CH627280A5

CH627280A5 -

Info

Publication number: CH627280A5
Application number: CH373775A
Authority: CH
Inventors: Ivar Giaever
Original assignee: Gen Electric
Priority date: 1974-04-01
Filing date: 1975-03-24
Publication date: 1981-12-31
Also published as: US3960488A; CA1049400A

Description

Die Erfindung betrifft eine Prüfplatte zur Bestimmung der 15 Konzentration von immunologisch reaktiven, biologischen Teilchen in einer Lösung mittels eines Inhibitionstestes.

Diese Erfindung betrifft somit das gleiche Gebiet wie die gleichzeitig angemeldeten folgenden Patente:

US Nr. 3 960 489,3 960 491,3 960 490,3 926 564 sowie 20 CH Nr. 579 777, 598 279, 604 172.

Die genannten Patente werden hiermit als Referenz angegeben.

Immunologische Reaktionen sind hoch spezifische biochemische Reaktionen, in denen ein erstes, immunologisch reakti-25 ves, biologisches Teilchen (im allgemeinen ein Protein), das als Antigen bezeichnet wird, sich mit einem zweiten Protein verbindet, welches zum Antigen spezifisch ist und als Antikörper bezeichnet wird. Durch die Reaktion wird ein immunologisch komplexiertes Protein gebildet. Solche immunologische Reak-3o tionen spielen sich in biologischen Systemen wie in Tieren oder Menschen ab und sind von grösster Wichtigkeit für die Bekämpfung von Krankheiten. Beim Eintritt eines fremden Proteins, d.h. des Antigens, in ein biologisches System, beginnt dieses System die spezifischen Antikörper zum Antigen zu produzie-35 ren. Dieser Prozess ist zur Zeit noch nicht vollständig geklärt. Die Molekeln des Antikörpers haben chemische Verbindungsstellen, die mit den entsprechenden Verbindungsstellen der An-tigenmolekeln chemische Verbindungen eingehen und so ein immunologisch komplexiertes Protein bilden.

40 Die meisten Antigene sind Proteine oder enthalten Proteine als wichtige Bestandteile. Alle Antikörper sind Proteine. Proteine sind grosse Molekeln von hohem Molekulargewicht, z.B. Polymere, wie Ketten mit einer variablen Anzahl von Aminosäuren. Die oben genannten Patentgesuche zeigen, dass ein 45 beliebiges Protein sich nur in einer monomolekularen Schicht auf ein Substrat legt und dass hierauf kein weiteres, beliebiges Protein sich auf der ersten Proteinschicht niederschlägt. Andererseits wird sich das zum Protein der ersten Schicht spezifische Protein auf diesem niederschlagen, und zwar durch immunolo-50 gische Verbindung. Gemäss dieser Lehre und ihren Anwendungen, werden nun als diagnostische Vorrichtungen Trägerblätt-chen vorgeschlagen, auf denen eine monomolekulare Proteinschicht absorbiert ist, und die dazu dienen, Lösungen auf vermutete, spezielle Proteine zu prüfen. Falls in der Lösung das zur 55 Testschicht spezifische Protein vorhanden ist, hat das Träger-blättchen nach Kontakt mit der Lösung eine bimolekulare Proteinschicht. Falls das spezifische Protein nicht in der Lösung ist, hat das Trägerblättchen nur die ursprüngliche, monomolekulare Schicht. Darauf wird mittels optischer, elektrischer und chemi-60 scher Methoden geprüft, ob nach der Untersuchung das Trägerblättchen eine mono- oder bimolekulare Schicht trägt.

Da Antikörper nur durch biologische Systeme als eine Antwort auf die Invasion durch fremde Proteine produziert werden, ist der Nachweis der Antikörper in einem biologischen System 65 von hohem diagnostischen Wert, da dadurch das Antigen, das in das System eingeführt worden ist, bestimmt werden kann. Ein typisches Beispiel des diagnostischen Nachweises von Antikörpern ist der Nachweis der Antikörper gegen Syphilis oder gegen

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Tripper im menschlichen Serum. Andererseits hat auch der von speziellen, immunologisch reaktiven, biologischen Teilchen

Nachweis von gewissen Antigenen in einem biologischen Sy- in einer Probe, wie z.B. Blut.

stem einen diagnostischen Wert: Nachweis der HCG-Proteine Die erfindungsgemässe Prüfplatte zur Bestimmung der im Urin als Schwangerschaftstest und Nachweis von HAA-Pro- Konzentration von immunologisch reaktiven, biologischen Teil-

teinen im Blut von möglichen Blutspendern. 5 chen in einer Lösung mittels eines Inhibitionstestes ist im

Um die genannten diagnostischen Untersuchungen ausfüh- Patentanspruch 1 definiert.

ren zu können, muss das geeignete Protein für die immunologi- Im gesamten Text steht Testlösung für die zu untersuchende sehe Reaktion erhalten werden. Die einzige heute bekannte Lösung mit ersten, immunologisch reaktiven Teilchen unbe-

Quelle für ein Antikörperprotein ist ein lebendes, biologisches kannter Konzentration. Die zweite Lösung enthält zweite, mit

System. Von diesen Systemen zeigen, wie es heute bekannt ist, io den ersten immunologisch reagierende Teilchen und die Ver-

nur Wirbeltiere immunologische Reaktionen gegen fremde gleichslösung wieder die ersten, immunologisch reagierende

Proteine. Z.B. werden viele Antikörper im Blutserum von Tie- Teilchen, jedoch in bekannter Konzentration.

ren und Menschen gefunden, die den entsprechenden Antige- Exemplifizierend zusammengefasst, liefert die vorliegend nen ausgesetzt worden sind. Im Gegensatz dazu können manche beschriebene Erfindung eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Antigene in Laboratoriumskulturen hergestellt werden. Einige 15 Bestimmung der Konzentration von ersten, immunologisch reAntigene aber, z.B. das HAA-Protein, können wie Antikörper aktiven, biologischen Teilchen in einer Testlösung durch die nur von höheren, lebenden, biologischen Systemen erhalten direkte Betrachtung von Auge der Neigung einer komplexierten werden. Proteinfällungslinie auf einem metallischen, festen Substrat.

Es ist in der Immunologie bekannt, dass Antikörper als An- Das metallische, feste Substrat hat anfänglich eine monomole-

tigene wirken können, wenn sie als fremde Proteine einem Wir- 20 kulare Schicht des ersten, biologischen Teilchens auf der Ober-beltier eingegeben werden. Somit können in einem solchen Wir- fläche absorbiert. Auf dieser monomolekularen Schicht wird beltiersystem spezifisch reagierende Antikörper zu einem gege- hierauf eine feuchtigkeitshaltende Schicht z.B. aus einem Gel benen Antikörper produziert werden. oder einer angefeuchteten Cellulose aufgebracht. Eine Testlö-

Wenn auch die Substrate (Trägerblättchen), die in den oben sung wird hierauf an einer Kante der feuchtigkeitshaltenden genannten Patenten beschrieben worden sind, qualitativ zufrie- 25 Schicht auf dem metallischen Substrat angelegt. Eine zweite Lö-

denstellend arbeiten, kann mit diesen Trägerblättchen doch die sung, die die zweiten, immunologisch reaktiven, biologischen

Konzentration der biologisch aktiven Teilchen in der Lösung Teilchen enthält, die zu den ersten Teilchen spezifisch sind, wird nicht festgestellt werden. hierauf an einer zur ersten, befeuchteten Kante senkrechten

„. , . , ... . ^ , Kante angelegt. Die Testlösung und die zweite Lösung diffun-

mean ere vonme a îsier en rager a c enaus 30 dieren nun gegeneinander durch die feuchtigkeitshaltende anod.sch behandeltem Tantal istin den folgenden Artikeln be- Schicht un(fb^ ihrem Zusammentreffen bildet sich die Fai-

schrieben: «L. Vroman et al», «Interactions Among Human . ,

* . T * ' , . / V1 lungslime, da dort die zweiten biologischen Teilchen mit den

Blood Proteins at Interfaces», Fédération Proceedings, Volume 6 biologischen Teilchen regieren Der Verkauf der resul-

30, No. 5 (September-October, 1971) Seiten 1494-1502. ersten biologischen 1 eilchen reagieren. Der Verkaut der resul

A A tierenden Fällungslime steht im Zusammenhang mit der Kon-

A. L. Adams et al, «Three Simple Ways to Detect Antibo- 35 zentration der erften Teilchen in der TestIösungB

dy-Antigen Complexon Fiat Surfaces», Journal of Immunologi- einer anderen Ausführungsform kann die Konzentration cal Methods 3 (1973), Seiten 227 232, und von ^hreren, verschiedenen, immunologisch reaktiven, biolo-

