CH623231A5 - Process for preparing an antischistosomal immunologial agent and product obtained - Google Patents
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Description
La présente invention concerne un procédé de préparation d'un agent immunologique antischistosomique. Elle concerne aussi le produit obtenu.
Dans la lutte contre les grandes endémies parasitaires, peu de moyens curatifs ou prophylactiques sont totalement efficaces, qu'il s'agisse de la chimiothérapie ou de la vaccinothérapie.
Dans le premier cas, dans l'état actuel des connaissances, on ne traite la bilharziose que par la chimiothérapie, notamment par le niridazole qui est commercialisé en particulier sous la marque Ambilhar. Ce produit guérit la maladie, mais ne protège pas contre une infection ultérieure. L'infestation est réalisée par voie transcutanée: des larves infestantes, appelées cercaires, traversent la peau, se transforment et, tout en grandissant, parviennent au foie et deviennent matures quelques semaines après l'infestation transcutanée. Les mâles et femelles s'accouplent, puis les femelles vont pondre leurs œufs dans les capillaires péri-intestinaux (bilharziose intestinale) ou périvésicaux (bilharzioses urinaires). Ces œufs vont traverser la paroi intestinale ou vésicale, vont être éliminés à l'extérieur et libérer une larve qui infestera un mollusque aquatique. Dans ce mollusque, cette larve se multiplie et se transforme en cercaires qui vont infester l'homme.
En résumé, la chimiothérapie n'immunise pas.
Dans le deuxième cas, c'est-à-dire la vaccinothérapie, en règle générale, le moyen de protéger un individu contre les agents infectieux, bactéries ou virus, consiste à l'immuniser contre les antigènes de ces agents infectieux. Mais, dans le cas des affections parasitaires, en particulier la schistosomiase, il n'a encore jamais été possible de déclencher une réponse immunitaire efficace et protectrice.
Pratiquement, la seule arme dont on dispose actuellement est la chimiothérapie, qui, bien que curative, ne pourra empêcher une réinfection.
L'inventeur a abordé le problème sous un angle immunologique, dans le cadre de la schistosomiase ou bilharziose, affection qui atteint actuellement environ 300 millions d'individus. On sait que les médicaments schistosomicides agissent au niveau de sites-cibles du parasite, ces sites étant constitués par des antigènes, que l'on dénommera dans ce qui suit antigènes-cibles, et qui représentent des structures moléculaires essentielles à l'intégrité et à la survie du parasite. L'inventeur a utilisé des médicaments schistosomicides connus comme ligands, notamment en Chromatographie d'affinité, pour tenter d'isoler lesdits antigènes-cibles dont le pouvoir immunogène a été apprécié soit par immunisation active ou transfert passif d'anticorps. En d'autres termes, l'invention permet la préparation d'un nouvel agent immunologique antiparasitaire constitué d'extraits de schistosomes et notamment d'antigènes-cibles de médicaments schistosomicides.
Les produits obtenus se prêtent au traitement notamment préventif de la schistosomiase. En effet, les antigènes-cibles injectés dans l'organisme y déterminent la formation d'anticorps, dirigés contre ces antigènes-cibles, et protecteurs de la schistosomiase. Il faut en outre remarquer qu'il n'a, jusqu'à présent, été possible d'obtenir des anticorps véritablement protecteurs contre le parasite, notamment lorsqu'on utilise comme antigène immunisant un extrait total d'antigènes de parasites constitué par le surnageant d'un broyât de parasites dans une solution de NaCl par exemple. Le procédé de préparation est caractérisé par le fait que l'on met en contact un médicament schistosomicide connu comme ligand avec un extrait total d'antigènes de schistosomes de façon que les anti-gènes-cibles se fixent sur le médicament.
Eventuellement, on élue lesdits antigènes-cibles de façon à les isoler. De préférence, le procédé consiste à utiliser une Chromatographie d'affinité, dans laquelle le ligand est constitué par un médicament schistosomicide qui sert d'agent de fixation des antigènes-cibles, ledit ligand étant immobilisé sur support insoluble de façon que ces antigènes-cibles soient retenus puis élués par un moyen adéquat pour être ensuite injectés à des animaux dans l'organisme desquels ils déterminent la formation d'anticorps protecteurs efficaces contre la schistosomiase.
