CH623231A5 - Process for preparing an antischistosomal immunologial agent and product obtained - Google Patents
Process for preparing an antischistosomal immunologial agent and product obtained Download PDFInfo
- Publication number
- CH623231A5 CH623231A5 CH753277A CH753277A CH623231A5 CH 623231 A5 CH623231 A5 CH 623231A5 CH 753277 A CH753277 A CH 753277A CH 753277 A CH753277 A CH 753277A CH 623231 A5 CH623231 A5 CH 623231A5
- Authority
- CH
- Switzerland
- Prior art keywords
- target antigens
- drug
- antigens
- target
- ligand
- Prior art date
Links
- 230000000347 anti-schistosomal effect Effects 0.000 title claims description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 title description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 81
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 78
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 78
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 27
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 27
- 241000242678 Schistosoma Species 0.000 claims description 24
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 24
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 18
- 230000001843 schistosomicidal effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 239000000677 immunologic agent Substances 0.000 claims description 5
- 229940124541 immunological agent Drugs 0.000 claims description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 22
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 14
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 13
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 12
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 11
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 10
- HTKFORQRBXIQHD-UHFFFAOYSA-N allylthiourea Chemical compound NC(=S)NCC=C HTKFORQRBXIQHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- 201000004409 schistosomiasis Diseases 0.000 description 10
- 229950008495 amphotalide Drugs 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- GIIGAFADHXYOPM-UHFFFAOYSA-N amphotalide Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1OCCCCCN1C(=O)C2=CC=CC=C2C1=O GIIGAFADHXYOPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 8
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- RDXLYGJSWZYTFJ-UHFFFAOYSA-N Niridazole Chemical compound S1C([N+](=O)[O-])=CN=C1N1C(=O)NCC1 RDXLYGJSWZYTFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 7
- AOGOCZMBIYQOFE-UHFFFAOYSA-B hexasodium;2-[1,2-dicarboxylato-2-[(4,5-dicarboxylato-1,3,2-dithiastibolan-2-yl)sulfanyl]ethyl]sulfanyl-1,3,2-dithiastibolane-4,5-dicarboxylate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].S1C(C([O-])=O)C(C([O-])=O)S[Sb]1SC(C([O-])=O)C(C(=O)[O-])S[Sb]1SC(C([O-])=O)C(C([O-])=O)S1 AOGOCZMBIYQOFE-UHFFFAOYSA-B 0.000 description 7
- 229960005130 niridazole Drugs 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 6
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- AUVVAXYIELKVAI-UHFFFAOYSA-N SJ000285215 Natural products N1CCC2=CC(OC)=C(OC)C=C2C1CC1CC2C3=CC(OC)=C(OC)C=C3CCN2CC1CC AUVVAXYIELKVAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 6
- 229960002694 emetine Drugs 0.000 description 6
- AUVVAXYIELKVAI-CKBKHPSWSA-N emetine Chemical compound N1CCC2=CC(OC)=C(OC)C=C2[C@H]1C[C@H]1C[C@H]2C3=CC(OC)=C(OC)C=C3CCN2C[C@@H]1CC AUVVAXYIELKVAI-CKBKHPSWSA-N 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 6
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 5
- MBYXEBXZARTUSS-QLWBXOBMSA-N Emetamine Natural products O(C)c1c(OC)cc2c(c(C[C@@H]3[C@H](CC)CN4[C@H](c5c(cc(OC)c(OC)c5)CC4)C3)ncc2)c1 MBYXEBXZARTUSS-QLWBXOBMSA-N 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 229910052787 antimony Inorganic materials 0.000 description 5
- AUVVAXYIELKVAI-UWBTVBNJSA-N emetine Natural products N1CCC2=CC(OC)=C(OC)C=C2[C@H]1C[C@H]1C[C@H]2C3=CC(OC)=C(OC)C=C3CCN2C[C@H]1CC AUVVAXYIELKVAI-UWBTVBNJSA-N 0.000 description 5
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 5
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 241000252983 Caecum Species 0.000 description 4
- WATWJIUSRGPENY-UHFFFAOYSA-N antimony atom Chemical compound [Sb] WATWJIUSRGPENY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- AVTYONGGKAJVTE-OLXYHTOASA-L potassium L-tartrate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O AVTYONGGKAJVTE-OLXYHTOASA-L 0.000 description 4
- 229940111695 potassium tartrate Drugs 0.000 description 4
- 239000001472 potassium tartrate Substances 0.000 description 4
- 235000011005 potassium tartrates Nutrition 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 3
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- HUEYSSLYFJVUIS-MRFSYGAJSA-N (2s,3r,11bs)-2-[[(1r)-6,7-dimethoxy-1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-1-yl]methyl]-3-ethyl-9,10-dimethoxy-2,3,4,6,7,11b-hexahydro-1h-benzo[a]quinolizine;hydron;chloride Chemical compound Cl.N1CCC2=CC(OC)=C(OC)C=C2[C@H]1C[C@H]1C[C@H]2C3=CC(OC)=C(OC)C=C3CCN2C[C@@H]1CC HUEYSSLYFJVUIS-MRFSYGAJSA-N 0.000 description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 5,5-diethylbarbituric acid Chemical compound CCC1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000237852 Mollusca Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000212255 Sylvilagus aquaticus Species 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 229960001923 emetine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 2
- LAOOXBLMIJHMFO-UHFFFAOYSA-N 1-[2-(diethylamino)ethylamino]-4-methylthioxanthen-9-one;hydron;chloride Chemical compound Cl.S1C2=CC=CC=C2C(=O)C2=C1C(C)=CC=C2NCCN(CC)CC LAOOXBLMIJHMFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003948 anatoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002141 anti-parasite Effects 0.000 description 1
- 229940026189 antimony potassium tartrate Drugs 0.000 description 1
- SZXAQBAUDGBVLT-UHFFFAOYSA-H antimony(3+);2,3-dihydroxybutanedioate Chemical compound [Sb+3].[Sb+3].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O.[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O.[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O SZXAQBAUDGBVLT-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000003096 antiparasitic agent Substances 0.000 description 1
- 229960002319 barbital Drugs 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- WBTCZEPSIIFINA-MSFWTACDSA-J dipotassium;antimony(3+);(2r,3r)-2,3-dioxidobutanedioate;trihydrate Chemical compound O.O.O.[K+].[K+].[Sb+3].[Sb+3].[O-]C(=O)[C@H]([O-])[C@@H]([O-])C([O-])=O.[O-]C(=O)[C@H]([O-])[C@@H]([O-])C([O-])=O WBTCZEPSIIFINA-MSFWTACDSA-J 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000012817 gel-diffusion technique Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 102000010705 glucose-6-phosphate dehydrogenase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040005050 glucose-6-phosphate dehydrogenase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001012 protector Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- RGHFKWPGWBFQLN-UHFFFAOYSA-M sodium;5,5-diethylpyrimidin-3-ide-2,4,6-trione Chemical compound [Na+].CCC1(CC)C([O-])=NC(=O)NC1=O RGHFKWPGWBFQLN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0003—Invertebrate antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/10—Anthelmintics
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
La présente invention concerne un procédé de préparation d'un agent immunologique antischistosomique. Elle concerne aussi le produit obtenu. The present invention relates to a process for the preparation of an antischistosomal immunological agent. It also relates to the product obtained.
