JPS586480B2 - 酸性ホスフアタ−ゼの定量 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酸性ボスファターゼ（ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐ−
ｈａｔａｓｅ）の定量（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）
方法に関する。

更に詳しくは、本発明は酸性ホスファターゼを活性化す
るための試薬を使用し、その際該試薬をそれ自体で及び
該試薬を含有する試薬キットとして用いるヒト起原（ｈ
ｕｍａｎ ｏｒｉｇｉｎ）の酸性ホスファターゼの改善
された定量方法に関する。

酸性ホスファターゼは酸性ｐＨ域においてホスホーモノ
エステルを最適に開裂させ得る酵素である。

ヒト起原の酸性ホスファターゼは種々の器官〔例えば、
前立腺（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｇｌａｎｄ），肝臓及び牌
臓〕中及び血球中に見出され、そして細胞が損傷を受け
た時血清中に移送される。

従って、体液、特に血清又は血漿中の酸性ホスファター
ゼの定量は、関係する器官の疾病の診断において重要な
役割を果たす。

前立腺中に癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）が存在する場合及
び前立腺の肥大の場合に、血清又は血漿中の酸性ホスフ
ァターゼの活性がかなり増加し、そしてこれらの体液中
の前立腺ホスファターゼの定量はこれらの特異的疾病の
診断がなされるのを可能にする。

ヒト起原の酸性ホスファターゼの活性は４〜６個の炭素
原子を含有する直鎖状アルコールを体液に加えることに
よりかなり増加させることができる。

体液中のヒト起原の酸性ホスファターゼの活性は比較的
低いので、この活性を増加させることは、この重要な酵
素の定量に関して当該技術水準における顕著な進歩であ
る。

本発明は前記の知見に基づくものであり、従って４〜６
個の炭素原子を含有する直鎖状アルコールから成る活性
化剤を使用する、酸性ホスファターゼの改善された定量
方法に関する。

更に詳しくは、本発明は体液中のヒト起原の酸性ホスフ
ァクーゼの定量方法に関するものであり、この方法は、
基質としてホスホーモノエステル５０マイクロモル／ｌ
乃至５０ミリモル／ｌ、ｐＨ値を４．５乃至６．５の間
に調節するための緩衝剤物質５０〜３００ミリモル／ｌ
及び４〜６個の炭素原子を含有する少なくとも１種の直
鎖状アルコールから成る活性化剤１０〜３００ミリモル
を含有する溶液を、２０℃乃至４５℃間のインキュベー
ション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）温度で被検（ｕｎｄｅ
ｒｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）体液の酵素作用に付し
、そして基質転化率を測定することから成る。

酵素反応における基質として使用されるホスホーモノエ
ステルは一般式 Ｒ−０−ＰＯ３Ｈ２ 〔式中、Ｒは任意の所望の有機基を表わす〕を有する。

Ｒは好ましくは発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｉｃｇｒ
ｏｕｐ） （例えば，４−ニトロフエニル、チモールフ
タレイン、フェノールフタレイン又は２−クロロ−４−
ニトロフエニル基）或いは螢光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏ
ｒｉｃｇｒｏｕｐ）（例えば、１−ナフチル基）を表わ
す。

Ｒはアデノシン，グリセリン又はフエニル基を表わすこ
ともできる。

基質は最適濃度で使用するのが好ましいが、該最適濃度
はそれぞれ個々の基質に対して異なり、そしてｐＨ値に
よっても影響される。

所定の田値において可能な最大酵素活性を達成する最適
基質濃度は基質活性曲線から決定され得る。

与えられた基質に対する基質活性曲線は、他は同じ条件
下に種々の基質濃度における酵素活性を測定することに
より得られる。

一般に、酸性ホスファターゼに対する最適基質濃度は、
５０マイクロモル／ｌ乃至５０ミリモル／ｌ間であり、
好ましくは６０マイクロモル／ｌ乃至２５ミリモル／ｌ
間である。