On peut aussi utiliser une Chromatographie d'affinité dans laquelle le ligand est un médicament schistosomicide non fixé et non immobilisé, mais qui soit utilisé dans des conditions de solution sursaturée telle qu'une quantité déterminée de ligand reste insoluble dans le procédé d'isolement des antigènes-cibles.
L'extrait sec constitué du ligand schistosomicide porteur d'antigènes-cibles peut être utilisé pour le traitement de la schistosomiase après mise en suspension dans un solvant approprié, par exemple.
Lorsqu'on considère ce résultat, il faut rappeler que les antigènes totaux du schistosome injectés à ces mêmes animaux ne déterminent aucune synthèse d'anticorps protecteurs, ce qui montre l'intérêt du procédé de l'invention. <
L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples ci-après qui indiquent aussi quelques applications thérapeutiques effectuées au stade expérimental sur des animaux.
L'analyse immunochimique a montré que le schistosome représentait un mélange très complexe d'antigènes. Parmi les nombreuses méthodes d'étude utilisées, l'immunoélectrophorèse a permis de mettre en évidence au moins 25 systèmes précipitants dont certains manifestent une nature allergénique ou supportent une activité enzymatique. Parmi ces antigènes à fonction biologique importante, se trouvent les antigènes-cibles des médicaments schistosomicides dont on a montré pour certaines une activité inhibitrice d'enzymes du parasite. On a utilisé ces médicaments comme ligands en Chromatographie d'affinité pour tenter d'isoler les antigènes-cibles, caractériser leurs activités enzymatiques et leur localisation au niveau du parasite ainsi que leur pouvoir immunogène.
Exemples
1 ) Obtention d'antigènes-cibles
Les antigènes-cibles sont isolés d'un extrait antigénique total de schistosomes (Schistosoma monsoni) préparé à partir de vers adultes récoltés chez le hamster, si ce n'est pas spécifié autrement. 3500 vers fraîchement récoltés sont broyés dans 2 ml de NaCl 0,5M, congelés et décongelés en broyant à l'appareil de Potter,
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puis centrifugés à 40000 g pendant 30 mn. Le surnageant est utilisé comme antigène total.
Les médicaments schistosomicides utilisables comme ligands sont par exemple le niridazole (Ciba 32,644 Ba), la thiosinamine (Fluka), l'astiban (Roche), le chlorhydrate d'émétine (Rhône-Poulenc) et l'amphotalide (6171 Rhône-Poulenc).
a) Chromatographie d'affinité Préparation des ligands immobilisés
Les supports connus sous les dénominations commerciales AH- et CH-sépharose (Pharmacia-Suède) permettent la synthèse d'absorbants spécifiques dans lesquels le ligand est séparé du support par une chaîne à 6 atomes de carbone. Le ligand est fixé au support par une réaction de couplage en un temps, à la carbo-diimide. La CH-sépharose possède des groupements carboxyliques libres qui peuvent être utilisés pour coupler des ligands à groupements aminés primaires libres. L'AH-sépharose possède des groupements aminés primaires libres qui peuvent être utilisés pour coupler des groupements carboxyliques. Le protocole de couplage à la carbodiimide recommandé par Pharmacia est utilisé. Le niridazole (30 mg/10 ml eau), la thiosinamine (30 mg/10 ml eau), l'amphotalide (30 mg/10 ml dioxanne) sont couplés à 2 g de gel CH-sépharose. L'astiban (30 mg/15 ml eau) et le tartrate double d'antimoine et de potassium (30 mg/10 ml eau) sont couplés à 2 g de gel d'AH-sépharose. Le protocole opératoire utilisé pour chaque médicament est le même. La poudre lyophilisée d'AH- ou CH-sépharose est pesée, puis mise à gonfler dans un excès de solution de NaCl 0,5M. Pour éliminer lactose et dextran, le gel est lavé avec la solution de NaCl 0,5M, puis avec l'eau distillée pour éliminer le NaCl. La solution de ligand est ajoutée au gel. Le pH de la suspension est ajusté entre 4,5 et 6. Une proportion finale liquide/gel (2/1) convient pour une douce agitation qui se fait à la température du laboratoire. La poudre de carbodiimide est ajoutée à une concentration finale de 0,1 M. Le pH est maintenu entre 4,5 et 6 pendant 1 h. La réaction se poursuit pendant 24 h à la température du laboratoire. Le gel est lavé successivement dans des solutions tampons alcalines et acides contenant du NaCl molaire. Si le dioxanne a été utilisé pour la dissolution du ligand, il est nécessaire de laver le gel avec ce solvant. Le gel est finalement lavé avec l'eau distillée.
