DE3856421T2

DE3856421T2 - Spezifische Bindungstestverfahren

Info

Publication number: DE3856421T2
Application number: DE3856421T
Authority: DE
Inventors: Keith May; Michael Evans Prior; Ian Richards
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Alere Switzerland GmbH
Priority date: 1987-04-27
Filing date: 1988-04-26
Publication date: 2000-12-14
Anticipated expiration: 2008-04-27
Also published as: ES2150428T3; US7109042B2; US20010041368A1; US5602040A; HK140995A; JP2919392B2; DE3856542D1; EP0560411B1; EP0560411A3; US20010008774A1; ES2050704T3; EP0291194B2; AU1622888A; US6818455B2; GB2204398A; GB8809867D0; DE8805565U1; DE560410T1; EP1555529A2; EP0560410A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft spezifische Bindungen einschließende Assays, insbesondere Immunoassays.
Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf Assays, die für den Gebrauch zuhause, in der Klinik oder in der Arztpraxis geeignet sind, und die ein analytisches Ergebnis angeben sollen, das schnell ist und minimale Fachkenntnis und Beteiligung des Verwenders erfordern. Der Einsatz der Testvorrichtungen zuhause, um auf Schwangerschaft und Fruchtbarkeitsperiode (Ovulation) zu testen, ist mittlerweile alltäglich und eine große Vielzahl an Testvorrichtungen und Kits sind kommerziell erhältlich. Ohne Ausnahme erfordern die kommerziell erhältlichen Vorrichtungen alle, dass der Verwender eine Reihe an Abläufen durchführt, bevor das Testergebnis beobachtbar wird. Diese Abläufe kosten notwendigerweise Zeit und führen zu der Möglichkeit von Fehlern.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Test bereitzustellen, der ohne weiteres von einem Nichtfachmann verwendbar ist und der vorzugsweise lediglich erfordert, dass ein bestimmter Abschnitt der Vorrichtung mit der Probe (z. B. einem Urinstrahl im Falle eines Schwangerschafts- oder Ovulationstests) in Kontakt gebracht wird und danach vom Verwender keine weiteren Handlungen erforderlich sind, bevor ein analytisches Ergebnis beobachtet werden kann. Idealerweise sollte das analytische Ergebnis innerhalb Von Minuten nach der Probenaufbringung, z. B. 10 Minuten oder weniger, beobachtbar sein.
Die Verwendung von reagenzimprägnierten Teststreifen in spezifischen Bindungsassays, wie Immunoassays, wurde früher bereits vorgeschlagen. In derartigen Verfahren wird eine Probe auf einen Abschnitt des Teststreifens aufgebracht und man läßt sie in der Regel mit Hilfe eines Eluierungslösungsmittels, wie Wasser durch das Streifenmaterial hindurchtreten. Währenddessen dringt die Probe in oder durch eine Detektionszone im Teststreifen, in der ein spezifisches Bindungsreagenz für einen Analyt, von dem man annimmt, dass er sich in der Probe befindet, immobilisiert ist. In der Probe vorhandener Analyt kann daher in der Detektionszone gebunden werden. Das Ausmaß, in dem der Analyt in dieser Zone gebunden wird, kann mit Hilfe markierter Reagenzien, die ebenfalls dem Teststreifen einverleibt oder nachträglich auf ihm aufgebracht sein können, bestimmt werden. Beispiele früherer Vorschläge, die diese Prinzipien verwenden, sind in der GB 1 589 234 von Thyroid Diagnostics Inc., der EP 0 225 054 von Boots-Celltech Diagnostics Ltd., der EP 0 183 442 von Syntex Inc. (USA) und der BP 0 186 799 der Behringwerke AG angegeben.
Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit der Anpassung und Verbesserung der bekannten Techniken, wie denjenigen der oben genannten Veröffentlichungen, um diagnostische Testvorrichtungen, insbesondere geeignet für den Hausgebrauch, bereitzustellen, die schnell und bequem zu verwenden sind und die vom Verwender die Vornahme von so wenig Handlungen wie möglich erfordert.
Die EP-A-186 799 offenbart insbesondere eine geschlossene Assayvorrichtung in Form eines Trockenstreifens aus porösem Material. Die Vorrichtung enthält ein markiertes Reagenz im trockenen Zustand, das durch aufgebrachte Probenflüssigkeit aufgenommen werden kann. Die beschriebenen Marker sind vorzugsweise Enzyme. Partikelförmige Direktmarker werden nicht vorgeschlagen. Es gibt keine Anregung, dass eine Kontrollzone stromabwärts von einer Detektionszone vorgesehen sein soll oder dass das markierte Reagenz ein Signal sowohl in der Detektionszone als auch in irgendeiner solchen Kontrollzone erzeugen soll.
Die anhängige EP-A-284 232 beschreibt Trockenteststreifen, die partikelförmige Direktmarkierung einsetzen. Jedoch wird hier kein Aufbau der Vorrichtung vorgeschlagen, derart dass das einzelne markierte Reagenz ein simultanes Signal sowohl in einer Detektionszone als auch einer Kontrollzone stromabwärts der Detektionszone hervorruft. Es scheint tatsächlich in der EP-A-284 232 keine Kontrollzone beabsichtigt zu sein.
Die anhängige EP-A-250 137 beschäftigt sich ebenfalls mit Streifenassays unter Verwendung partikelförmiger Marker und beschreibt im Speziellen einige Beispiele für die Möglichkeit, stromabwärts von der Testzone eine Kontrollzone vorzusehen, die ein Doppelsignal hervorrufen kann. Jedoch ist in der EP-A-250 137 kein markiertes Reagenz im trockenen Zustand in der Testvorrichtung selbst vor Beginn des Assays vorgesehen.
In der jetzt als EP 291 194 B1 erteilten Stammanmeldung beanspruchen wir eine analytische Testvorrichtung, umfassend ein hohles Gehäuse, aufgebaut aus feuchtigkeitsundurchlässigem festem Material und enthaltend einen trockenen porösen Träger, der direkt oder indirekt mit dem Äußeren des Gehäuses derart zusammenwirkt, dass eine flüssige Testprobe auf den porösen Träger aufgebracht werden kann, wobei die Vorrichtung ebenfalls ein markiertes spezifisches Bindungsreagenz für einen Analyt, wobei das markierte spezifische Bindungsreagenz im porösen Träger, wenn es sich im feuchten Zustand befindet, frei beweglich ist, sowie ein unmarkiertes spezifisches Bindungsreagenz für denselben Analyt enthält, wobei das unmarkierte Reagenz in einer Detektionszone auf dem Trägermaterial permanent immobilisiert und daher im feuchten Zustand nicht beweglich ist, wobei die relative Positionierung des markierten Reagenz und der Detektionszone derart ist, dass die auf die Vorrichtung aufgebrachte Flüssigkeitsprobe markiertes Reagenz aufnehmen und danach in die Detektionszone eindringen kann, und die Vorrichtung Mittel umfaßt, die es ermöglichen, das Ausmaß (sofern vorhanden) mit dem das markierte Reagenz in der Detektionszone gebunden wird, zu beobachten, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung eine partikelförmige Direktmarkierung ist.
Im vorliegenden Schutzrecht beanspruchen wir ein spezifisches Bindungsassay, umfassend die Verwendung eines für einen Analyt spezifischen markierten Reagenz, wobei das markierte Reagenz durch einen porösen Träger frei wandern kann, der durch Aufbringen einer vermutlich den Analyt enthaltenden wässerigen Probe befeuchtet wird, wobei es auf dem porösen Träger eine Detektionszo ne gibt, in der Detektionszone ein unmarkiertes spezifisches Bindungsagens für den Analyt permanent immobilisiert und daher im feuchten Zustand nicht beweglich ist, wobei das unmarkierte spezifische Bindungsagens mit dem Analyt und dem markierten Reagenz an einer Sandwich-Reaktion teilnehmen kann, und der poröse Träger einen Teil einer analytischen Testvorrichtung umfaßt, dadurch gekennzeichnet, dass
a) die Markierung eine partikelförmige Direktmarkierung ist;
b) es auf dem porösen Träger stromabwärts von der Detektionszone eine Kontrollzone gibt, wobei die Kontrollzone immobilisierten Antikörper enthält, der an das markierte Reagenz oder den immobilisierten Analyt, der an das markierte Reagenz binden kann, binden kann, und
c) das markierte Reagenz aus dem trockenen Zustand in der analytischen Testvorrichtung durch die wässerige Probe aufgenommen wird und mit dieser durch die Detektionszone und Kontrollzone wandert, wodurch sich ein positives Assayergebnis durch sichtbares Binden desselben markierten Reagenz sowohl in der Detektionszone als auch der Kontrollzone zeigt und sich ein negatives Assayergebnis durch sichtbares Binden des markierten Reagenz nur in der Kontrollzone zeigt.