Alexandre Rothen, «Immunologie und Enzymatic Reac- gischen Teilchen, wie z.B. verschiedene Komponenten im tions Carned Out at a SoM-Liquid Interface», Phys.ological menschlichen Blutplasma, bestimmt werden. Dabei werden ein-Chemistry and Physics 5 (1973), Seiten 243 58. 40 zelne monomolekulare Schichtstreifen auf der metallischen Un-Die in diesen Artikeln angegebenen anodisch behandelten terl auf und mit einer feuchtigkeitshaltenden Schicht Tantaltragerblattchen sind jedoch weniger empfmdlich als unse- üb en Die TestIösung mit den zu bestimmenden, verschiere Indium-Gold-Legierung, Indmm-Oxid-Tragerblattchenwie denen K nenten wird entla einer Kante mit der {euchti sie vor allem im oben genannten Patent No. 3 926 564 fur den keitshaltenden Schicht in Kontakt gebracht. Eine Vergleichslö-Nachweis von Hepatitis geschildert werden. 45 sung> die die gleichen Komponenten in bekannten Konzentra-

Zum Stand der Technik gehören auch die immunologischen tionen enthält, wird hierauf entlang der gegenüberliegenden Doppeldiffusionsversuche durch Celluloseacetatmembrane und Kante angebracht. Eine zweite Lösung, die immunologisch rein Gelen. In diesen Versuchen werden Proben mit Antigenen aktive, biologische Teilchen, die zu den zu bestimmenden Kom-und ihren Antikörpern an verschiedenen Flächen der feuchten ponenten spezifisch sind, enthält, wird entlang einer Mittellinie Membrane oder im Gel angesetzt. Die Wirksubstanzen diffun- 50 zwischen den beiden benetzten Kanten in die feuchtigkeitshal-dieren zueinander hin und formen dann in einer Fällungslinie tende Schicht aufgebracht. Die drei Lösungen sind also parallel die komplexierte Proteinverbindung. In diesen Versuchen ist zueinander aufgebracht. Während der Diffusion der drei Lösun-jedoch die Empfindlichkeit ungenügend hoch. Zudem ist die gen durch die feuchtigkeitshaltende Schicht bilden sich mono-Fällungslinie im allgemeinen mit unbewaffnetem Auge nicht molekulare Schichten der spezifischen, biologischen Partikeln sichtbar, ausser die Celluloseacetatmembrane oder das Gel sei 55 durch immunologische Reaktionen entlang der adsorbierten mit einem geeigneten Proteinmaterial, wie Amido Black, vorge- monomolekularen Schichtstreifen ausserhalb der Mittellinie, so färbt worden. Diese Methode wird im Buch von C. A. Williams dass die Länge der verschiedenen doppelten Schichten von bio-und M. W. Chase, «Methods in Immunology and Immunoche- logischen Partikeln im Zusammenhang steht mit den Konzen-mistry», Vol III, Academic Press, Seiten 153 und 169, beschrie- trationen der verschiedenen Komponenten. Ein Vergleich zwi-ben. Dieses Vorfärben führt also zu einem zusätzlichen Verfah- 60 sehen der Vergleichslösung und der Testlösung kann nun durch rensschritt im Verfahren, um solche biologischen Teilchen zu visuelle Vergleiche der Längen der Doppelschichten entlang je-analysieren. Weitere Nachteile dieses Verfahrens sind, dass die den Komponentenstreifens von der Mittellinie gemacht werden. Anzeige der immunologischen Reaktion nur temporär erfolgt, Dadurch kann sehr rasch bestimmt werden, ob die Konzentra-ausser man halte die Reaktionsanzeige durch ein kompliziertes tion jeder Komponente in der Testlösung normal oder abnormal Färb-, Wasch- und Trocken-Verfahren fest, und dass das Gel zu 65 ist. Die Fällungslinie der komplexierten Proteinverbindungen, unerwünschtem Bakterienwachstum führen kann. Schliesslich die sich auf den metallisierten Oberflächen der festen Substrate liefert das beschriebene Verfahren keine einfache Methode und als ein Resultat der immunologischen Reaktionen in allen Aus-keine einfache Vorrichtung zur Bestimmung der Konzentration führungsformen unserer Erfindung bilden, sind von Auge klar

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zu erkennen. Dies im Gegensatz zur Beobachtung derselben (1) eine nicht kontinuierliche Schicht, d.h. Metallteilchen

Fällungslinien in früheren Verfahren, welche ohne spezielle oder Kügelchen, wobei Indium ein typisches Metall sein kann,

Färbung mit dem unbewaffneten Auge nicht zu erkennen sind. (2) eine erste Schicht aus Indiumkügelchen mit einem dün-

Zudem sind die Fällungslinien in den zwei ersten Ausführungs- nen Goldüberzug,

formen und die verschiedenen Fällungslinien in den anderen s (3) ejne Schicht Indiumkügelchen (oder eine kontinuierliche

Ausführungsformen schon erkenntlich bei wesentlich tieferen Indiumschicht) und ein dünner Goldüberzug, welcher mit dem

Konzentrationen der biologischen Partikel als z.B. in früheren Indium legiert worden ist. Darauf zusätzlich eine dünne Indium-

Verfahren ; dies wegen der höheren Empfindlichkeit unseres oxidschicht, welche die äusserste Oberfläche bildet, oder

Verfahrens und unserer Vorrichtung. (4) ein Metall, wie Nickel, und ein Oxidfilm darauf.

Fig. la ist eine Aufsicht auf eine erste Ausführungsform 10 Die bevorzugte Ausführungsform ist diejenige mit der nicht unserer Erfindung. Darin wird eine angefeuchtete Cellulose- kontinuierlichen Indiumteilchenschicht. Speziell gilt dies, wenn membrane als Diffusionsmedium für zwei Proben verwendet. die Grösse (Molekulargewicht) der beiden reagierenden biolo-

Fig. lb ist eine Schnittzeichnung der Vorrichtung gemäss gischen Teilchen von gleicher Grössenordnung ist. Bei grossen

Fig. la entlang der Linie lb-lb. Unterschieden zwischen diesen Grössen, wie z.B. beim Nach-Fig. 2a ist eine Aufsicht auf Fig. la, nachdem die Reaktions- 15 weis von Hepatitisteilchen, hat sich die dritte Metallisation als diffusion abgeschlossen ist. die empfindlichste erwiesen. Die Metallisation kann also der

Fig. 2b ist eine Seitenansicht der Fig. 2a entlang der Linie speziellen Untersuchung angepasst werden. Gemäss den oben

2b-2b. genannten Patenten wird das Substrat 10 mit Vorteil aus licht-

Fig. 3a ist eine Aufsicht auf eine zweite Ausführungsform durchlässigem Material, wie Glas oder Plastic, hergestellt. Die dieser Erfindung analog der ersten Ausführungsform, aber mit 20 Indiumteilchen werden hierauf aufgedampft und erhalten dabei einer dünnen Gelschicht als Diffusionsmedium. Durchmesser von der Grössenordnung von 1000 Angström. Die

Fig. 3b ist eine Schnittansicht der Fig. 3a entlang der Linie genaue Grösse dieser Kügelchen ist jedoch nicht kritisch, solan-

3b-3b. ge sie von ähnlicher Grössenordnung wie ein grosser Teil der

Fig. 4a ist eine Aufsicht auf das metallisierte, feste Substrat Wellenlänge des sichtbaren Lichtes ist.

vor der Abdeckung mit dem Diffusionsmedium gemäss einer 25 Die Farbe der Indiumteilchenmetallisation ist ein leichtes dritten und vierten Ausführungsform unserer Erfindung. Braun. Im Falle der Indiumgoldlegierung mit Indiumoxidüber-

Fig. 4b ist eine Schnittzeichnung der Fig. 4a entlang der zug beträgt die Schichtdicke für Indium ungefähr 2000 Ang-

Linie 4b-4b. ström, für Gold ungefähr 1000 Angström und für Indiumoxid Fig. 5a ist die Aufsicht auf die dritte Ausführungsform unse- einige 100 Angström. Die Farbe dieser Metallisation ist unge-

rer Erfindung, bevor die zu untersuchenden Lösungen in einer 30 fähr Bronze. In dieser Metallisation hängt aber die Farbgebung

Cellulosemembrane als Diffusionsmedium angebracht werden. vom Grad der Oxidation der Indiumoxidschicht ab. Ebenso

Fig. 5b ist die Schnittzeichnung der Fig. 5a entlang der Linie wird mit dieser Oxidation die Empfindlichkeit für verschiedene

5b-5b. Schichtdicken von biologischen Partikelschichten beeinflusst.

