqueuse. Le mélange est agité pendant 16 heures à 20 0 C, puis dialysé pour éliminer l'excès de dihydrazide adipique.

B.2 Fixation de groupements fonctionnels terminaux constitués par une fonction amine primaire

Exemple 14

Fixation sur un support solide insoluble d'une chaîne latérale constituée par un acide aminé couplé à une diamine L'on fixe sur les billes d'Estapor sur lesquelles a été fixé de l'acide E-aminocaproïque conformément à l'exemple 3 ci-dessus, du diaminopropane, en procédant comme suit:

Le contenu du sac de dialyse contenant la suspension de billes d'Estapor sur lesquelles est fixé l'acide £-aminocaproïque est transféré à un tube contenant 25 umoles de diaminopropane. Le mélange est agité pendant 3 heures à 20°C, en présence de 0,05 M d'EDC, puis dialysé contre du tampon BBS comme décrit à l'exemple 1 ci-dessus, à la suite de quoi le diaminopropane est couplé à l'acide e-aminocaproïque fixé sur le support insoluble.

Exemple 15

Couplage d'HMD sur des billes de gel d'agarose portant des chaînes latérales d'acide e-aminocaproïque Le couplage de la HMD sur les billes de Sepharose substituées de l'exemple 9 est réalisé en se conformant aux modalités décrites à l'exemple 7 ci-dessus.

Les — NH2 terminaux du substituant HMD de la chaîne latérale d'acide e-aminocaproïque sont eux-mêmes couplés avec une hydrazine aliphatique ou aromatique qui est substituée sur lesdits groupements — NH2 terminaux, en se conformant aux techniques décrites respectivement aux Exemples 11 et 13 ci-dessus.

B.3 Fixation sur un support solide insoluble de chaînes latérales comportant des groupements fonctionnels terminaux constitués par des groupements SH—CH2—CH—NH2 susceptibles de former un dérivé thiazolidine en présence du groupement —CHO du composé à fixer.

Exemple 16

Fixation sur un support insoluble comportant des groupements NH2 libres, d'un acide aminé comportant un groupement — SH A 2 mg d'«ESTAPOR»-NH2 en suspension dans du tampon phosphate pH 6,5, on ajoute 6 (xmoles de cystéine chlorhydrate de formule HSCH2CH NH2 COOH,HCl dissoutes dans de l'eau. Le mélange est agité à 20°C pendant 16 heures, en présence de 0,05 M d'EDC. Au bout de ce temps, les sphères d' «ESTAPOR» sur lesquelles est fixée la cystéine, sont lavées sur filtre Millipore 0,22 |x pour éliminer l'excès de cystéine et les produits de la réaction. Les sphères modifiées de la sorte sont remises en suspension dans 2 ml de tampon phosphate pH 6,5.

Exemple 17

Fixation de cystéine sur du polystyrène carboxylé DOW-HMD

A la suspension de polystyrène carboxylé DOW 816-HMD obtenue à l'Exemple 6 ci-dessus, on a ajouté 18 mg de cystéine-HCl dissous dans 2 ml de tampon phosphate 0,1 M pH 6, puis de l'EDC à une concentration finale de 0,05 M. Après 18 heures à 4°C, les sphères ont été lavées comme décrit dans l'exemple 6 ci-dessus.

II - Exemples d'oxydation des composés à fixer sur les supports

La nécessité du rôle déterminant de l'oxydation conforme à l'invention, dans la fixation sur les supports est démontrée à l'exemple 18 ci-dessous.

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Exemple 18

Mise en évidence du rôle déterminant des groupements -CHO libres des globulines dans la fixation de ces derniers sur un support insoluble Des gammaglobulines ont été oxydées comme décrit aux exemples 19 à 27 ci-dessous, mais pré-réduites en présence de NaB3Ht de manière à être marquées au tritium et à ne pas comporter de groupements —CHO libres. Des aliquots de ces gammaglobulines (0,3 ml) contenant 8400 cpm ont été mis en contact avec les échantillons cités dans le Tableau ci-dessous en présence du tampon 0,1 M PO4 pH 6,0. Après 16 heures à 4°C, les échantillons ont été filtrés sur filtres Millipore 0,22 |x, lavés quatre fois avec 5 ml du tampon suivant:

0,1 % Sérum Albumine Bovine 0,1% Triton X 100

0,14 M NaCl, 0,01 M Borate-HCl pH 8,8

Echantillon

Quantité

Volume cpm retenus sur filtre

A) Tampon

—

2

319

B) Estapor 68

500 (xg

2

311

C) Estapor NH2

500 [ig

2

276

D) Estapor NH-NH2

500 ng

2

204

Il ressort des résultats regroupés dans le Tableau ci-dessus que (1) une certaine quantité de radioactivité est retenue sur filtre; (2) le lavage par le tampon ci-dessus réduit considérablement l'adsorption sur les filtres eux-mêmes. Dans ce cas l'adsorption sur les filtres due aux gammaglobulines + tampon seul représente environ 20% de la radioactivité totale de l'ali-quot (1680 cpm) mis sur le filtre; (3) la quantité de radioactivité retenue sur filtre n'a pas augmenté de façon significative en présence d'Estapor 68 —COOH, d'Estapor 68 —NH2 ou d'Estapor NH-NH2. En effet les valeurs sont égales ou inférieures aux résultats obtenus avec le tampon seul (319 cpm). Donc il n'y a pas d'adsorption des gammaglobulines sur les trois types d'Estapor utilisés. De plus pour que cette technique de filtra-tion soit significative, il faut que la radioactivité couplée aux supports insolubles en présence des gammaglobulines oxydées dépasse les 20% trouvés avec les gammaglobulines non oxydées.