かくして、５．５のｐＨ値において、最適基質濃度はβ
−グリセリンホスフエートに対しては約２５ミリモル／
ｌ，４−ニトロフエニルホスフエートに対しては２．５
ミリモル／ｌ及びフェノールフタレインジホスフエ−ト
に対しては１００マイクロモル／ｌである。

本発明の方法に従えば、ｐＨ値は、緩衝剤物質を使用し
て、４，５乃至６．５、好ましくは５乃至６間に調節さ
れる。

好適な緩衝剤物質の例はクエン酸塩緩衝剤及び酢酸塩緩
衝剤である。

緩衝剤物質濃度は一般に５０ミリモル／ｌ乃至３００ミ
リモル／ｌであり、そして好ましくは１００ミリモル／
ｌである。

本発明の方法に従えば、使用する活性化剤は、４〜６個
の炭素原子を含有する直鎖状アルコール、好ましくは、
ｎ−ブタノール、ｎ−ペンタノール又は１，５−ペンタ
ンジオールから成る。

１−ペンタノール及び２−ペンタノールが特に好ましい
。

活性化剤の濃度は一般に１０ミリモル／ｌ乃至３００ミ
リモル／ｌ、好ましくは１００ミリモル／ｌ乃至２００
ミリモル／ｌである。

活性化剤は４〜６個の炭素原子を含有する１種又はそれ
以上の直鎖状アルコールから成り得るが、好ましくは単
独のこの種の直鎖状アルコールから成る。

被検体液の試料を試験溶液と混合し、次いで該溶液を２
０℃乃至４０℃間の温度で、好ましくは３０℃乃至３７
℃の温度でインキユベートすることによって酵素反応を
行なう。

インキュベーション期間は一般に５〜６０分であるが、
好ましくは反応は適当な物質（例えば、水酸化ナトリウ
ム溶液又はリン酸三ナトリウム溶液）を加えることによ
って３０分後に停止させるのが好ましい。

適当な基質（例えば２−クロロ−４−ニトロフエニルホ
スフエート）を選ぶことにより酵素反応を速度論的に測
定することもできる。

基質転化率は酵素活性の目安である。

それはホスホーモノエステル濃度における減少又は遊離
した有機基の濃度における増加を決定することによって
測定される。

酸性ホスファターゼの活性化はホスホリル転位反応（ｔ
ｒａｎｓ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔ−ｉｏｎ ｒｅａ
ｃｔｉｏｎ），即ち、使用したホスホーモノエステルか
ら活性化剤として使用したアルコールへのホスフエート
転位（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）により
達成されるので、酵素反応後の遊離ホスフエートの量は
基質転化率に対応せず、従ってその目安と見なし得ない
。

測定方法は使用する基質に依存する。

基質として４−ニトローフエニルホスフエート、チモー
ルフタレインホスフエート フェノールフタレインホス
フエート又はナフチルホスフエートを使用する場合には
、遊離した有機基の濃度における増加は酵素反応を適当
に停止させた後直接測光法により又は螢光分析により決
定することができる。

他の基質（例えば、β−グリセリンホスフエート、フエ
ニルホスフエート又はアデンシンモノホスフエート）を
使用する場合には、基質転化率の測定は、遊離した有機
基をその濃度が測色法により決定され得る物質へと化学
的又は酵素的に転化させることにより行なわれる。

例えば、フエニルホスフエートを使用する場合には、遊
離したフェノールをフェノール試薬（Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉ
ｏｃａｌｔｅｕｓ，Ｍｅｒｃｋ９０１１）を使用して青
色染料に転化される。

本発明の方法は手動及び自動的の双方の酸性ホスファタ
ーゼの定量に対して好適である。

定量が行なわれ得る物質の例は血清、血漿、血液、液（
ｆｌｕｉｄ）及び尿である。

診断目的に好適な添加剤〔例えば、Ｂｒｉｊ−３５（ポ
リオキシエチレンラウリルエーテ）の如き洗剤、又はマ
グネシウムイオンの如き安定剤〕を、ホスホーモノエス
テル、緩衝剤に加えることができる。

