CH625534A5

CH625534A5 -

Info

Publication number: CH625534A5
Application number: CH354276A
Authority: CH
Inventors: Wolfgang Dr Schreiber
Original assignee: Henkel Kgaa
Priority date: 1975-03-22
Filing date: 1976-03-22
Publication date: 1981-09-30
Also published as: DE2512735A1; IT1058477B; JPS51139691A; DK86876A; NL7602108A; US4016039A

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von Proteinen aus wässrigen Proteinlösungen durch Fällung mittels Salzen und Abfiltrieren, gegebenenfalls unter Mitverwendung üblicher Filtrationshilfsmittel, dadurch gekennzeichnet, dass man der Proteinlösung vor der Fällung ein Polyäthylenglykol des Molgewichtes 400 bis 1000, vorzugsweise 500 bis 800, in einer Menge von 0,5 bis 3 Gew.-% zusetzt.

Die verwendeten Polyäthylenglykole sind bekannte Produkte. Sie werden beispielsweise durch Polymerisation von Äthylenoxid in Gegenwart von Katalysatoren, vorzugsweise unter Druck, gewonnen. Als besonders geeignet hat sich ein Polyäthylenglykol des Molgewichtes 600 erwiesen. Die bevorzugt angewendete Menge beträgt 1 bis 2 Gew.-%, bezogen auf Proteinlösung.

Durch den erfindungsgemässen Polyäthylenglykolzusatz wird die Filtrierbarkeit der gefällten Proteinlösungen entscheidend verbessert, d.h. die benötigte Filtrationsdauer wird unter sonst gleichen Bedingungen wesentlich verringert. Die Verbesserung tritt auch ein, wenn übliche Filtrationshilfsmittel, wie sie eingangs genannt wurden, mitverwendet werden.

Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass die Wirkung des Polyäthylenglykols ganz spezifisch und auf den beanspruchten relativ engen Molgewichts-Bereich von 400 bis 1000 begrenzt ist, wobei das Optimum etwa bei einem Molgewicht von 600 liegt. Möglicherweise hängt dieses Verhalten mit der Aussalz-barkeit von Polyäthylenglykolen verschiedener Molgewichte durch die bei der Fällung verwendeten Salze zusammen. Eine endgültige Klärung dieser Fragen steht jedoch noch aus.

Eine weitere Verbesserung kann auch noch dadurch erzielt werden, dass man der Proteinlösung bei der Fällung ein wasserlösliches Polymer zusetzt, das bei geringeren Salzkonzentrationen als Protein gefällt wird. Geeignete Polymere sind Poly-vinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon. Die benötigte Menge beträgt etwa 0,5 bis 2 Gew.-%, vorzugsweise 1 Gew.-%. Diese Polymere wirken zwar an und für sich nicht filtrationserleich-ternd, sie können jedoch in Kombination mit dem erfindungs-gemäss verwendeten Polyäthylenglykol eingesetzt werden und wirken dann in ähnlicher Weise wie die bekannten unlöslichen Filtrationshilfsmittel, indem sie dem Filterkuchen eine trockenere und festere Konsistenz geben und das Ablösen vom Füter erleichtern.

Das erfindungsgemässe Verfahren wird vor allem für die Gewinnung von Enzymen, insbesondere Proteasen aus Fermenterlösungen und dgl., angewendet.

Beispiel 1

Eine Fermenterbrühe des Bacillus licheniformis, die eine alkalische Protease enthält und nach den Angaben der DE-OS 2 063 988 hergestellt wurde, wurde - wie ebenfalls in der DE-OS beschrieben - von Zellresten durch Filtration befreit und eingeengt. Diesem Konzentrat wurden jeweils 2 Gew.-% von Polyäthylenglykolen verschiedener Molgewichte zugesetzt. Die anschliessende Fällung der Protease erfolgte durch Zusatz von 25 Gew.-% wasserfreiem Natriumsulfat bei pH-Wert 5. Die Filtration erfolgte mit einem Büchnertrichter. Die nachfolgende Tabelle 1 gibt die festgestellte Filtrationsdauer für je 11 Konzentrat wieder:

Tabelle 1

Filtrationsdauer mit Polyäthylenglykolen verschiedener Molgewichte mittl. Molgew.

Filtrationsdauer (in % des Ansatzes ohne Zusatz)

300

138

400

53

600

4

1000

91

4000

100

12 000

127

Die Versuchswerte zeigen, dass eine nennenswerte Verbesserung der Filtrationsdauer lediglich mit Polyäthylenglykolen der Molgewichte 400-1000 möglich ist. Das Wirkungsoptimum liegt bei einem Molgewicht von 600.