b) Isolement des antigènes-cibles au moyen de ces ligands immobilisés
L'extrait antigénique brut de schistosome (3500 vers #/20 mg poids sec) est passé sur la colonne de 2 ml de gel. La colonne est lavée avec une solution de NaCl 0,5M jusqu'à ce que la densité optique à 280 nm soit nulle. Les composants antigéniques fixés sont élués avec du tampon glycocolle-HCl 0,2M, NaCl 0,5M pH 2,8. L'éluat est immédiatement neutralisé dans du tampon phosphate M pH 8, puis dialysé contre de l'eau. La quantité de produit obtenu est appréciée en d, 0 à 280 nm.
c) Chromatographie d'affinité sur ligands non immobilisés
Une quantité de 1,5 mg de médicament se trouve dans les conditions d'expérience sous forme insoluble pendant le contact avec l'extrait antigénique du ver et pendant les lavages réalisés avec des solutions saturéesdemédicament.L'extraitd'antigène(0,l ml= 1 mg poids sec) de schistosomes [récoltés chez la souris (pour l'immunisation des souris] ou chez le hamster (pour l'immunisation des lapins) est mis en contact avec 2 mg de niridazole, 5 mg de thiosinamine, 10 mg de tartrate d'antimoine-potassium, 40 mg d'astiban, 15 mg d'émétine-hydrochloride, 3 mg d'amphotalide. Après 1 h de contact à 37° et 30 mn à température du laboratoire, le médicament insoluble est lavé trois fois avec 10 ml de solution saturée du médicament considéré. Le ligand antigène-cible servira à l'immunisation des souris ou des lapins.
2) Caractérisation immunochimique et localisation parasitaire des antigènes-cibles
Cette étude est menée en utilisant les I.S. du lapin injectés avec les différents antigènes-cibles.
a) Immunisation des lapins
Une quantité de médicament insoluble, incubée avec l'extrait antigénique de schistosome (la totalité de l'insoluble obtenu dans les conditions décrites), est injectée au lapin (Vaitukaitis et al.).
Le sang est prélevé au jour 35 (Sj, au jour 50 (S2) et au jour 80 (S3)-
Pour les études réalisées en immunoélectrophorèse et en immunofluorescence, les I.S. sont préalablement absorbés par les antigènes d'hôte. L'absorption est réalisée en ajoutant 10 mg de sérum de hamster lyophilisé et 10 mg de foie de hamster lyophilisé à 1 ml d'I.S. Après incubation 2 h à 37e C, le mélange est laissé une nuit à 4° C, puis centrifugé. Le surnageant représente l'I.S. absorbé.
b) Etude des antigènes-cibles en immunoprécipitation
L'immunoélectrophorèse classique est menée selon le protocole décrit par Capron et al. en utilisant l'extrait antigénique de schistosome et les différents I.S. anti-antigènes-cibles.
L'immunoélectrophorèse bidimensionnelle est inspirée de la technique décrite par Laurell. Des lames de verre de 5 x 5 cm sont utilisées. La migration de l'antigène Sm (2 mg) dans un gel d'agarose 1 % en tampon véronal pH 8,2 (véronal sodé 16 g, HCl N 22 ml/eau OSP 1000 ml) se fait pendant 2 h sous une ddp 12,5 V aux bords des lames. La deuxième migration a lieu dans un gel d'agarose contenant l'I.S. (agarose 1,3% 2,34 ml; I.S. 1,16 ml) pendant 1 nuit sous une ddp 3 V aux bords des lames.
c ) Mise en évidence des activités enzymatiques des antigènes-cibles
Les activités enzymatiques (LDH, G6 PDH, MDH, A1DH, a- et P-carboxylestérases) sont recherchées selon une technique développée par Uriel au niveau des précipités obtenus en double diffusion en gel entre l'antigène Sm et les différents I.S. antigènes-cibles.