該試薬は試薬キットにパックするのが好ましい。

本発明に従う試薬キットは、１個又はそれ以上の容器中
に、 ａ）ホスホーモノエステル、 ｂ）ｐＨ値を４．５乃至６．５に調節するための緩衝剤
物質、及び ｃ）活性化剤としての４〜６個の炭素原子を含有する直
鎖状アルコール、 を含んで成ることが好ましい。

該試薬キットは、容器中に対照溶液もしくは標準溶液を
及び／又は、容器中に反応を停止させるための試薬を及
び／又は、容器中に遊離した有機基を転化させるための
試薬を及び／又は、容器中に、診断目的に対して好適な
前記した添加剤（例えば、洗剤及び安定剤）を更に含ん
で成ることができる。

しかしながら、該試薬及び添加剤を別々の容器中に貯蔵
することは必らずしも必要ではない。

本発明はまた、本発明の方法を行なうために必要な成分
のいくつかを同じ容器中に一緒に貯蔵する試薬キットに
関するものでもある。

例えば、緩衝剤物質及び活性化剤は単独の容器中に溶解
した形態で一緒に貯蔵することができる。

常に液体状態にある活性化剤を除けば、種々の試薬及び
添加剤を液体で及び固体形態〔例えば粉末、顆粒、錠剤
又は凍結乾燥物（Ｉｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｅ）の両方に
おいてパックすることができる。

下記の実施例により本発明をさらに説明する。

実施例 １ 酸性前立腺ホスファターゼ溶液（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．
，Ｃｌｉｍ．Ｃｈｅｍ．１９４８３，１９７３に記載の
方法により単離された）０．１ｍｌを、クエン酸塩緩衝
剤０．１モル／／ｌ（ｐＨ５．２５）、Ｂｒｉｊ−３５
５ｇ／ｌ，４−ニトローフエニルホスフエート５ミリモ
ル／ｌ及び種々の濃度の１−ペンタノールから成る基質
緩衝液２．Ｏｍｌと混合し、そしてその混合物を３７℃
で３０分間インキユベートする。

ＩＮ水酸化ナトリウム溶液１．０ｍｌを加えることによ
り反応を停止させ、そして遊離した４−ニトローフエノ
ラートを４０ ５ｎｍの波長で測色法により定量する。

その結果を１−ペンタノール濃度０における前立腺才ス
ファターゼ活性の％として第■表に示す。

実施例 ２ １−ペンタノールの代りに２−ペンタノールを使用して
前記実施例１に記載の方法を繰り返す。

その結果を第■表に同様に示す。

実施例 ３ １−ペンタノールの代りに１，５−ペンタジオールを使
用して前記実施例１に記載の方法を繰り返す。

結果を第■表に示す。実施例 ４ １−ペンタノールの代りに１−ブタノールを使用して前
記実施例１に記載の方法を繰り返す。

結果を第■表に同様に示す。

実施例 ５ １−ペンタノールの代りに１−ヘキサノールを使用して
前記実施例１に記載の方法を繰り返す。

その結果を第Ｖ表に同様に示す。

実施例 ６ 前立腺ホスファターゼ溶液０．０５ｍｌを、酢酸塩緩衝
剤０．１モル／ｌｐＨ５．５）、フェノールフタレイン
ジホスフエート６２マイクロモル／ｌ及び種々の濃度の
１−ペンタノールから成る基質緩衝液２．０ｍｌと混合
し、そしてその混合物を３７℃で１５分間インキユベー
トする。

反応を停止させそして発色させるために、０．４モル／
ｌリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ１０）２．０ｍｌを混
合し、そして色の強度を５４６ｎｍの波長で測定する。

その結果を１−ペンタノール濃度０における前立腺ホス
ファターゼ活性の％として第■表に示す。

実施例 ７ 赤血球ホスファターゼ（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｐｈｏ
ｓｐｈａｔａｓｅ）０．１ｍｌを、酢酸塩緩衝剤０．１
モル／ｌ（ｐＨ５．５）、４−ニトロフエニルホスフエ
ート５ミリモル／ｌ，Ｂｒｉｊ−３５ ５ｇ／ｌ及び種
々の濃度の１−ペンタノールから成る基質緩衝液２．０
ｍｌと混合する。