Beispiel 2

Unter den gleichen Bedingungen, wie in Beispiel 1 angegeben, wurde die zugesetzte Menge an Polyäthylenglykol 600 variiert, um die optimale Zusatzmenge zu ermitteln. Wie die nachfolgende Tabelle 2 zeigt, verringerte sich die Filtrationsdauer bis zu einer Zusatzmenge von 2 Gew.-% kontinuierlich. Durch eine weitere Erhöhung der Zusatzmenge wurden keine Verbesserungen erzielt, während die isolierten Produkte nach der Gefriertrocknung ein leicht öliges, relativ dunkles Aussehen erhielten, was sich auf einen zu hohen Gehalt an Polyäthylenglykol 600 zurückführen lässt.

s

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Tabelle 2

Filtrationsdauer bei verschiedenen Zusatzmengen an Polyäthylenglykol 600

Zusatzmenge Filtrationsdauer für 100 ml (Gew.-%)

0 18 min 40 s 0,6 11 min 40 s

1 11min 0 s 1,5 2 min 15 s

2 2 min 30 s

Beispiel 3

Ein Zusatz von wasserunlöslichen Filtrierhilfsmitteln, die zur Verbesserung des Filterkuchens verwendet werden, beeinträchtigt die filtrationsverkürzende Wirkung eines Polyäthylenglykol 600-Zusatzes nicht. Dasselbe gilt für die Mitverwendung eines wasserlöslichen Polymers, wie Polyvinylalkohol. Die nachfolgende Tabelle zeigt die Filtrationsdauer mit und ohne Zusatz an Polyäthylenglykol 600 und in Gegenwart verschiedener Filtrierhilfsmittel.

3 625 534

Tabelle 3

Wirkung von Polyäthylenglykol 600 in Gegenwart verschiedener Filtrierhüfsmittel

Zusatz an

Charge

Polyglykol

Filtrierhilfsmittel

Filtrationsdauer

(Fermenter

600

Zusatzmenge 1 Gew.-%

min brühe)

1

—

72,1

—

Maisstärke

43,8

1,5%

Maisstärke

10,7

2

—

31,3

—

Na-Al-Silikat

38,2

1,5%

Na-Al-Silikat

1,6

3

—

31,3

-

Polyvinylalkohol

44,5

1,5%

Polyvinylalkohol

9,25

4

—

31,3

-

Kieselgur

26,8

1,5%

Kieselgur

1,3

—

Cellulosepulver

30,2

1,5%

Cellulosepulver

4,8

B

Claims

625 534

1. Verfahren zur Gewinnung von Proteinen aus wässrigen Proteinlösungen durch Fällung mittels Salzen und Abfiltrieren, dadurch gekennzeichnet, dass man der Proteinlösung vor der Fällung ein Polyäthylenglykol des Molgewichts 400-1000 in einer Menge von 0,5-3 Gew.-% zusetzt.

2. Anwendung des Verfahrens gemäss Patentanspruch 1 zur Gewinnung von Enzymen aus Fermenterlösungen.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Polyäthylenglykol des Molgewichtes 500 bis 800, insbesondere 600, zusetzt.

4. Verfahren gemäss Patentanspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man das Polyäthylenglykol in einer Menge von 1-2 Gew.-% zusetzt.

5. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein weiteres wasserlösliches Polymer, das bei geringeren Salzkonzentrationen als das Protein gefällt wird, in einer Menge von 0,5-2 Gew.-%, vorzugsweise 1 Gew.-%, zusetzt.

6. Verfahren gemäss Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das weitere wasserlösliche Polymer Polyvinylal-kohol oder Polyvinylpyrrolidon ist.

7. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ausserdem ein wasserunlösliches Filtrationshilfsmittel in einer Menge von 0,5-2 Gew.-% zusetzt, beispielsweise Stärke, Kieselgur, Cellulosepulver, Bleicherde, kolloidale Kieselsäure oder ein gefälltes Natrium-Aluminium-Silikat.

8. Anwendung gemäss Patentanspruch 2 zur Gewinnung von alkalischer Protease aus Bacillus licheniformis.

Die Gewinnung von Proteinen aus Protein-Lösungen, z.B. Proteasen aus Fermenterlösungen, erfolgt üblicherweise durch Fällung mittels Salzzusätzen und nachfolgende Filtration zur Verbesserung der Filtrierbarkeit. Die Fällung erfolgt bei Zimmertemperatur oder wenig erhöhter Temperatur bis etwa 50°C, wobei in der Regel anorganische Salze, wie NaCl, CaCk, MgCk, MgS04 und vorzugsweise Na2S04 verwendet werden. Zur Abkürzung der in der Regel sehr langen und von Charge zu Charge stark schwankenden Filtrationsdauer, kann man übliche Filtrationshilfsmittel, wie z.B. Stärke, Kieselgur, Cellulosepulver, Bleicherden, kolloidale Kieselsäure, gefällte Natrium-Aluminium-Silikate der dergl., zusetzen. Diese Zusätze vermögen das Problem jedoch nicht immer in zufriedenstellender Weise zu lösen und stellen häufig eine unerwünschte Verunreinigung des Proteins dar.