Fig. 6a ist die Aufsicht auf ein metallisiertes, festes Substrat Im Falle der Metallisation mittels Teilchen oder Kügelchen gemäss der dritten und vierten Ausführungsform unserer Erfin- 35 von Metallen mit oder ohne Goldüberzug und mit oder ohne dung nach Beendigung der Diffusion. Indiumoxidüberzug ist die oberste Oberfläche leicht unregel-

Fig. 6b ist die Schnittzeichnung der Fig. 6a entlang der Linie mässig. Im Falle einer Metallisation durch eine kontinuierliche

6b-6b. Metallschicht ist diese Fläche im wesentlichen flach. Beide Flä-Fig. 7a ist die Aufsicht auf die vierte Ausführungsform unse- chen (leicht unregelmässig oder flach) können in dieser unserer rer Erfindung analog der dritten Ausführungsform, aber mit 40 Erfindung verwendet werden.

einer Gelschicht als Diffusionsmedium. Das Substrat 10 kann bis zu ca. 3 cm2 klein sein. Weitere Fig. 7b ist die Schnittzeichnung der Fig. 7a entlang der Linie Einzelangaben über das Substrat, seine Metallisation und die

7b-7b. Herstellung derselben, sind in den oben angegebenen Patenten

Die Fig. la und lb zeigen also, wie gesagt, eine Aufsicht und enthalten.

eine Schnittansicht der ersten Ausführungsform der Vorrich- 45 Nachdem nun das geeignete, metallisierte Substrat herge-

tung gemäss unserer Erfindung. Die Vorrichtung dient zur Be- stellt worden ist, wird eine monomolekulare Schicht 11 des er-

stimmung der Konzentration von speziellen, immunologisch re- sten, immunologisch reaktiven, biologischen Teilchens auf im aktiven, biologischen Teilchen in einer Probelösung mittels ei- wesentlichen der ganzen Oberfläche adsorbiert. Diese ersten,

nes Inhibitionstestes auf einer festen Oberfläche, speziell auf biologischen Teilchen sind die speziellen Teilchen in einer Ver-

der Oberfläche eines metallisierten, festen Substrates. 50 gleichslösung, deren Konzentration man nachher bestimmen

Die Vorrichtung enthält das metallisierte Substrat 10, wel- will. Die Adsorption dieser ersten biologischen Teilchen kann ches im wesentlichen auf der gesamten metallisierten Oberflä- durch Eintauchen des Substrates in einer Lösung der Teilchen che eine adsorbierte, monomolekulare Schicht 11 des (ersten), während genügend langer Zeit, oder durch Aufbringung einer biologischen Partikels, und ein flüssiges Diffusionsmedium 12 in konzentrierten Lösung auf das Substrat erfolgen. Die konzen-

Kontakt und auf der monomolekularen Schicht 11 enthält, wo- 55 trierte, aufgebrachte Lösung soll dabei die gesamte, metallisier-

bei die Diffusionsschicht der Aufnahme sowohl einer Testlö- te Substratoberfläche bedecken. Diese ersten, biologischen sung wie auch einer zweiten Lösung, die die (zweiten) immuno- Teilchen können entweder in Laborkulturen hergestellt werden logisch reaktiven, biologischen Teilchen enthält, welche zu den oder sie können von höheren, lebenden biologischen Systemen ersten Teilchen spezifisch sind, dient. erhalten werden. Sie sind im Handel in hochreiner Form erhält-

Das Substrat 10 hat eine im wesentlichen flache Oberfläche 60 lieh; sie können aber auch, falls man sie selbst herstellt, che-und wird aus irgendeinem geeigneten Material, wie Metall, misch gereinigt werden. Die Lösung dieser ersten, biologischen Glas, Plastic oder ähnliche Stoffe, hergestellt. Vorteilhafterwei- Teilchen kann beispielsweise eine Lösung von Salz in Wasser se ist das Substrat 10 ein Glasträger, wie er in der konventionel- oder in einer anderen geeigneten Flüssigkeit sein, wobei das len Mikroskopie verwendet wird. Die obere Oberfläche des Salz nicht mit dem ersten biologischen Teilchen reagieren soll. Substrates 10 wird hierauf metallisiert gemäss dem Verfahren, « Das mit der Lösung bedeckte Substrat 10 wird hierauf in einer die in den oben angeführten Patenten beansprucht sind. Als feuchten Kammer genügend lange aufbewahrt, so dass die erBeispiel kann die metallisierte Schicht 10a die folgenden Be- sten, biologischen Teilchen auf der metallisierten Oberfläche standteile enthalten: des Substrates 10 adsorbiert werden. Sie bilden dabei im we-

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sentlichen eine vollständige, monomolekulare Schicht 11 auf der gesamten oberen Oberfläche des metallisierten Substrats. Die dazu benötigte Zeit (im allgemeinen bis zu einer Stunde) ist eine Funktion der Konzentration der ersten Teilchen in der Lösung. Eine Spülung des beschichteten Substrates 10 nach der Adsorption der monomolekularen Schicht 11 wird oft empfohlen. Hierauf wird die monomolekulare Schicht auf dem überzogenen Substrat 10 getrocknet, was vorteilhafterweise durch Lufttrocknung bei Raumtemperatur geschieht. Die Schichtdicke der monomolekularen Schicht 11 liegt im allgemeinen zwischen 30 und 100 Angström und hängt natürlich von den speziellen, zu untersuchenden biologischen Teilchen der ersten Schicht ab.

Über der monomolekularen Schicht 11 auf dem Substrat 10 wird nun ein geeignetes, flüssiges Diffusionsmedium aufgebracht. Wie in den Fig. la und lb gezeigt wird, kann dieses Diffusionsmedium z.B. eine Cellulosemembrane 12 sein, die z.B. mit destilliertem Wasser angefeuchtet wird. Die Anfeuchtung kann entweder vor oder nach der Plazierung auf der monomolekularen Schicht geschehen. Die Membrane 12 muss so auf die monomolekulare Schicht gelegt werden, dass sie mit ihr auf der ganzen Oberfläche in Kontakt ist.

Hierauf wird das mit der feuchten Membrane bedeckte Substrat in eine feuchte Kammer gebracht. Die Lösung, in der die Konzentration des ersten, biologischen Teilchens zu bestimmen ist, wird hierauf entlang einer ersten Kante in Verbindung mit der feuchten Membrane 12 auf dem Substrat 10 gebracht. Eine zweite Lösung, die das zweite, biologische Teilchen enthält,

wird analog entlang der zur ersten, befeuchteten Kante senkrechten Kante angebracht. Die Lösungen der ersten und zweiten biologischen Teilchen können z.B. Salzlösungen in Wasser oder anderen geeigneten Flüssigkeiten sein, wobei sowohl die Salze wie auch die Flüssigkeiten mit dem biologischen Teilchen nicht reagieren sollen. Beispiele dafür sind Blutplasma oder menschliches Serum. Die Lösungen enthalten im allgemeinen zusätzlich nicht spezifizierte biologische Teilchen. Ein typisches Beispiel für eine zu untersuchende Lösung ist das menschliche Serum und die andere Lösung Wildkaninchenantiserum. Wenn auch die Lösungen der ersten und zweiten biologischen Teilchen durch Auftropfen entlang der ersten und zweiten Kante aufgebracht werden können, ist das folgende Verfahren doch das bessere: Schmale Streifen von Cellulosemembrane 13 und 14 werden mit den genannten Lösungen angefeuchtet. Die Streifen werden hierauf entlang zweier senkrechter Kanten des Substrates 10 abgelegt. Die zwei Lösungen diffundieren darauf von den Streifen in die Membrane 12. Die Streifen 13 und 14 werden also, wie in Fig. la gezeigt wird, parallel zur ersten und zweiten Kante des Substrates 10 und mit gleichem Abstand davon darauf abgelegt. Dieser Abstand ist nicht speziell kritisch und die Streifen 13 und 14 könnten sogar leicht übereinandergelegt werden, wie es z.B. in Fig. 5a dargestellt ist. Die Membrane 12 und die Streifen 13 und 14 können aus irgendeiner Cellulose oder aus Cellulosederivaten, wie z.B. Celluloseacetat, bestehen. Dazu zählen also z.B. poröses Papier, wie normales Filterpapier, oder einfach ein Tissuepapier. Die Ausmasse der Membrane 12 sind im allgemeinen ein wenig grösser als diejenigen des Substrates 10, um so entlang den Kanten genügend Platz zu schaffen für die schmalen Streifen 13 und 14. Als typische Beispiele dieser Dimensionen können gelten: Für ein Substrat ca. 6,5 cm2, für die Membrane 12 ca. 10 cm2 und für die Streifen 13 und 14 je 3,2 cm Länge und 0,6 cm Breite. Die Streifen 13 und 14 können gleich lang wie oder kürzer bzw. länger als die aneinanderliegenden Seiten des Substrates 10 sein.