３７℃で３０分間インキュベーション後に、ＩＮ水酸化
ナトリウム溶液１．０ｍｌを加えることによって反応を
停止させ、そして遊離した４−ニトロフエノラートを４
０５ｎｍの波長で測色法により定量する。

その結果を１−ペンタノール濃度０における赤血球ホス
ファターゼ活性の係として第■表に示す。

実施例 ８ 血清０． １ ｍｌを、クエン酸塩緩衝剤０．１モル／
ｌ（ｐＨ５．５）及び４−ニトロフエニルホスフエート
５ミリモル／ｌから成を基質緩衝液０．５ｍｌと混合す
る。

３７゜Ｃで３０分間インキュベーション後に、０．１Ｎ
水酸化ナトリウム溶液２． ５ ｍｌを加えることによ
って停止させ、そして遊離した４−ニトロフエノラート
を４０５ｎｍの波長で測色法により定量する。

この酸性ホスファターゼの活性の定量は１−ペンタノー
ルの不存在下において１回行ない、そして１−ペンタノ
ール１５０ミリモル／ｌの存在下に１回行なう。

その結果を第■表に示す。

実施例 ９ 前立腺ホスファターゼ溶液０．１ｍｌを、酢酸塩緩衝剤
０．１モル／ｌ（ｐＨ５．ｓ）及び種々の濃度のフエニ
ルホスフエートから成る基質緩衝液２．０ｍｌと混合す
る。

３７℃で５分間インキュベーション後に、フェノール試
薬（Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕｓ）０． ５ ｙ
ｄ及び２０％濃度の炭酸ナトリウム溶液１．０ｍｌをピ
ペットで採り入れ、そしてその混合物を３７℃で更に１
０分間インキユベートする。

遊離したフェノールの濃度に対応する青色染料の強度を
５７８ｎｍの波長で測定する。

これらの定量は１−ペンタノールの不存在下に１回行な
い、そして１−ペンタノール１５０ミリモル／ｌの存在
下に１回行なう。

その励果を第■表に示す。

実施例 １０ 精製した前立腺ホスファターゼ溶液０．０５ｍｌを、酢
酸塩緩衝剤０．１モル／ｌｐＨ５．５）、フェノールフ
タレインモノホスフエート０．５ミリモル／ｌ及び種々
の濃度の１−ペンタノールから成る基質緩衝液１．Ｏｍ
ｌと混合する。

３７℃で１０分間インキュベーション後、０．４モル／
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）２．０ｍｌを加え
ることにより反応を停止させ、そして遊離したフェノー
ルフタレインを５４６ｎｍの波長で測色法により定量す
る。

その結果を１−ペンタノール濃度０における前立腺ホス
ファクーゼ活性の係として第Ｘ表に示す。

実施例 １１ 精製した前立腺ホスファターゼ溶液０．０５ｍｌを、ク
エン酸塩緩衝剤０．１モル／ｌ（ｐＨ５．７５）、チモ
ールフタレインホスフエート１．２ミリモル／ｌ、Ｂｒ
ｉｊ−３５ ５ｇ／ｌ及び種々の濃度の１−ペンタノ
ールから成る基質緩衝液１．０ｍｌと混合する。

３７℃で１０分間インキュベーション後０．２モル／ｌ
重炭酸塩緩衝液（ｐＨ１０）２．０ｍｌを加えることに
よって反応を停止させ、そして遊離したチモールフタレ
インを５７８ｎｍの波長で測色法により定量する。