Üblicherweise kann das Assay der Erfindung unter Verwendung einer analytischen Testvorrichtung durchgeführt werden, die ein hohles Gehäuse, aufgebaut aus feuchtigkeitsundurchlässigem festem Material, umfaßt, enthaltend einen trockenen porösen Träger, der di rekt oder indirekt mit dem Äußeren des Gehäuses derart zusammenwirkt, dass eine flüssige Testprobe auf den porösen Träger aufgebracht werden kann, wobei die Vorrichtung ebenfalls ein markiertes spezifisches Bindungsreagenz für einen Analyt, wobei das markierte spezifische Bindungsreagenz im porösen Träger, wenn es sich im feuchten Zustand befindet, frei beweglich ist, sowie ein unmarkiertes spezifisches Bindungsreagenz für denselben Analyt enthält, wobei das unmarkierte Reagenz in einer Detektionszone auf dem Trägermaterial permanent immobilisiert und daher im feuchten Zustand nicht beweglich ist, wobei die relative Positionierung des markierten Reagenz und der Detektionszone derart ist, dass die auf die Vorrichtung aufgebrachte Flüssigkeitsprobe markiertes Reagenz aufnehmen und danach in die Detektionszone eindringen kann und die Vorrichtung Mittel umfaßt, die es ermöglichen, das Ausmaß (sofern vorhanden), mit dem das markierte Reagenz in der Detektionszone gebunden wird, zu beobachten.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird der Assay unter Verwendung einer Vorrichtung durchgeführt, die ein poröses Festphasenmaterial umfaßt, das in einer ersten Zone ein markiertes Reagenz trägt, das in der ersten Zone, während sich das porösen Material in einem trockenen Zustand befindet, zurückgehalten wird, aber durch das poröse Material, wenn das poröse Material, beispielsweise durch Aufbringen einer wässerigen Flüssigkeitsprobe, die vermutlich den Analyt enthält, befeuchtet wird, frei wandern kann und das poröse Material in einer zweiten Zone, die von der ersten Zone räumlich getrennt liegt, ein unmarkiertes spezifisches Bindungsreagenz mit einer Spezifität für den Analyt trägt, und das in der Lage ist, mit dem markierten Reagenz an einer Sandwich-Reaktion teilzunehmen, wobei das unmarkierte spezifische Bindungsreagenz auf dem porösen Material derart fest immobilisiert vorliegt, dass es, wenn sich das poröse Material im feuchten Zustand befindet, nicht frei wandern kann.
In der Erfindung ist das markierte Reagenz ein spezifischer Bindungspartner für den Analyt. Das markierte Reagenz, der Analyt (wenn vorhanden) und das immobilisierte, unmarkierte spezifische Bindungsreagenz wirken in einer "Sandwich"-Reaktion zusammen. Dies führt dazu, dass das markierte Reagenz in der zweiten Zone gebunden wird, wenn in der Probe Analyt vorliegt. Die zwei Bindungsregeanzien müssen für verschiedene Epitope auf dem Analyt spezifisch sein.
Eine wichtige bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist die Auswahl von Nitrocellulose als Trägermaterial. Dies hat beträchtliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Streifenmaterialien, wie Papier, weil sie eine natürliche Fähigkeit besitzt, Proteine zu binden, ohne eine vorherige Sensibilisierung zu erfordern. Spezifische Bindungsreagenzien, wie Immunglobuline, können direkt auf Nitrocellulose aufgebracht und auf dieser immobilisiert werden. Es ist keine chemische Behandlung erforderlich, welche die wesentliche spezifische Bindungsaktivität des Reagenz beeinträchtigen könnte. Nicht verwendete Bindungsstellen auf der Nitrocellulose können danach unter Verwendung einfacher Materialien, wie Polyvinylalkohol, blockiert werden. Darüber hinaus ist Nitrocellulose ohne weiteres mit einer Reihe an Porengrößen erhältlich, was die Auswahl eines geeigneten Trägermaterials für spezielle Anforderungen, wie die Probenflußgeschwindigkeit, erleichtert.
Ein anderer wichtiger Aspekt der Erfindung ist die Verwendung sogenannter "Direktmarker", die an eines der spezifischen Bindungsreagenzien gebunden sind. Direktmarker, wie Goldsole und Farbsole, sind bereits per se bekannt. Sie können eingesetzt werden, um ein sofortiges analytisches Ergebnis zu erzeugen, ohne die Notwendigkeit weitere Reagenzien zuzugeben, um ein detektierbares Signal zu entwickeln. Sie sind widerstandsfähig und stabil und können daher ohne weiteres in einer analytischen Vorrichtung eingesetzt werden, die im Trockenzustand gelagert wird. Ihre Freisetzung bei Kontakt mit einer wässerigen Probe kann angepaßt werden, z. B. durch Verwendung von löslichen Glasuren gesteuert werden.
Ein wichtiger Aspekt der Erfindung ist die Auswahl technischer Merkmale, die den Einsatz eines direkt markierten spezifischen Bindungsreagenz in einer analytischen Vorrichtung auf Trägerbasis ermöglicht, z. B. einer basierend auf einem Streifenformat, um ein schnelles und klares Ergebnis zu ergeben. Idealerweise sollte das Ergebnis des Assays für das Auge sichtbar sein, und um dies zu erleichtern, ist es für den Direktmarker notwendig, dass er in der Detektionszone konzentriert wird. Um dies zu erreichen, sollte das direkt markierte Reagenz leicht und schnell durch die Entwicklungsflüssigkeit transportierbar sein. Weiterhin ist es bevorzugt, dass die gesamte Entwicklungsprobenflüssigkeit durch eine vergleichsweise schmale Detektionszone geführt wird, damit die Wahrscheinlichkeit erhöht wird, ein beobachtbares Ergebnis zu erhalten.
Ein weiterer wichtiger Aspekt der Erfindung ist der Einsatz eines direkt markierten spezifischen Bindungsreagenz auf einem Nitrocellulose umfassenden Trägermaterial. Vorzugsweise weist die Nitrocellulose eine Porengröße von mindestens 1 um auf. Bevorzugt besitzt die Nitrocellulose eine Porengröße von nicht größer als etwa 20 um. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Direktmarker ein gefärbter Latexpartikel von kugelförmiger oder fast kugelförmiger Gestalt und weist einen maximalen Durchmesser von nicht mehr als 0,5 um auf. Ein idealer Größenbereich für derartige Partikel liegt bei etwa 0,05 bis etwa 0,5 um.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das poröse Festphasenmaterial mit einem porösen Aufnahmeelement verbunden, auf das die Flüssigkeitsprobe aufgebracht wird und von dem die Probe in das poröse Festphasenmaterial eindringen kann. Bevorzugt ist das poröse Festphasenmaterial in einem feuchtigkeitsundurchlässigen Behälter oder Gehäuse enthalten, und das poröse Aufnahmeelement, mit dem das poröse Festphasenmaterial verbunden ist, erstreckt sich über das Gehäuse hinaus und kann als Mittel dienen, das den Eintritt einer Flüssigkeitsprobe in das Gehäuse und das Vordringen in das poröse Festphasenmaterial ermöglicht. Das Gehäuse sollte mit Mitteln versehen sein, z. B. geeignet plazierten Öffnungen, die ein Beobachten der zweiten Zone des porösen Festphasenmaterials (das das immobilisierte unmarkierte spezifische Bindungsreagenz trägt) von außerhalb des Gehäuses ermöglichen, so dass das Ergebnis des Assays beobachtet werden kann. Das Gehäuse ist mit weiteren Mitteln versehen, die ein Beobachten einer weiteren Zone des porösen Festphasenmaterials von außerhalb des Gehäuses ermöglichen, wobei diese weitere Zone Kontrollreagenzien umfaßt, die es ermöglichen, eine Anzeige, ob das Assayverfahren abgeschlossen wurde, zu geben. Bevorzugt ist das Gehäuse mit einer entfernbaren Kappe oder Hülle versehen, die das vorstehende poröse Aufnahmeelement während der Lagerung vor dem Gebrauch schützen kann. Die Kappe oder Hülle kann, wenn gewünscht, nach Probenaufbringung, während das Assayverfahren durchgeführt wird, auf das vorstehende poröse Aufnahmeelement aufgebracht werden. Gegebenenfalls kann das markierte Reagenz anderswo in der Vorrichtung, z. B. im saugfähigen Probensammelelement, enthalten sein, aber dies ist nicht bevorzugt.