Comparaison du taux de radioactivité associée aux Estapor NH2 avec les gammaglobulines oxydées et non oxydées après réduction par NaB3Ht

Réactifs mis en présence Volumes oxydée Non oxydée ml

Estapor NH2 dans 0,1 M

P04 pH 6,0

2,00

1 mg

1 mg

Gammaglobulines cheval

oxydées

0,10

2 mg

-

Gammaglobulines cheval

non oxydées

0,10

-

2 mg

0,1 M Borate pH 8,8

0,90

+

+

NaB3H4 dans H2O

0,20

2 (iCi

2 [iCi

Après un temps de contact de 18 heures à 4°C, le contenu de chaque sac est dialysé 5 jours durant contre du BBS pH 8,8 avec trois ou quatre changements par jour, jusqu'à ce que le liquide de dialyse ne contienne plus de radioactivité. Un aliquot de chaque préparation est ensuite filtré sur Millipore 0,22 (x et lavé avec le tampon 0,1 % SAB, 0,1 % Triton X 100, BBS pH 8,8.

Sur un autre aliquot la densité optique à 550 nm est mesurée afin de déterminer la concentration d'Estapor.

Echantillon

CPM'mg

Estapor 68-NH2-

- gammaglobuline

oxydée

62 466

Estapor 68-NH2-

-gammaglobuline

non oxydée

11 135

La radioactivité trouvée avec l'Estapor 68-NH2 en présence de gammaglobulines non oxydées ne représente que 17,8% de celle trouvée associée à l'Estapor 68-NH2 en présence de gammaglobulines oxydées (Cette valeur est du même ordre de grandeur que celle due à l'adsorption sur filtre des gammaglobulines en absence d'Estapor).

Par contre avec les gammaglobulines oxydées la quantité de radioactivité associée à l'Estapor NH2 augmente cinq fois.

On donnera ci-après quelques exemples d'oxydation de divers composés comportant un résidu glucidique, par oxydation d'au moins un de leurs groupements — CH2OH en groupements — CHO.

A/ Oxydation de gammaglobulines

Exemple 19 Oxydation chimique des gammaglobulines Des gammaglobulines en provenance de la chèvre, du lapin et du cheval ont été purifiées par précipitation à l'aide de (NH4)2S04 suivie d'une Chromatographie sur DEAE-cellulose.

A 60 mg d'immunogammaglobulines de cheval (contenant des anticorps antipolyamines) en solution dans 2 ml de 0,1 M de tampon phosphate pH 6, l'on ajoute 0,2 ml de 0,15 M de NaIÛ4 soluble dans l'eau.

Le mélange est laissé à 4°C à l'abri de la lumière pendant 3 heures, puis dialysé contre le tampon 0,14 M NaCl-0,1 M PÛ4pH 6 pendant 1 heure, avec trois changements. A ce pH, le risque de formation de ponts de Schiff est amoindri entre les fonctions aldéhyde réactives obtenues par oxydation par le NaIÛ4, et les groupements — NH2 soit de la lysine, soit des groupements terminaux des protéines.

Exemple 20

Oxydation chimique d'anticorps antigammaglobulines A 520 [ig de gammaglobulines de chèvre anti-lapin dans 0,1 ml de BBS est ajouté 0,1 ml de NaI04 0,03 M. Le mélange est laissé à 4°C à l'abri de la lumière pendant 3 heures et est ensuite dialysé contre du BBS pendant 2 heures avec trois changements de tampon.

Exemple 21 Oxydation chimique de gammaglobulines A 60 mg d'immunoglobulines de cheval en solution dans 2 ml de tampon de phosphate 0,1 M, pH 6, l'on ajoute 0,2 ml de NaI04 0,15 M soluble dans l'eau.

Le mélange est laissé à 4°C à l'abri de la lumière pendant 3 heures, au bout desquelles on arrête l'action du NaIÛ4 par addition de glycérol à 0,15 M final. Après 30 minutes à 4°C, les produits de la réaction sont dialysés pendant 18 heures à 4°C avec plusieurs changements contre du tampon phosphate 0,1 M, pH 6.

B1 Oxydation de virus

Exemple 22 Préparation de virus de la rougeole oxydé A 5 ml d'une préparation antigénique de virus de la rougeole contenant 16 mg de protéine, on a ajouté 0,5 ml de NaI04 0,15 M dans du tampon phosphate de sodium 0,1 M à pH 6.

Ce mélange est laissé à 4°C à l'abri de la lumière pendant 3 heures.

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L'on ajoute ensuite 0,5 ml de Na2SÛ3 0,15 M afin d'arrêter l'action du NalCk.

Après 30 minutes à 4°C, le mélange est dialysé pendant 18 heures à 4°C afin d'éliminer l'excès de produits d'oxydation.

Exemple 23 Préparation de virus de la maladie de Carré

La technique mise en œuvre pour oxyder le virus de la maladie de carré est celle décrite à l'exemple 22 ci-dessus.

Exemple 24 Préparation de virus de la grippe oxydé

La technique mise en œuvre pour oxyder le virus de la grippe est celle décrite à l'exemple 22 ci-dessus.

Exemple 25 Préparation de virus de la rubéole oxydé

La technique mise en œuvre pour oxyder le virus de la rubéole est celle décrite à l'exemple 22 ci-dessus.

C/ Oxydation d'hormones

Exemple 26

Préparation de la gonadotrophine chrorionique humaine oxydée

La technique mise en œuvre pour oxyder cette hormone est celle décrite aux exemples 19 et 20 ci-dessus.

