CH622555A5 - - Google Patents

Description

Wiederfindung

Spalte 1

Spalte 2

Spalte 3

Probe

Zusätze mit Serum-Leerwert ohne Serum-Leerwert erfindungsgemäss

Pyruvat

ohne NADH-regenerie

mg/100 ml

rendes System

Skalen

% Wieder

Skalen

%

Skalen

%

teile findung teile

teile

Probe 1

72

Û 100

73

101

71,5

99,3

Probe 1

2

72

100

78

108

72

100

Probe 1

4

74

102,7

81,5

113

72,5

100,6

Probe 1

6

72,5

100,6

86

119

72,5

100,6

Probe 1

8

73

101

91,5

127

72

100

Probe 1

10

72

100

96,5

134

71

98,6

Probe 1 enthält 30,0 mg Glycerin in 100 ml bidest. Wasser

Es wird deutlich, dass nur das erfindungsgemässe Verfahren (Spalte 3) mit einem Messkanal übereinstimmende Werte zu 35 dem als richtig beurteilten 2-Kanal-Verfahren mit Proben-Leerwert liefert (Spalte 1).

Beispiel 2

Bestimmung von Neutralfett im Humanserum 40

Als Probe wurden Humanseren genommen, denen Pyruvat in den Konzentrationen 2,4,6,8 und 10 mg/100 ml zugesetzt wurden. Apparativ wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet. Die Lösungen haben folgende Bestandteile und werden mit folgender Fliessgeschwindigkeit gepumpt: 45

Probe: 0,05 ml/min

Lösung 1 :

0,1 M Triäthanolamin-Puffer, pH = 7,8, mit 0,8 ml/min, ent50

haltend: 0,025 mM NADH, 0,13 mM ATP, 0,04 mM PEP, 1,0 mM Magnesiumsulfat, 2 g/100 ml Äthanol, 1,6 IU LDH/ml, 0,26 IU PK/ml, 180 IU ADH/ml, 11 IU Esterase/ml, 400 IU Lipase/ml, 0,1 mg Na-Dodecylsulfat/ml.

Lösung 2 (Dialysat):

0,1 M Triäthanolamin-Puffer, pH = 7,6 mit 0,6 ml/min, enthaltend: 0,1 mM NADH, 0,53 mM ATP, 0,18 mM PEP, 1,0 mM Magnesiumsulfat, 6,4 IU LDH/ml, 1,0 IU PK/ml.

Lösung 3:

7,5 mM Magnesiumsulfat mit 0,1 ml/min, enthaltend: 2 IU Glycerokinase/ml.

Die Inkubationszeit beträgt 7,5 min bei 37 °C. Die Messwerte sind in Tabelle 2 zusammengestellt.

Tabelle 2

Wiederfindung

Spalte 1

Spalte 2

Spalte 3

Probe

Zusätze mit Serum-Leerwert ohne Serum-Leerwert erfindungsgemäss

Pyruvat

ohne NADH-regenerie

mg/100 ml

rendes System

Skalen

% Wieder

Skalen

%

Skalen

%

teile findung teile

teile

Probe 1

_

29

100

31

106,8

29

100

= 138 mg

2

29

100

35,5

122

29

100

Neutral-

4

29

100

39,5

136

29,5

102

fett/100

ml Serum

6

28

97

44,5

153

29,0

100

8

28

97

49

168

29,0

100

10

28

97

53,5

184

29,0

100

5

622555

Wiederlïndung

Spalici Spalle 2 Spalte 3

Probe Zusätze mit Serum-Leerwert ohne Serum-Leerwert erfindungsgemäss

Pyruvat ohne NADH-regenerie-

mg/100 ml rendes System

Skalen- ".«Wieder- Skalen- % Skalen- "»

teile findung teile teile

Probe 2

-

21,5

113

19

100

= 114 mg

2

25

131

19

100

Neutral-

4

28,5

150

19

100

fett/100

ml Serum

6

32

168

19

100

8

36,5

192

19

100

10

40,5

213

19

100

Beispiel 3 tion, Maximum liegt bei 450 nm.) Im übrigen werden experi-Ausschaltung von Interferenzen anderer gefärbter Substanzen 2o mentell gleiche Bedingungen eingehalten wie in Beispiel 2 mit