その結果を１−ペンタノール濃度０で前立腺ホスファタ
ーゼ活性の％として第■■表に示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 基質として、ホスホーモノエステル５０マイクロモ
   ル／ｌ乃至５０ミリモル／１，ｐＨ値を４．５乃至６．
   ５の間に調節するための緩衝剤物質５０〜３００ミリモ
   ル／ｌ及び４〜６個の炭素原子を含有する少なくとも１
   種の直鎖状アルコールから成る活性化剤１０〜３００ミ
   リモルを含有する溶液を、２０℃乃至４５℃間のインキ
   ュペーション温度で、被検体液の酵素作用に付し、そし
   て基質転化率を測定することを特徴とする、体液中のヒ
   ト起原の酸性ホスファターゼの定量方法。 ２ ヒト起原の該酸性ホスファターゼが前立腺ホスファ
   ターゼである、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ ヒト起原の該酸性ホスファターゼが赤血球ホスファ
   ターゼである、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ 該ホスホーモノエステルとして４−ニトロフエニル
   ホスフエートを使用する、特許請求の範囲第１〜３項の
   何れかに記載の方法。 ５ 該ホスホーモノエステルとしてチモールフタレイン
   ホスフエートを使用する、特許請求の範囲第１〜３項の
   何れかに記載の方法。 ６ 該ホスホーモノエステルとしてフェノールフタレイ
   ンホスフエートを使用する、特許請求の範囲第１〜３項
   の何れかに記載の方法。 ７ 該ホスホーモノエステルとしてナフチルホスフエー
   トを使用する、特許請求の範囲第１〜３項の何れかに記
   載の方法。 ８ 該ホスホーモノエステルとしてβ−グリセリンホス
   フエートを使用する、特許請求の範囲第１〜３項の何れ
   かに記載の方法。 ９ 該ホスホーモノエステルとしてアデノシンモノホス
   フエートを使用する、特許請求の範囲第１〜３項の何れ
   かに記載の方法。 １０ 該ホスホーモノエステルとしてフエニルホスフエ
   ートを使用する、特許請求の範囲第１〜３項の何れかに
   記載の方法。 １１ 該ホスホーモノエステルとして２−クロロ−４−
   ニトロフエニルホスフエートを使用する、特許請求の範
   囲第１〜３項の何れかに記載の方法。 １２ 緩衝剤物質を使用してｐＨ値を約５．５に調節す
   る、特許請求の範囲第１〜１１項の何れかに記載の方法
   。 １３ 該緩衝剤物質としてクエン酸塩緩衝剤を使用する
   、特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １４ 該緩衝剤物質として酢酸塩緩衝剤を使用する、特
   許請求の範囲第１２項記載の方法。 １５ 使用する該活性化剤がｎ−ブタノールから成る、
   特許請求の範囲第１〜１４項の何れかに記載の方法。 １６ 使用する該活性化剤が１−ペンタノールから成る
   、特許請求の範囲第１〜１４項の何れかに記載の方法。 １７ 使用する該活性化剤が２−ペンタノールから成る
   、特許請求の範囲第１〜１４項の何れかに記載の方法。 １８ 使用する該活性化剤が１，５−ペンタンジオール
   から成る、特許請求の範囲第１〜１４項の何れかに記載
   の方法。 １９ 遊離した有機基の直接測光法測定により基質転化
   率を決定する、特許請求の範囲第１〜６項及び特許請求
   の範囲第１１〜１３項の何れかに記載の方法。 ２０ 遊離した有機基の直接螢光分析測定により基質転
   化率を決定する、特許請求の範囲第１〜３項及び特許請
   求の範囲第７項並びに特許請求の範囲１２〜１８項の何
   れかに記載の方法。 ２１ 該遊離した有機基を測光法で測定し得る物質に化
   学的に又は酵素的に転化させて該基質転化率を決定する
   、特許請求の範囲第１〜８項、特許請求の範囲第８〜１