III - Exemples de couplages de composés comportant un résidu glucidique dont au moins un groupement — CH2OH a été oxydé en groupement —CHO, sur des supports conformes à l'invention.

Exemple 27

Exemple de couplage effectué sur un —NH2 terminal: préparation d'un réactif «ESTAPOR»-HMD-anticorps antipolyami-nes, par fixation d'anticorps sur le support

Pour préparer un réactif conforme à l'invention utilisant les anticorps antipolyamines qui sont mis en œuvre par ailleurs pour la recherche et le dosage des polyamines dans le sang des malades, l'on fixe ces anticorps par Chromatographie d'affinité de substrat sur des supports de verre contenant de la spermine, puis on les oxyde par une solution 0,06 M NaKX Après 30 minutes à 4°C dans l'obscurité, les anticorps sont lavés dans du BBS pH 8,8 afin d'éliminer l'excès de NaI04.

2 ml de 1'«Estapor»-HMD (10 mg) (préparés comme indiqué à l'exemple 1 ci-dessus) sont mélangés avec les anticorps oxydés comme décrit aux exemples 19 à 21 ci-dessus. La suspension est agitée doucement par un mouvement rotatoire à 4°C pendant 14 heures. Les bases de Schiff formées sont stabilisées par un traitement de 5 heures à 4°C avec du NaBH4 (3 [imoles} sous une agitation intermittente. La suspension est centrifugée à 10 000 tours/minute pendant 5 minutes. Le surnageant est récupéré, le culot est relavé quatre fois avec du BBS et tous les surnageants sont réunis.

Exemple 28

Exemple de couplage effectué sur une hydrazine: Préparation d'un réactif «Estapor»-HMD-p-hydrazino-benzoate-anticorps anti IgG

L'on prépare de l'«Estapor»-anticorps anti IgG de lapin, qui constitue un modèle d'utilisation des anticorps libres en solution. La préparation finale présente un très large spectre d'utilisation car elle permet par voie indirecte de détecter toutes les réactions immunologiques dans lesquelles on utilise des IgG de lapin, en vue de leur mise en évidence par la méthode indirecte.

0,1 ml de la solution de gammaglobulines oxydées obtenue à l'exemple 20 (260 ug) sont ensuite ajoutés à 1,7 mg d'«Esta-

por»-HMD-p-hydrazino-benzoate. Le mélange est agité pendant 3 heures à 4°C.

Dans l'exemple 27 ci-dessus, après le traitement décrit, les billes d'«Estapor» contenant les anticorps sont lavées et concentrées par sédimentation sur une couche de saccharose à 60% à travers une solution de saccharose à 10% (100 000 g 1 heure à 4°C). L'«Estapor» concentré à l'interphase est dialysé pour éliminer l'excès de saccharose.

Exemple 29

Exemple de couplage effectué sur un — SH terminal: Couplage d'un support insoluble comportant des groupements terminaux libres -SH aux groupements —CHO de gammaglobulines oxydées

A 2 mg d'«ESTAPOR-SH», on ajoute 1 mg de gammaglobulines oxydées comme décrit à l'exemple 19. Après 30 minutes de contact à 4°C, on observe la floculation de particules d'«ESTAPOR-SH» par formation de thiazolidines. Cette floculation ne se produit ni avec l'«ESTAPOR-NH2» ni avec l'«ESTAPOR-SH» sur lequel ont été fixées des gammaglobulines non-oxydées.

IV - Exemples de marquage isotopique des produits objet de l'invention

Exemple 30

Préparation de produits de cuplage conformes à l'invention radioactifs, par prémarquage du support de latex à l'éthanol-amine 3H ou 14C

Les billes d'«Estapor» sont rendues radioactives en fixant par liaison covalente Péthanolamine 3H ou 14C. A 20 mg de l'«Estapor» en suspension dans du BBS sont ajoutés 0,05 ml de 14C éthanolamine 10 |xCi (1,6 fiMole) et 6,0 mg de 1-éthyl-3-(3-diméthyl-aminopropyl)-carbodiimide dans un volume total de 4,0 ml. Après une agitation rotative de 2 heures à 20 °C, 20 jxmoles de HMD et 20^moles de l-éthyl-3-(3-diméthyl-aminopropyl)-carbodiimide sont ajoutés. L'agitation est maintenue pendant 2 heures puis le contenu du tube est dialysé contre du BBS jusqu'à l'élimination de la radioactivité libre.

Le produit obtenu a une radioactivité de 2,2 X106 cpm par mg de 1'«Estapor».

La fixation des anticorps est effectuée comme décrit à l'exemple 27. Le produit obtenu correspond donc à une préparation des anticorps hautement radioactifs dans laquelle les anticorps n'ont subi aucune manipulation chimique autre que la fixation au latex par la partie glucidique. Le produit peut être utilisé dans toutes les applications des dosages radio-immunologiques en mettant en œuvre soit la méthode directe soit la méthode indirecte. La mesure de la réaction s'effectue par détermination de la radioactivité soit du complexe antigè-nes-anticorps agglutinés, soit des billes n'ayant pas réagi, la séparation étant faite par centrifugation ou filtration.

Ces réactifs (radioactifs) permettent de mesurer quantitativement les antigènes à la surface des cellules, en comptant la radioactivité fixée sur les lamelles. Ainsi il est possible de quantifier les données obtenues précédemment par visualisation au microscope électronique à balayage, de ces billes.