Eine Probe, in der Neutralfett bestimmt werden soll, wird der Ausnahme, dass zur Kontrolle in der Versuchsreihe Spalte mit einer Probe vermischt, die eine hohe Bilirubin-Konzentra- 3 ohne Kinase (Glycerokinase) gemessen wurde.

tion enthält. (Bilirubin ist ein körpereigenes Abbauprodukt des

Blutfarbstoffs und zeigt bei 340 oder 366 nm eine Grenzabsorp- Die Ergebnisse zeigt Tabelle 3.

25

Tabelle 3

Wiederfindung

Spalte 1

Spalte 2

Spalte 3

Probe

Zusätze ohne Serum-Leerwert ohne Serum-Leerwert wie bei Erfindung,

Bilirubin mit NADH-regenerie-

ohne Kinase (GK) und aber ohne Kinase (GK)

(mg/100 ml)

rendem System (komplett)

NADH-regen. System

Skalen

% Wieder

Skalen

%

Skalen

%

teile findung teile

teile

Probe 1

0

11

Û 100

1*

9

0

0

Probe 2

0

18

4 100

1,7*

9,5

0

0

Probe 2

2

18

100

1,7*

9,5

0

0

Probe 2

5

18,5

102,7

1,7*

9,5

0

0

Probe 2

10

17,5

97,2

1,7*

9,5

0

0

Probe 3

0

37,5

Ù 100

1,3*

3,5

0

0

* Dieser Wert repräsentiert endogenes Pyruvat

Die Wiederfindungsquote von 0% in Spalte 3 beweist, dass kein Einfluss von Bilirubin zu messen ist.

G

Claims (4)

622555 2 PATENTANSPRÜCHE dass man das Verfahren auf einem Analysenautomaten durch-

1. Analysen verfahren zur enzymatischen Bestimmung von führt.

Substraten, die unter dem Einfluss einer spezifischen Kinase 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

durch ATP unter Bildung von ADP phosphoryliert werden dass man die Enzyme durch Dialyse, Ultrafiltration, umge-können, bzw. von Substraten, aus denen sich entsprechend 5 kehrte Osmose oder Zentrifugieren abtrennt, phosphorylierbare Umsetzungsprodukte erhalten lassen, in 5. Anwendung des Verfahrens nach Anspruch 1 zur Bestim-

biologischen Flüssigkeiten, durch Phosphorylierung des Sub- mung von Substraten, die unter dem Einfluss einer spezifischen strates oder eines daraus enzymatisch erhaltenen Umsetzungs- Kinase durch ATP unter Bildung von ADP phosphoryliert wer-produktes mit ATP in Gegenwart einer spezifischen Kinase den können, bzw. von Substraten, aus denen sich entsprechend unter Freisetzung von ADP, Umsetzung des letzteren mit Phos-1» phosphorylierbare Umsetzungsprodukte erhalten lassen, im phoenolpyruvat in Gegenwart von Pyruvatkinase unter Bil- Serum.

dung von Pyruvat, Hydrierung des Pyruvats mittels NADH in Gegenwart von Lactatdehydrogenase und Messung des NADH-Verbrauchs, dadurch gekennzeichnet, dass man die Flüssigkeitsprobe in Abwesenheit der spezifischen Kinase und 's in Gegenwart eines NADH-regenerierenden enzymatischen Die Erfindung betrifft ein Analysenverfahren zur enzymati-