Dans la lutte contre les grandes endémies parasitaires, peu de moyens curatifs ou prophylactiques sont totalement efficaces, qu'il s'agisse de la chimiothérapie ou de la vaccinothérapie. In the fight against major parasitic endemics, few curative or prophylactic means are totally effective, whether it be chemotherapy or vaccinotherapy.
Dans le premier cas, dans l'état actuel des connaissances, on ne traite la bilharziose que par la chimiothérapie, notamment par le niridazole qui est commercialisé en particulier sous la marque Ambilhar. Ce produit guérit la maladie, mais ne protège pas contre une infection ultérieure. L'infestation est réalisée par voie transcutanée: des larves infestantes, appelées cercaires, traversent la peau, se transforment et, tout en grandissant, parviennent au foie et deviennent matures quelques semaines après l'infestation transcutanée. Les mâles et femelles s'accouplent, puis les femelles vont pondre leurs œufs dans les capillaires péri-intestinaux (bilharziose intestinale) ou périvésicaux (bilharzioses urinaires). Ces œufs vont traverser la paroi intestinale ou vésicale, vont être éliminés à l'extérieur et libérer une larve qui infestera un mollusque aquatique. Dans ce mollusque, cette larve se multiplie et se transforme en cercaires qui vont infester l'homme. In the first case, in the current state of knowledge, bilharziasis is treated only with chemotherapy, in particular with niridazole which is marketed in particular under the brand Ambilhar. This product cures the disease, but does not protect against further infection. The infestation is carried out by the transcutaneous route: infesting larvae, called cercariae, cross the skin, transform and, while growing, reach the liver and become mature a few weeks after the transcutaneous infestation. The males and females mate, then the females will lay their eggs in the peri-intestinal capillaries (intestinal bilharziasis) or perivesical capillaries (urinary bilharziasis). These eggs will cross the intestinal or bladder wall, will be eliminated outside and will release a larva which will infest an aquatic mollusk. In this mollusk, this larva multiplies and turns into cercariae which will infest humans.
En résumé, la chimiothérapie n'immunise pas. In summary, chemotherapy does not immunize.
Dans le deuxième cas, c'est-à-dire la vaccinothérapie, en règle générale, le moyen de protéger un individu contre les agents infectieux, bactéries ou virus, consiste à l'immuniser contre les antigènes de ces agents infectieux. Mais, dans le cas des affections parasitaires, en particulier la schistosomiase, il n'a encore jamais été possible de déclencher une réponse immunitaire efficace et protectrice. In the second case, that is to say vaccinotherapy, as a general rule, the means of protecting an individual against infectious agents, bacteria or viruses, consists in immunizing him against the antigens of these infectious agents. However, in the case of parasitic diseases, in particular schistosomiasis, it has never been possible to trigger an effective and protective immune response.
Pratiquement, la seule arme dont on dispose actuellement est la chimiothérapie, qui, bien que curative, ne pourra empêcher une réinfection. In practice, the only weapon currently available is chemotherapy, which, although curative, cannot prevent reinfection.
L'inventeur a abordé le problème sous un angle immunologique, dans le cadre de la schistosomiase ou bilharziose, affection qui atteint actuellement environ 300 millions d'individus. On sait que les médicaments schistosomicides agissent au niveau de sites-cibles du parasite, ces sites étant constitués par des antigènes, que l'on dénommera dans ce qui suit antigènes-cibles, et qui représentent des structures moléculaires essentielles à l'intégrité et à la survie du parasite. L'inventeur a utilisé des médicaments schistosomicides connus comme ligands, notamment en Chromatographie d'affinité, pour tenter d'isoler lesdits antigènes-cibles dont le pouvoir immunogène a été apprécié soit par immunisation active ou transfert passif d'anticorps. En d'autres termes, l'invention permet la préparation d'un nouvel agent immunologique antiparasitaire constitué d'extraits de schistosomes et notamment d'antigènes-cibles de médicaments schistosomicides. The inventor approached the problem from an immunological angle, in the context of schistosomiasis or bilharziasis, a condition which currently affects approximately 300 million people. It is known that schistosomicidal drugs act at target sites of the parasite, these sites being constituted by antigens, which will be referred to in the following as target antigens, and which represent molecular structures essential for the integrity and survival of the parasite. The inventor used schistosomicidal drugs known as ligands, in particular in affinity chromatography, in an attempt to isolate said target antigens whose immunogenicity was assessed either by active immunization or passive transfer of antibodies. In other words, the invention allows the preparation of a new antiparasitic immunological agent consisting of extracts of schistosomes and in particular of target antigens of schistosomicidal drugs.
Les produits obtenus se prêtent au traitement notamment préventif de la schistosomiase. En effet, les antigènes-cibles injectés dans l'organisme y déterminent la formation d'anticorps, dirigés contre ces antigènes-cibles, et protecteurs de la schistosomiase. Il faut en outre remarquer qu'il n'a, jusqu'à présent, été possible d'obtenir des anticorps véritablement protecteurs contre le parasite, notamment lorsqu'on utilise comme antigène immunisant un extrait total d'antigènes de parasites constitué par le surnageant d'un broyât de parasites dans une solution de NaCl par exemple. Le procédé de préparation est caractérisé par le fait que l'on met en contact un médicament schistosomicide connu comme ligand avec un extrait total d'antigènes de schistosomes de façon que les anti-gènes-cibles se fixent sur le médicament. The products obtained lend themselves to the preventive treatment of schistosomiasis in particular. In fact, the target antigens injected into the body determine the formation of antibodies there, directed against these target antigens, and protectors of schistosomiasis. It should also be noted that, until now, it has only been possible to obtain truly protective antibodies against the parasite, in particular when a total extract of parasite antigens constituted by the supernatant is used as the immunizing antigen. of a ground material of parasites in a NaCl solution for example. The preparation process is characterized in that a schistosomicidal drug known as a ligand is brought into contact with a total extract of schistosome antigens so that the target anti-genes bind to the drug.
Eventuellement, on élue lesdits antigènes-cibles de façon à les isoler. De préférence, le procédé consiste à utiliser une Chromatographie d'affinité, dans laquelle le ligand est constitué par un médicament schistosomicide qui sert d'agent de fixation des antigènes-cibles, ledit ligand étant immobilisé sur support insoluble de façon que ces antigènes-cibles soient retenus puis élués par un moyen adéquat pour être ensuite injectés à des animaux dans l'organisme desquels ils déterminent la formation d'anticorps protecteurs efficaces contre la schistosomiase. Optionally, said target antigens are eluted so as to isolate them. Preferably, the method consists in using affinity chromatography, in which the ligand consists of a schistosomicidal drug which serves as an agent for fixing the target antigens, said ligand being immobilized on an insoluble support so that these target antigens are retained and then eluted by an appropriate means to be then injected into animals in the body of which they determine the formation of protective antibodies effective against schistosomiasis.