Eine wichtige Ausführungsform der Erfindung ist eine Schwangerschaftstestvorrichtung, umfassend ein hohles längliches Gehäuse, enthaltend einen trockenen porösen Nitrocelluloseträger, der mit dem Äußeren des Gehäuses über ein saugfähiges Urinaufnahmeelement indirekt in Verbindung steht, das vom Gehäuse hervorsteht und als Reservoir dienen kann, von dem Urin in den porösen Träger freigesetzt wird, wobei der Träger eine erste Zone eines einen gefärbten "Direkt"-Marker tragenden hochspezifischen Anti-hCG- Antikörper enthält, wobei der markierte Antikörper, wenn er sich im feuchten Zustand befindet, im porösen Träger frei beweglich ist und in einer von der ersten Zone räumlich getrennten zweiten Zone einen hochspezifischen unmarkierten Anti-hCG-Antikörper enthält, der auf dem Trägermaterial permanent immobilisiert und daher im feuchten Zustand nicht beweglich ist, wobei die markierten und unmarkierten Antikörper für verschiedene hCG-Epitope spezifisch sind, und die zwei Zonen derart angeordnet sind, dass eine auf den porösen Träger aufgebrachte Urinprobe über die erste Zone in die zweite Zone eindringen kann, und das Gehäuse aus opa kem oder durchsichtigem Material aufgebaut ist und mindestens eine Öffnung aufweist, durch die das analytische Ergebnis beobachtet werden kann, zusammen mit einem entfernbaren wiederaufbringbaren Deckel für das vorstehende saugfähige Urinaufnahmeelement. Eine wichtige Alternative ist eine die Fruchtbarkeitsperiode vorhersagende Vorrichtung, im wesentlichen wie eben definiert, ausgenommen, dass der Analyt LH ist.
Derartige Vorrichtungen können als für den Hausgebrauch geeignete Kits vorgesehen werden, umfassend eine Vielzahl von Vorrichtungen (z. B. zwei), die einzeln in einer feuchtigkeitsundurchlässigen Umhüllung und zusammen mit geeigneten Anweisungen für den Verwender verpackt sind.
Das poröse Probenaufnahmeelement kann aus jedem saugfähigen, porösen oder fibrösen Material, das in der Lage ist, schnell Flüssigkeit zu absorbieren, hergestellt werden. Die Porosität des Materials kann in eine Richtung (d. h. mit Poren oder Fasern, die alle oder vorwiegend parallel zu einer Achse des Elements verlaufen) oder in mehrere Richtungen (omnidirektional, so dass das Element eine amorphe, schwammähnliche Struktur aufweist) verlaufen. Poröse Kunststoffmaterialien, wie Polypropylen, Polyethylen (bevorzugt mit sehr hohem Molekulargewicht), Polyvinylidenfluorid, Ethylenvinylacetat, Acrylnitril und Polytetrafluorethylen, können eingesetzt werden. Es kann vorteilhaft sein, das Element während der Herstellung mit einem oberflächenaktiven Mittel vorzubehandeln, da dies die Eigenhydrophobizität des Elements verringern und daher dessen Fähigkeit für die Aufnahme sowie die schnelle und effiziente Abgabe einer feuchten Probe verbessern kann. Die porösen Probenaufnahmeelemente können auch aus Papier oder anderen Cellulosematerialien, wie Nitrocellulose, hergestellt werden. Materialien, die derzeit in den Spitzen sogenannter mit Faserspitze versehener Stifte verwendet werden, sind insbesondere geeignet, und derartige Materialien können in einer Vielzahl von Längen und Querschnitten, die im Rahmen der Erfindung geeignet sind, geformt oder extrudiert werden. Bevorzugt sollte das das poröse Aufnahmeelement umfassende Material so ausgewählt werden, dass das poröse Element innerhalb von Sekunden mit wässeriger Flüssigkeit gesättigt werden kann. Bevorzugt bleibt das Material beständig, wenn es feucht wird, und aus diesem Grund sind Papier und ähnliche Materialien in den Ausführungsformen weniger bevorzugt, in denen das poröse Aufnahmeelement aus einem Gehäuse herausragt. Die Flüssigkeit muß danach vom porösen Probenaufnahmeelement in das poröse Festphasenmaterial frei übertreten.
Die "Kontroll"-Zone ist dafür ausgelegt, dem Verwender anzuzeigen, dass die Vorrichtung gearbeitet hat. Zum Beispiel kann die Kontrollzone mit einem Antikörper beladen werden, der sich an den markierten Antikörper aus der ersten Zone bindet, z. B. einen "Anti-Maus"-Antikörper, wenn der markierte Antikörper ein solcher ist, der unter Verwendung eines Maushybridoms abgeleitet ist, um zu bestätigen, dass die Probe den Teststreifen durchdrungen hat. In einer Alternative könnte die Kontrollzone immobilisierten Analyt enthalten, der mit überschüssigem markierten Reagenz aus der ersten Zone reagiert. Da es Zweck der Kontrollzone ist, dem Verwender anzuzeigen, dass der Test beendet wurde, sollte die Kontrollzone stromabwärts von der Detektionszone, in der das ge wünschte Testergebnis aufgenommen wird, angeordnet sein. Eine positive Kontrollanzeige sagt dem Verwender daher, dass die Probe die notwendige Distanz durch die Testvorrichtung zurückgelegt hat.
Die Markierung ist eine Direktmarkierung, d. h. eine Einheit, die in ihrem natürlichen Zustand für das Auge ohne weiteres oder mit Hilfe eines optischen Filters und/oder einer einwirkenden Stimulierung, z. B. UV-Licht, um Fluoreszenz hervorzurufen, sichtbar ist. Zum Beispiel sind kleine gefärbte Partikel, wie Farbsole, metallische Sole (z. B. Gold) und gefärbte Latexpartikel, sehr geeignet. Von diesen Möglichkeiten sind gefärbte Latexpartikel insbesondere bevorzugt. Die Konzentration des Markers in einer schmalen Zone oder einem geringen Volumen sollte für ein einfach detektierbares Signal sorgen, z. B. einen stark gefärbten Bereich. Dieser kann durch Augenschein oder Instrumente, wenn gewünscht, bewertet werden.
Ein Koppeln des Markers an das spezifische Bindungsreagenz kann durch eine kovalente Bindung, wenn erwünscht, oder eine hydrophobe Bindung erfolgen. Derartige Techniken sind im Stand der Technik üblich und sind nicht Teil der vorliegenden Erfindung. In der bevorzugten Ausführungsform, wo der Marker ein Direktmarker ist, wie ein gefärbtes Latexpartikel, ist eine hydrophobe Bindung bevorzugt.