Pour autant qu'il s'agit des produits de couplage glycoprotéines - et plus particulièrement anticorps-support comportant au moins un — NH2 réactif, par l'intermédiaire du résidu glucidique, qui ont été décrits à titre non limitatif dans les exemples 27 et 28, l'on dispose, grâce à la présente invention, d'une gamme de billes contenant des anticorps spécifiques contre différents antigènes intéressant la pathologie médicale, qui devrait permettre un séro-diagnostic rapide et facile de diverses maladies. L'utilisation des billes contenant des anticorps antigammaglobulines élargit encore les possibilités d'emploi en introduisant le procédé indirect. La quantification est facile et

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précise soit par méthode de dilution directe soit par la méthode de compétition.

Le procédé peut être appliqué à tous les dosages (hormones, médicaments etc.) basés sur une réaction immunologique. L'utilisation des billes radioactives rend le procédé aussi sensible que toutes les autres méthodes radioimmunologiques tout en diminuant le risque de modifier les anticorps ou antigènes au cours de l'iodination.

La méthode décrite présente, par rapport aux procédés couramment utilisés (dosage radioimmunologique, fluorescence, recherche de radicaux libres, dosages immunoenzymo-logiques, etc.), les avantages suivants: - facilité d'utilisation ne nécessitant pas d'équipement particulier; - mode d'emploi simple donc apprentissage rapide; - bonne sensibilité; - stabilité des réactifs qui peuvent être conservés plusieurs mois;

- très faible prix de revient.

Exemple 31

Préparation de produits de couplage marqués par marquage isotopique des anticorps I. Marquage au tritium

A 1,5 mg de gammaglobulines de chèvre anti-polyamines dans 2 ml de 0,14 M NaCl, 0,02 M tampon phosphate pH 6, on ajoute 0,65 ml de 0,06 M NaIC>4 en solution dans du tampon phosphate pH 6 (concentration finale de NalCk: 0,015 M).

Le mélange est laissé à 4°C à l'abri de la lumière pendant 3 heures et est ensuite dialysé contre le tampon 0,14 M NaCl, 0,02 M phosphate pH 6 pendant 1 heure avec trois changements pour éliminer l'excès de NalO (vérification à l'aide de papier amidonné-ioduré). A ce pH, le risque de formation de ponts de Schiff est amoindri entre les groupements —CHO réactifs ainsi formé et les groupements— NH2, soit de la lysine, soit de groupements N terminaux des protéines.

Le contenu du sac à dialyse est ensuite transféré dans un tube.

Un excès de NaB3H4 cristallin (100 mCi/mMol) en provenance de New England Nuclear) est alors ajouté, suivi d'1 ml de tampon 0,1 M borate-HCl pH 8,8 (ce changement de pH favorise la réduction des groupements —CHO en — CH2OH).

Après un temps de contact de 16 heures à 4°C, sous une hotte bien ventilée, le contenu du tube est transféré dans un sac à dialyse et dialysé jusqu'à ce que le liquide de dialyse soit exempt de toute radioactivité. L'on obtient ainsi un marquage pour les anticorps anti-polyamines de 670 c. p. m. par fig de protéines.

Il est également possible d'augmenter l'activité spécifique des anticorps en procédant de la façon suivante: à 1,5 mg de gammaglobulines oxydées on ajoute 20 |xCi d'éthanolamine 3H (3,8 Ci/mMol) à pH 8,8; les ponts de Schiff ainsi formés sont ensuite stabilisés par réduction à l'aide de NaB3H4 (5 mCi) pendant 18 heures à 4°C. L'excès de NaB3H4 est éliminé par dialyse. Ceci a permis d'obtenir des gammaglobulines anti-polyamines ayant une activité spécifique de 1807 c. p. m./u.g.

On peut obtenir, de même, des anticorps marqués au 14C en utilisant de l'éthanolamine 14C et en procédant à la réduction à l'aide de NaB3H4.

II. Couplage d'un support insoluble comportant des chaînes latérales portant au moins un -NH2 réactif aux groupements —CHO des gammaglobulines oxydées et stabilisation des ponts de Schiff par réduction au NaB3H4

La technique mise en œuvre est celle décrite aux exemples 27 et 29 ci-dessus.

L'on obtient ainsi des réactifs dont la stabilité est très longue, qui n'émettent pas de rayonnement gamma (contrairement aux procédés connus qui réalisent le marquage par iodi-nation des groupements tyrosine sur la chaîne protéique, à

l'aide d'iode radioactif) et dont l'activité biologique est inaltérée.

V - Exemples d'immunoréactifs Exemple 32 .

Préparation d'un réactif de diagnostic de la rougeole constitué par le produit de la réaction d'un support substitué, avec le virus oxydé de la rougeole I. Préparation du support substitué

a) La fixation d'une chaîne latérale portant des groupements —NH2 terminaux, constituée par une diamine, est réalisée conformément aux modalités décrites à l'exemple 1 ci-dessus.

b) La fixation sur l'«ESTAPOR-NH2» obtenu au stade précédent, d'un acide aminé comportant un groupement — SH est réalisée en mettant en œuvre les modalités décrites à l'exemple 16 ci-dessus.

II. Préparation de virus de la rougeole oxydé L'oxydation de ce virus est réalisée comme décrit à l'exemple 20 ci-dessus.

III. Couplage du virus de la rougeole oxydé, sur l'«ESTAPOR-SH» A 20 mg d'«ESTAPOR-SH» obtenu au stade Ib) ci-dessus, en suspension dans du tampon phosphate 0,1 M, pH 6,0, on ajoute 10 mg de virus de la rougeole oxydé comme décrit en II ci-dessus.