On peut aussi utiliser une Chromatographie d'affinité dans laquelle le ligand est un médicament schistosomicide non fixé et non immobilisé, mais qui soit utilisé dans des conditions de solution sursaturée telle qu'une quantité déterminée de ligand reste insoluble dans le procédé d'isolement des antigènes-cibles. It is also possible to use affinity chromatography in which the ligand is an unbound and non-immobilized schistosomicidal drug, but which is used under conditions of supersaturated solution such that a determined quantity of ligand remains insoluble in the process for the isolation of target antigens.
L'extrait sec constitué du ligand schistosomicide porteur d'antigènes-cibles peut être utilisé pour le traitement de la schistosomiase après mise en suspension dans un solvant approprié, par exemple. The dry extract consisting of the schistosomicide ligand carrying target antigens can be used for the treatment of schistosomiasis after suspension in a suitable solvent, for example.
Lorsqu'on considère ce résultat, il faut rappeler que les antigènes totaux du schistosome injectés à ces mêmes animaux ne déterminent aucune synthèse d'anticorps protecteurs, ce qui montre l'intérêt du procédé de l'invention. < When considering this result, it should be remembered that the total schistosome antigens injected into these same animals do not determine any synthesis of protective antibodies, which shows the advantage of the process of the invention. <
L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples ci-après qui indiquent aussi quelques applications thérapeutiques effectuées au stade expérimental sur des animaux. The invention will be better understood using the following examples which also indicate some therapeutic applications carried out at the experimental stage in animals.
L'analyse immunochimique a montré que le schistosome représentait un mélange très complexe d'antigènes. Parmi les nombreuses méthodes d'étude utilisées, l'immunoélectrophorèse a permis de mettre en évidence au moins 25 systèmes précipitants dont certains manifestent une nature allergénique ou supportent une activité enzymatique. Parmi ces antigènes à fonction biologique importante, se trouvent les antigènes-cibles des médicaments schistosomicides dont on a montré pour certaines une activité inhibitrice d'enzymes du parasite. On a utilisé ces médicaments comme ligands en Chromatographie d'affinité pour tenter d'isoler les antigènes-cibles, caractériser leurs activités enzymatiques et leur localisation au niveau du parasite ainsi que leur pouvoir immunogène. Immunochemical analysis has shown that the schistosome represents a very complex mixture of antigens. Among the many study methods used, immunoelectrophoresis has made it possible to highlight at least 25 precipitating systems, some of which manifest an allergenic nature or support an enzymatic activity. Among these antigens with an important biological function are the target antigens of schistosomicidal drugs, some of which have been shown to inhibit parasite enzymes. These drugs have been used as affinity chromatography ligands in an attempt to isolate target antigens, characterize their enzymatic activities and localization at the parasite level, as well as their immunogenicity.
Exemples Examples
1 ) Obtention d'antigènes-cibles 1) Obtaining target antigens
Les antigènes-cibles sont isolés d'un extrait antigénique total de schistosomes (Schistosoma monsoni) préparé à partir de vers adultes récoltés chez le hamster, si ce n'est pas spécifié autrement. 3500 vers fraîchement récoltés sont broyés dans 2 ml de NaCl 0,5M, congelés et décongelés en broyant à l'appareil de Potter, Target antigens are isolated from a total antigenic extract of schistosomes (Schistosoma monsoni) prepared from adult worms harvested from the hamster, if not otherwise specified. 3500 freshly harvested worms are ground in 2 ml of 0.5M NaCl, frozen and thawed by grinding with the Potter apparatus,
5 5
10 10
15 15
20 20
25 25
30 30
35 35
40 40
45 45
50 50
55 55
60 60
65 65
3 3
623 231 623,231
puis centrifugés à 40000 g pendant 30 mn. Le surnageant est utilisé comme antigène total. then centrifuged at 40,000 g for 30 min. The supernatant is used as the total antigen.
Les médicaments schistosomicides utilisables comme ligands sont par exemple le niridazole (Ciba 32,644 Ba), la thiosinamine (Fluka), l'astiban (Roche), le chlorhydrate d'émétine (Rhône-Poulenc) et l'amphotalide (6171 Rhône-Poulenc). Schistosomicidal drugs which can be used as ligands are, for example, niridazole (Ciba 32.644 Ba), thiosinamine (Fluka), astiban (Roche), emetine hydrochloride (Rhône-Poulenc) and amphotalide (6171 Rhône-Poulenc) .
a) Chromatographie d'affinité Préparation des ligands immobilisés a) Affinity chromatography Preparation of immobilized ligands
Les supports connus sous les dénominations commerciales AH- et CH-sépharose (Pharmacia-Suède) permettent la synthèse d'absorbants spécifiques dans lesquels le ligand est séparé du support par une chaîne à 6 atomes de carbone. Le ligand est fixé au support par une réaction de couplage en un temps, à la carbo-diimide. La CH-sépharose possède des groupements carboxyliques libres qui peuvent être utilisés pour coupler des ligands à groupements aminés primaires libres. L'AH-sépharose possède des groupements aminés primaires libres qui peuvent être utilisés pour coupler des groupements carboxyliques. Le protocole de couplage à la carbodiimide recommandé par Pharmacia est utilisé. Le niridazole (30 mg/10 ml eau), la thiosinamine (30 mg/10 ml eau), l'amphotalide (30 mg/10 ml dioxanne) sont couplés à 2 g de gel CH-sépharose. L'astiban (30 mg/15 ml eau) et le tartrate double d'antimoine et de potassium (30 mg/10 ml eau) sont couplés à 2 g de gel d'AH-sépharose. Le protocole opératoire utilisé pour chaque médicament est le même. La poudre lyophilisée d'AH- ou CH-sépharose est pesée, puis mise à gonfler dans un excès de solution de NaCl 0,5M. Pour éliminer lactose et dextran, le gel est lavé avec la solution de NaCl 0,5M, puis avec l'eau distillée pour éliminer le NaCl. La solution de ligand est ajoutée au gel. Le pH de la suspension est ajusté entre 4,5 et 6. Une proportion finale liquide/gel (2/1) convient pour une douce agitation qui se fait à la température du laboratoire. La poudre de carbodiimide est ajoutée à une concentration finale de 0,1 M. Le pH est maintenu entre 4,5 et 6 pendant 1 h. La réaction se poursuit pendant 24 h à la température du laboratoire. Le gel est lavé successivement dans des solutions tampons alcalines et acides contenant du NaCl molaire. Si le dioxanne a été utilisé pour la dissolution du ligand, il est nécessaire de laver le gel avec ce solvant. Le gel est finalement lavé avec l'eau distillée. The supports known under the trade names AH- and CH-Sepharose (Pharmacia-Sweden) allow the synthesis of specific absorbents in which the ligand is separated from the support by a chain with 6 carbon atoms. The ligand is attached to the support by a one-time coupling reaction to the carbo-diimide. CH-Sepharose has free carboxylic groups which can be used to couple ligands with free primary amino groups. HA-Sepharose has free primary amino groups which can be used to couple carboxylic groups. The carbodiimide coupling protocol recommended by Pharmacia is used. Niridazole (30 mg / 10 ml water), thiosinamine (30 mg / 10 ml water), amphotalide (30 mg / 10 ml dioxane) are coupled to 2 g of CH-sepharose gel. The astiban (30 mg / 15 ml water) and the double antimony and potassium tartrate (30 mg / 10 ml water) are coupled to 2 g of HA-sepharose gel. The operating protocol used for each drug is the same. The lyophilized powder of AH- or CH-sepharose is weighed, then allowed to swell in an excess of 0.5M NaCl solution. To remove lactose and dextran, the gel is washed with 0.5M NaCl solution, then with distilled water to remove the NaCl. The ligand solution is added to the gel. The pH of the suspension is adjusted between 4.5 and 6. A final liquid / gel proportion (2/1) is suitable for gentle stirring which is carried out at laboratory temperature. The carbodiimide powder is added to a final concentration of 0.1 M. The pH is maintained between 4.5 and 6 for 1 h. The reaction continues for 24 h at laboratory temperature. The gel is washed successively in alkaline and acidic buffer solutions containing molar NaCl. If dioxane has been used for the dissolution of the ligand, it is necessary to wash the gel with this solvent. The gel is finally washed with distilled water.