Während der Diffusion der Test- und der Zweitlösung in die Membrane 12 wandern die ersten, biologischen Teilchen und andere nicht spezifizierte biologische Teilchen der Testlösung vom Streifen 13 durch die Membrane 12. Dabei reagieren natürlich die diffundierenden, ersten biologischen Teilchen immunologisch nicht mit den Teilchen der monomolekularen Schicht

11, da die beiden Teilchen ja die gleichen sind. In analoger Art und Weise diffundieren die zweiten biologischen Teilchen aus dem Streifen 14 durch die Membrane 12. Da nun aber die zweiten Teilchen spezifisch zu den in der monomolekularen Schicht 511 sich befindenden ersten Teilchen sind, reagieren diese zweiten Teilchen immunologisch mit den ersten Teilchen zu einer monomolekularen Schicht 15 der zweiten Teilchen über der monomolekularen Schicht 11, wie es in den Fig. 2a und 2b dargestellt ist. Der Zweck des Diffusionsmediums 12 ist, die io darin enthaltene Feuchtigkeit zu immobilisieren, so dass eine kontrollierte Diffusion der Lösungen (und der darin enthaltenen Teilchen) in der Membrane 12 geschieht, um so reproduzierbare Resultate zu gestalten. Entlang der Berührungslinie der zwei diffundierenden Lösungen bildet sich die Fällungslinie 16 15 des komplexierten Proteins. Diese besteht aus mehreren Schichten und entsteht durch die immunologische Reaktion zwischen den Teilchen der diffundierenden Test- und zweiten Lösung. Die Fällungslinie 16 ist eine Gerade oder eine Kurve je nach Art und Konzentration der untersuchten Teilchen. Der Verlauf 20 dieser Kurve steht im Zusammenhang mit der Konzentration des ersten, biologischen Teilchens in der zu untersuchenden Lösung. Die Zeit bis zur Beendigung der Diffusion und bis zur Bildung der Fällungslinie hängt von der Art der biologischen Teilchen, von deren Konzentrationen, von der Temperatur und 25 von den räumlichen Gegebenheiten der Vorrichtung ab. Die Zeit für diese Diffusion und die Bildung der Fällungslinie beträgt normalerweise mehrere Stunden. Diese Zeit kann jedoch durch Anwendung von Elektrophorese auf einige Minuten reduziert werden.

30 Nach der Ausbildung der Fällungslinie 16 wird die Cellulosemembrane 12 vom Substrat 10 abgeschält. Es verbleibt somit auf der Oberfläche des Substrates die Fällungslinie 16, das Gebiet der monomolekularen Schicht 11 und das Gebiet der bimolekularen Schicht 11 und 15. Dies ist dargestellt in den Fig. 35 2a und 2b. Das Substrat wird hierauf gespült, wozu vorteilhafterweise destilliertes Wasser verwendet wird, und getrocknet, vorteilhafterweise durch Uberblasen des Substrates mit Luft bei Raumtemperatur. Die Oberfläche des Substrates 10 wird hierauf von Auge auf Anwesenheit von und auf Verlauf der Fällungslinie 16 untersucht. Wenn auch normalerweise die Testlösungen das erste biologische Teilchen tatsächlich enthalten, kann mit dem erfindungsgemässen Verfahren auch eine Lösung untersucht werden, die kein erstes biologisches Teilchen enthält. In diesem Fall wird keine sichtbare Fällungslinie 16 ausgebildet 45 werden. Die Betrachtung der Oberfläche von Auge geschieht ohne irgendwelche Hilfsmittel. Dabei wird bei denjenigen Substraten, die nur mittels Indiumteilchen metallisiert worden sind, das durchtretende Licht beobachtet, währenddem bei denjenigen Substraten, die mit Indiumteilchen, Goldfilm und Indiumoxidüberzug metallisiert worden sind, das reflektierte Licht betrachtet wird. Im Falle der ersten Metallisation ist die Fläche der monomolekularen Schicht hellbraun, die Schicht mit der bimolekularen Schicht 11,15 mittelbraun und die Fällungslinie 16 dunkelbraun. Im Falle der Indium-Gold-Indiumoxid-Metallisa-tion ist die Fällungslinie purpurrot.

Aus dem oben Gesagten folgt, dass, je höher die Konzentration des ersten biologischen Teilchens in der Testlösung aus dem Streifen 13 ist, umso weiter diffundieren diese Teilchen in die 60 Membrane hinein, und umso kleiner wird der Winkel zwischen der Fällungslinie 16 und der Horizontalen. Dies ist in Fig. 2a dargestellt. Ein quantitativer Nachweis der Konzentration der ersten Teilchen kann dadurch geschehen, dass man diesen Winkel für verschiedene Lösungen, in denen das erste Teilchen in 65 bekannten Konzentrationen vorliegt, mittels des genau gleichen Verfahrens bestimmt, und hierauf die Lage der zur unbekannten Lösung gehörenden Fällungslinie mit derjenigen der bekannten Lösungen vergleicht.

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Im beschriebenen Verfahren wurde angenommen, dass die Zweitlösung, die auf dem Streifen 14 aufgetragen wird, eine bekannte Lösung ist, die die zweiten, biologischen Teilchen enthält. Andererseits können beide, Test- und zweite Lösung, Lösungen mit unbekannten Teilchen oder solche, in denen diese Teilchen nur vermutet werden, sein. Die Bildung einer Fällungslinie gibt in diesem Fall an, dass die beiden Lösungen tatsächlich aufeinander spezifische Teilchen enthielten. Die Abwesenheit der Fällungslinie zeigt an, dass eine oder beide der Lösungen die entsprechenden Teilchen nicht enthielt. Falls nur die Zweitteilchen vorhanden sind, bildet sich jedoch die bimolekulare Schicht auf dem Substrat.

Die oben genannten ersten und zweiten biologischen Teilchen können sein: Antigene, Antikörper, Viren, Bakterien, Hormone, Enzyme, andere Teile, die leicht aus Kulturen gewonnen oder sonstwie isoliert und gesammelt werden können, oder Teilchen, die im menschlichen Serum oder in anderen Lösungen, die untersucht werden müssen, vorhanden sind. Ein typisches Beispiel für spezielle biologische Teilchen, die mittels des erfindungsgemässen Verfahrens analysiert werden können, sind: erstes biologisches Teilchen Hepatitis B Antigen, zweites biologisches Teilchen Antikörper zum Hepatitis B Antigen.

Die Untersuchung der Konzentration von speziellen, immunologisch reaktiven, biologischen Teilchen, die im vorgehenden Text beschrieben worden ist, wird als Inhibitions- oder indirekter Test bezèichnet, im Gegensatz zum direkten Test, in dem die Anwesenheit des ersten biologischen Teilchens in der zu untersuchenden Lösung keine bimolekulare Schicht bildet. So ist im Falle unseres Inhibitionstestes für ein Antigen und speziell für das HB-Antigen die Testlösung, die auf dem Streifen 13 aufgebracht wird, menschliches Serum. Die Lösung, die auf dem Streifen 14 aufgebracht wird, ist eine solche mit HB-Antikör-per. Auf dem Substrat war, vor dieser Untersuchung, die Oberfläche mit einer monomolekularen Schicht von HB-Antigen belegt worden. Die Konzentration des HB-Antigens in der zu untersuchenden Lösung wird nach der Ausbildung der Fällungslinie in der weiter oben angegebenen Art und Weise bestimmt.

Der Inhibitionstest zur Bestimmung von Anwesenheit und Konzentration von Antikörpern, wie HB-Antikörper, wird analog ausgeführt. Vorher wird das Substrat mit einer monomolekularen Schicht von HB-Antikörpern belegt und hierauf die Lösung mit der unbekannten Konzentration an HB-Antikörper auf dem Streifen 13 aufgebracht. Auf dem Streifen 14 wird eine Lösung mit HB-Antigen aufgelegt. Die Lösung, die auf dem Streifen 13 aufgelegt wird, ist ein Serum eines Patienten, von dem vermutet wird, dass er Hepatitis B hat. In beiden genannten Untersuchungen führt die Abwesenheit der ersten biologischen Teilchen in der zu untersuchenden Lösung dazu, dass sich keine Fällungslinie bildet.

In den beiden genannten Hepatitis-Untersuchungen wird der HB-Antikörper aus menschlichem Serum von Patienten mit Hepatitis B gewonnen. Es kann aber auch in passenden Tieren gezüchtet werden, wie z.B. in Ziegen oder Wildkaninchen. Diese Tiere werden mit HB-Antigenen injiziert, und nach der Inkubationszeit von etwa 2 Wochen kann aus dem Blut der Tiere der spezifische Antikörper gewonnen werden.