Le mélange est soumis à agitation à 4°C, pendant 18 heures. Il est ensuite centrifugé à 6000 g pendant 60 minutes. Le surnageant est recueilli et le culot est lavé à deux reprises par du tampon phosphate, pH 6,0.

Le dosage des protéines subsistant dans le surnageant permet de déterminer qu'il y a 130 [ig de protéines virales fixées par mg d'«ESTAPOR-SH».

Exemple 33

Préparation d'un réactif de diagnostic de la maladie de Carré, constitué, par le produit de la réaction d'un support substitué avec le virus oxydé de la maladie de Carré La préparation de ce réactif de diagnostic est effectuée en procédant comme décrit à l'exemple 32 I—II—III.

Exemple 34

Préparation d'un réactif de diagnostic sphères de latex-virus de la grippe

La technique mise en œuvre pour la préparation de ce réactif est celle décrite à l'exemple 32 ci-dessus, le virus de la rougeole étant toutefois remplacé par des virus de grippe.

Exemple 35

Préparation d'un réactif de diagnostic sphères de latex-virus de la rubéole

On utilise, pour préparer ce réactif, la même technique que celle décrite dans l'exemple 32 pour la préparation du réactif de diagnostic de la rougeole, en remplaçant toutefois, le virus de la rougeole par le virus de la rubéole.

Exemple 36

Préparation d'un réactif de diagnostic sphères de latex-virus cytomégalique L'on utilise, pour préparer ce réactif, la même technique que celle décrite à l'exemple 32, en remplaçant toutefois le virus de la rougeole par le virus cytomégalique.

Exemple 37

Préparation d'un réactif de diagnostic «ESTAPOR»-anticorps I. Préparation du support substitué La fixation sur les billes de latex d'une chaîne latérale portant des groupements — NH2 terminaux et la fixation sur cette s

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:haîne d'un acide aminé comportant un groupement — SH sont effectuées comme décrit à l'exemple 28 ci-dessus.

II. L'oxydation chimique des gammaglobulines est effectuée comme décrit à l'exemple 21

III. Couplage des gammaglobulines oxydées sur l'«ESTA-

POR»-SH obtenu au cours du stade I Ce couplage est réalisé en mettant en œuvre la technique décrite à l'exemple 29 ci-dessus. L'on a réalisé de cette manière le couplage de gammaglobulines contenant des anticorps antipolyamines, de gammaglobulines-antiproduits de la dégradation du fibrinogène (FDP), des gammaglobulines anti IgG humaine, des gammaglobulines anti IgM humaine, des gammaglobulines anti IgG de lapin et des gammaglobulines anti IgG de cobaye.

Exemple 38

Préparation d'un réactif sphères de latex gonadotrophine chorionique humaine (GCH)

I. Préparation d'Estapor substitué La fixation sur les billes de latex, d'une chaîne latérale portant des —NH2 réactifs et la fixation sur cette chaîne d'un acide aminé comportant un groupement — SH sont effectuées comme décrit à l'exemple 16 ci-dessus.

II. Préparation de la gonadotrophine chorionique humaine oxydée

L'oxydation a été effectuée comme décrit à l'exemple 26 ci-dessus.

III. Couplage d'Estapor-SH à la gonadotrophine chorionique Ce couplage a été réalisé en mettant en œuvre la technique décrite dans l'Exemple 29 ci-dessus.

L'efficacité des réactifs de diagnostic ainsi obtenus est démontrée dans le Chapitre VI ci-après.

VI. - Efficacité des immunoréactifs conformes à l'invention

La réaction antigène-anticorps est effectuée dans les conditions de température, durée de contact, etc. les plus appropriées à chaque cas particulier. La réaction positive se manifeste par l'agglutination des billes ou sphères. La lecture des résultats se fait en estimant l'agglutination soit simplement par macroagglutination, soit par microagglutinations sur plaques alvéolaires.

Il est possible de quantifier la réaction par une lecture néphélométrique directe ou en séparant les complexes formés soit par filtration, soit par centrifugation et lecture de la densité optique des sphères de latex restantes, ou par mesure de la radioactivité dans le cas de latex marqués présents sur les filtres ou dans le culot.

Al Tests par macroagglutination sur plaques de verre

Exemple 39

Test d'activité agglutinante d'«Estapor-SH»-virus de la rougeole oxydé

Les dilutions d'antisérum ont été effectuées dans le tampon suivant: 1% sérum albumine bovine, 0,14 M NaCl; 0,01 M Tris-HCl, pH 8,2.

Le réactif latex-virus de la rougeole conforme à l'invention a été utilisé, dans ce test, à raison de 4 ng/ml.

Les résultats obtenus par macroagglutination du réactif conforme à l'invention sur plaques de verre sont illustrés à la fig. 3 dans laquelle le résultat obtenu avec le témoin (sérum de lapin anti-VSV) se trouve dans la partie gauche de la figure, et le résultat obtenu avec le sérum de lapin anti-rougeole se trouve dans la partie droite de la figure.

Exemple 40

Test d'activité agglutinante d'«Estapor-SH»-virus de la maladie de Carré oxydé Ce réactif a été testé dans les conditions rapportées à l'exemple 39 ci-dessus.

Des résultats similaires ont été obtenus en présence de sérum de lapin anti-VSV comme témoin, et de sérum de lapin anti-virus de la maladie de Carré comme essai.

Exemple 41

Test d'activité agglutinante d'Estapor-GCH par macroagglutination sur plaque Résultats: la réaction est positive avec un sérum de lapin anti-GCH dilué jusqu'à 1/160. A cette dilution l'inhibition de la réaction a été obtenue avec l'urine de la femme enceinte.

