CH625833A5 - Method for the determination of acid phosphatase - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Bestimmung der sauren Phosphatase menschlicher Herkunft, in welchem ein Reagens zur Aktivierung der sauren Phosphatase Verwendung findet.
Die saure Phosphatase ist ein Enzym, welches die Fähigkeit besitzt, im sauren pH-Bereich optimal Phosphomonoester zu spalten. Die saure Phosphatase menschlicher Herkunft kommt
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40
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65
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in verschiedenen Organen, wie z. B. in der Prostata, in der Leber, in der Milz oder in Blutzellen vor und geht bei Zellschädigungen in das Serum über. Die Bestimmung der sauren Phosphatase in Körperflüssigkeiten, insbesondere im Serum oder im Plasma spielt somit eine wichtige Rolle in der Diagnose von 5 Erkrankungen der betreffenden Organen.
Die Aktivität der sauren Phosphatase im Serum oder Plasma wird von allem beim Vorliegen eines Prostatakarzinoms oder einer Prostatahypertrophie wesentlich erhöht und die Bestimmung dieser Prostataphosphatase-Aktivität ermög- 10 licht die Diagnose dieser spezifischen Erkrankungen.
In Chemical Abstracts Vol. 42, No. 22,1948,8838g wird erwähnt, dass Alkohole mit bis zu 3 C-Atomen die Aktivität der sauren Phosphatase zu erhöhen vermögen. Entsprechende Versuche haben gezeigt, dass dies nicht zutrifft und dass 15
namentlich Methanol, Äthanol und n-Propanol keinen Einfluss auf die Aktivität der sauren Phosphatase haben. Demgegenüber wurde nun im Rahmen der vorliegenden Erfindung gefunden, dass die Aktivität der sauren Phosphatase menschlicher Herkunft durch Zusatz eines geradkettigen Alkohols mit 4 bis 6 2o C-Atomen wesentlich erhöht werden kann. Da die Aktivität der sauren Phosphatase menschlicher Herkunft in Körperflüssigkeiten relativ gering ist, bedeutet eine Erhöhung dieser Aktivität einen eindeutigen technischen Fortschritt im Hinblick auf die Bestimmung dieses wichtigen Enzyms. 25
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein verbessertes Verfahren zur Bestimmung der sauren Phosphatase unter Verwendung eines Aktivators enthaltend einen geradkettigen Alkohol mit 4 bis 6 C-Atomen.
Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung ein Ver- 30 fahren zur Bestimmung einer sauren Phosphatase menschlicher Herkunft in einer Körperflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Lösung, enthaltend als Substrat 50 jimol/1 bis 50 mmol/1 eines Phosphomonoesters, 50 bis 300 mmol/1 einer Puffersubstanz zum Einstellen eines pH-Wertes 35 zwischen 4,5 und 6,5 und 10 bis 300 mmol/1 eines Aktivators enthaltend mindestens einen geradkettigen Alkohol mit 4 bis 6 C-Atomen bei einer Inkubationstemperatur zwischen 20 °C und 45 °C der Phosphatase-Wirkung in der zu untersuchenden Körperflüssigkeit unterwirft und den Substrat-Umsatz misst. 40
Der als Substrat für die enzymatische Reaktion verwendete Phosphomonoester besitzt die allgemeine Formel
R-O-PO3H2
45
worin R ein beliebiger organischer Rest ist.
Vorzugsweise ist jedoch R ein Chromophor, wie z. B. 4-Nitrophenyl,Thymolphthalein, Phenolphthalein, 2-Chlor-4-nitrophenyl; oder ein Fluorophor wie z. B. 1-Naphthyl. Als R kann aber auch Adenosin, Glycerin oder Phenyl in Frage kom- 50 men.
Für die eingesetzte Substratmenge wird vorzugsweise eine optimale Konzentration gewählt, die bei den einzelnen Substraten verschieden ist und auch vom pH-Wert beeinflusst wird. Die optimale Substratkonzentration, die bei einem bestimmten 55 pH-Wert die maximal mögliche Enzym-Aktivität bewirkt, kann an Hand einer Substrat-Aktivitätskurve abgelesen werden.