Systems mit den für die Reaktionsfolge benötigten Reagentien sehen Bestimmung von Substraten, die unter dem Einfluss einer umsetzt, anschliessend die Enzyme durch eine semipermeable spezifischen Kinase durch ATP unter Bildung von ADP pho-Membran aus der Reaktionslösung abtrennt und nach Umset- sporyliert werden können, bzw. von Substraten, aus denen sich zung des Filtrats mit der spezifischen Kinase, Pyruvatkinase 20 entsprechend phosphorylierbare Umsetzungsprodukte erhal-und Lactatdehydrogenase die Messung durchführt. ten lassen, in biologischen Flüssigkeiten, insbesondere in Kör-

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, perflüssigkeiten, wie Serum.

dass man Alkoholdehydrogenase mit Alkohol als Substrat ver- In der Analytik werden Bestandteile in biologischen Flüs-

wendet. sigkeiten häufig nach folgendem allgemeinen Reaktions-

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, 25 schema bestimmt:

S + ATP ^vez' Klnase<> S-Phosphat + ADP

-r-jT r

ADP + PEP ATP + Pyruvat

T,T)XT

Pyruvat + NADH r—L-Lactat + KAD

35

In den obigen Gleichungen bedeutet S das zu bestimmende benleerwertes, in dem die spezifische Kinase, also das phospho-Substrat oder ein daraus durch eine vorgeschaltete enzymati- rylierende Enzym, fehlt, durchgeführt. Durch Subtraktion der sehe Reaktion erhaltenes Umsetzungsprodukt, ATP Adenosin- in den beiden Parallelbestimmungen erhaltenen Ergebnisse triphosphat, S-Phosphat phosphoryliertes Substrat oder lässt sich dann der Gehalt an der gesuchten Substanz bestim-

Umsetzungsprodukt, ADP Adenosindiphosphat, PEP Phos- 40 men. Nachteilig daran ist, dass doppelt so viel der an sich sehr phoenolpyruvat, PK Pyruvatkinase, NADH reduziertes teuren enzymatischen Reagentien benötigt werden, als für die

Nicotinamid-adenin-dinucleotid, LDH Lactatdehydrogenase Bestimmung erforderlich wäre, mithin die Reagentienkosten und NAD oxydiertes Nicotinamid-adenin-dinucleotid. praktisch verdoppelt werden. Nachteilig ist weiter, dass die

Bei der obigen Reaktionsfolge ist die Menge des in der Durchführung des Verfahrens mit dem derzeit gebräuchlichen ersten Reaktion gebildeten ADPs direkt der unbekannten 45 Analysenautomaten nur möglich ist, wenn zwei Messkanäle zur Menge an S proportional. Messgrösse ist der Verbrauch an Verfügung stehen.

NADH, welches durch Bestimmung der Absorptionserniedri- Eine andere Möglichkeit zur Beseitigung des durch endo-

gung bei 340 nm, Hg 365 oder Hg 335 routinemässig gemessen gene Substanzen verursachten Fehlers besteht darin, die endo-wird. Das obige Reaktionssystem ist allgemein anwendbar zur genen Substanzen vor Zugabe der spezifischen Kinase abrea-Bestimmung von Substanzen, die unter dem Einfluss einer spe- 50 gieren zu lassen, in einer ersten Bestimmung den NADH-Ver-zifischen Kinase durch ATP unter Bildung von ADP phospho- brauch zu messen, dann die spezifische Kinase zuzusetzen und ryliert werden können bzw. von Substanzen, aus denen sich ent- erneut den NADH-Verbrauch zu bestimmen. Dieses Verfahren sprechend phosphorylierbare Umsetzungsprodukte erhalten ist aufwendig und hat den besonders schweren Nachteil, dass es lassen. auf den bekannten automatischen Analysengeräten überhaupt

Das oben dargestellte Reaktionsschema wird insbesondere 55 nicht durchführbar ist.

im klinisch chemischen Labor in grossem Umfang zur Bestim- Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Ver-

mung verschiedener Substrate benutzt, wobei die Spezifität für fahren der oben beschriebenen Art zu schaffen, bei welchem ein bestimmtes Substrat jeweils durch die spezifische Kinase nur eine einzige Messung durchgeführt werden muss und bei erzielt wird. Das System hat jedoch den Nachteil, dass in biolo- welchem der-Verbrauch an Enzymen verringert wird. Aussergischen Flüssigkeiten, wie Körperflüssigkeiten und insbeson- 60 dem soll das Verfahren zur Durchführung auf gebräuchlichen dere im Serum, in der Regel andere Substanzen vorliegen, die Analysenautomaten geeignet sein.