Exemple 42

Test d'activité agglutinante du réactif sphères de latex DOW-antifibrinogène par macroagglutination sur plaques Les sphères de DOW anti-FDP ont été mises en suspension dans le tampon suivant: 1 % sérum albumine bovine, 0,14 M NaCl, 0,1 M Tris-HCl pH 8,2, 0,0015 M azide de soude, à raison de 8 mg/ml.

La réaction est positive avec le fibrinogène humain jusqu'à 4 [J.g/ml, ainsi que cela ressort de la fig. 4 annexée, et avec le sérum humain dilué à 1/10.

Exemple 43

Dosage de polyamines dans l'urine par macroagglutination sur plaques de verre Les billes d'Estapor-polyamine préparées conformément à l'exemple 3 ci-dessus, sont mises en suspension dans un tampon contenant 1% de sérum d'albumine bovine, 0,14 M NaCl, 0,1 M Tris, pH 8,3, 0,001 M d'azide de sodium, à raison de 4 mg de latex/ml.

Une agglutination positive a été obtenue avec le sérum de chèvre antipolyamines dilué au 1/30™= dans ce même tampon; la réaction négative a été obtenue avec ce même sérum de chèvre, avant immunisation.

Dans ces conditions, la réaction positive a été inuibée par l'urine de la femme enceinte.

B/ Tests par microagglutination sur plaques alvéolaires

Exemple 44

Test de l'activité de microagglutination de l'«Estapor-SH»-virus de la rougeole oxydé Les résultats-obtenus sont illustrés à la fig. 2 des dessins annexés, à partir d'Estapor coloré suivant l'exemple 4.

Les dilutions d'antisérum ont été effectuées dans le tampon suivant: 0,14 M NaCl, 0,01 M borate-HCl, pH 8,1.

A: Sérum de lapin J anti-rougeole préparé sur cellules Véro; B: Sérum de lapin M anti-rougeole préparé sur cellules Véro; C: Sérum de lapin C anti-VSV (VSV = Vesicular Stomatitis Virus) utilisé comme témoin.

La dilution du sérum est la suivante:

Rangée 1:1/10 Rangée 5:1/160 Rangée 9:1/2560

2:1/20 - 6:1/320 - 10:1/5120

3:1/40 - 7:1/640 - 11:1/10240 4:1/80 - 8:1/1280

La rangée 12 ne contient que du tampon.

Le réactif latex-virus de la rougeole conforme à l'invention a été utilisé à raison de 675 [xg/ml.

La réaction est positive de Ai à A6 et négative de A7 à A12. La réaction est positive de Bi à B 5 et négative de Bô à Bi2. La réaction est négative de Ci à C12.

Il ressort du test illustré à la fig. 2 que les trois témoins A12, B12, C12 sont négatifs et qu'il n'y a pas de réaction non spécifique avec le sérum C.

La sensibilité de la réaction a été augmentée en soumettant les sphères de latex-virus de la rougeole conformes à l'invens

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tion à un traitement préalable au tritium X-100 à 1 %: avec ce latex-rougeole tritié, la réaction négative avec le sérum J ne commence qu'à Aio et avec le sérum M à Bô. La réaction avec le sérum C est totalement négative. Cette spécificité de réaction a été contrôlée par des essais avec latex-Véro, c'est-à-dire un extrait de cellules Véro utilisées pour préparer le virus de la rougeole, et couplé au latex dans les conditions décrites à l'exemple 32. On n'a observé aucune réaction entre le réactif latex-Véro et les sérums J. M et C, ce qui permet de conclure que la réaction avec le réactif latex-rougeole conforme à l'invention est spécifique et d'une très grande sensibilité. CI Quantification de la réaction de diagnostic par lecture néphélométrique directe

Exemple 45

Mesure directe par néphélométrie pour des gammaglobulines oxydées couplées à des supports conformes à l'invention Pour réaliser une réaction directe d'agglutination de supports antipolyamines avec des antigènes, on ajoute à une quantité fixe du réactif ci-dessus («ESTAPOR»-antipolyamines), à savoir 2 ng/ml dans 0,1% de Triton Xioo-tampon BBS pH 8,1, des quantités croissantes (de 15 à 500 nanogrammes/ml d'antigènes). Le mélange est laissé 45 heures en présence. La lumière diffusée à 90° par le mélange est mesurée. Les résultats obtenus sont représentés à la fig. 1 par la courbe I pour des gammaglobulines de lapin normal utilisées comme antigènes et par la courbe II pour l'acide Poly L glutamique spermine utilisé comme autre antigène, les quantités d'antigène introduites étant portées en abrisse et la lumière diffusée à 90° en ordonnée: la sensibilité et la précision de la mesure sont de l'ordre du nanogramme.

Exemple 46

Test d'activité d'un réactif de diagnostic «Estapor»-anticorps par néphélométrie Les dilutions d'antigènes et de latex-anticorps anti-polyamines sont effectuées au tampon «Borate BBS» filtre sur filtre «Millipore» 0,22 [i (Borate Buffer Saline = 0,01 M Na2B407 0,15 M NaCl, HCl pH 8,1). Après la mise en contact des réactifs, les échantillons et les témoins sont incubés 1 h à 37°C, puis à la température ambiante.

L'équilibre est déjà atteint à la 45™° heure d'incubation,

dans le cas de 0,1 nmole de spermine couplée à des molécules d'acide poly-L-glutamine (P. L. G. Spm) en présence de 2 (ig de latex-antipolyamine (latex couplés à des anticorps de chèvre immunisée contre les polyamines).