In allen Ausführungsformen der Erfindung ist wesentlich, dass das markierte Reagenz mit der Flüssigkeitsprobe wandert, wenn diese zur Detektionszone fortschreitet. Der Fluß der Probe setzt sich vorzugsweise über die Detektionszone hinaus fort, und es wird ausreichend Probe auf das poröse Material aufgebracht, damit dies der Fall ist und jedes überschüssige markierte Reagenz aus der ersten Zone, das nicht an irgendeiner Bindungsreaktion in der zweiten Zone teilnimmt, durch diesen kontinuierlichen Fluß aus der Detektionszone herausgewaschen wird. Eine Absorptions- "Vertiefung" kann, wenn gewünscht, am distalen Ende des Trägermaterials vorgesehen werden. Die Absorptionsvertiefung kann z. B. Whatman 3MM-Chromatographiepapier umfassen und sollte ausreichende Absorptionskapazität bereitstellen, um ein Herauswaschen jedes nicht gebundenen Konjugats aus der Detektionszone zu ermöglichen. Als Alternative für eine derartige Vertiefung kann es ausreichend sein, eine bestimmte Länge an porösem Festphasenmaterial zu haben, das über die Detektionszone hinausreicht.
Die Gegenwart oder die Intensität des Signals des Markers, der in der zweiten Zone gebunden wird, kann eine qualitative oder quantitative Messung von Analyt in der Probe liefern. Eine Vielzahl von in Reihe auf dem porösen Festphasenmaterial angeordneten Detektionszonen, durch welche die wässerige Flüssigkeitsprobe nach und nach hindurchtreten kann, können ebenfalls eingesetzt werden, um eine quantitative Messung des Analyts zu liefern oder können einzeln mit verschiedenen spezifischen Bindungsagenzien beladen werden, um einen Multi-Analyttest zur Verfügung zu stellen.
Das immobilisierte spezifische Bindungsreagenz in der zweiten Zone ist bevorzugt ein hochspezifischer Antikörper und besonders bevorzugt ein monoklonaler Antikörper. Das markierte Reagenz ist ebenfalls bevorzugt ein hochspezifischer Antikörper und besonders bevorzugt ein monoklonaler Antikörper.
Vorzugsweise liegt das Trägermaterial in Form eines Streifens oder einer Lage vor, worauf die Reagenzien in einzelnen, voneinander getrennten Zonen aufgebracht werden, und die Flüssigkeitsprobe kann durch die Lage oder den Streifen von einer Seite oder einem Ende zum anderen vordringen.
Eine erfindungsgemäße Vorrichtung kann, wenn erwünscht, zwei oder mehrere einzelne Körper porösen Festphasenmaterials umfassen, z. B. getrennte Streifen oder Lagen, wobei jeder bewegliche und immobilisierte Reagenzien trägt. Diese einzelnen Körper können z. B. derart parallel angeordnet sein, dass ein einzelnes Aufbringen einer Flüssigkeitsprobe auf die Vorrichtung einen Probenfluß gleichzeitig in die getrennten Körper einleitet. Die getrennten analytischen Ergebnisse, die in dieser Art und Weise bestimmt werden können, können als Kontrollergebnisse eingesetzt werden oder, wenn auf den verschiedenen Trägern verschiedene Reagenzien eingesetzt werden, kann die simultane Bestimmung einer Vielzahl von Analyten in einer einzelnen Probe durchgeführt werden. Alternativ können mehrere Proben einzeln auf eine Anordnung von Trägern aufgebracht und gleichzeitig analysiert werden.
Das die poröse Festphase umfassende Material ist bevorzugt Nitrocellulose. Diese hat den Vorteil, dass der Antikörper in der zweite Zone ohne vorherige chemische Behandlung fest immobilisiert werden kann. Wenn das poröse Festphasenmaterial z. B. Papier umfaßt, muß die Immobilisierung des Antikörpers in der zweiten Zone durch chemische Kopplung unter Verwendung von beispielsweise CNBr, Carbonyldiimidazol oder Tresylchlorid, durchgeführt werden.
Nach der Aufbringung des Antikörpers auf die Detektionszone sollte das verbliebene poröse Feststoffmaterial behandelt werden, um jegliche verbliebenen Bindungsstellen zu blockieren. Ein Blockieren kann z. B. durch Behandeln mit Protein (z. B. Rinderserum Albumin oder Milchprotein) oder mit Polyvinylalkohol oder Ethanolamin oder jeder Kombination dieser Agenzien erreicht werden. Das markierte Reagenz für die erste Zone kann dann auf dem trockenen Träger verteilt werden und wird, wenn es sich im feuchten Zustand befindet, auf dem Träger beweglich. Zwischen jedem dieser verschiedenen Verfahrensschritte (Sensibilisieren, Aufbringen unmarkierten Reagenz, Blockieren und Aufbringen des markierten Reagenz) sollte das poröse Festphasenmaterial getrocknet werden.
Um die freie Beweglichkeit des markierten Reagenz zu unterstützen, wenn der poröse Träger mit der Probe befeuchtet wird, wird bevorzugt das markierte Reagenz als Oberflächenschicht auf den Träger aufgebracht, statt es über die Dicke des Trägers zu imprägnieren. Dadurch kann die Wechselwirkung zwischen Trägermaterial und markiertem Reagenz minimiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Träger mit einem Glasurmaterial in dem Bereich, auf den das markierte Reagenz aufgebracht werden soll, vorbehandelt. Eine Glasur kann beispielsweise durch Abscheiden einer wässerigen Zucker- oder Celluloselösung, z. B. von Saccharose oder Lactose, auf den Träger auf dem entsprechenden Abschnitt sowie Trocknen erreicht werden. Das markierte Reagenz kann dann auf dem glasierten Abschnitt aufgebracht werden.
Der restliche Teil des Trägermaterials sollte nicht glasiert werden.
Bevorzugt ist das poröse Festphasenmaterial eine Nitrocelluloselage mit einer Porengröße von mindestens etwa 1 um, besonders bevorzugt größer als etwa 5 um und insbesondere bevorzugt etwa 8 bis 12 um. Eine besonders geeignete Nitrocelluloselage mit einer nominalen Porengröße von bis zu etwa 12 um ist kommerziell von der Schleicher und Schuell GmbH erhältlich.
Bevorzugt ist die Nitrocelluloselage "verstärkt", z. B. mit einer Kunststofflage, um dessen Handhabungsfestigkeit zu erhöhen. Dies kann einfach durch Ausbilden eines dünnen Nitrocellulosefilms auf einer Lage Verstärkungsmaterial hergestellt werden. Die tatsächliche Porengröße der Nitrocellulose, wenn sie in dieser Art und Weise verstärkt ist, liegt etwas niedriger als die für das entsprechend nicht verstärkte Material.
Alternativ kann eine vorgeformte Lage Nitrocellulose zwischen zwei Trägerlagen festen Materials, z. B. Kunststofflagen, fest dazwischengelegt werden.
Es ist bevorzugt, dass die Flußgeschwindigkeit einer wässerigen Probe durch das poröse Festphasenmaterial derart sein sollte, dass im unbehandelten Material wässerige Flüssigkeit mit einer Geschwindigkeit von 1 cm in nicht mehr als 2 Minuten wandert, aber auch langsamere Flußgeschwindigkeiten können, wenn gewünscht, eingesetzt werden.
Die räumliche Trennung zwischen den Zonen und die Flußgeschwindigkeitscharakteristika des porösen Trägermaterials können ausgewählt werden, um adäquate Reaktionszeiten, während deren die notwendige spezifische Bindung auftreten kann, und ein Dispergieren des markierten Reagenz in der ersten Zone in der Flüssigkeitsprobe und ein Wandern durch den Träger zu ermöglichen. Eine weitere Steuerung dieser Parameter kann durch die Einverleibung von Viskositätsmodifizierern (z. B. Zuckern und modifizierten Cellulosen) in die Probe erreicht werden, um die Reagenzwanderung zu verlangsamen.
Bevorzugt wird das immobilisierte Reagenz in der zweiten Zone über die ganze Dicke des Trägers imprägniert (z. B. über die Dicke der Lage oder des Streifens, wenn der Träger in dieser Form vorliegt). Eine derartige Imprägnierung kann das Ausmaß erhöhen, in dem das immobilisierte Reagenz jeden in der wandernden Probe vorhandenen Analyt einfangen kann.