In den Fig. 3a und 3b wird eine zweite Ausführungsform unserer Erfindung gezeigt, die ähnlich der ersten Ausführungsform ist, in der jedoch das feuchtigkeitshaltende Diffusionsmedium eine dünne Gelschicht ist anstelle der höheren Cellulosemembrane. Die geeignetsten Gele für immunologische Reaktionen sind Agar-Agar und Agarose. Das Substrat 10 und die Metallisation 10a sind vom gleichen Typ wie sie schon unter den Fig. la und lb beschrieben worden sind. Die dünne Gelschicht 30 wird über der monomolekularen, adsorbierten Schicht 11 gebildet und ist weniger als 1 mm dick. Passende Gellösungen sind z.B. Salzlösungen mit destilliertem Wasser, die nötigenfalls noch einen Puffer enthalten. Nach Verfestigung des Geles werden zwei Mulden 31 und 32 in der Gelschicht gebildet. Die Mulden 31 und 32 sind beide gleich lang und gleich angeordnet, wie die Streifen 13 und 14 in der Fig. la. Da jedoch das Gel keine weitere Ausdehnung hat als das Substrat, liegen die ge-5 nannten Mulden innerhalb der Substratfläche. Sie sollten sich auch nicht überschneiden. Ihre Dimensionen sind ungefähr die folgenden: Länge ungefähr gleich lang wie das Substrat, Breite von 1 bis 5 mm. Die wichtigsten Unterschiede zwischen dieser Erfindung und früheren Diffusionsvorrichtungen in Gelen wie io sie z.B. im Buch «Methods in Immunology and Immunochemi-stry» beschrieben sind, sind die folgenden:

(1) Diese Vorrichtung erfordert eine metallisierte, feste Oberfläche, da die sichtbare Fällungslinie der immunologischen Reaktion der beiden biologischen Teilchen auf der mit einer 15 monomolekularen Schicht bedeckten metallisierten Oberfläche sichtbar ist (die Fällungslinie ist allerdings auch in Gelen sichtbar). In früheren Vorrichtungen wird keine Metallisation verlangt, und das Substrat wird nur als Träger für die Gelschicht verwendet.

20 (2) Diese Gelschicht ist wesentlich dünner als die von höheren Vorrichtungen. Währenddem unsere höchstens 1 mm dick ist, wird in früheren Referenzen ein Bereich von 1 bis 3 mm angegeben. Diese signifikante Reduktion der Schichtdicke resultiert aus der Tatsache, dass in der erfindungsgemässen Vor-25 richtung das Gel nur als Diffusionsmedium und als Feuchtigkeitshalter eingesetzt wird, währenddem in früheren Vorrichtungen sich die Fällungslinie im Gel bildet, was eine dickere Gelschicht verlangt.

(3) Aus den Angaben unter Punkt (2) folgt, dass dieFällungs-30 linie, die sich in der erfindungsgemässen Vorrichtung bildet,

eine dauerhafte ist, ohne dass sie irgendwelche Färbung zur Sichtbarmachung benötigt. Früher erforderte das Gel eine Färbung, um die Fällungslinie sichtbar zu machen. Sie war auch so wesentlich weniger kontrastreich verglichen mit der Fällungsli-35 nie, die im erfindungsgemässen Verfahren erreicht wird.

(4) Die Mulden in der erfindungsgemässen Vorrichtung gehen durch die gesamte Gelschicht. In früheren Vorrichtungen musste der Grund dieser Mulden immer im Gel liegen. Dies kann zwar bei der erfindungsgemässen Vorrichtung auch so

40 sein, es muss aber nicht so sein. Dieser wichtige Unterschied folgt aus der Tatsache, dass die sichtbare Fällungslinie in unserer Vorrichtung auf der metallisierten, festen Oberfläche sichtbar wird und nicht im Gel selber.

Nachdem die Mulden 31 und 32 aus der Gelschicht 30 aus-45 gehoben worden sind, wird das metallisierte, mit einer monomolekularen, adsorbierten Schicht versehene und mit Gel bedeckte Substrat in eine feuchte Kammer plaziert. Darauf wird die zu untersuchende Lösung, von der vermutet wird, dass sie das erste immunologisch reaktive, biologische Teilchen (und im 50 allgemeinen noch weitere, nicht spezifizierte Teilchen), das dem biologischen Teilchen der monomolekularen Schicht 11 entspricht, enthält, in die Mulde 31 gegeben. Eine zweite Lösung, die das zweite, biologische Teilchen (und im allgemeinen noch weitere nicht spezifizierte Teilchen), das zum ersten Teilchen 55 spezifisch ist, enthält, wird hierauf in die Mulde 32 gegeben. Die beiden Lösungen diffundiéren nun durch das Gel gegeneinander, in ganz gleicher Weise wie durch die Celluloseacetatmembrane in der Fig. la. Während der Diffusion der beiden Lösungen im Gel reagieren die ersten Teilchen der zu untersuchenden 60 Lösungen nicht mit der monomolekularen Schicht 11, währenddem die zweiten Teilchen mit dieser Schicht reagieren und darauf eine weitere monomolekulare Schicht 15 ablegen, wie dies in den Fig. 2a und 2b gezeigt wird. Auf der Linie, auf der die beiden Lösungen zusammentreffen, bildet sich ebenfalls 65 wieder die Fällungslinie 16 aus komplexierten Proteinen, wie dies am besten in der Fig. 2a ersichtlich ist. Wiederum ist die Steigung der Kurve abhängig von der Konzentration des ersten biologischen Teilchens in der Testlösung. Die Dauer der Diffu-

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sion und der Bildung der Fällungslinie ist ebenfalls wieder eine auf die Membrane aufgebracht. Die Testlösung, beispielsweise Funktion der Arten der biologischen Teilchen, der Konzentra- ein Plasma eines Patienten, der auf die verschiedenen Krankheition dieser Teilchen, der Temperatur und der geometrischen ten untersucht werden muss, wird entlang einer Kante, die pa-Anordnung der Mulden 31 und 32. rallel ist zur obengenannten Mittellinie, an der feuchten Mem-

Nach Ausbildung der Fällungslinie 16 auf der metallisierten 5 brane 12 angebracht. Eine Vergleichslösung mit bekannten Oberfläche des Substrates 10 wird die Gelschicht 30 abgeschält Konzentrationen der zu untersuchenden Teilchen wird entlang oder sonstwie von der metallisierten Oberfläche entfernt. Die der gegenüberliegenden Kante angebracht. Wie in den Fig. 5a metallisierte Oberfläche mit dem Anteil monomolekularer und 5b gezeigt wird, kann dieses Anbringen der Lösungen durch Schicht 11, mit dem Anteil bimolekularer Schicht 11 und 15 und Auflegen von mit Lösungen angefeuchteten schmalen Cellulo-mit der Fällungslinie 16 darauf wird hierauf mit destilliertem 10 sestreifen geschehen. So wird das antihumane Serum des obigen Wasser gewaschen, getrocknet und hierauf von Auge unter- Beispiels im Streifen 50 auf der Mittellinie auf das Substrat 10 sucht. Die Untersuchung kann wiederum mittels durchtreten- gelegt. Dieses Serum enthält alle vier Plasmakomponenten, die dem oder reflektiertem Licht erfolgen. Die Fällungslinie 16 ist die vier monomolekularen Streifen bilden. Der Streifen 51 wird wiederum in allen Fällen sehr gut sichtbar, wobei hier ebenfalls mit der Kontrollösung mit den bekannten Konzentrationen aneine kleinere Menge biologischer Partikel zur Ausbildung dieser 15 gefeuchtet und entsprechend der Zeichnung 5a auf das Substrat Fällungslinie benötigt wird. Unsere Erfindung schafft also ein gelegt. Schliesslich wird der Streifen 52 mit der Testlösung beempfindlicheres Verfahren zur Bestimmung der Konzentration feuchtet und auf das Substrat gelegt. Die drei Cellulosestreifen von biologischen Teilchen, verglichen mit früheren Verfahren. 50,51 und 52 sind von ungefähr gleicher Länge und Breite. Ihre Ebenso ist keine Vorfärbung der Fällung benötigt, wie dies frü- Länge ist ungefähr diejenige des Substrates 10 und ihre Breite her in den Doppeldiffusionsverfahren nötig war. Auch mittels 20 ungefähr ein Achtel der Breite des Substrates. Die Streifen 51 der beschriebenen, zweiten Ausführungsform unserer Erfin- und 52 werden parallel zum Mittelstreifen 50 gelegt, und ihr dung kann die Konzentration des ersten biologischen Teilchens Abstand von diesem Mittelstreifen soll gleich sein. Die Streifen quantitativ bestimmt werden. Dies geschieht ganz analog den können über die Kanten des Substrates 10 ragen.