b) Isolement des antigènes-cibles au moyen de ces ligands immobilisés b) Isolation of target antigens by means of these immobilized ligands
L'extrait antigénique brut de schistosome (3500 vers #/20 mg poids sec) est passé sur la colonne de 2 ml de gel. La colonne est lavée avec une solution de NaCl 0,5M jusqu'à ce que la densité optique à 280 nm soit nulle. Les composants antigéniques fixés sont élués avec du tampon glycocolle-HCl 0,2M, NaCl 0,5M pH 2,8. L'éluat est immédiatement neutralisé dans du tampon phosphate M pH 8, puis dialysé contre de l'eau. La quantité de produit obtenu est appréciée en d, 0 à 280 nm. The crude schistosome antigenic extract (3500 to # / 20 mg dry weight) is passed over the column of 2 ml of gel. The column is washed with a 0.5M NaCl solution until the optical density at 280 nm is zero. The fixed antigenic components are eluted with 0.2 M glycocolle-HCl buffer, 0.5 M NaCl pH 2.8. The eluate is immediately neutralized in phosphate buffer M pH 8, then dialyzed against water. The amount of product obtained is assessed in d, 0 to 280 nm.
c) Chromatographie d'affinité sur ligands non immobilisés c) Affinity chromatography on non-immobilized ligands
Une quantité de 1,5 mg de médicament se trouve dans les conditions d'expérience sous forme insoluble pendant le contact avec l'extrait antigénique du ver et pendant les lavages réalisés avec des solutions saturéesdemédicament.L'extraitd'antigène(0,l ml= 1 mg poids sec) de schistosomes [récoltés chez la souris (pour l'immunisation des souris] ou chez le hamster (pour l'immunisation des lapins) est mis en contact avec 2 mg de niridazole, 5 mg de thiosinamine, 10 mg de tartrate d'antimoine-potassium, 40 mg d'astiban, 15 mg d'émétine-hydrochloride, 3 mg d'amphotalide. Après 1 h de contact à 37° et 30 mn à température du laboratoire, le médicament insoluble est lavé trois fois avec 10 ml de solution saturée du médicament considéré. Le ligand antigène-cible servira à l'immunisation des souris ou des lapins. An amount of 1.5 mg of drug is found in the experimental conditions in insoluble form during contact with the antigenic extract of the worm and during the washes carried out with saturated drug solutions. The antigen extract (0.1 ml = 1 mg dry weight) of schistosomes [harvested from mice (for immunization of mice] or from hamsters (for immunization of rabbits) is brought into contact with 2 mg of niridazole, 5 mg of thiosinamine, 10 mg antimony potassium tartrate, 40 mg astiban, 15 mg emetine hydrochloride, 3 mg amphotalide After 1 h of contact at 37 ° and 30 min at laboratory temperature, the insoluble drug is washed three times times with 10 ml of saturated solution of the drug under consideration. The antigen-target ligand will be used to immunize mice or rabbits.
2) Caractérisation immunochimique et localisation parasitaire des antigènes-cibles 2) Immunochemical characterization and parasitic localization of target antigens
Cette étude est menée en utilisant les I.S. du lapin injectés avec les différents antigènes-cibles. This study is conducted using the I.S. rabbit injected with the different target antigens.
a) Immunisation des lapins a) Rabbit immunization
Une quantité de médicament insoluble, incubée avec l'extrait antigénique de schistosome (la totalité de l'insoluble obtenu dans les conditions décrites), est injectée au lapin (Vaitukaitis et al.). A quantity of insoluble drug, incubated with the antigenic schistosome extract (all of the insoluble material obtained under the conditions described), is injected into the rabbit (Vaitukaitis et al.).
Le sang est prélevé au jour 35 (Sj, au jour 50 (S2) et au jour 80 (S3)- Blood is drawn on day 35 (Sj, day 50 (S2) and day 80 (S3) -
Pour les études réalisées en immunoélectrophorèse et en immunofluorescence, les I.S. sont préalablement absorbés par les antigènes d'hôte. L'absorption est réalisée en ajoutant 10 mg de sérum de hamster lyophilisé et 10 mg de foie de hamster lyophilisé à 1 ml d'I.S. Après incubation 2 h à 37e C, le mélange est laissé une nuit à 4° C, puis centrifugé. Le surnageant représente l'I.S. absorbé. For studies carried out in immunoelectrophoresis and immunofluorescence, the I.S. are previously absorbed by host antigens. The absorption is carried out by adding 10 mg of lyophilized hamster serum and 10 mg of lyophilized hamster liver to 1 ml of I.S. After incubation for 2 h at 37 ° C., the mixture is left overnight at 4 ° C. and then centrifuged. The supernatant represents the I.S. absorbed.
b) Etude des antigènes-cibles en immunoprécipitation b) Study of target antigens in immunoprecipitation
L'immunoélectrophorèse classique est menée selon le protocole décrit par Capron et al. en utilisant l'extrait antigénique de schistosome et les différents I.S. anti-antigènes-cibles. Conventional immunoelectrophoresis is carried out according to the protocol described by Capron et al. using the schistosome antigen extract and the various I.S. anti-target antigens.