d) Localisation des antigènes-cibles au niveau du schistosome par immunofluorescence
Les coupes de schistosomes sont préparées et traitées de la manière suivante. Après trois lavages dans le sérum physiologique tamponné, les vers prélevés chez le hamster sont fixés dans du Bouin-Hollande-Sublime, déshydratés dans des bains d'alcool éthylique à concentrations croissantes, traités par l'alcool butylique et inclus dans la paraffine. Les blocs sont découpés en sections de 5 à 6 (i d'épaisseur qui sont fixées sur des lames de microscopie. Ces sections de ver sont déparaffinées, lavées dans le sérum physiologique tamponné et incubées pendant 30 mn à 37° C avec l'immun-sérum de lapin anti-antigènes-cibles, dilué au V20 jusqu'au Vi6o-Les lames sont ensuite lavées dans le sérum physiologique tamponné et incubées pendant 30 mn à 37° C avec les immunoglo-bulines fluorescentes de chèvre, anti-immunoglobulines de lapin (Institut Pasteur), diluées au 1/s0. Les lames sont lavées et soumises à une contre-coloration au Bleu d'Evans. Comme contrôle de spécificité, l'inhibition de fluorescence est réalisée en utilisant l'immun-sérum anti-antigènes-cibles préalablement absorbé avec l'extrait antigénique total de schistosomes.
3) Etude de l'immunogénicité des antigènes-cibles a) Immunisation des rats
Des rats Fischer de 3 mois pesant 180 g sont immunisés selon le protocole suivant:
A J 55 (55 j avant l'infestation), une injection d'antigènes-cibles est réalisée par voie intradermique (antigènes-cibles 50 ng - Ana-toxine diphtérique de l'Institut Pasteur 40 ni - Adjuvant complet de Freud 40 ni).
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A J 38, sous-cutanée de la même suspension.
A J 24, injection delà même suspension dans les coussinets plantaires.
A J 0, infestation par 800 cercaires.
Les rats sont saignés à J 45 (Si), J 30 (S2), J17 (S3), J 4 (S*), J 22 (Ss).
Des rats recevant la même suspension sans antigènes-cibles servent de contrôles.
La récolte des vers a lieu à J 22 par perfusion hépatique. Les vers mâles, femelles et immatures sont comptés.
L'étude de la cytotoxicité des sérums est réalisée selon un protocole utilisé par Capron et al. et décrit par Clegg et Smithers.
b) Immunisation des souris
Une quantité de médicament insoluble incubé avec l'extrait antigénique de Schistosoma monsoni (V10 de la quantité insoluble obtenue dans les conditions décrites, pour une souris) est injectée (une seule injection) dans les coussinets plantaires de souris C 57 noires de 18 g, âgées de cinq semaines. Cette dose de ligand-antigène est mise en suspension dans 0,2 ml de NaCl 8 % 0,0,1 g de Tween 80 et 25 ni d'ACF.
Des souris témoins reçoivent 0,1 g de Tween 80 et 25 ni d'ACF. D'autres souris témoins de médicament reçoivent la même quantité de médicament original sans antigène.
Les souris sont infestées 15 j plus tard par 60 cercaires et saignées et perfusées 70 j plus tard. Les vers mâles et femelles recueillis par perfusion hépatique sont comptés.
c) Transfert passif d'anticorps anti-antigènes-cibles chez la souris
Les souris C57 reçoivent 0,3 ml d'I.S. de lapin anti-antigène-cible en intraveineuse dans la queue et 0,25 ml de sérum frais de lapin sain comme source de complément en intrapéritonéale. Les souris témoins reçoivent 0,3 ml de sérum frais de lapin sain en intraveineuse et 0,25 ml en intrapéritonéale. L'infestation par 60 cercaires a lieu 1 h après ces injections. Les souris sont saignées et sacrifiées 60 j après l'infestation. Les vers sont comptés.
Résultats
1 ) Etude immunochimique des antigènes-cibles a) Isolement
2 ml de gel sépharose-ligand mis en présence de 20 mg d'extrait antigénique Schistosoma monsoni permettent l'obtention des quantités d'antigènes-cibles suivantes, appréciées à 280 nm:
CH-sépharose - niridazole: 160 ng antigène-cible.