Angaben in der ersten Ausführungsform. Die Anordnung gemäss den Fig. 5a und 5b wird hierauf in

In den Fig. 4a und 4b werden eine dritte (und eine vierte) 25 eine feuchte Kammer gegeben. Die Lösung aus dem Streifen 50 Ausführungsform gezeigt. Diese ist speziell geeignet für die Be- diffundiert nun gegen aussen, währenddem die Lösungen aus Stimmung der Konzentration von mehreren verschiedenen, bio- dem Streifen 51 und 52 gegen die Mitte hin wandern. Wie in logischen Teilchen. Diese Verfahrensform ist z.B. geeignet zur den weiter oben beschriebenen Ausführungsformen dieser ErBestimmung der Konzentration einer bestimmten Anzahl Kom- findung diffundieren die ersten biologischen Teilchen, d.h. die-ponenten im menschlichen Blutplasma. Das metallisierte Sub- 30 jenigen, aus denen die vier monomolekularen Streifen gebildet strat wird dafür durch Aufbringung von nebeneinanderliegen- sind, durch die Membrane 12, ohne mit diesen monomolekula-den, monomolekularer Schichtstreifen IIa, IIb, 11c, lld usw. ren Streifen zu reagieren. Die Antikörper aus dem antihumanen vorbereitet. In diesen Schichtstreifen sind die zu bestimmenden Serum hingegen bilden über den monomolekularen Streifen je Plasmakomponenten auf der metallisierten Oberfläche adsor- eine weitere monomolekulare Schicht 15a, 15b, 15c und 15d, da biert. Es können beliebig viele Anzahl Streifen verwendet wer- 35 die Antikörper mit den biologischen Teilchen der ersten mono-den. Im dargestellten Beispiel sind vier verschiedene Streifen molekularen Schichten reagieren. Wie aus den Fig. 6a und 6b 1 la bis 1 lb auf der metallisierten Oberfläche des Substrates 10 ersichtlich ist, bilden sich auf den Linien, auf denen die diffun-aufgezogen. Die Streifen sind gleich lang wie das Substrat und dierenden Lösungen aufeinanderstossen, die Fällungslinien der weisen jeweils vorteilhafterweise die gleiche Breite auf. So kön- komplexierten Proteine. Diese bilden sich als ein Resultat der nen z.B. auf einem quadratischen Substrat mit einer Kantenlän- 40 immunologischen Reaktion der spezifischen Paare der biologige von ca. 2,5 cm vier Streifen à je 0,635 cm aufgezogen wer- sehen Teilchen. Wie aus der Fig. 6a ersichtlich ist, bildet sich den. Als Beispiel für eine solche Mehrfachanalyse sei die Be- eine erste Fällungslinie 60 über dem monomolekularen Streifen Stimmung von Plasmaproteinen wie Albumin, Gammaglobulin, IIa in einer gewissen Distanz von der Mittellinie des Substrates Heptoglobulin und Plasminogen aus dem menschlichen Blut- 10, wobei diese Distanz abhängt von der Konzentration der plasma genannt. Da die vier untersuchten Plasmaproteine nicht 45 Komponente des monomolekularen Streifens 1 la im Plasma-zueinander spezifisch sind, d.h. nicht miteinander reagieren, Vergleichsmuster. Auf die gleiche Art und Weise bildet sich eine können die vier Streifen IIa bis IIb mit kleinem oder gar kei- zweite Fällungslinie 61 über der monomolekularen Schicht IIb nem Zwischenraum angeordnet werden. in einem anderen Abstand von der Mittellinie. Das gleiche gilt

Solche Bestimmungen können z.B. durch geeignete Anord- für die Fällungslinien 62 und 63.

nung der Streifen ausgeführt werden. Ebenso können z.B. so- so Der analoge Vorgang spielt sich nun zwischen dem Mittelwohl das Hepatitis-Antigen wie auch der Hepatitis-Antikörper streifen 50 und dem Streifen 52 ab. Die Antikörper aus dem aus der gleichen Lösung bestimmt werden, indem das Antigen Streifen 50 reagieren vorerst mit den Bestandteilen aus den auf dem Streifen IIa und der Antikörper auf dem Streifen 11c Streifen IIa und lld und legen sich darauf ebenfalls als Schicht und lld untersucht wird. 15a bis 15b ab. Bei der Linie, an der die beiden diffundierenden Die beschriebenen vier Ausführungsformen speziell die 55 Lösungen zusammenstossen, bilden sich die analogen Fällungs-Ausführungsform zur Bestimmung der Konzentration von meh- Knien 64,65,66 und 67 über den Streifen 1 la, 1 lb, 1 lc und reren biologischen Teilchen in einer Lösung, sind speziell gut 1 id.

geeignet für die Bestimmung dieser Teilchen auch bei tiefen Deren Abstand von der Mitte ist wiederum abhängig von

Konzentrationen. Die Ursache dafür ist die hohe Empfindlich- der Konzentration der zu untersuchenden Teilchen in der Plas-

keit des erfindungsgemässen Verfahrens. 60 maprobe. Die Zeit zur Ausführung dieser Bestimmung hängt

Nachdem das metallisierte Substrat mit einer Mehrzahl von wiederum ab von der Art der biologischen Teilchen, der Kon-

monomolekularen Streifen versehen worden ist, wird dieses zentration dieser Teilchen, der Temperatur und dem Abstand

Substrat mit einer angefeuchteten Cellulosemembrane 12 be- zwischen den Streifen 50 und 51 bzw. 52.

deckt, wie es in den Fig. la und lb dargestellt ist. Ein antihuma- Nach der Ausbildung der Fällungslinien 60 bis 67 wird die nes Serum, das Antikörper enthält (d.h. diejenigen biologischen 65 Cellulosemembrane 12 abgeschält und das Substrat mit den Fäl-

Teilchen, die zu den zu bestimmenden und somit zu den auf den lungslinien mit destilliertem Wasser gewaschen. Nach Trock-

verschiedenen Streifen aufgebrachten Teilchen spezifisch sind), nung kann das Substrat nun von Aug untersucht werden. Die wird hierauf entlang der Mittellinie senkrecht zu den Streifen Konzentrationen werden bestimmt, indem die entsprechenden

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Längen der bimolekularen Schichten von der Mittellinie aus ten Proteinen bildet. Die komplexierten Proteine sind das Proverglichen werden. Dasselbe kann natürlich von der Aussenlinie dukt einer immunologischen Reaktion zwischen ersten (zu be-her gemessen und verglichen werden. Gleiche Abstände der stimmenden) biologischen Teilchen und zwischen zweiten biolo-entsprechenden Fällungslinien auf einem monomolekularen gischen Teilchen, die zum ersten biologischen Teilchen spezi-Streifen (entweder gleich weit entfernt von der Mittellinie oder 5 fisch sind. Das erfindungsgemässe Verfahren und die Vorrich-gleich weit entfernt von den Aussenlinien) zeigen an, dass die tung sind sehr einfach auszuführen und herzustellen. Sie beru-Konzentration der Testlösung gleich ist mit derjenigen in der hen dabei vor allem auf der hohen Empfindlichkeit der metalli-Vergleichslösung. Dies ist in ungefähr auf dem Streifen 1 la der sierten Substrate. Das Verfahren geht ohne Vorfärbung der Dif-Fig. 6a der Fall. Auf dem Streifen 1 lb der gleichen Figur ist die fusionsmedien vor sich. Ein weiterer Vorteil der erfindungsge-Fällungslinie auf der Seite der zu untersuchenden Flüssigkeit 10 mässen Vorrichtungen ist der, dass sie maschinell und automati-näher bei der Mittellinie. Das zeigt an, dass die Konzentration siert hergestellt werden können. Sie fallen daher mit grosser der Komponente, die die monomolekulare Schicht IIb bildet Indentität an, was für die Ausführung von Reihenuntersuchun-und die in der zu untersuchenden Lösung bestimmt werden soll, gen von grosser Wichtigkeit ist. Solche Untersuchungen sind vor höher ist als in der gegenüberliegend angebrachten Vergleichs- allem für die medizinische Diagnostik wichtig und dort wieder-lösung. Die Fälle auf den Streifen 11c und lld entsprechen 15 um vor allem im Gebiet der Analyse von Humanserum. In die-ungefähr demjenigen auf dem Streifen 1 la. So kann, durch eine sem Serum können die verschiedenen Antikörper und Antigene schnelle Beobachtung von Auge, festgestellt werden, ob in einer bestimmt werden, wobei vor allem auch diejenigen mit tiefen bestimmten Lösung eine Mehrzahl von Komponenten in nor- Konzentrationen analysiert werden können. Mit den früheren maier oder abnormaler Konzentration vorliegt. Auch hier kann Verfahren war dies nur sehr schlecht oder gar nicht möglich. Die die Beobachtung in durchscheinendem oder reflektiertem Licht 20 eigentliche Beurteilung geschieht jeweils, wie weiter oben ausgeschehen, je nach Art der Metallisation des Substrates. geführt worden ist, von blossem Aug ohne irgendwelche Messin den Fig. 7a und 7b ist eine vierte Ausführungsform aufge- instrumente. Die Fällungslinie wird in einer dauerhaften Form zeichnet. Diese steht im gleichen Verhältnis zur dritten wie die erhalten.