L'immunoélectrophorèse bidimensionnelle est inspirée de la technique décrite par Laurell. Des lames de verre de 5 x 5 cm sont utilisées. La migration de l'antigène Sm (2 mg) dans un gel d'agarose 1 % en tampon véronal pH 8,2 (véronal sodé 16 g, HCl N 22 ml/eau OSP 1000 ml) se fait pendant 2 h sous une ddp 12,5 V aux bords des lames. La deuxième migration a lieu dans un gel d'agarose contenant l'I.S. (agarose 1,3% 2,34 ml; I.S. 1,16 ml) pendant 1 nuit sous une ddp 3 V aux bords des lames. Two-dimensional immunoelectrophoresis is inspired by the technique described by Laurell. 5 x 5 cm glass slides are used. The migration of the Sm antigen (2 mg) in a 1% agarose gel in veronal buffer pH 8.2 (veronal sodium 16 g, HCl N 22 ml / OSP water 1000 ml) is done for 2 h under a ddp 12.5 V at the edges of the blades. The second migration takes place in an agarose gel containing the I.S. (1.3% agarose 2.34 ml; I.S. 1.16 ml) overnight under a 3 V ddp at the edges of the blades.
c ) Mise en évidence des activités enzymatiques des antigènes-cibles c) Demonstration of the enzymatic activities of target antigens
Les activités enzymatiques (LDH, G6 PDH, MDH, A1DH, a- et P-carboxylestérases) sont recherchées selon une technique développée par Uriel au niveau des précipités obtenus en double diffusion en gel entre l'antigène Sm et les différents I.S. antigènes-cibles. The enzymatic activities (LDH, G6 PDH, MDH, A1DH, a- and P-carboxylesterases) are sought according to a technique developed by Uriel at the level of the precipitates obtained in double gel diffusion between the Sm antigen and the various I.S. target antigens.
d) Localisation des antigènes-cibles au niveau du schistosome par immunofluorescence d) Location of target antigens at the level of the schistosome by immunofluorescence
Les coupes de schistosomes sont préparées et traitées de la manière suivante. Après trois lavages dans le sérum physiologique tamponné, les vers prélevés chez le hamster sont fixés dans du Bouin-Hollande-Sublime, déshydratés dans des bains d'alcool éthylique à concentrations croissantes, traités par l'alcool butylique et inclus dans la paraffine. Les blocs sont découpés en sections de 5 à 6 (i d'épaisseur qui sont fixées sur des lames de microscopie. Ces sections de ver sont déparaffinées, lavées dans le sérum physiologique tamponné et incubées pendant 30 mn à 37° C avec l'immun-sérum de lapin anti-antigènes-cibles, dilué au V20 jusqu'au Vi6o-Les lames sont ensuite lavées dans le sérum physiologique tamponné et incubées pendant 30 mn à 37° C avec les immunoglo-bulines fluorescentes de chèvre, anti-immunoglobulines de lapin (Institut Pasteur), diluées au 1/s0. Les lames sont lavées et soumises à une contre-coloration au Bleu d'Evans. Comme contrôle de spécificité, l'inhibition de fluorescence est réalisée en utilisant l'immun-sérum anti-antigènes-cibles préalablement absorbé avec l'extrait antigénique total de schistosomes. Schistosome sections are prepared and processed as follows. After three washes in buffered saline, the worms taken from the hamster are fixed in Bouin-Holland-Sublime, dehydrated in ethyl alcohol baths at increasing concentrations, treated with butyl alcohol and included in paraffin. The blocks are cut into sections of 5 to 6 (i of thickness which are fixed on microscopy slides. These sections of worm are dewaxed, washed in buffered physiological serum and incubated for 30 min at 37 ° C. with the immune - anti-target antigen rabbit serum, diluted with V20 to Vi6o - The slides are then washed in buffered physiological serum and incubated for 30 min at 37 ° C with fluorescent goat immunoglobulins, anti-immunoglobulin rabbit (Institut Pasteur), diluted to 1 / s0 The slides are washed and subjected to counterstaining with Evans Blue As a specificity control, fluorescence inhibition is carried out using the anti-immune serum target antigens previously absorbed with the total antigenic extract of schistosomes.
3) Etude de l'immunogénicité des antigènes-cibles a) Immunisation des rats 3) Study of the immunogenicity of target antigens a) Immunization of rats
Des rats Fischer de 3 mois pesant 180 g sont immunisés selon le protocole suivant: 3-month-old Fischer rats weighing 180 g are immunized according to the following protocol:
A J 55 (55 j avant l'infestation), une injection d'antigènes-cibles est réalisée par voie intradermique (antigènes-cibles 50 ng - Ana-toxine diphtérique de l'Institut Pasteur 40 ni - Adjuvant complet de Freud 40 ni). At D 55 (55 d before the infestation), an injection of target antigens is carried out intradermally (target antigens 50 ng - Ana-toxin diphtheria from the Pasteur Institute 40 ni - Complete adjuvant of Freud 40 ni).
5 5
10 10
15 15
20 20
25 25
30 30
35 35
40 40
45 45
50 50
55 55
60 60
65 65
623 231 623,231
4 4
A J 38, sous-cutanée de la même suspension. At D 38, subcutaneous with the same suspension.
A J 24, injection delà même suspension dans les coussinets plantaires. At D 24, injection of the same suspension into the plantar pads.
A J 0, infestation par 800 cercaires. On D 0, infestation with 800 cercariae.
Les rats sont saignés à J 45 (Si), J 30 (S2), J17 (S3), J 4 (S*), J 22 (Ss). The rats are bled on D 45 (Si), D 30 (S2), D 17 (S3), D 4 (S *), D 22 (Ss).
Des rats recevant la même suspension sans antigènes-cibles servent de contrôles. Rats receiving the same suspension without target antigens serve as controls.
La récolte des vers a lieu à J 22 par perfusion hépatique. Les vers mâles, femelles et immatures sont comptés. The worms are harvested on D 22 by hepatic perfusion. Male, female and immature worms are counted.
L'étude de la cytotoxicité des sérums est réalisée selon un protocole utilisé par Capron et al. et décrit par Clegg et Smithers. The study of the cytotoxicity of the sera is carried out according to a protocol used by Capron et al. and described by Clegg and Smithers.
b) Immunisation des souris b) Immunization of mice
Une quantité de médicament insoluble incubé avec l'extrait antigénique de Schistosoma monsoni (V10 de la quantité insoluble obtenue dans les conditions décrites, pour une souris) est injectée (une seule injection) dans les coussinets plantaires de souris C 57 noires de 18 g, âgées de cinq semaines. Cette dose de ligand-antigène est mise en suspension dans 0,2 ml de NaCl 8 % 0,0,1 g de Tween 80 et 25 ni d'ACF. A quantity of insoluble drug incubated with the antigenic extract of Schistosoma monsoni (V10 of the insoluble quantity obtained under the conditions described, for a mouse) is injected (a single injection) into the plant pads of 18 g black C 57 mice, five weeks old. This dose of ligand-antigen is suspended in 0.2 ml of 8% NaCl 0.0.1 g of Tween 80 and 25 μl of ACF.
Des souris témoins reçoivent 0,1 g de Tween 80 et 25 ni d'ACF. D'autres souris témoins de médicament reçoivent la même quantité de médicament original sans antigène. Control mice receive 0.1 g of Tween 80 and 25 µl of ACF. Other drug control mice receive the same amount of original drug without antigen.