CH-sépharose - thiosinamine: 290 ng antigène-cible. 5 AH-sépharose - tartrate d'antimoine et de potassium: 1,65 mg antigène-cible.
AH-sépharose - astiban: 290 ng antigène-cible.
CH-sépharose - émétine: 260 ng antigène-cible.
CH-sépharose - amphotalide: 80 ng antigène-cible. 10 AH- et CH-sépharose non couplés à des ligands ne fixent pas non spécifiquement l'antigène.
b) Carte immunoélectrophorétique des antigènes-cibles
Les I.S. anti-antigènes-cibles portés en immunoélectrophorèse 15 classique ou bidimensionnelle contre un extrait antigénique de Schistosoma monsoni permettent l'obtention pour chacun d'un profil propre comportant un ou plusieurs systèmes précipitants. L'immun-sérum anti-antigènes-cibles d'amphotalide ne contient pas d'antigènes-cibles précipitants révélables.
20 Comparativement, l'immunsérum anti-antigène-S. monsoni permet de révéler en immunoélectrophorèse bidimensionnelle plus de 40 systèmes précipitants.
c) Activités enzymatiques des antigènes-cibles 25 Elles sont rapportées dans le tableau I.
d) Localisation des antigènes-cibles au niveau du parasite
L'immunsérum anti-antigènes-cibles du niridazole révèle une fluorescence diffuse au niveau du parenchyme du schistosome, principalement chez le mâle dont les tubercules sont également fluorescents.
L'immunsérum anti-antigène-cible de thiosinamine révèle une fluorescence exclusivement limitée à l'assise cellulaire du caecum 35 digestif, les noyaux cellulaires exceptés. L'immunsérum antiantigènes-cibles du tartrate d'antimoine et de potassium révèle une fluorescence similaire. L'immunsérum anti-antigène-cible de l'astiban révèle une fluorescence exclusivement limitée à l'assise cellulaire superficielle du caecum, épargnant les noyaux, et de type 40 discontinu. L'immunsérum anti-antigènes-cibles de l'émétine révèle une fluorescence totale de l'assise cellulaire superficielle du caecum. L'immunsérum anti-antigènes-cibles de l'amphotalide ne montre qu'une fluorescence diffuse du parenchyme.
Tableau I
Immunsérum de lapin Immunoélectrophorèse (IEP)1 Activités enzymatiques Localisation des anti-antigènes-cibles de: 2relevées au niveau de Ag-cibles en immuno-
Classique Bidimensionnelle systèmes précipitants fluorescence3
Nombre d'arcs Nombre de pics
Niridazole 1
Thiosinamine 3
Tartrate double d'anti- 4 moine et potassium
Astiban 3
Emétine 1
Amphotalide 0
1 4 6
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G6 PDH A1DH
MDHG6PDH
a-carboxyles-térase
G6PDHA1DH
G6PDH
0
Parenchyme
Caecum
Caecum
Caecum Caecum Parenchyme
1 Nombre d'arcs obtenus en IEP classique et nombre de pics obtenus en IEP bidimensionnelle entre un extrait total de Schistosoma monsoni et les immunsérums anti-antigènes-cibles.
2 Nombre d'activités enzymatiques révélées au niveau de systèmes précipitants obtenus entre l'extrait total de schistosome et les immunsérums anti-antigènes-cibles.
3 Localisation des antigènes-cibles réalisée avec les différents immunsérums anti-antigènes-cibles.
2) Etude immunobiologique a) Etude des phénomènes immunologiques chez les rats immunisés - Etude in vitro de la cytotoxicité des sérums.
65 Les sérums (St à S5) sont rassemblés séparément pour éprouver leur effet létal sur les schistosomes et les schistosomules. Chaque expérience est réalisée en double. Les différents sérums n'ont aucun effet létal sur les schistosomes adultes. Les sérums de rats (S5) immu
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nisés avec les antigènes-cibles de l'émétine ou de la thiosinamine provoquent respectivement 40 et 27,5% de mortalité. Les témoins infestés et les témoins sains ne donnent respectivement que 20 et 7% de mortalité.