Die Substrat-Aktivitätskurve für ein bestimmtes Substrat wird dadurch erhalten, dass unter sonst gleichen Bedingungen die Enzym-Aktivität mit verschiedenen Substrat-Konzentratio- 60 nen gemessen wird.
Die Substratkonzentration für die saure Phosphatase liegt erfindungsgemäss zwischen 50 jimol/1 und 50 mmol/1; vorzugsweise 60 (imol/1 und 25 mmol/1. So beträgt bei einem pH-Wert von 5,5 die optimale Substratkonzentration ungefähr 25 mmol/165 für ß-Glycerophosphat, 2,5 mmol/1 für 4-Nitrophenylphosphat und 100 jimol/I für Phenolphthalein-diphosphat.
In dem erfindungsgemässen Verfahren wird der pH-Wert mittels einer Puffersubsjanz zwischen 4,5 und 6,5, vorzugsweise zwischen 5 und 6 eingestellt. Geeignete Puffersubstanzen sind z. B. Citratpuffer und Acetatpuffer. Die Pufferkonzentration liegt in der Regel zwischen 50 mmol/1 und 300 mmol/I, vorzugsweise 100mmol/I.
Gemäss vorliegender Erfindung enthält der verwendete Aktivator einen geradkettigen Alkohol mit 4 bis 6 C-Atomen, vorzugsweise n-Butanol, n-Pentanol und 1,5-Pentandiol. Besonders bevorzugt sind 1-Pentanol und 2-Pentanol.
Die Konzentration des Aktivators beträgt 10 bis 300 mmol/1, vorzugsweise 100 bis 200 mmol/1.
Der Aktivator kann einen oder mehrere geradkettige Alkohole mit 4 bis 6 C-Atomen enthalten. Mit Vorzug besteht jedoch der Aktivator aus einem einheitlichen, geradkettigen Alkohol mit 4 bis 6 C-Atomen.
Nach Vermischen einer Probe der zu analysierenden Körperflüssigkeit mit der Testlösung erfolgt die enzymatische Reaktion durch Inkubieren der Lösung bei einer definierten Reaktionstemperatur, die zwischen 20 und 45 °C, vorzugsweise zwischen 30 bis 37 °C liegt. Die Inkubationsdauer beträgt in der Regel zwischen 5 und 60 Minuten. Vorzugsweise wird jedoch die Reaktion nach 30 Minuten mittels einem geeigneten Zusatz wie z. B. mittels Natronlauge oder einer Trinatriumphosphatlö-sung abgestoppt.
Bei Auswahl eines geeigneten Substrates wie z. B. 2-Chlor-4-nitrophenylphosphat ist es auch möglich, die enzymatische Reaktion kinetisch zu messen.
Der Substrat-Umsatz ist die Messgrösse für die Enzym-Aktivität. Er wird gemessen, indem die Abnahme des eingesetzten Phosphomonoesters oder die Zunahme des freigesetzten organischen Restes bestimmt wird. Da die Aktivierung der sauren Phosphatase durch eine Transphosphorylierung, d. h. eine Phosphatübertragung vom eingesetzten Phosphomonoester auf den als Aktivator eingesetzten Alkohol erfolgt, entspricht die Menge des freien Phosphats nach der enzymatischen Reaktion nicht dem Substratumsatz und kann dementsprechend nicht als dessen Mass genommen werden.
Die Art der Messung hängt vom eingesetzten Substrat ab. So kann bei Verwendung von 4-Nitro-phenylphosphat, Thy-molphthaleinphosphat, Phenolphthaleinphosphat oder bei Verwendung von Naphthylphosphat die Zunahme des freigesetzten organischen Rests nach geeignetem Abstoppen der enzymatischen Reaktion direkt photometrisch bzw. fluorimetrisch bestimmt werden.
Bei Verwendung anderer Substrate wie z. B. ß-Glycerophosphat, Phenylphosphat oder Adenosinmonophosphat erfolgt die Messung des Substratumsetzes in der Weise, dass der freigesetzte organische Rest chemisch oder enzymatisch in eine Substanz umgewandelt wird, die photometrisch gemessen werden kann.