zweite zur ersten Ausführungsform. D.h., anstelle der Cellu- Das erfindungsgemässe Verfahren und die erfindungsge-losemembrane ist eine Gelschicht als Diffusionsmedium aufge- 25 mässe Vorrichtung sind in verschiedenen Ausführungsformen tragen und die Lösungen werden in den Mulden 70,71 und 72 beschrieben worden. Es ist jedoch anzunehmen, dass, ausge-aufgegeben. Die Schichtdicke des Gels ist wiederum weniger als hend von der vorliegenden Erfindung, weitere Modifikationen 1 mm. Die Mulden sind jetzt innerhalb des Substrates angeord- und Variationen solcher Ausführungsformen gefunden werden net, sie sind etwa 1 bis 5 mm breit. Der eigentliche Analysen- können. Z.B. könnten die Form und die Grösse der Substrate Vorgang und die Beurteilung gehen analog den Ausführungen 30 oder der verschiedenen Uberzüge variiert werden. Auch auf den zu den Fig. 6a und 6b. so veränderten Substraten kann natürlich irgendeine immunolo-Aus den Beschreibungen der Ausführungsformen folgt, dass gische Reaktion nachgewiesen werden. Ebenso kann die Metal-keine Vorfärbung der Cellulosemembrane oder des Gels nötig lisierung anders und mit anderen Materialien ausgeführt wer-ist, um die Fällungslinien permanent sichtbar zu machen. Dieses den. Auch auf diesem so präparierten Substrat können spezielle Färben stellt einen sehr aufwendigen Schritt der früheren Ver- 3s immunologische Reaktionen nachgewiesen werden, einige evtl. fahren dar. In einem dieser früheren Verfahren, in sogenannten sogar mit besser kontrastierenden Fällungslinien und Doppel-Ouchterlony-Verfahren, mittels Doppeldiffusion in Gelen wur- schichten. Weiter kann auch die unregelmässige Oberfläche der den vorerst nicht spezifische Teilchen im Wasserbad während erfindungsgemässen Vorrichtung dadurch gestaltet werden, dass ungefähr 24 Stunden lang entfernt ; hierauf wurde das Gel ge- man von einem Substrat ausgeht, welches schon eine unregel-färbt, es folgte ein weiterer Waschprozess, um die Färbung aus 40 mässige Oberfläche hat und auf diesem eine Metallschicht von dem Gel zu entfernen, aber nicht aus der Fällungslinie, und konstanter Schichtdicke aufbringt. Schliesslich muss auch gese-schliesslich wurde das Gel in einem langsamen und heiklen Ver- hen werden, dass mittels der ersten zwei Ausführungsformen fahren getrocknet. Auch ist das erfindungsgemässe Verfahren des erfindungsgemässen Verfahrens auch Inhibitionsteste nach empfindlicher gegenüber früher beschriebenen Verfahren. Es der direkten Methode ausgeführt werden können. Dabei wer-folgt dies vor allem aus den verschiedenen Schichten und der 45 den also keine monomolekularen Schichten des ersten biologi-Fällungslinie, die ja zugleich die Grenze zwischen diesen ver- sehen Teilchens auf dem metallisierten Substrat adsorbiert, son-schiedenen Schichten bildet. Durch die nachgewiesene höhere dern von jeder Kante aus würde sich das entsprechende monoEmpfindlichkeit des erfindungsgemässen Verfahrens kann es molekulare Gebiet bis zur Linie des Zusammentreffens der bei-auch dort verwendet werden, wo weniger Probematerial oder den Lösungen erstrecken. Auf der gleichen Linie würde sich sehr verdünntes Probematerial zur Verfügung steht. Zur Aus- 50 dann die Fällungslinie ausbilden. Die Lage dieser Linie muss führung dieses empfindlicheren Verfahrens benötigt man natür- nicht mit derjenigen übereinstimmen, die mittels der ersten oder lieh auch weniger Material, was vor allem für verschiedene, im- zweiten Ausführungsform des Verfahrens weiter oben beschrie-munologisch reaktive, biologische Teilchen, wie sie in der Lö- ben worden ist. Bei der direkten Methode müssen nämlich noch sung mit dem zweiten biologischen Teilchen oder in der Ver- die verschiedenen Adsorptionsgeschwindigkeiten berücksichtigt gleichslösung verwendet werden, preislich sehr stark auswirkt. 55 werden. So können also die erfindungsgemässen Vorrichtungen Ebenso kann es sich bei gewissen Patienten positiv auswirken, für die erste oder zweite Ausführungsform des erfindungsge-wenn man ihm nur kleine Proben entnehmen kann. mässen Verfahrens metallisierte Substrate mit oder ohne mono-Aus all dem oben Gesagten folgt, dass die Erfindung eine molekulare Schichten des ersten immunologisch reaktiven bioverbesserte Methode für einen Oberflächeninhibitionstest logischen Teilchens sein. Beide können zudem entweder mit schafft, zur Bestimmung der Konzentration von biologischen 60 einer Cellulosemembrane oder einer dünnen Schicht von Gel als Teilchen in Lösungen durch direkte Betrachtung von Aug. Es Diffusionsmedium bedeckt sein. Auf dem Diffusionsmedium geschieht dies auf metallisierten Oberflächen von festen Sub- sind dann noch die verschiedenen Möglichkeiten zum Aufbrin-straten, auf welchen sich während der Untersuchung eine zweite gen der Lösungen vorzusehen.

monomolekulare Schicht und eine Fällungslinie aus komplexier-

C

2 Blatt Zeichnungen

Claims

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PATENTANSPRÜCHE

1. Prüfplatte zur Bestimmung der Konzentration von immunologisch reaktiven, biologischen Teilchen in einer Lösung mittels eines Inhibitionstests, dadurch gekennzeichnet, dass die Prüfplatte die folgenden Teile umfasst: Ein festes Substrat, dessen eine grosse Oberfläche metallisiert ist, eine monomolekulare Schicht von ersten, immunologisch reaktiven, biologischen Teilchen, die auf der metallisierten Oberfläche des Substrates aufgebracht ist, eine weitere Schicht von höchstens 1 mm Dicke, welche im wesentlichen in vollständigem Kontakt mit der äusseren Oberfläche der genannten, monomolekularen Schicht ist und zur Rückhaltung und Immobilisierung von Feuchtigkeit dient, so dass diese f euchtigkeitshaltende, weitere Schicht zugleich als Diffusionsmedium dient, eine erste Anlage, um auf dem oben genannten Diffusionsmedium eine Testlösung aufzubringen, in der die ersten biologischen Teilchen enthalten sind, wobei diese erste Anlage entlang einer ersten Kante des oben genannten Substrates angeordnet ist, und eine zweite Anlage, um auf dem genannten Diffusionsmedium eine zweite Lösung aufzubringen, die die zweite immunologisch reaktiven biologischen Teilchen, die spezifisch zu den ersten biologischen Teilchen sind, enthält, wobei diese zweite Anlage in einer speziellen Orientierung relativ zur ersten Anlage für die Ablage der Testlösung angebracht ist.
2. Prüf platte gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das feste Substrat aus lichtdurchlässigem Material, z.B. Glas oder Kunststoff, gebildet ist.
3. Prüfplatte gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das feste Substrat aus Metall gebildet ist.
4. Prüfplatte gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die metallisierte Oberfläche des genannten festen Substrates ein nicht kontinuierlicher Überzug aus Metallteilchen ist.
5. Prüfplatte gemäss Patentanspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der nicht kontinuierliche Überzug aus Indiumteilchen besteht.
6. Prüf platte gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die metallisierte Oberfläche des genannten festen Substrates ein Überzug aus einem Metall und dessen Oxid ist.
7. Prüfplatte gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die metallisierte Oberfläche des genannten Substrates aus einer Legierung von zwei Metallen gebildet ist.
8. Prüfplatte gemäss Patentanspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Legierung von zwei Metallen eine Legierung von Indium und Gold ist.
9. Prüfplatte gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die metallisierte Oberfläche des festen Substrates aus einer Legierung von zwei Metallen und aus einem äusseren Überzug aus dem Oxid des einen dieser zwei Metalle besteht.
10. Prüfplatte gemäss Patentanspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden Metalle Indium und Gold sind und der Oxidüberzug aus Indiumoxid besteht.
11. Prüfplatte gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der grösste Teil der metallisierten Oberfläche des genannten Substrats flach ist.
12. Prüfplatte gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die erste und zweite Kante des genannten festen Substrates senkrecht zueinander stehen, so dass die genannte erste Anlage zum Aufbringen der Testlösung entlang der ersten Kante und die genannte zweite Anlage zum Aufbringen der zweiten Lösung entlang der zweiten Kante auch senkrecht zueinander stehen.
13. Prüfplatte gemäss Patentanspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Diffusionsmedium eine angefeuchtete Cellulosemembrane ist.
14. Prüfplatte gemäss Patentanspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Cellulosemembrane mit destilliertem Wasser angefeuchtet ist und dass diese Membrane so gross ist, dass sie über die Seiten des festen Substrates herausragt.
15. Prüfplatte gemäss Patentanspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die genannten Anlagen zum Aufbringen der beiden Lösungen aus langen, dünnen Streifen von Cellulosemem-