ebenfalls zu einer NADH-verbrauchenden Reaktion führen. Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäss durch ein

Dies gilt ganz besonders für endogenes Pyruvat. Ein weiterer Analysenverfahren zur enzymatischen Bestimmung von SubGrund für die Berücksichtigung eines Probenleerwertes ist die Straten in biologischen Flüssigkeiten, insbesondere im Serum, unterschiedliche Eigenabsorption der biologischen bzw. Kör- 65 durch Phosphorylierung des Substrates oder eines daraus enzy-perflüssigkeiten bei den genannten Wellenlängen, zum Beispiel matisch erhaltenen Umsetzungsproduktes mit ATP in Gegen-aufgrund ihres Bilirubingehaltes. Man hat daher derartige wart einer spezifischen Kinase unter Freisetzung von ADP,

Bestimmungen bisher in der Regel unter Mitführung eines Pro- Umsetzung des letzteren mit Phosphoenolpyruvat in Gegen-

J

wart von Pyruvatkinase unter Bildung von Pyruvat, Hydrierung des Pyruväts mittels NADH in Gegenwart von Lactatdehydrogenase und Messung des NADH-Verbrauchs, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass die Flüssigkeitsprobe in Abwesenheit der spezifischen Kinase und in Gegenwart eines NADH- 5

regenerierenden enzymatischen Systems mit den für die Reaktionsfolge benötigten Reagentien umgesetzt wird, anschliessend die Enzyme durch eine semipermeable Membran aus der Reaktionslösung abgetrennt werden und nach Umsetzung des Filtrats mit der spezifischen Kinase, Pyruvatkinase und Lactat- 10 dehydrogenase die Messung durchgeführt wird.

Das Verfahren der Erfindung eignet sich prinzipiell für alle enzymatischen Analysenverfahren, bei welchen entweder das zu bestimmende Substrat selbst oder aber das Produkt einer vorgeschalteten enzymatischen Reaktion mit ATP und der ent-15 sprechenden spezifischen Kinase umgesetzt wird unter Bildung von ADP. Beispiele für derartige Verfahren sind die Bestimmung von freiem Glycerin (Klin. Wschr. 40,362 [1962]), Neutralfett (Klin. Wschr. 44,262 [1966]), Creatinin (Scand. J. Clin. Lab. Invest. 29, Suppl. 126 [1972]), Glucose (Biochem. Z. 328, 20 499 [1957]).

Wird das Substrat der spezifischen Kinase selbst bestimmt, beispielsweise im Falle der Messung von freiem Glycerin, so wird nur die hierfür spezifische Kinase, im Beispielsfall also Glycerinkinase, zugesetzt. Falls die Kinase ein aus dem eigent- 25 lieh zu bestimmenden Substrat enzymatisch erhaltenes Umsetzungsprodukt phosphoryliert, ist zusätzlich noch das enzymati-sche Reaktionssystem zur Gewinnung des Umsetzungsproduktes aus dem Substrat in der ersten Verfahrensstufe erforderlich.

Ein Beispiel hierfür ist die Neutralfettbestimmung (Tri- 30 glyceridbestimmung), wobei die Fette mit Lipase und gegeben-falls Esterase umgesetzt werden unter Bildung von Glycerin und Fettsäure und gebildetes Glycerin dann wiederum mit ATP und Glycerinkinase phosphoryliert wird.

Die für die Reaktionsfolge benötigten Reagentien sind aus- 35 ser den erwähnten Enzymen ATP, PEP und NADH auch die Hilfsstoffe wie Puffersubstanzen, anorganische Salze, beispielsweise Magnesiumsulfat, gegebenenfalls oberflächenaktive Substanzen und dergleichen. Alle diese Stoffe sind dem Fachmann im Rahmen der durchzuführenden Reaktionsfolge bekannt und 40 brauchen hier nicht im einzelnen beschrieben zu werden.