Les souris sont infestées 15 j plus tard par 60 cercaires et saignées et perfusées 70 j plus tard. Les vers mâles et femelles recueillis par perfusion hépatique sont comptés. The mice are infested 15 days later with 60 cercariae and bled and perfused 70 days later. Male and female worms collected by hepatic perfusion are counted.
c) Transfert passif d'anticorps anti-antigènes-cibles chez la souris c) Passive transfer of anti-target antigen antibodies in mice
Les souris C57 reçoivent 0,3 ml d'I.S. de lapin anti-antigène-cible en intraveineuse dans la queue et 0,25 ml de sérum frais de lapin sain comme source de complément en intrapéritonéale. Les souris témoins reçoivent 0,3 ml de sérum frais de lapin sain en intraveineuse et 0,25 ml en intrapéritonéale. L'infestation par 60 cercaires a lieu 1 h après ces injections. Les souris sont saignées et sacrifiées 60 j après l'infestation. Les vers sont comptés. C57 mice receive 0.3 ml of I.S. rabbit anti-target antigen intravenously in the tail and 0.25 ml of fresh healthy rabbit serum as an intraperitoneal supplement source. Control mice receive 0.3 ml of fresh healthy rabbit serum intravenously and 0.25 ml intraperitoneally. The infestation with 60 cercariae takes place 1 hour after these injections. The mice are bled and sacrificed 60 days after the infestation. The worms are counted.
Résultats Results
1 ) Etude immunochimique des antigènes-cibles a) Isolement 1) Immunochemical study of target antigens a) Isolation
2 ml de gel sépharose-ligand mis en présence de 20 mg d'extrait antigénique Schistosoma monsoni permettent l'obtention des quantités d'antigènes-cibles suivantes, appréciées à 280 nm: 2 ml of Sepharose-ligand gel placed in the presence of 20 mg of Schistosoma monsoni antigen extract allow the following quantities of target antigens to be obtained, appreciated at 280 nm:
CH-sépharose - niridazole: 160 ng antigène-cible. CH-sepharose - niridazole: 160 ng target antigen.
CH-sépharose - thiosinamine: 290 ng antigène-cible. 5 AH-sépharose - tartrate d'antimoine et de potassium: 1,65 mg antigène-cible. CH-sepharose - thiosinamine: 290 ng target antigen. 5 AH-sepharose - antimony and potassium tartrate: 1.65 mg target antigen.
AH-sépharose - astiban: 290 ng antigène-cible. AH-sepharose - astiban: 290 ng target antigen.
CH-sépharose - émétine: 260 ng antigène-cible. CH-sepharose - emetine: 260 ng target antigen.
CH-sépharose - amphotalide: 80 ng antigène-cible. 10 AH- et CH-sépharose non couplés à des ligands ne fixent pas non spécifiquement l'antigène. CH-sepharose - amphotalide: 80 ng target antigen. AH- and CH-sepharose not coupled to ligands do not specifically bind the antigen.
b) Carte immunoélectrophorétique des antigènes-cibles b) Immunoelectrophoretic map of target antigens
Les I.S. anti-antigènes-cibles portés en immunoélectrophorèse 15 classique ou bidimensionnelle contre un extrait antigénique de Schistosoma monsoni permettent l'obtention pour chacun d'un profil propre comportant un ou plusieurs systèmes précipitants. L'immun-sérum anti-antigènes-cibles d'amphotalide ne contient pas d'antigènes-cibles précipitants révélables. The I.S. anti-target antigens carried in conventional or two-dimensional immunoelectrophoresis against an antigenic extract of Schistosoma monsoni allow each to obtain a specific profile comprising one or more precipitating systems. The amphotalide anti-target antigen immune serum does not contain any detectable precipitating target antigens.
20 Comparativement, l'immunsérum anti-antigène-S. monsoni permet de révéler en immunoélectrophorèse bidimensionnelle plus de 40 systèmes précipitants. 20 In comparison, the anti-S-antigen immune serum. monsoni reveals more than 40 precipitating systems in two-dimensional immunoelectrophoresis.
c) Activités enzymatiques des antigènes-cibles 25 Elles sont rapportées dans le tableau I. c) Enzymatic activities of the target antigens They are reported in Table I.
d) Localisation des antigènes-cibles au niveau du parasite d) Location of target antigens at the parasite level
L'immunsérum anti-antigènes-cibles du niridazole révèle une fluorescence diffuse au niveau du parenchyme du schistosome, principalement chez le mâle dont les tubercules sont également fluorescents. The niridazole antigen-target antiserum reveals diffuse fluorescence in the parenchyma of the schistosome, mainly in males whose tubers are also fluorescent.
L'immunsérum anti-antigène-cible de thiosinamine révèle une fluorescence exclusivement limitée à l'assise cellulaire du caecum 35 digestif, les noyaux cellulaires exceptés. L'immunsérum antiantigènes-cibles du tartrate d'antimoine et de potassium révèle une fluorescence similaire. L'immunsérum anti-antigène-cible de l'astiban révèle une fluorescence exclusivement limitée à l'assise cellulaire superficielle du caecum, épargnant les noyaux, et de type 40 discontinu. L'immunsérum anti-antigènes-cibles de l'émétine révèle une fluorescence totale de l'assise cellulaire superficielle du caecum. L'immunsérum anti-antigènes-cibles de l'amphotalide ne montre qu'une fluorescence diffuse du parenchyme. The thiosinamine anti-antigen-target immune serum reveals a fluorescence exclusively limited to the cellular base of the digestive cecum, except for the cell nuclei. The anti-antigen-target antiserum of antimony and potassium tartrate reveals a similar fluorescence. Astiban's anti-antigen-target immune serum reveals a fluorescence exclusively limited to the surface cellular base of the caecum, sparing the nuclei, and of discontinuous type 40. The emetine anti-target antigen immune serum reveals a total fluorescence of the surface cell base of the cecum. The amphotalide antigen-target antigen only shows diffuse fluorescence of the parenchyma.
Tableau I Table I
Immunsérum de lapin Immunoélectrophorèse (IEP)1 Activités enzymatiques Localisation des anti-antigènes-cibles de: 2relevées au niveau de Ag-cibles en immuno- Rabbit Immunoelectrophoresis Immunoelectrophoresis (IEP) 1 Enzymatic activities Localization of the target anti-antigens of: 2 raised at the level of Ag-targets in immuno-
Classique Bidimensionnelle systèmes précipitants fluorescence3 Classic Two-dimensional fluorescence precipitating systems3
Nombre d'arcs Nombre de pics Number of arcs Number of peaks
Niridazole 1 Niridazole 1
Thiosinamine 3 Thiosinamine 3
Tartrate double d'anti- 4 moine et potassium Anti-monk and potassium double tartrate
Astiban 3 Astiban 3
Emétine 1 Emetine 1
Amphotalide 0 Amphotalide 0
1 4 6 1 4 6
3 3 0 3 3 0
G6 PDH A1DH G6 PDH A1DH
MDHG6PDH MDHG6PDH
a-carboxyles-térase a-carboxyls-terase
G6PDHA1DH G6PDHA1DH
G6PDH G6PDH
0 0
Parenchyme Parenchyma
Caecum Caecum
Caecum Caecum
Caecum Caecum Parenchyme Caecum Caecum Parenchyma
1 Nombre d'arcs obtenus en IEP classique et nombre de pics obtenus en IEP bidimensionnelle entre un extrait total de Schistosoma monsoni et les immunsérums anti-antigènes-cibles. 1 Number of arcs obtained in classical IEP and number of peaks obtained in two-dimensional IEP between a total extract of Schistosoma monsoni and the anti-target antigen immune systems.