So wird z. B. bei Verwendung von Phenylphosphat, das freigesetzte Phenol mit Hilfe des Phenolreagens [Folin-Ciocalteus, Merck 9001] in einen blauen Farbstoff umgewandelt.
Das erfindungsgemässe Verfahren eignet sich sowohl für manuelle wie für automatische Bestimmungen der sauren Phosphatase. Als Bestimmungsgut können z. B. Serum, Plasma, Blut, Liquor oder Urin verwendet werden.
Den zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens notwendigen Reagenzien, nämlich Phosphomonoester, Puffer und Aktivator, können für diagnostische Zwecke geeignete Zusätze wie z. B. Detergentien wie Brij-35 (Polyoxyäthylenlau-ryläther) oder Stabilisatoren wie Magnesium-Ionen zugesetzt werden.
Die Reagentien werden vorzugsweise in eine Reagenziengarnitur verpackt. Eine für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignete Reagenziengarnitur enthält mit Vorteil in einem oder in mehreren Behältern a) einen Phosphomonoester,
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4
b) eine Puffersubstanz zum Erstellen eines pH-Wertes zwischen 4,5 und 6,5,
c) einen geradkettigen Alkohol mit 4 bis 6 C-Atomen als Aktivator.
Die Reagenziengarnitur kann auch noch zusätzlich einen Behälter mit einer Kontroll- oder Eichlösung und/oder einen Behälter mit einem Reagens zum Abstoppen der Reaktion und/ oder einen Behälter mit einem zur weiteren Umwandlung des freigesetzten organischen Rests und/oder einen Behälter mit den erwähnten, für diagnostische Zwecke geeigneten Zusätze wie Detergentien oder Stabilisatoren, enthalten.
Es ist jedoch nicht notwendig, Reagenzien und Zusätze in separaten Behältern aufzubewahren. Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine Reagenziengarnitur, worin einige der zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens notwendigen Bestandteile gemeinsam im gleichen Behälter aufbewahrt werden.
So kann z. B. die Puffersubstanz zusammen mit dem Aktivator in gelöster Form in einem einzigen Behälter aufbewahrt werden.
Mit Ausnahme des Aktivators, welcher stets in flüssiger Form vorliegt, können die verschiedenen Reagenzien und Zusätze sowohl in flüssiger als auch in fester Form, wie z. B. als Pulver, Granulat, Tabletten oder Lyophilisat verpackt werden.
Die Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1
Zu 2,0 ml Substratpufferlösung, bestehend aus 0,1 mol/1 Citratpuffer (pH 5,25), 5 g/1 Brij-35 und 5 mmol/14-Nitrophenyl-phosphat, mit unterschiedlichem Gehalt an 1-Pentanol werden 0,1 ml saure Prostataphosphataselösung (isoliert nach der Methode von Lam et al., Clin. Chem. 19,483,1973) zugemischt und bei 37 °C während 30 Minuten inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 1,0 ml 1 N Natronlauge abgestoppt und das freigesetzte 4-Nitro-Phenolat bei der Wellenlänge 405 nm photometrisch gemessen.
Die Versuchsergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle I in % der Prostataphosphatase-Aktivität ohne Zusatz von 1-Pentanol wiedergegeben.
1-Pentanol
Aktivität der
Konzentration
Prostataphosphatase in der Testlösung
0 mmol/1
100%
50 mmol/1
137%
100 mmol/1
173%
150 mmol/1
189%
200 mmol/1
139%
Beispiel 2
Das Verfahren nach Beispiel 1 wird wiederholt mit 2-Penta nol anstatt 1-Pentanol. Die Versuchsergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle I
I in gleicher Weise wiedergegeben.
2-Pentanol
Aktivität der
Konzentration
Prostataphosphatase in der Testlösung
0 mmol/1
100%
50 mmol/1
138%
100 mmol/1
172%
150 mmol/1
190%
200 mmol/1 139%
Beispiel 3
Das Verfahren nach Beispiel 1 wird wiederholt mit 1,5-Pen-tandiol anstatt 1-Pentanol. Die Versuchsergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle III wiedergegeben.