Die Reagenzien können auf das Trägermaterial in einer Vielzahl von Möglichkeiten aufgebracht werden. Verschiedene "Druck"- Techniken wurden früher zum Aufbringen von Flüssigkeitsreagenzien auf Träger vorgeschlagen, z. B. Mikrospritzen, Stifte unter Verwendung von Dosierungspumpen, Direktdruck und Tintenstrahldruck, und jede dieser Techniken kann im vorliegenden Zusammenhang eingesetzt werden. Um die Handhabung zu erleichtern, kann der Träger (z. B. eine Lage) mit den Reagenzien behandelt werden und dann in kleinere Abschnitte (z. B. kleine schmale Streifen, die jeweils die erforderlichen Reagenz enthaltenden Zonen enthalten) unter teilt werden, um eine Vielzahl von identischen Trägereinheiten zu erzeugen.
Nur beispielhaft werden einige Aspekte der Erfindung nun detailliert anhand der beigefügten Zeichnungen beschrieben, obwohl die beschriebenen Vorrichtungen und Assays nicht alle sämtliche Merkmale des beanspruchten Assays enthalten.

Ausführungsform 1

Die Fig. 1 und 2 stellen einen typischen Streifen porösen Festphasenmaterials zur Verwendung in einem Assaytest dar und veranschaulichen das zugrundeliegende Prinzip, nach dem die Erfindung arbeitet.
In Fig. 1 ist der Assayteststreifen 10 als rechteckiger Streifen mit (für die Beschreibung) seiner longitudinalen Achse in einer vertikalen Position zu sehen. Benachbart zum unteren Ende 11 des Streifens 10 befindet sich ein schmales Band oder eine schmale Zone 12, die sich über die gesamte Breite des Streifens erstreckt. Ein schmaler Bereich 13 des Streifens 10 liegt vertikal unter der Zone 12. Oberhalb der Zone 12 befindet sich eine zweite Zone 14, die in einem Abstand oberhalb von Streifen 10 liegt und sich in ähnlicher Weise über die gesamte Breite des Streifens erstreckt. Der Bereich 15 des Streifens 10 zwischen den Zonen 12 und 14 kann jede Größe aufweisen, solange die zwei Zonen getrennt sind. Ein weiterer Bereich 16 des Streifens erstreckt sich oberhalb der Zone 14 und am oberen Ende 17 des Streifens liegt ein mit dem Streifen 10 fest verbundenes poröses Kissen 18, so dass das Kissen 18 als ein "Sumpf" (eine Vertiefung) für eine Flüssigkeitsprobe dienen kann, die durch Kapillarwirkung durch den Streifen 10 aufsteigen kann.
Die Zone 12 ist mit einem ersten, einen sichtbaren ("Direkt")Marker (z. B. gefärbte Latexpartikel, Farbstoffsol oder Goldsol) tragenden Antikörper beladen. Dieses Reagenz kann in Gegenwart einer Flüssigkeitsprobe frei durch den Streifen wandern. In der Zone 14 ist der Streifen mit einem zweiten Antikörper, der für ein anderes Epitop auf demselben Analyt wie für den ersten Antikörper spezifisch ist, imprägniert. Der zweite Antikörper wird auf dem Streifen fest immobilisiert.
Fig. 2 veranschaulicht, was passiert, wenn der Assaystreifen in einem analytischen Verfahren eingesetzt wird. Das untere Ende 11 des trockenen Streifens wird mit einer Flüssigkeitsprobe (nicht gezeigt) in Kontakt gebracht, die den zu bestimmenden Analyt enthalten kann. Die Kapillarwirkung bewirkt, dass die Flüssigkeit durch den Streifen aufsteigt und eventuell das Kissen 18 erreicht. Währenddessen durchquert die Probe die Zone 12 und der markierte Antikörper dispergiert in der Probe und wandert mit dieser durch den Streifen. Während der Wanderung in Richtung der Zone 14 kann der markierte Antikörper an jeden in der Probe vorhandenen Analyt binden. Beim Erreichen der Zone 14 sollte jedes Analytmolekül an den zweiten Antikörper gebunden werden, wodurch das derart erzeugte markierte "Sandwich" immobilisiert wird. Wenn in der Flüssigkeitsprobe eine beträchtliche Konzentration des zu bestimmenden Analyt vorliegt, sollte in einer kurzen Zeitspanne eine eindeutige Akkumulation des sichtbaren Markers in der Zone 14 auftreten.
Als Beispiel einer Analyse für die diese Ausführungsform eingesetzt werden kann, kann der Analyt hCG sein, die Reagenzien in den Zonen 12 und 14 können monoklonale Antikörper für hCG sein, die an einer "Sandwich"-Reaktion mit hCG teilnehmen können, und die Marker können partikelförmige Farbstoffe, ein Goldsol oder gefärbte Latexpartikel sein.
Ein auf obigen Prinzipien basierender Assay kann eingesetzt werden, um eine große Vielzahl von Analyten durch Auswahl geeigneter spezifischer Bindungsreagenzien zu bestimmen. Die Analyten können z. B. Proteine, Immunglobuline, Hormone, Polynucleotide, Steroide, Arzneimittel, infektiöse Krankheitserreger (z. B. bakteriellen oder viralen Ursprungs), wie Streptococcus, Neisseria und Chlamydia, sein. Sandwich-Assays können für Analyten, wie hCG, LH und infektiöse Krankheitserreger, durchgeführt werden.
Die Bestimmung der Gegenwart (wenn vorhanden) von mehr als einem Analyten in der Probe kann signifikante klinische Anwendung finden. Zum Beispiel kann das Verhältnis der Niveaus an Apolipoproteinen A&sub1; und B eine Empfindlichkeit gegenüber koronarer Herzerkrankung anzeigen. Ähnlich kann das Verhältnis der Niveaus von glukosidiertem Hämoglobin (HbA) zu unglukosidiertem (HbAo) oder Gesamthämoglobin (Hb) bei der Behandlung von Diabetis helfen. Zum Beispiel kann ein Doppelanalyttest für die Apolipoproteine A&sub1; und B hergestellt werden, indem als zwei räumlich getrennte Zonen ein für Apolipoprotein A&sub1; spezifischer Antikörper in einer ersten Zo ne und ein zweiter für Apolipoprotein B spezifischer Antikörper in einer zweiten Zone einer porösen Trägermatrix abgeschieden wird. Nach dem Aufbringen der beiden Antikörper auf jede der entsprechenden Zonen über ein geeignetes Aufbringungsverfahren (z. B. Tintenstrahldruck, Dosierungspumpe und -stift oder Airbrush) sollte das verbliebene poröse Material mit einem Reagenz behandelt werden, z. B. Rinderserum Albumin, Polyvinylalkohol oder Ethanolamin, um alle anderswo verbliebenen Bindungsstellen zu blockieren. Ein drittes und viertes einen Marker tragendes Reagenz kann dann auf dem trockenen Träger in einer oder mehreren Zonen in der Nähe eines Endes des Streifens verteilt werden, wobei man den Streifen zwischen Aufbringung der zwei Reagenzien auf dieselbe Zone trocknen läßt. Das Reagenz 3 und das Reagenz 4 können Konjugate von Anti-Apolipoprotein-A&sub1;-Antikörper bzw. Anti-Apolipoprotein-B-Antikörper umfassen. Diese beiden Konjugate werden, wenn sie sich in feuchtem Zustand befinden, in und auf dem Träger beweglich. Die Reagenzien 3 und 4 können, wenn auf das erste Ende des Trägerstreifens eine wässerige Probe aufgebracht wird, mit dem Flüssigkeitsfluß wandern. Beim weiteren Wandern entlang des Streifens in Richtung auf die zwei Zonen kann Reagenz 3 jedes in der Probe vorliegende Apolipoprotein A&sub1; binden, und das Reagenz 4 kann jedes in der Probe vorhandene Apolipoprotein B binden. Bei Erreichen der ersten Zone des zweiten Antikörpers (Anti- Apolipoprotein-A&sub1;-Antikörperzone) sollten sich Anti-Apolipoprotein-A&sub1;-Moleküle an den zweiten Antikörper binden, und das so erzeugte markierte "Sandwich" immobilisieren. Keine markierten Apolipoprotein-B-Moleküle werden in der ersten Zone binden. Bei Erreichen der zweiten Zone des zweiten Antikörpers (Anti-Apolipoprotein-B-Antikörperzone) sollte jedes Apolipoprotein-B-Molekül an den zweiten Antikörper binden (Festphasenantikörper) und das so erzeugte markierte "Sandwich" immobilisieren. Keine markierten Apolipoprotein-A&sub1;-Moleküle werden in der zweiten Zone binden. Eine Akkumulierung jedes der Direktmarker wird in beiden oder in einer der Zonen in einem kleineren oder größeren Ausmaß auftreten, was in einer oder beiden der Festphasen-Antikörperzonen zu einem sichtbaren Signal führt. Ein Überschuß ungebundenen Konjugats (sowohl von Reagenz 3 als auch Reagenz 4) kann über die beiden Antikörperzonen frei hinübertreten und wird in das distale Ende des Streifens hineingewaschen.