2 Nombre d'activités enzymatiques révélées au niveau de systèmes précipitants obtenus entre l'extrait total de schistosome et les immunsérums anti-antigènes-cibles. 2 Number of enzymatic activities revealed at the level of precipitating systems obtained between the total schistosome extract and the anti-target antigen immune systems.
3 Localisation des antigènes-cibles réalisée avec les différents immunsérums anti-antigènes-cibles. 3 Location of the target antigens carried out with the various anti-target antigen sera.
2) Etude immunobiologique a) Etude des phénomènes immunologiques chez les rats immunisés - Etude in vitro de la cytotoxicité des sérums. 2) Immunobiological study a) Study of immunological phenomena in immunized rats - In vitro study of the cytotoxicity of sera.
65 Les sérums (St à S5) sont rassemblés séparément pour éprouver leur effet létal sur les schistosomes et les schistosomules. Chaque expérience est réalisée en double. Les différents sérums n'ont aucun effet létal sur les schistosomes adultes. Les sérums de rats (S5) immu 65 The sera (St to S5) are collected separately to test their lethal effect on schistosomes and schistosomules. Each experiment is carried out in duplicate. The different sera have no lethal effect on adult schistosomes. Immu rat sera (S5)
5 5
623 231 623,231
nisés avec les antigènes-cibles de l'émétine ou de la thiosinamine provoquent respectivement 40 et 27,5% de mortalité. Les témoins infestés et les témoins sains ne donnent respectivement que 20 et 7% de mortalité. nized with the target antigens of emetine or thiosinamine cause 40 and 27.5% mortality respectively. Infested controls and healthy controls only gave 20% and 7% mortality, respectively.
- Numération des ver?, recueillis par perfusion hépatique. Le nombre de vers mâles, femelles et immatures est relevé. Les résultats sont rapportés dans le tableau II: - Numeration of worms, collected by hepatic perfusion. The number of male, female and immature worms is noted. The results are reported in Table II:
Tableau II Table II
Mâles Males
Femelles Females
Immatures Immature
Total Total
Rats contrôlés (4)1 Controlled rats (4) 1
19,50 ±3 19.50 ± 3
16 ±3,74 16 ± 3.74
2,75 ±1,71 2.75 ± 1.71
38,25 ±5,38 38.25 ± 5.38
Rats immunisés avec ag-cibles de: Rats immunized with ag-targets of:
Tartrate double d'antimoine et potassium (4)1 Antimony and potassium double tartrate (4) 1
3,25 + 3,20 3.25 + 3.20
3 ±2,16 3 ± 2.16
1,25 ±0,96 1.25 ± 0.96
7,50 ±5,07 7.50 ± 5.07
Amphotalide (4)1 Amphotalide (4) 1
7,50+3,32 7.50 + 3.32
5,50 ±5,07 5.50 ± 5.07
1,75+1,71 1.75 + 1.71
14,75 ±9,60 14.75 ± 9.60
Moyenne (+écart-type) des vers mâles, femelles, immatures et totaux, récoltés par perfusion hépatique des rats immunisés avec les différents antigènes-cibles et infestés depuis 22 j. Average (+ standard deviation) of male, female, immature and total worms, harvested by hepatic perfusion from rats immunized with the various target antigens and infested since 22 days.
1 Nombre d'animaux. 1 Number of animals.
20 20
Le test de Student, applicable après contrôle du test d'étendue, permet d'obtenir des valeurs hautement significatives de la diminution du nombre de vers chez les rats immunisés avec les antigènes-cibles du tartrate d'antimoine et potassium ou de l'amphotalide (t=8,32; ddl=6; p<0,001 et t=4,26; ddl=6; p<0,05). 25 The Student test, applicable after control of the range test, makes it possible to obtain highly significant values of the decrease in the number of worms in rats immunized with the target antigens of antimony and potassium tartrate or of amphotalide. (t = 8.32; dof = 6; p <0.001 and t = 4.26; dof = 6; p <0.05). 25
b ) Etude des phénomènes biologiques chez les souris immunisées - Numération des vers recueillis par perfusion hépatique b) Study of biological phenomena in immunized mice - Count of worms collected by hepatic perfusion
Le nombre de vers mâles et femelles est relevé. Le nombre de vers des souris témoins de drogue n'est pas significativement différent du 30 nombre de vers des souris témoins. Le test de Student ne montre pas de valeurs significativement différentes entre le nombre de vers des souris immunisées et celui des souris témoins. The number of male and female worms is noted. The number of worms in drug control mice was not significantly different from the number of worms in control mice. Student's test does not show significantly different values between the number of worms in immunized mice and that in control mice.
c ) Etude des phénomènes biologiques chez la souris soumise au 35 transfert passif d'anticorps c) Study of biological phenomena in mice subjected to passive transfer of antibodies
Le nombre de vers mâles et femelles est rapporté dans le tableau III. The number of male and female worms is reported in Table III.
Tableau III Table III
Mâles Males
Femelles Females
Total Total
Souris témoins recevant Witness mice receiving
sérum de lapin sain (5)1 healthy rabbit serum (5) 1
10,60 ±7,80 10.60 ± 7.80
11 ±10,77 11 ± 10.77
21,60± 17,81 21.60 ± 17.81
Souris recevant immun- Immune-receiving mouse
sérum de anti-ag-cible anti-ag-target serum
de lapin rabbit
Thiosinamine (4) Thiosinamine (4)
5,75 ±4,27 5.75 ± 4.27
7,75±9,54 7.75 ± 9.54
13,50± 13,72 13.50 ± 13.72
Tartrate d'antimoine et Antimony tartrate and
de potassium (3) potassium (3)
3,67 ±4,04 3.67 ± 4.04
3,61 ±5 3.61 ± 5
8,67 ±7,51 8.67 ± 7.51
Astiban (6) Astiban (6)
4,50 ±5,50 4.50 ± 5.50
3,83 ±3,71 3.83 ± 3.71
8,33 ±8,69 8.33 ± 8.69
Emétine (7) Emetine (7)
2±3,61 2 ± 3.61
1,43 ±2,51 1.43 ± 2.51
3,43 ±6,11 3.43 ± 6.11
Moyenne ( ± SD) du nombre de vers mâles, femelles et totaux des souris ayant reçu les immensérums anti-ag-cibles des drogues. Average (± SD) of the number of male, female and total worms of mice receiving the anti-ag-target drugs.
1 Nombre d'animaux. 1 Number of animals.
Le test de Student montre des différences hautement significatives entre le nombre de vers des souris témoins et celui des souris ayant reçu l'immunsérum de lapin anti-ag-cible de l'émétine. The Student's test shows highly significant differences between the number of worms in control mice and that of mice having received rabbit anti-agetarget emetin immuniserum.
t=2,59; ddl=10; P<0,001. t = 2.59; dof = 10; P <0.001.