1,5-Pentandiol Konzentration in der Testlösung
Aktivität der Prostataphosphatase
0 mmol/1
100%
50 mmol/1
120%
100 mmol/1
131%
150 mmol/1
140%
200 mmol/1
148%
Beispiel 4
Das Verfahren nach Beispiel 1 wird wiederholt mit 1-Buta-nol anstatt 1-Pentanol. Die Versuchsergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle IV wiedergegeben.
1-Butanol Konzentration in der Testlösung
Alktivität der Prostataphosphatase
0 mmol/1
100%
50 mmol/1
119%
100 mmol/1
131%
150 mmol/1
131%
200 mmol/1
116%
Beispiel 5
Das Verfahren nach Beispiel 1 wird wiederholt mit 1-Hexa-nol anstatt 1-Pentanol. Die Versuchsergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle V wiedergegeben.
1-Hexanol
Aktivität der
Konzentration
Prostataphosphatase in der Testlösung
0 mmol/1
100%
25 mmol/1
107%
50 mmol/1
114%
100 mmol/1
120%
Beispiel 6
Zu 2,0 ml 0,1 mol/1 Acetatpuffer, pH 5,5 mit 62 |imol/l Phe-nolphthalein-di-Phosphat mit unterschiedlichem Gehalt an 1-Pentanol werden 0,05 ml Prostataphosphataselösung zugegeben und die Lösung während 15 Minuten bei 37 °C inkubiert. Zum Abstoppen der Reaktion sowie zur Farbentwicklung werden 2,0 ml 0,4 mol/1 Natriumphosphatpuffer, pH 10 zugemischt und die Farbintensität bei der Wellenlänge 546 nm gemessen.
Die Versuchsergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle VI wiedergegeben.
1-Pentanol Konzentration in derTestlösung
Aktivität der Prostataphosphatase
0 mmol/1
100%
50 mmol/1
154%
100 mmol/1
174%
150 mmol/I
177%
200 mmol/1
131%
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
5
625 833
Beispiel 7
Zu 2,0 ml 0,1 mol/1 Acetatpuffer (pH 5,5) 5 mmol/14-Nitro-phenylphosphat und 5 g/I Brij-35 mit unterschiedlichem Gehalt an 1-Pentanol werden 0,1 ml Erythrozytenphosphatase zugemischt. Nach 30 Minuten Inkubation bei 37 °C wird die Enzymreaktion durch Zugabe von 1,0 ml 1 N Natronlauge abgestoppt und das freigesetzte 4-Nitrophenolat bei der Wellenlänge 405 nm photometrisch bestimmt.
Die Versuchsergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle VII wiedergegeben.
1-Pentanol Konzentration in der Testlösung
Aktivität der
Erythrozytenphosphatase
0 mmol/1
100%
50 mmol/1
132%
100 mmol/1
153%
150 mmol/1
162%
200 mmol/1
136%
Beispiel 8
Zu 0,5 ml 0,1 mol/1 Citratpuffer, pH 5,5 und 5 mmol/14-Nitro-phenylphosphat werden 0,1 ml Serum zugemischt. Nach 30 Minuten Inkubation bei 37 °C wird die Enzymreaktion durch Zugabe von 2,5 ml 0,1 N Natronlauge abgestoppt und das freigesetzte 4-Nitrophenolat bei der Wellenlänge 405 nm photometrisch gemessen. Diese Aktivitätsbestimmung der sauren Phosphatase wird einmal ohne 1-Pentanol und einmal mit 150 mmol/11-Pentanol durchgeführt.
Die Versuchsergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle VIII wiedergegeben.
Probe
Aktivität ohne 1-Pentanol (U/1)
Aktivität mit 150 mmol/1 an 1 -Pentanol (U/1)
Serum 1
1,12
2,10
Serum 2
16,63
24,55
Serum 3
18,41
31,53
Serum 4
20,65
33,59
Beispiel 9
Zu 2,0 ml 0,1 mol/1 Acetatpuffer, pH 5,5 und verschiedenen Konzentrationen an Phenylphosphat werden 0,1 ml Prostataphosphataselösung zugemischt. Nach 5 Minuten Inkubation bei 37 °C werden 0,5 ml Phenolreagens [Folin-Ciocalteus] und 1,0 ml 20%ige NazCOä-Lösung zupipettiert und die Mischung weitere 10 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Intensität des blauen Farbstoffes, der der Konzentration an freigesetztem Phenol entspricht, wird bei der Wellenlänge 578 nm bestimmt. Die Versuche werden parallel einmal ohne 1-Pentanol und einmal mit 150 mmol/1 Pentanol-1 in der Substratpufferlösung durchgeführt.