Die Entwicklung einer quantifizierbaren Färbung in beiden Zonen des zweiten Antikörpers können mit geeigneten Geräten beurteilt werden, die ein Farbdichteverhältnis zwischen den beiden Stellen liefern.
Die Bestimmung der Gegenwart von mehr als zwei (d. h. mehreren) Analyten in irgendeiner Probe kann bedeutende klinische Anwendbarkeit haben. Zum Beispiel kann die Detektion der Gegenwart verschiedener unterschiedlicher Serotypen eines Bakteriums oder die Detektion der Gegenwart von löslichen serologischen Markern im Menschen nützlich sein. Beispielsweise kann ein multipler Analyttest für die Detektion der Gegenwart von verschiedenen Serotypen von Streptococcus für die Gruppen A, B, C und D hergestellt werden. Eine Mischung von monoklonalen Antikörpern, die jeder für verschiedene pathalogisch wichtige Gruppen von Serotypen spezifisch sind, oder ein gegen eine spezielle Streptococcengruppe eingesetztes polyklonales Antiserum kann auf einen porösen Trägerstreifen als eine Linie, die sich über die Breite des Strei fens mit etwa 1 mm Zonenlänge erstreckt, verteilt werden. Mehrfachlinien können in räumlich getrennten Zonen verteilt werden, wobei jede (eine) immunochemisch reaktive Komponente(n) enthaltende Zone in der Lage ist, den interessierenden Analyt zu binden. Nach dem Aufbringen der multiplen Zonen durch ein geeignetes Aufbringungsverfahren (z. B. Tintenstrahldruck, Dosierungspumpe und -stift, Airbrush) sollte das verbliebene poröse Material mit einem Reagenz behandelt werden (z. B. Rinderserum Albumin, Polyvinylalkohol, Ethanolamin), um alle anderswo verbliebenen Bindungsstellen zu blockieren. Die Markierungskonjugate, z. B. Farbstoffsol, und jede für jede bakterielle Gruppe spezifische immunochemisch reaktive Komponente kann dann entweder auf einer Einzelzone am unteren Ende des Streifens unmittelbar anschließend zur Probenaufbringungszone, oder auf eine Reihe von getrennten Zonen verteilt werden.
Die Fig. 3, 4 und 5 der begleitenden Zeichnungen zeigen eine vollständige Vorrichtung, die einen porösen Streifen, wie oben gerade beschrieben, einsetzt. Fig. 3 stellt die in einer Draufsicht zu sehende vollständige Vorrichtung dar, Fig. 4 zeigt die gleiche Vorrichtung teilweise aufgeschnitten, um die Details des Streifens innerhalb sichtbar zu machen, und Fig. 5 zeigt die Unterseite der Vorrichtung.
In Fig. 3 umfaßt die Vorrichtung einen flachen rechteckigen Körper 30 in der Frontfläche 31, die durch eine kreisförmige Öffnung oder ein Fenster 32 durchbrochen wird, wodurch der poröse Teststreifen 10 innerhalb des Körpers zu sehen ist. Der durch das Fenster 32 sichtbare Bereich des Teststreitens 10 umfaßt eine schmale horizontale Zone 14.
In Fig. 4 umfaßt die Vorrichtung einen trockenen rechteckigen Teststreifen 10, hergestellt aus porösem Material, das sich vom unteren Ende 33 des Körpers 30 zwischen der Vorderseite 31 und Rückseite 34 des Körpers in den Körper erstreckt. In der Nähe des unteren Endes 11 des Streifens 10 befindet sich eine horizontale Zone 12, die ein markiertes spezifisches Bindungsreagenz für einen Analyt trägt, wobei das Bindungsreagenz im feuchten Zustand im Teststreifen beweglich ist. Weiter oben auf dem Teststreifen liegt die schmale horizontale Zone 14, die durch das Fenster 32 sichtbar ist. Am oberen Ende 17 des Teststreifens 10 liegt eine poröse "Vertiefung" 18, die jede Flüssigkeitsprobe, die durch den Streifen nach oben vordringt, absorbieren kann.
In Fig. 5 umfaßt die untere Kante 35 des Körpers 30 eine seitliche Öffnung, in der das untere Ende 11 des Streifens liegt.
Beim Betrieb wird das untere Ende 33 des Körpers 30 in eine Flüssigkeitsprobe (z. B. Urin) eingetaucht, so dass die Flüssigkeitsprobe durch das untere Ende 11 des Teststreifens 20 absorbiert werden und durch Kapillarwirkung zum oberen Ende 17 des Teststreifens und in die Vertiefung 18 aufsteigen kann. Währenddessen fließt die Flüssigkeitsprobe von Zone 12 zu Zone 14. Spezifische Bindungsreaktionen, wie oben beschrieben, treten auf, und das Testergebnis wird durch das Fenster 32 für den Verwender sichtbar.

Ausführungsform 2

Die Fig. 6 und 7 der beigefügten Zeichnungen veranschaulichen eine weitere erfindungsgemäße Testvorrichtung. Fig. 6 veranschaulicht die vollständige Vorrichtung von vorne gesehen und Fig. 7 zeigt dieselbe Vorrichtung teilweise aufgeschnitten, um Einzelheiten eines im Körper der Vorrichtung enthaltenen porösen Teststreifens darzustellen.
In Fig. 6 umfaßt die Vorrichtung einen länglichen Körper 200, der am unteren Ende 201 in einem kleinen einstückigen Behälter 202 endet, der ein vorbestimmtes Volumen einer Flüssigkeitsprobe, z. B. Urin, aufnehmen kann. Die Vorderfläche 203 des Körpers 200 umfaßt zwei quadratische schmale Öffnungen oder Fenster 204 und 205, die übereinander angeordnet sind.
In Fig. 7 ist der verlängerte Abschnitt des Körpers 200 hohl und umfaßt einen Teststreifen 206, der fast die gesamte Länge des Körpers einnimmt. Dieser Teststreifen ist von ähnlichem Aufbau wie die unter Ausführungsform 1 beschriebenen und umfaßt in der Nähe seines unteren Endes 207 eine horizontale Zone 208, die ein markiertes spezifisches Bindungsreagenz trägt, das in feuchtem Zustand im Streifen frei wandern kann. Es gibt zwei kreisförmige Zonen 209 und 210, benachbart zu den Fenstern 204 und 205, durch die man hindurchsehen kann. Der Streifen endet an seinem oberen Ende 211 in einer porösen Vertiefung 212. Am unteren Ende 201 der Vorrichtung steht der Behälter 202 mit dem hohlen Körper über eine seitliche Öffnung 213 in Verbindung.
Im Betrieb wird eine Flüssigkeitsprobe auf das untere Ende der Vorrichtung aufgebracht, und ein vorbestimmtes Volumen der Probe füllt den Behälter 202. Vom Behälter 202 steigt die Flüssigkeitsprobe durch Kapillarwirkung durch den Teststreifen 206 und befördert das markierte Reagenz von Zone 208 zu den zwei kreisförmigen Zonen 209 und 210. Eine Reihe an spezifischen Bindungsreaktionen, wie sie im Zusammenhang mit der obigen Ausführungsform 1 beschrieben sind, treten auf. In dieser Ausführungsform dient die zweite kreisförmige Zone 210 als Kontrolle (sie verursacht beispielsweise ein gefärbtes Signal, unabhängig davon, ob die Probe den zu bestimmenden Analyt enthält oder nicht), und die Bestimmung des Analyt findet in der ersten kreisförmigen Zone 209 statt. Der Verwender kann feststellen, ob der Analyt in der Probe vorhanden ist, indem er das in den beiden Zonen erzeugte Signal vergleicht.