Das NADH-regenerierende enzymatische System besteht im wesentlichen aus einer NADH-spezifischen Dehydrogenase sowie einem Substrat für diese Dehydrogenase. Bevorzugt wird im Rahmen der Erfindung ein derartiges System, welches 45 Alkoholdehydrogenase und als Substrat Alkohol enthält.

Andere NADH-spezifische Dehydrogenasen und Substrate für diese können jedoch in gleicher Weise verwendet werden.

Als semipermeable Membran wird im Rahmen der Erfindung vorzugsweise eine Membran verwendet, welche Eiweiss- 50 stoffe zurückhält, niedermolekulare Substanzen jedoch durch-lässt. Beispiele für geeignete Membranen dieser Art sind Dialysemembranen, Ultrafiltrationsmembranen, Membranen für die umgekehrte Osmose und ähnliches.

Bei Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens auf 55 einem der handelsüblichen Analysenautomaten kann als semipermeable Membran zur Abtrennung der Proteine der in derartigen Apparaten in der Regel vorgesehene Dialyseapparat eingesetzt werden. Es ist daher möglich, das erfindungsge-mässe Verfahren auf derartigen Automaten durchzuführen, bo ohne diese abändern zu müssen und ohne dass ein zweiter Messkanal erforderlich ist. Bei dieser Ausführungsform der Erfindung wird daher im Prinzip von einer Kompartmentie-rung der Umsetzungen Gebrauch gemacht, wobei die enzymatischen Reaktionen, ausgenommen die Phosphorylierung mit 65 ATP (infolge Fehlens der spezifischen Kinase) in einem ersten Kompartment ablaufen, die niedermolekularen Bestandteile dann durch die semipermeable Membran in ein zweites Kom-

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partment übertreten, ohne dass irgendwelche Messungen erforderlich sind, im zweiten Kompartment dann die spezifische Kinase, PK und LDH zugesetzt werden und der NADH-Verbrauch photometrisch gemessen wird. Da durch die semipermeable Membran auch das NADH-regenerierende System infolge Abtrennung der hierzu benötigten Dehydrogenase ausgeschaltet wird, entspricht der gemessene NADH-Ver-brauch allein der Menge des phosphorylierten Substrates unter Ausschaltung der Störreaktionen. Das Ausmass der so vermiedenen Störreaktionen wird dabei erkennbar, wenn man zum Beispiel für Serum die dort üblichen Pyruvatkonzentrationen mit den Konzentrationen vergleicht, die verschiedene nach dem oben beschriebenen Verfahren zu bestimmende Substanzen im Serum normalerweise aufweisen:

Serumbestandteil Konzentration % Gehalt des

Normalbereich Pyruvats bezo-(mM) gen auf Substrat

Pyruvat 0,05-0,07

Triglyceride 0,8-1,94 3% bis 10%

freies Glycerin 0,03-0,145 30% bis 200%

Creatinin 0,07-0,13 40%bisl00%

Die obige Tabelle lässt erkennen, dass allein die durch Pyruvat bedingte Störung ein mehrfaches des durch das Substrat bedingten Messwertes ausmachen kann. Hinzu kommt, dass in den biologischen Flüssigkeiten in vielen Fällen auch andere störende Stoffe wie Bilirubin vorliegen, deren Einfluss ebenfalls beim erfindungsgemässen Verfahren ausgeschaltet wird. Um dies zu zeigen, wurden steigende Mengen Bilirubin (bis zu 10 mg/100 ml) in einem Serum gelöst. Die Bestimmung des Glyceringehaltes mit einem derartigen Reagensgemisch ergab mit und ohne Bilirubin gleiche Werte. Bei Weglassung des NADH-regenerierenden Systems ergaben sich etwa 10% höhere Messwerte, die auf dem endogenen Pyruvatgehalt beruhen, jedoch überraschenderweise von der Bilirubinkonzentra-tion praktisch unabhängig waren. Durch das erfindungsge-mässe Verfahren werden daher auch Störungen ausgeschaltet, die auf eine Eigenfärbung der biologischen Flüssigkeit zurückzuführen sind. Worauf dieser Effekt beruht, ist nicht bekannt.