   ０項及び特許請求の範囲第１２〜１８項の何れかに記載
   の方法。 ２２ ４〜６個の炭素原子を含有する直鎖状アルコール
   を含有する、ヒト起原の酸性ホスファターゼの活性化用
   試薬。 ２３ 単独の直鎖状アルコールから成る、特許請求の範
   囲第２２項記載の試薬。 ２４ 該直鎖状アルコールがｎ−ブタノールである特許
   請求の範囲第２３項記載の試薬。 ２５ 該直鎖状アルコールが１−ペンタノールである、
   特許請求の範囲第２３項記載の試薬。 ２６ 該直鎖状アルコールが２−ペンタノールである、
   特許請求の範囲第２３項記載の試薬。 ２７ 該直鎖状アルコールが１，５−ペンタンジオール
   である、特許請求の範囲第２３項記載の試薬，２８ ホ
   スホーモノエステル、ｐＨ値を４．５乃至６．５に調節
   するための緩衝剤物質、及び４〜６値の炭素原子を含有
   する少なくとも１種の直鎖状アルコールを含有する、ヒ
   ト起原の酸性ホスファクーゼの定量用試薬。 ２９ 該ホスホーモノエステルが４−ニトロフエニルホ
   スフエートである、特許請求の範囲第２８項記載の試薬
   。 ３０ 該ホスホーモノエステルがチモールフタレインホ
   スフエートである、特許請求の範囲第２８項記載の試薬
   。 ３１ 該ホスホーモノエステルがフェノールフタレイン
   ホスフエートである、特許請求の範囲第２８項記載の試
   薬。 ３２ 該ホスホーモノエステルがナフチルホスフエート
   である、特許請求の範囲第２８項記載の試薬。 ３３ 該ホスホーモノエステルがβ−グリセリンホスフ
   エートである、特許請求の範囲第２８項記載の試薬。 ３４ 該ホスホーモノエステルがアデンシンモノホスフ
   エートである、特許請求の範囲第２８項記載の試薬。 ３５ 該ホスホーモノエステルがフエニルホスフエート
   である、特許請求の範囲第２８項記載の試薬。 ３６ 該ホスホーモノエステルが２−クロロ−４−ニト
   ロフエニルホスフエートである、特許請求の範囲第２８
   項記載の試薬。 ３７ ｐＨ値を約５．５に調節するための緩衝剤物質を
   含有する、特許請求の範囲第２８〜３６項の何れかに記
   載の試薬。 ３８ 該緩衝剤物質がクエン酸塩緩衝剤である、特許請
   求の範囲第３７項記載の試薬。 ３９ 該緩衝剤物質が酢酸塩緩衝剤である、特許請求の
   範囲第３７項記載の試薬。 ４０ ｎ−ブタノールを含有する、特許請求の範囲第２
   ８〜３９項の何れかに記載の試薬。 ４１ １−ペンタノールを含有する、特許請求の範囲第
   ２８〜３９項の何れかに記載の試薬。 ４２ ２−ペンタノールを含有する、特許請求の範囲第
   ２８〜３９項の何れかに記載の試薬。 ４３ １，５−ペンタンジオールを含有する、特許請求
   の範囲第２８〜３９項の倒れかに記載の試薬。 ４４ 更に洗剤を含有する、特許請求の範囲第２８〜４
   ３項の何れかに記載の試薬。 ４５ 更に安定剤を含有する、特許請求の範囲第２８〜
   ４３項の何れかに記載の試薬。 ４６ １個又はそれより多くの容器中に、ａ）ホスホー
   モノエステル、 ｂ） ｐＨ値を４．５乃至６．５の間に調節するための
   緩衝剤物質、 ｃ）活性化剤としての４〜６個の炭素原子を含有する直
   鎖状アルコール、 を含んで成る、酸性ホスファターゼの定量用試薬キット
   。 ４７ 容器中に対照溶液又は標準溶液を更に含んで成る
   、特許請求の範囲第４６項記載の試薬キット。 ４８ 容器中に酵素反応を停止させるための試薬を更に
   含んで成る、特許請求の範囲第４６又は４７項記載の何
   れかに記載の試薬キット。 ４９ 容器中に該遊離した有機基を更に転化するのに適
   した試薬を更に含んで成る、特許請求の範囲第４６〜４
   ８項の何れかに記載の試薬キット。 ５０ 容器中に洗剤を更に含んで成る、特許請求の範囲
   第４６〜４９項の合れかに記載の試薬キット。 ５１ 容器中に安定剤を更に含んで成る、特許請求の範
   囲第４６〜５０項の倒れかに記載の試薬キット。