Wenn der Test beispielsweise eingesetzt wird, um die Gegenwart von hCG im Urin im Verlaufe eines Schwangerschaftstests zu bestimmen, kann die kreisförmige Kontrollzone 210 immobilisiertes hCG enthalten, das einen markierten Antikörper bindet, der durch die wandernde Flüssigkeitsprobe von Zone 208 nach oben getragen wird. Der gleiche markierte Antikörper kann in einer "Sandwich"- Reaktion mit hCG in der Probe eingreifen und in der ersten kreisförmigen Zone 209 durch einen weiteren spezifischen Anti-hCG- Antikörper, der darin immobilisiert wurde, gebunden werden. Alternativ kann die "Kontroll"-Zone, wenn gewünscht, nur dafür ausgelegt werden, dem Verwender ein unspezifisches Signal zu übermitteln, dass die Vorrichtung gearbeitet hat. Zum Beispiel kann die zweite kreisförmige Zone mit einem Antikörper beladen sein, der an den markierten Antikörper von Zone 208 bindet, z. B. einen "Anti-Maus"-Antikörper, wenn der markierte Antikörper einer ist, der unter Verwendung eines Maushybridoms abgeleitet wurde, um zu bestätigen, dass die Probe den Teststreifen durchdrungen hat.

Ausführungsform 3

Fig. 8 der beigefügten Zeichnungen stellt eine isometrische Ansicht einer erfindungsgemäßen Assayvorrichtung dar, und Fig. 9 stellt einen Querschnittsseitenaufriß der in Fig. 8 gezeigten Vorrichtung dar.
In Fig. 8 umfaßt die Vorrichtung ein Gehäuse oder einen Behälter 500 mit länglicher rechteckiger Form mit einem Abschnitt 502 mit verringertem Querschnittsbereich an einem Ende 501. Eine Kappe 503 kann auf dem Abschnitt 502 angebracht werden und kann gegen die Schulter 504 am Ende 501 des Gehäuses anstoßen. Die Kappe 503 ist vom Gehäuse 500 getrennt gezeigt. Über das Ende 505 des Abschnitts 502 hinaus erstreckt sich ein poröses Element 506. Wenn die Kappe 503 auf dem Abschnitt 502 des Gehäuses angebracht ist, bedeckt sie das poröse Element 506. Die obere Fläche 507 des Gehäuses 500 umfaßt zwei Öffnungen 508 und 509.
In Fig. 9 ist zu sehen, dass das Gehäuse 500 eine Hohlkonstruktion darstellt. Das poröse Element 506 erstreckt sich in das Gehäuse 500 und steht mit einem Streifen porösen Trägermaterials 510 in Kontakt. Das poröse Element 506 und der Streifen 510 überlappen, um sicherzustellen, dass es einen ausreichenden Kontakt zwischen diesen zwei Materialien gibt, und dass eine auf das Ele ment 506 aufgebrachte Flüssigkeitsprobe das Element 506 durchdringen kann und in den Streifen 510 übertritt. Der Streifen 510 erstreckt sich weiter in das Gehäuse 500. Der Streifen 510 ist durch einen aus transparentem feuchtigkeitsundurchlässigen Kunststoffmaterial gebildeten Trägerstreifen 511 "rückseitig verstärkt". Der Streifen 510 erstreckt sich über die Öffnungen 508 und 509 hinaus. Mittel sind innerhalb des Gehäuses 500 durch die Stege 512 und 513 vorgesehen, um den Streifen 510 fest an Ort und Stelle zu halten. Die inneren Konstruktionsdetails des Gehäuses sind diesbezüglich kein bedeutender Aspekt der Erfindung, solange der Streifen im Gehäuse fest an Ort und Stelle gehalten, das poröse Element 506 im Gehäuse fest zurückgehalten, und ein geeigneter flüssigkeitsdurchlässiger Kontakt zwischen dem Element 506 und dem Streifen 510 aufrechterhalten wird. Der transparente Verstärkungsstreifen 511 liegt zwischen dem Streifen 510 und den Öffnungen 508 und 509 und kann als Abdichtung gegen den Eintritt von Feuchtigkeit von außerhalb des Gehäuses 500 über diese Öffnungen wirken. Der verbliebene Zwischenraum 514 im Gehäuse kann, wenn gewünscht, feuchtigkeitsabsorbierendes Material, wie Silicagel, enthalten, damit der Streifen 510 während der Lagerung in trockenem Zustand erhalten bleibt. Die Reagenz enthaltenden Zonen im Streifen 510 sind in Fig. 8 nicht gezeigt, aber die erste Zone, die das markierte Reagenz enthält, das, wenn der Streifen befeuchtet wird, beweglich ist, liegt im Bereich zwischen dem porösen Element 506 und Öffnung 508. Die das immobilisierte unmarkierte Reagenz enthaltende zweite Zone liegt in dem Bereich der durch die Öffnung 508 freigelegt wird, so dass, wenn die Vorrichtung in einem Assay eingesetzt wurde, das Ergebnis durch die Öffnung 508 beobachtet werden kann. Die Öffnung 509 liefert Mit tel, durch die sich eine weitere Reagenzien enthaltende Kontrollzone, welche eine angemessene Durchdringung der Probe durch den Streifen ermöglicht, beobachten läßt.
Beim Gebrauch wird die Schutzkappe 503 vom Halter entfernt, und das Element 506 wird einer Flüssigkeitsprobe ausgesetzt, z. B. durch Halten in den Urinstrahl im Falle eines Schwangerschaftstests. Nachdem das Element 506 der Flüssigkeitsprobe für eine ausreichende Zeit ausgesetzt wurde, um sicherzustellen, dass das Element 506 mit der Probe gesättigt ist, kann die Kappe 503 wieder aufgebracht werden, und die Vorrichtung wird durch den Verwender für eine geeignete Zeitspanne (z. B. 2 oder 3 Minuten) beiseite gestellt, während die Probe den Teststreifen 510 durchdringt, um das analytische Ergebnis zu liefern. Nach der geeigneten Zeitspanne kann der Verwender den Teststreifen durch die Öffnungen 508 und 509 beobachten und kann ermitteln, ob das Assay beendet wurde, indem die Kontrollzone durch die Öffnung 509 beobachtet wird und kann das Ergebnis des Assays durch Beobachten der zweiten Zone durch die Öffnung 508 feststellen.
Während der Herstellung kann die Vorrichtung ohne weiteres aus z. B. Kunststoffmaterial zusammengebaut werden, wobei das Gehäuse 500 in zwei Teilen (z. B. obere und untere Hälfte 515 und 516) geformt wird, die fest aneinander befestigt werden können (z. B. durch Ultraschallschweißen), nachdem das poröse Element und der Teststreifen innerhalb einer der Hälften plaziert und dann zwischen die zwei Hälften eingebracht wurden. Die Ausbildung dieser Sandwich-Konstruktion kann verwendet werden, um das poröse Element und den Teststreifen "zusammenzupressen", um zwischen ihnen ausreichenden Kontakt sicherzustellen. Die Kappe 503 kann als getrennter vollständiger Gegenstand ausgebildet werden. Die Öffnungen 508 und 509 können, wenn gewünscht, mit transparenten Einlagen versehen werden, die eine größere Sicherheit gegen Eintritt von Feuchtigkeit von außerhalb des Gehäuses sicherstellen können. Durch Vorsehen einer dichten Verbindung zwischen dem Ende 505 des Gehäuses 500 und dem vorstehenden porösen Element 506, führt das Aufbringen der Probe auf das vorstehende Element nicht dazu, dass die Probe direkt in die Vorrichtung eintritt und das Element 506 umgeht. Das Element 506 bietet daher den einzigen Zutrittsweg für die Probe zum Streifen innerhalb des Gehäuses und kann die Probe an den Streifen in gesteuerter Art und Weise abgeben. Die Vorrichtung kombiniert daher als Ganzes die Funktionen als Sammler und Analysator.