Die Versuchsergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle IX wiedergegeben.
Phenylphosphat- ohne 1-Pentanol AE 578 mit 150 mmol/1 konzentrationin nm/5mjn Pentanol-1 AE 578 nm/5min der Testlösung
0,078 mmol/1
0,105
0,169
0,155 mmol/1
0,150
0,280
0,312 mmol/1
0,198
0,390
0,625 mmol/1
0,245
0,490
1,25 mmol/1
0,275
0,550
2,50 mmol/1
0,280
0,590
5,00 mmol/1
0,280
0,590
Beispiel 10
Zu 1,0 ml 0,1 mol/1 Acetatpuffer (pH 5,5) und 0,5 mmol/1 Phe-nolphthalein-Monophosphat mit unterschiedlichem Gehalt an 1-Pentanol werden 0,05 ml gereinigte Prostataphosphataselösung zugemischt. Nach 10 Minuten Inkubation bei 37 °C wird die Enzymreaktion durch Zugabe von 2,0 ml 0,4 mol/1 Natriumphosphatpuffer vom pH abgestoppt und das freigesetzte Phenolphthalein bei der Wellenlänge 546 nm photometrisch bestimmt.
Die Versuchsergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle X wiedergegeben.
1-Pentanolkonzentration Aktivität der Prostata in der T estlösung phosphatase
0 mmol/1 100%
50 mmol/1 125%
100mmol/l 135%
150 mmol/1 140%
Beispiel 11
Zu 1,0 ml 0,1 mol/1 Citratpuffer (pH 5,75), 1,2 mmol/1 Thy-molphthaleinphosphat, 5 g/I Barij-35 mit unterschiedlichem Gehalt an 1-Pentanol werden 0,05 ml gereinigte Prostataphosphataselösung zugemischt. Nach 10 Minuten Inkubation bei 37 °C wird die Enzymreaktion durch Zugabe von 2,0 ml 0,2 mol/1 Bicarbonatpuffer vom pH 10 abgestoppt und das freigesetzte Thymolphthalein bei der Wellenlänge 578 nm photometrisch gemessen.
Die Resultate sind in der folgenden Tabelle XI zusammengestellt.
1-Pentanolkonzentration Aktivität der Prostata in der Testlösung phosphatase
0 mmol/1 100%
50 mmol/1 117%
100 mmol/1 125%
150 mmol/1 140%
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Claims (40)
1. Verfahren zur Bestimmung einer sauren Phosphatase menschlicher Herkunft in einer Körperflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Lösung enthaltend als Substrat 50 umol/l bis 50 mmol/1 eines Phosphomonoesters, 50 bis 300 mmol/I einer Puffersubstanz zum Einstellen eines pH-Wertes zwischen 4,5 und 6,5 und 10 bis 300 mmol/1 eines Aktivators enthaltend mindestens einen geradkettigen Alkohol mit 4 bis 6 C-Atomen bei einer Inkubationstemperatur zwischen 20 °C und 45 °C der enzymatischen Wirkung der zu untersuchenden Körperflüssigkeit unterwirft und den Substrat-Umsatz misst.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die saure Phosphatase menschlicher Herkunft Prostata-phosphatase ist.
2
PATENTANSPRÜCHE
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die saure Phosphatase menschlicher Herkunft Erythrozytenphosphatase ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Phosphomonoester 4-Nitrophe-nylphosphat verwendet.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Phosphomonester Thymolphtha-leinphosphat verwendet.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Phosphomonoester Phenol-phthaleinphosphat verwendet.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Phosphomonoester Naphthyl-phosphat verwendet.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Phosphomonoester ß-Glycero-phosphat verwendet.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Phosphomonoester Adenosinmo-nophosphat verwendet.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Phosphomonoester Phenylpho-sphat verwendet.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Phosphomonoester 2-Chlor-4-nitrophenylphosphat verwendet.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass ein Puffer zum Einstellen eines pH-Wertes von etwa 5,5 verwendet wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass als Puffersutôtanz ein Citratpuffer verwendet wird.