La spécificité de cette réaction a été mise en évidence par comparaison des réactions d'agglutination obtenue en présence de l'antigène P. L. G. Spm avec les latex-antipolyamines et des latex contrôles couplés à des globulines de lapin témoin.

L'application au dosage d'un antigène nécessite la détermination du point d'équivalence: maximum de l'augmentation d'intensité lumineuse diffusée en fonction du rapport latex-anticorps sur antigène.

Ce rapport au point d'équivalence est une constante pour un lot de latex-anticorps donné. Il permet, connaissant la concentration de latex-anticorps au point d'équivalence, de déduire la concentration inconnue d'antigène présent.

Dans la pratique, devant une préparation d'antigène de concentration inconnue, il est préférable de faire une gamme de concentrations de latex-anticorps.

L'on prépare une série témoin, et une série recevant une quantité constante d'antigène.

I est l'intensité lumineuse diffusée par les témoins.

l'est l'intensité lumineuse diffusée par les essais contenant l'antigène.

I est une fonction linéaire de la concentration de latex-anticorps dans le domaine exploré: de 62,5 ng à 8 ug/ml.

A chaque point de la gamme le rapport 171 % traduit le phénomène d'agrégation des sphères de latex en présence de l'antigène correspondant.

Dans le cas d'une préparation de latex couplé à des globulines de chèvres immunisées contre le fibrinogène humain: pour 0,35 ng de fibrinogène humain, en présence de concentrations variables de latex-antifibrinogène, le point d'équivalence est atteint pour 200 ng de latex anti-fibrinogène, ce qui correspond à un rapport latex-anticorps/antigène de 570. Cette préparation permet de doser avec une précision suffisante jusqu'à un minimum de 70 pg de fibrinogène humain.

Le rapport au point d'équivalence n'évolue pas de façon notable au cours du stockage d'une préparation de latex-anticorps plusieurs mois durant, à 4°C. Ceci est probablement dû à la liaison covalente des anticorps au latex et à l'élimination après couplage des anticorps simplement adsorbés. D/ Quantification de la réaction de diagnostic par lecture de la densité optique

Exemple 47

Pour réaliser une réaction directe d'agglutination de l'«Esta-por»-antipolyamines avec des polyamines, l'on ajoute à une quantité fixe d'«Estapor»-antipolyamines (6 [ig), préparé conformément à l'exemple 17 ci-dessus, des quantités croissantes (de 31 à 2000 nmoles) d'antigènes (spermine, spermidine, putrescine liée à l'acide poly-L-glutamique et lysine HCl). Le mélange est laissé 30 minutes à 25°C puis une nuit à 4°C.

Après centrifugation à 3000 tours/minute pendant 15 minutes pour sédimenter les billes d'«Estapor» et l'antigène qui s'y est fixé, la densité optique du surnageant est mesurée à 230 nm. Les résultats obtenus sont présentés dans le dessin annexé, qui représente, dans l'ordre de réaction, les courbes I pour la spermine, II pour la spermidine, III pour la lysine, IV pour la putrescine et V pour le témoin, avec une limite de détectabilité pour la spermine de 32 nmoles, la densité optique ayant été portée en ordonnée et les quantités de nmoles d'antigènes ajoutées, en abcisse.

E/ Quantification de la réaction de diagnostic par mesure de la radioactivité de latex marqués

Exemple 48

L'excellente sensibilité des réactifs conformes à la présente invention a été mise en évidence dans le cadre d'une étude comparative d'agglutination réalisée respectivement avec les produits de couplage tels que décrits par R. S. MOLDAY et collaborateurs dans l'Art antérieur (références citées plus haut), et les produits de couplage radioactifs obtenus conformément à l'exemple 30 ci-dessus et dont il sera rendu compte ci-après.

Etude comparative d'agglutination des produits de couplage selon MOLDAY et collaborateurs d'une part et selon l'invention d'autre part.

I. - Des billes de polystyrène carboxylé sphérique de 0,3 (référence PSI 68 de RHONE-PROGIL7, traitées par l'étha-nolamine marquée 14C sont substituées conformément à l'exemple 1 ci-dessus, par de l'hexaméthylènediamine, puis activées par réaction avec le glutaraldéhyde à 1,25% pendant 1 heure à la température du laboratoire (20°C), après quoi l'on procède à des dialyses prolongées pour éliminer l'excès de glutaraldéhyde.

Les billes substituées obtenues de la sorte, sont évaluées à 560 microgrammes de billes par ml et leur radioactivité est de 95 000 cpm par ml.

On leur ajoute 520 microgrammes d'anticorps antigammaglobulines de lapin provenant de chèvres, et on laisse en contact sous agitation pendant 5 heures à la température du laboratoire (2 0°C).

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II. - Des billes PSI 68 de 0,30 u préfiltrées sur filtre et marquées à la 14C éthanolamine sont substituées, conformément à l'exemple 10 ci-dessus, par de Phexaméthylènediamine et de l'acide p-hydrazinobenzoïque. L'on obtient 560 microgrammes de billes substituées de la sorte, par ml et leur radioactivité est évaluée à 87 000 cpm par ml.

On leur ajoute 0,15 ml (soit 520 microgrammes) d'anticorps antigammaglobulines de lapin, provenant de chèvres, préalablement oxydés par du periodate de sodium, conformément à la présente invention.

Dans les deux cas, les complexes billes-anticorps ont été séparés des anticorps libres par centrifugation à travers une couche de 10% de saccharose, l'excès de saccharose étant éliminé par dialyse.