R R
Claims (6)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR7620687A FR2356428A1 (en) | 1976-06-29 | 1976-06-29 | PROCESS FOR PREPARATION OF AN IMMUNOLOGICAL ANTIPARASITIC AGENT, PRODUCT OBTAINED AND ITS APPLICATION |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CH623231A5 true CH623231A5 (en) | 1981-05-29 |
Family
ID=9175335
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CH753277A CH623231A5 (en) | 1976-06-29 | 1977-06-20 | Process for preparing an antischistosomal immunologial agent and product obtained |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5362814A (en) |
| BE (1) | BE855898A (en) |
| CH (1) | CH623231A5 (en) |
| DE (1) | DE2728802C2 (en) |
| DK (1) | DK285777A (en) |
| FR (1) | FR2356428A1 (en) |
| GB (1) | GB1582294A (en) |
| IE (1) | IE45443B1 (en) |
| NL (1) | NL7707174A (en) |
| SE (1) | SE7707311L (en) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4158049A (en) * | 1976-09-27 | 1979-06-12 | Edna Mcconnell Clark Foundation | Antigen fraction of Schistosoma mansoni eggs suitable for testing for schistosomiasis |
| US4493825A (en) * | 1982-10-05 | 1985-01-15 | Iowa State University Research Foundation | Purified and antigenically selective vaccines for domestic animals |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2420706C3 (en) * | 1974-04-29 | 1979-11-22 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Process for preparing specific antigens from schistosomes and agent containing them |
-
1976
- 1976-06-29 FR FR7620687A patent/FR2356428A1/en not_active Withdrawn
-
1977
- 1977-06-20 CH CH753277A patent/CH623231A5/en not_active IP Right Cessation
- 1977-06-21 BE BE2056013A patent/BE855898A/en unknown
- 1977-06-23 SE SE7707311A patent/SE7707311L/en not_active Application Discontinuation
- 1977-06-27 DE DE2728802A patent/DE2728802C2/en not_active Expired
- 1977-06-27 IE IE1313/77A patent/IE45443B1/en unknown
- 1977-06-27 DK DK285777A patent/DK285777A/en not_active Application Discontinuation
- 1977-06-27 GB GB26775/77A patent/GB1582294A/en not_active Expired
- 1977-06-28 NL NL7707174A patent/NL7707174A/en not_active Application Discontinuation
- 1977-06-29 JP JP7769877A patent/JPS5362814A/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE2728802A1 (en) | 1978-01-05 |
| FR2356428A1 (en) | 1978-01-27 |
| NL7707174A (en) | 1978-01-02 |
| IE45443B1 (en) | 1982-08-25 |
| GB1582294A (en) | 1981-01-07 |
| BE855898A (en) | 1977-10-17 |
| IE45443L (en) | 1977-12-29 |
| DE2728802C2 (en) | 1982-04-22 |
| DK285777A (en) | 1977-12-30 |
| JPS5362814A (en) | 1978-06-05 |
| SE7707311L (en) | 1977-12-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2907813B2 (en) | Antigenic protein for preventing coccidiosis and vaccine containing the same | |
| Siles-Lucas et al. | Cestode parasites: application of in vivo and in vitro models for studies on the host-parasite relationship | |
| Ramalho‐Pinto et al. | Murine Schistosomiasis mansoni: anti‐schistosomula antibodies and the IgG subclasses involved in the complement‐and eosinophilmediated killing of schistosomula in vitro | |
| MacKenzie et al. | Autoimmunity in trypanosome infections: I. Tissue autoantibodies in Trypanosoma (Trypanozoon) brucei infections of the rabbit | |
| EP0112784B1 (en) | Polypeptidic fractions inducing protective antibodies against malaria parasites, and immunogenic compositions containing them | |
| KR20000004990A (en) | Anti-inflammatory composition of egg, isolation method and use thereof | |
| JP2759652B2 (en) | Proteins, methods for extracting proteins, vaccines and methods for immunizing ruminants | |
| FR2781158A1 (en) | NOVEL MODIFIED NON-IMMUNOSUPPRESSIVE IMMUNOGENIC PROTEINS, THEIR PREPARATION PROCESS AND THEIR APPLICATIONS | |
| FR2556220A1 (en) | NOVEL LYMPHOKINE AND MONOCLONAL ANTIBODY SPECIFIC TO THE LYMPHOKINE, THEIR PRODUCTION AND USES THEREOF | |
| Cutts et al. | Elimination of a primary schistosome infection from rats coincides with elevated IgE titres and mast cell degranulation | |
| CH623231A5 (en) | Process for preparing an antischistosomal immunologial agent and product obtained | |
| Cross et al. | Ichthyophthirius multifiliis Fouquet (Ciliophora): the location of sites immunogenic to the host Cyprinus carpio (L.) | |
| Mazza et al. | Antibody isotype responses to the Schistosoma mansoni schistosomulum in the CBA/N mouse induced by different stages of the parasite life cycle | |
| JPH09241159A (en) | Synthesis suppressant containing atractylenolide iii for protein belonging to hsp60 family | |
| JPH10212230A (en) | Synthesis inhibitor containing dihydroxynaphthoquinone compound of protein belonging to HSP60 family | |
| FR2479000A1 (en) | BRUCELLOSIS VACCINE, LIVESTOCK DISEASE | |
| FR2572936A1 (en) | NOVEL LYMPHOKINE AND MONOCLONAL ANTIBODY SPECIFIC TO THE LYMPHOKINE, THEIR PRODUCTION AND USES | |
| US4178365A (en) | Method of preparing an antiparasitic immunological agent, the product obtained, and its application | |
| Stuart et al. | The allergic macrophage of graft versus host disease | |
| Ramalho-Pinto et al. | Carrier effect during the course of experimental schistosomiasis: suppression of the response to TNP-schistosomula in rats and inbred mice | |
| Bout et al. | Drugs as ligands of immunogenic molecules in parasites: an approach to the isolation of target-antigens | |
| FR2598147A1 (en) | MOLLUSC INSULATED IMMUNOGEN, METHOD FOR THE PREPARATION THEREOF, DIAGNOSTIC REAGENTS FOR HUMAN BILHARZIOSES, VACCINES AGAINST SCHISTOSOMIASES AND IMMUNIZING COMPOSITIONS COMPRISING THE SAME. | |
| CA1245216A (en) | Polypeptidic fractions inducting protective antibodies against the malaria parasites and immunogenic compositions containing them | |
| FR2731353A1 (en) | USE OF QUAIL EGG OR ITS DERIVATIVES ADDED TO AN ANTIGEN AS AN ADJUVANT TO INDUCING TOLERANCE BY ORAL OR AIR FOR THE TREATMENT OF DISEASES WITH IMMUNE COMPONENTS | |
| Hindsbo et al. | Worm kinetics and serum IgE in hooded Lister rats infected with the acanthocephalan Moniliformis moniliformis and the nematode Nippostrongylus brasiliensis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PL | Patent ceased | ||
| PL | Patent ceased |