14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass als Puffersubstanz ein Acetatpuffer verwendet wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Aktivator aus n-Butanol besteht.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Aktivator aus 1-Pentanol besteht.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Aktivator aus 2-Pentanol besteht.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Aktivator aus 1,5-Pentan-diol besteht.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und 11 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Umsatz an Phosphomonoester durch direkte photometrische Messung des freigesetzten organischen Restes bestimmt wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3,7 und 12 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Umsatz an Phosphomonoester durch direkte fluorometrische Messung des freigesetzten organischen Restes bestimmt wird.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3,8 bis 10 und 12 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Umsatz an Phosphomonoester dadurch bestimmt wird, dass der freigesetzte organische Rest chemisch oder enzymatisch in eine Substanz umgewandelt wird, die photometrisch gemessen werden kann.
22. Reagenziengarnitur zur Durchführung das Verfahrens gemäss Anspruch 1, enthaltend in einem oder mehreren Behältern a) einen Phosphomonoester,
b) eine Puffersubstanz zum Einstellen eines pH-Wertes zwischen 4,5 und 6,5,
c) einen geradkettigen Alkohol mit 4 bis 6 C-Atomen als Aktivator.
23. Reagenziengarnitur nach Anspruch 22, enthaltend 4-Nitrophenylphosphat als Phosphomonoester.
24. Reagenziengarnitur nach Anspruch 22, enthaltend Thy-molphthaleinphosphat als Phosphomonoester.
25. Reagenziengarnitur nach Anspruch 22 enthaltend Phe-nolphthaleinphosphat als Phosphomonoester.
26. Reagenziengarnitur nach Anspruch 22 enthaltend Naphthylphosphat als Phosphomonoester.
27. Reagenziengarnitur nach Anspruch 22 enthaltend ß-Glycerophosphat als Phosphomonoester.
28. Reagenziengarnitur nach Anspruch 22 enthaltend Ade-nosinmonophosphat als Phosphomonoester.
29. Reagenziengarnitur nach Anspruch 22 enthaltend Phe-nylphosphat als Phosphomonoester.
30. Reagenzgarnitur nach Anspruch 22 enthaltend 2-Chlor-4-nitrophenylphosphat als Phosphomonoester.
31. Reagenzgarnitur nach einem der Ansprüche 22-30 enthaltend als Puffersubstanz ein Citratpuffer.
32. Reagenzgarnitur nach Anspruch 31 enthaltend als Puffersubstanz ein Acetatpuffer.
33. Reagenzgarnitur nach einem der Ansprüche 22-32 enthaltend n-Butanol.
34. Reagenzgarnitur nach einem der Ansprüche 22-32 enthaltend 1-Pentanol.
35. Reagenzgarnitur nach einem der Ansprüche 22-32 enthaltend 2-Pentanol.
36. Reagenzgarnitur nach einem der Ansprüche 22-32 enthaltend 1,5-Pentandiol.
37. Reagenzgarnitur nach einem der Ansprüche 22-36 enthaltend zusätzlich einen Behälter mit einer Kontroll- oder Eichlösung.
38, enthaltend zusätzlich einen Behälter mit einem zur weiteren Umwandlung des freigesetzten organischen Restes geeigneten Reagens.
40. Reagenziengarnitur nach einem der Ansprüche 22 bis
38. Reagenzgarnitur nach einem der Ansprüche 22 bis 37, enthaltend zusätzlich einen Behälter mit einem Reagenz zum Abstoppen der enzymatischen Reaktion.
39, enthaltend zusätzlich einen Behälter mit einem Detergenz.
41. Reagenziengarnitur nach einem der Ansprüche 22 bis
39. Reagenziengarnitur nach einem der Ansprüche 22 bis
40, enthaltend zusätzlich einen Behälter mit einem Stabilisator.
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