III. - Etude comparative proprement dite Les préparations I et II ci-dessus ont alors été traitées comme suit:

A / à 0,15 ml de chacune de ces deux préparations ont été ajoutés:

0,25 ml de 2% de sérum de veau décomplémenté 0,1 ml de sérum de lapin aux dilutions suivantes:

1/500 1/1000 1/5000 1/10000

B/ la composition des contrôles a été la suivante:

0,15 ml de chacune des préparations I ou II 0,25 ml de 2% de sérum de veau décomplémenté 0,1 ml de tampon BBS, pH 8,8.

Les quatre tubes, l'Essai A et le contrôle B pour chaque préparation I et II, sont incubés à 4°C pendant 48 heures, puis l'on filtre 0,4 ml de chaque tube à travers un filtre Millipore 0,80 n présaturé avec 2% de sérum de veau décomplémenté. Les filtres sont lavés avec 4x2 ml de 2% de sérum de veau, suivis de 10 ml de tampon BBS, puis suivis de 4x2 ml de tampon BBS.

Les filtres sont comptés dans 10 ml du mélange triton x 100/ toluène 1:2 vol/vol.

Les résultats obtenus sont consignés dans le Tableau ci-dessous:

10

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Tableau

Préparation Maximum de réacti- Diminution progressive de la radioactivité Point d'équivalence vité retenu sur le aux dilutions filtre, avec le sérum dilué au ...

I 90 cpm 1/1000 1/5000 1/10000 1/500

dilution au 1/500

II 113 cpm dilution au

1/5000 1/500 1/1000 1/5000

Il ressort de ce Tableau que:

— comparativement au procédé de fixation qui fait l'objet de la présente invention pour lequel on a obtenu un point d'équivalence de 1/5000, la fixation des anticorps sur les particules de latex conformément à la technique de MOLDAY et Collaborateurs, pour laquelle on a obtenu un point d'équivalence de 1/ 500, implique que la réalisation du couplage par cette dernière technique provoque une perte importante de sensibilité.

Il résulte de ce qui précède que, quels que soient les modes de mise en œuvre, de réalisation et d'application adoptés, l'on obtient des produits résultant du couplage de composés comportant un résidu glucidique, par l'intermédiaire de leur(s) groupement^) —CHO, avec des supports solides, insolubles comportant des chaînes latérales portant au moins un — NH2

réactif qui réagit avec le groupement —CHO susdit, pour réaliser le produit de couplage susdit, lesquels produits sont utilisables, en particulier en tant que réactifs de diagnostic présentant une grande stabilité et une très grande sensibilité.

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en œuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les varian-50 tes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention, et elle s'étend en particulier à d'autres systèmes anticorps-antigènes que ceux qui ont été décrits, à titre d'exemples non limitatifs, dans les exemples.

45

B

4 feuilles dessins

Claims (10)

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1. Procédé pour la préparation d'un support solide insoluble sur lequel sont fixées des chaînes latérales portant au moins un — NH2 réactif, caractérisé en ce que la fixation des chaînes latérales portant au moins un — NH2 réactif, sur le support solide insoluble susdit, est réalisée en fixant un composé choisi dans le groupe qui comprend les aminés, les polyamines, les diacides, les acides aminés, les hydrazines aliphatiques ou aromatiques comportant éventuellement une fonction acide, par liaisons de covalence sur ledit support, en présence d'un agent de condensation approprié.

2. Procédé selon la revendication 1 pour la préparation d'un support solide insoluble sur lequel sont fixées des chaînes latérales portant au moins un — NH2 couplé au moins par l'intermédiaire de leur — NH2 réactif, avec un composé azoté choisi parmi les aminés aliphatiques ou aromatiques, les hydrazines aliphatiques ou aromatiques, ou les acides aminés comportant éventuellement conjointement un groupe — SH et un groupe — NH2, caractérisé en ce qu'on prépare un support d'après le procédé selon la revendication 1 et en ce que le

—NH2 réactif est couplé avec le composé azoté en présence d'un agent de couplage.

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REVENDICATIONS

3. Support solide insoluble, obtenu d'après le procédé selon la revendication 1.

4. Support selon la revendication 3, obtenu d'après le procédé selon la revendication 2.

5. Utilisation du support selon la revendication 3 pour la fixation chimique de composés organiques comportant un résidu glucidique, caractérisé en ce que l'on transforme, au cours d'un premier stade, au moins un groupe-CH2OH

du résidu glucidique du composé organique, en un groupe -CHO, par oxydation, et en ce que l'on fait réagir, au cours d'un second stade le(s) groupe(s) -CHO obtenu(s) au moins avec un —NH2 réactif porté par des chaînes latérales fixées sur le support solide insoluble, réalisant ainsi la fixation chimique du composé organique sur ledit support.

6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisé en ce que le groupe — NH2 réactif porté par les chaînes latérales fixées sur le support solide insoluble est une fonction amine primaire et en ce qu'on stabilise la base de Schiff obtenue par réduction chimique.

7. Utilisation selon la revendication 5, caractérisé en ce que les chaînes latérales fixées sur le support solide insoluble sont choisies parmi les hydrazines.

8. Utilisation selon la revendication 5, caractérisé en ce que les chaînes latérales fixées sur le support solide insoluble sont choisies parmi les acides aminés comportant conjointement un groupe — SH et un groupe — NH2 et en ce que l'on obtient un hétérocycle du type notamment de la thiazolidine.

9. Utilisation selon la revendication 5 pour la préparation de réactifs biologiques pour le sérodiagnostic.

10. Produits obtenus selon la revendication 5.