5 brane bestehen.
16. Prüfplatte gemäss Patentanspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der erste und der zweite Streifen aus Cellulosemembrane ungefähr gleich lang sind wie die erste und zweite Kante des genannten Substrates.

io 17. Prüfplatte gemäss Patentanspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Diffusionsmedium eine dünne Gelschicht ist.
18. Prüfplatte gemäss Patentanspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Schichtdicke der genannten Gelschicht weni-

15 ger als 1 mm ist.
19. Prüfplatte gemäss Patentanspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Gelschicht im wesentlichen sich über die ganze äussere Oberfläche des Substrates erstreckt, die zugleich die Metallisierung und die monomolekulare Schicht der

20 ersten biologischen Teilchen trägt, und dass das Gel aus Agar-Agar besteht.
20. Prüfplatte gemäss Patentanspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die genannten Anlagen zum Aufbringen der verschiedenen Lösungen aus langen, schmalen Mulden in der Gel-

25 schicht entlang der ersten und der zweiten Kante des genannten Substrates bestehen.
21. Prüfplatte gemäss Patentanspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Länge der ersten und zweiten Mulden ein wenig kleiner ist als die Länge der ersten bzw. der zweiten Kan-

30 te des genannten Substrates.
22. Prüfplatte gemäss Patentanspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die genannten ersten und zweiten Mulden ungefähr die gleiche Breite haben, und dass diese Breite im Bereich von 1 bis 5 mm liegt.

35 23. Prüfplatte gemäss Patentanspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das erste biologische Teilchen ein Antigen ist.
24. Prüfplatte gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte monomolekulare Schicht von ersten

40 biologischen Teilchen, die auf der metallisierten Oberfläche des Substrates aufgebracht ist, aus einer Mehrzahl von monomolekularen Schichtstreifen besteht, wobei jeder Streifen aus einem anderen, immunologisch reaktiven biologischen Teilchen besteht, und wobei diese Streifen in nebeneinanderliegender An-

45 Ordnung auf der metallisierten Oberfläche des Substrates liegen, das genannte Diffusionsmedium im wesentlichen auf der gesamten Oberfläche, die durch die genannten Schichtstreifen gebildet wird, im vollständigen Kontakt aufliegt, die erste und zweite Kante des genannten Substrates in diesem Fall parallel sind, die

50 erste Anlage zum Aufbringen der Testlösung parallel zur zweiten Kante des genannten Substrates angeordnet ist, dass die zweite Anlage zum Aufbringen der zweiten Lösung parallel zur ersten Anlage verläuft, wobei die Anordnung eine weitere, dritte Anlage zum Aufbringen einer Vergleichslösung auf dem ge-

55 nannten Diffusionsmedium entlang der zweiten Kante des genannten Substrates aufweist, derart, dass die Anlagen zum Aufbringen der Testlösung und der Vergleichslösung parallel zueinander und gleich weit entfernt von der zweiten Anlage für das Aufbringen der zweiten Lösung angeordnet sind, und die verschiedenen monomolekularen Schichtstreifen, die auf dem metallisierten Substrat angebracht sind, senkrecht zur ersten und zur zweiten Kante des genannten Substrates angeordnet sind.
25. Prüfplatte gemäss Patentanspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass das Diffusionsmedium eine Cellulosemembrane

65 ist, die mit den verschiedenen monomolekularen Schichtstreifen in Kontakt steht.
26. Prüfplatte gemäss Patentanspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Diffusionsmedium eine dünne Gel-

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Schicht ist, und die Anlagen zum Aufbringen der Lösungen schmale Mulden in der Gelschicht sind.
27. Prüfplatte gemäss Patentanspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Mulden alle von gleicher Breite sind, diese Breite in der Grössenordnung von 1 bis 5 mm liegt und dass die Mulden alle gleich lang sind, und zwar ein wenig weniger lang als die Länge der ersten Kante des genannten Substrates, wobei die Schichtdicke der Gelschicht weniger als 1 mm ist.
28. Prüfplatte gemäss Patentanspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die verschiedenen immunologisch reaktiven biologischen Teilchen, die die verschiedenen monomolekularen Schichtstreifen auf der metallisierten Oberfläche des genannten Substrates bilden, die gleichen sind, die im menschlichen Blutplasma vorkommen.
29. Verfahren zur Herstellung der Prüfplatte gemäss Patentanspruch 1, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

- Auswählen eines festen Substrates mit einer metallisierten Oberfläche,

- Adsorbieren einer ersten monomolekularen Schicht von ersten immunologisch reaktiven biologischen Teilchen auf der metallisierten Oberfläche des Substrates,

- Auflegen einer als Diffusionsmedium dienenden, feuchtig-keitshaltenden Schicht mit im wesentlichen vollständigem Kontakt mit der Oberfläche der ersten monomolekularen Schicht, von höchstens 1 mm Dicke,

- Anbringen von Anlagen zur Beaufschlagung mit Lösungen und

- Plazierung dieser Prüfplatte aus Substrat, monomolekularer Schicht und Diffusionsmedium in einer feuchten Kammer, um das Diffusionsmedium genügend feucht zu halten.
30. Verfahren gemäss Patentanspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass, bei Aufbringen des Diffusionsmediums auf der gesamten Oberfläche der monomolekularen Schicht in Form von monomolekularen Schichtstreifen einer dünnen Gelschicht von weniger als 1 mm und bei Anlegen einer ersten Anlage in Form einer ersten langen, schmalen Mulde, die aus der Gelschicht ausgehoben wird, und zwar entlang der ersten Kante des Substrates, und einer zweiten Anlage in Form einer zweiten langen, schmalen Mulde, die aus der Gelschicht ausgehoben wird, und zwar entlang der zweiten Kante des Substrates, eine dritte lange, schmale Mulde aus der Gelschicht ausgehoben wird, die parallel zur ersten und zweiten Mulde ist, zwischen diesen liegt und den gleichen Abstand von diesen hat.
31. Verwendung der Prüfplatte gemäss Patentanspruch 1 zur Bestimmung der Konzentration von immunologisch reaktiven, biologischen Teilchen mittels eines Inhibitionstestes, wobei nach Abheben des Diffusionsmediums vom Substrat, die Untersuchung der metallisierten Oberfläche des Substrates und Zur-kenntnisnahme der Lage der Fällungslinie in Bezug auf die Kante des Substrates erfolgt, wobei die Lage der Fällungslinie eine Funktion der Konzentration des ersten biologischen Teilchens ist, und wobei die Fällungslinie von unbewaffnetem Aug sichtbar ist und eine dauerhafte Anzeige ohne weitere Färbungsmittel bildet.
32. Verwendung gemäss Patentanspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass die Untersuchung der metallisierten Oberfläche des Substrates durch Untersuchung von an der metallisierten Oberfläche reflektiertem Licht besteht.
33. Verwendung gemäss Patentanspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass die Untersuchung der metallisierten Oberfläche des Substrates durch die Beobachtung des durch das Substrat und dessen metallisierte Oberfläche durchtretenden Lichtes geschieht.
34. Verwendung gemäss Patentanspruch 31 einer Prüfplatte gemäss Patentanspruch 12.
35. Verwendung gemäss Patentanspruch 31 einer Prüfplatte gemäss Patentanspruch 13.
36. Verwendung gemäss Patentanspruch 31 einer Prüfplatte gemäss Patentanspruch 20.
37. Verwendung gemäss Patentanspruch 31 einer Prüfplatte gemäss Patentanspruch 24.

5 38. Verwendung gemäss Patentanspruch 31 einer Prüfplatte gemäss Patentanspruch 25.
39. Verwendung gemäss Patentanspruch 31 einer Prüfplatte gemäss Patentanspruch 28.
40. Verwendung gemäss Patentanspruch 31 einer Prüfplatte io gemäss Patentanspruch 23.