Durch die Beseitigung der Notwendigkeit, einen Proben-leerwert zu bestimmen, wird der Verbrauch an teuren Enzymen bis zu 50% herabgesetzt und gleichzeitig wird die Automa-tengängigkeit des Verfahrens nicht nur beibehalten, sondern es wird auch möglich, mit solchen Analysenautomaten zu arbeiten, die nur einen einzigen Messkanal aufweisen. Bei Analysenautomaten mit zwei Messkanälen wird nicht nur ein Messkanal für andere Bestimmungen freigehalten, sondern auch die Handhabung wird wesentlich einfacher, denn der zeitliche, elektronische und optische Abgleich zweier Analysenautomatenkanäle wird eingespart.

Erfindungsgemäss werden auch Störungen durch einen Gehalt an hochmolekularen Proteinen, die das Licht stark streuen und auf diese Weise eine Lichtabsorption vortäuschen, ausgeschaltet, beispielsweise bei stark lipämischen Seren.

Besonders gute Ergebnisse wurden im erfindungsgemässen Verfahren erzielt mit Äthanol und Alkoholdehydrogenase als NADH-regenerierendes System, wenn die Äthanolkonzentration mindestens 2 g/100 ml Puffer und die ADH-Konzentration mindestens 180 IU/ml betrug. Geeignet erwies sich in diesem Falle insbesondere Triäthanolamin-Puffer 0,05 bis 0,2 M, pH 7 bis 8.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter. Beispiel 1

Glycerinbestimmung

In die Bestimmung wurde eingesetzt eine wässrige Probe,

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4

Glycerin-Konzentration von 30 mg/100 ml. Der Einfluss von Pyruvat wurde studiert durch Zusatz von 2,4,6,8 und 10 mg Pyruvat/100 ml zur Probe. Ausgeführt wurde die Bestimmung am Auto-Analyzer, 2. Generation, einem Analysenautomaten der Firma Technicon, USA. Dieser Apparat arbeitet mit einem kontinuierlichen Fliesssystem, die Dosierungen der einzelnen Reagentien werden deshalb in der Dimension (ml/min) angegeben. Zur Abtrennung der Enzyme diente eine handelsübliche Dialysezelle der Firma Technicon, USA. Die Probe wurde (0,05 ml/min) mit einer Lösung, enthaltend Triäthanolamin-Puf-fer, 0,1 M, pH = 7,6, NADH (0,025 mM), ATP (0,13 mM), PEP (0,04 mM), Magnesiumsulfat (1,0 mM), Äthanol (2 g/100 ml), und den Enzymen LDH (1,6 IU/ml), PK (0,3 IU/ml) sowie ADH (180 IU/ml) verdünnt mit einer Fliessgeschwindigkeit von 0,8 ml/min. Dialysiert wird gegen eine Lösung, enthaltend Tri-äthanolamin-Puffer, 0,1 M, pH = 7,6, mit NADH (0,1 mM), ATP (0,53 mM), PEP (0,18 mM), Magnesiumsulfat (1,0 mM), LDH (6,4 IU/ml), PK (1 IU/ml), mit einer Fliessgeschwindigkeit von 0,6 ml/min.

Dem Dialysat wird die Lösung der Glycerokinase (2 IU/ml in 7,5 mM Magnesiumsulfat) zugemischt, Fliessgeschwindigkeit 0,1 ml/min. Die Extinktionsabnahme, ausgedrückt in Skalenteile, nach einer Inkubationszeit von 7,5 min bei 37 °C wird gemessen. In Tabelle 1 sind die Ergebnisse zusammengefasst.

Tabelle 1