- Numération des ver?, recueillis par perfusion hépatique. Le nombre de vers mâles, femelles et immatures est relevé. Les résultats sont rapportés dans le tableau II:
Tableau II
Mâles
Femelles
Immatures
Total
Rats contrôlés (4)1
19,50 ±3
16 ±3,74
2,75 ±1,71
38,25 ±5,38
Rats immunisés avec ag-cibles de:
Tartrate double d'antimoine et potassium (4)1
3,25 + 3,20
3 ±2,16
1,25 ±0,96
7,50 ±5,07
Amphotalide (4)1
7,50+3,32
5,50 ±5,07
1,75+1,71
14,75 ±9,60
Moyenne (+écart-type) des vers mâles, femelles, immatures et totaux, récoltés par perfusion hépatique des rats immunisés avec les différents antigènes-cibles et infestés depuis 22 j.
1 Nombre d'animaux.
20
Le test de Student, applicable après contrôle du test d'étendue, permet d'obtenir des valeurs hautement significatives de la diminution du nombre de vers chez les rats immunisés avec les antigènes-cibles du tartrate d'antimoine et potassium ou de l'amphotalide (t=8,32; ddl=6; p<0,001 et t=4,26; ddl=6; p<0,05). 25
b ) Etude des phénomènes biologiques chez les souris immunisées - Numération des vers recueillis par perfusion hépatique
Le nombre de vers mâles et femelles est relevé. Le nombre de vers des souris témoins de drogue n'est pas significativement différent du 30 nombre de vers des souris témoins. Le test de Student ne montre pas de valeurs significativement différentes entre le nombre de vers des souris immunisées et celui des souris témoins.
c ) Etude des phénomènes biologiques chez la souris soumise au 35 transfert passif d'anticorps
Le nombre de vers mâles et femelles est rapporté dans le tableau III.
Tableau III
Mâles
Femelles
Total
Souris témoins recevant
sérum de lapin sain (5)1
10,60 ±7,80
11 ±10,77
21,60± 17,81
Souris recevant immun-
sérum de anti-ag-cible
de lapin
Thiosinamine (4)
5,75 ±4,27
7,75±9,54
13,50± 13,72
Tartrate d'antimoine et
de potassium (3)
3,67 ±4,04
3,61 ±5
8,67 ±7,51
Astiban (6)
4,50 ±5,50
3,83 ±3,71
8,33 ±8,69
Emétine (7)
2±3,61
1,43 ±2,51
3,43 ±6,11
Moyenne ( ± SD) du nombre de vers mâles, femelles et totaux des souris ayant reçu les immensérums anti-ag-cibles des drogues.
1 Nombre d'animaux.
Le test de Student montre des différences hautement significatives entre le nombre de vers des souris témoins et celui des souris ayant reçu l'immunsérum de lapin anti-ag-cible de l'émétine.
t=2,59; ddl=10; P<0,001.
R
Claims (6)
1. Procédé de préparation d'un agent immunologique anti-schistosomique à partir de schistosomes humains ou animaux, caractérisé en ce qu'on met en contact un médicament schistosomicide, connu comme ligand, avec un extrait total d'antigènes qui sont les sites-cibles du schistosome vis-à-vis dudit médicament, de façon que lesdits antigènes-cibles se fixent sur le médicament.
2. Procédé de préparation selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise une Chromatographie d'affinité dans laquelle le ligand est constitué par un médicament schistosomicide, immobilisé sur un support insoluble de façon que les antigènes-cibles soient retenus, puis on procède à une élution par un solvant approprié de manière à séparer les antigènes-cibles de leur support.
2
REVENDICATIONS
3. Procédé de préparation selon la revendication 1, caractérisé en ce que le médicament schistosomicide est utilisé dans des conditions de solution sursaturée de manière qu'après mise en contact avec l'extrait total d'antigènes du schistosome, les antigènes-cibles se fixent sur le ligand resté insoluble, ledit ligand porteur d'antigènes-cibles étant alors séparé.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on procède à une séparation des antigènes-cibles dudit médicament.
5. Agent immunologique antischistosomique obtenu par le procédé selon la revendication 1.
6. Agent immunologique selon la revendication 5, obtenu par le procédé de préparation selon l'une des revendications 2 à 4.
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