Durch Verwendung der Teststreifenmaterialien und der Reagenzien, wie sie hier beschrieben sind, kann gemäß der Fig. 8 und 9 eine Vorrichtung hergestellt werden, die in hohem Maß für den Gebrauch als Schwangerschaftstestkit oder Testkit für die Fruchtbarkeitsperiode zur Verwendung zuhause oder in der Klinik geeignet ist. Der Verwender braucht nur eine Urinprobe auf das exponierte poröse Element aufzubringen und kann dann (nachdem gegebenenfalls die Kappe wieder aufgebracht wurde) das Testergebnis durch die Öffnung 508 innerhalb von wenigen Minuten beobachten.
Obwohl insbesondere anhand von Schwangerschaftstests und Fruchtbarkeitstests beschrieben, ist darauf hinzuweisen, dass die Vorrichtung, wie gerade beschrieben, eingesetzt werden kann, um die Gegenwart von einer sehr großen Vielzahl von Analyten zu bestim men, wenn dem Teststreifen geeignete Reagenzien einverleibt werden. Ferner kann die allgemeine Form des Gehäuses und der Kappe sowohl hinsichtlich ihrer Länge, ihres Querschnitts und anderer physischer Merkmale beträchtlichen Variationen unterliegen, ohne vom Grundgedanken der Erfindung abzuweichen.
Eine weitere Wahlmöglichkeit ist das Weglassen des markierten Reagenz in Teststreifen, wobei das Reagenz im vorstehenden porösen Element 506 enthalten ist.
Die Fig. 10 der beigefügten Zeichnungen zeigt eine vergrößerte Ansicht des porösen Aufnahmeelements und des Teststreifens in der in den Fig. 8 und 9 abgebildeten Vorrichtung.
Das poröse Aufnahmeelement 506 ist mit dem porösen Teststreifen 510 verbunden und derart durch die transparente Kunststofflage 511 verstärkt, dass die Flüssigkeit in der mit den Pfeilen gezeigten Richtung durch das poröse Aufnahmeelement zum porösen- Streifen fließen kann. Die Testzone 517 umfaßt das immobilisierte spezifische Bindungsreagenz und die Kontrollzone 518 enthält ein Reagenz, um anzuzeigen, dass die Probe eine ausreichende Entfernung entlang des Teststreifens zurückgelegt hat. Ein Abschnitt der Teststreifenoberfläche gegenüber dem Verstärkungsstreifen 511 und benachbart zum porösen Aufnahmeelement 506 trägt eine Glasur 519, auf der eine Schicht 520 des markierten spezifischen Bindungsreagenz abgeschieden ist. Die Dicke dieser zwei Schichten, wie in Fig. 10 gezeigt, ist nur zu Zwecken der Darstellung stark übertrieben. Es ist festzustellen, dass in der Praxis die Glasur keine echte Oberflächenschicht ausbilden kann, und das Glasurma terial in einigem Ausmaß in die Dicke des Streitens eindringt. In ähnlicher Weise kann das anschließend aufgebrachte markierte Reagenz ebenfalls in den Streifen eindringen. Nichtsdestotrotz wird die Verringerung jeder Wechselwirkung zwischen dem markierten Reagenz und dem Trägermaterial, das den Streifen bildet, als wesentliches Ziel erreicht. Eine auf dem Aufnahmeelement 506 abgeschiedene wässerige Probe kann von dort über die Länge des Streifens 510 fließen und dadurch löst sich die Glasur 519 und mobilisiert das markierte Reagenz und trägt das markierte Reagenz entlang des Streifens und durch Zone 517.

Ausführungsform 4

Die Fig. 11 und 12 veranschaulichen eine weitere Ausführungsform der Erfindung, die in Fig. 11 als Draufsicht und in Fig. 12 im Querschnitt zu sehen ist, wobei der Querschnitt ein Aufriß entlang der Linie A in Fig. 11 ist.
In Fig. 11 umfaßt die Testvorrichtung ein flaches rechteckiges Gehäuse 600, umfassend eine zentral angeordnete rechteckige Öffnung 601, benachbart zu dem linken Ende 602 und zwei weiteren Öffnungen 603 und 604 nahe des Mittelpunkts der Vorrichtung und derart angeordnet, dass die Öffnungen 601, 603 und 604 auf der zentralen longitudinalen Achse der Vorrichtung, entsprechend der Linie A, liegen. Obwohl alle drei Öffnungen rechteckig dargestellt sind, ist ihre tatsächliche Form nicht kritisch.
In dem in Fig. 12 zu sehenden Querschnitt ist die Vorrichtung hohl und umfaßt im Inneren ein poröses Probenaufnahmeelement, be nachbart zum Ende 602 des Gehäuses 600 und direkt unterhalb der Öffnung 601 liegend. Ein Teststreifen ähnlichen Aufbaus zu dem anhand von Ausführungsform 4 beschriebenen, umfassend einen durch eine durchsichtige Kunststofflage 607 verstärkten porösen Streifen 606, ist ebenfalls im Gehäuse 600 enthalten und erstreckt sich vom porösen Aufnahmeelement 602, mit dem der poröse Träger in flüssigkeitsdurchlässigem Kontakt steht, bis zum anderen äußeren Ende des Gehäuses. Die transparente Verstärkungslage 607 steht mit der oberen Innenfläche 608 des Gehäuses 600 in festem Kontakt und liefert eine Abdichtung gegenüber den Öffnungen 603 und 604, um den Eintritt von Feuchtigkeit oder von der Probe in das Gehäuse zu verhindern. Obwohl in den Zeichnungen nicht gezeigt, umfaßt der poröse Teststreifen 606 ein markiertes spezifisches Bindungsreagenz, eine Testzone und eine Kontrollzone, die in geeignetem Verhältnis zu den Öffnungen 603 und 604 in analoger Art und Weise, wie in Ausführungsform 3 beschrieben, angeordnet sind.
Während des Gebrauchs kann eine wässerige Probe durch die Öffnung 601, z. B. mit einer Spritze, aufgebracht werden, um das poröse Aufnahmeelement 605 zu sättigen. Hiernach kann die wässerige Probe den Teststreifen durchdringen, und nach einer geeigneten Zeitspanne kann das Testergebnis durch die Öffnungen 603 und 604 beobachtet werden.
Nur anhand von Beispielen werden nun bestimmte bevorzugte Teststreifenmaterialien, Reagenzien und Verfahren zu ihrer Herstellung beschrieben.

1. Auswahl von flüssigkeitsleitendem Material

Repräsentative Beispiele von flüssigkeitsleitenden Materialien umfassen Papier, Nitrocellulose und Nylonmembranen. Wesentliche Merkmale des Materials sind dessen Fähigkeit, Proteine zu binden, die Geschwindigkeit der Flüssigkeitsleitung und, wenn notwendig nach einer Vorbehandlung, dessen Fähigkeit, den Durchtritt von markierten Antikörpern durch den Streifen zu ermöglichen. Wenn es ein Direktmarkierung ist, kann es für das Material wünschenswert sein, den Fluß von Partikeln einer Größe bis zu einigen um zu ermöglichen (in der Regel weniger als 0,5 um). Beispiele von mit verschiedenen Materialien erhaltenen Flußgeschwindigkeiten sind nachfolgend angegeben:
Die Geschwindigkeit eines Testverfahrens wird durch die Flußgeschwindigkeit des eingesetzten Materials bestimmt, und während jedes der obigen Materialien eingesetzt werden kann, ergeben einige schnellere Testergebnisse als andere.
Nitrocellulose besitzt den Vorteil, dass sie keine Aktivierung benötigt und Proteine durch Absorption beständig immobilisiert. "Immunodyne" wird voraktiviert und erfordert keine chemische Behandlung. Papier, wie Whatman 3MM, erfordert chemische Aktivierung mit beispielsweise Carbonyldiimidazol, um Antikörper erfolgreich zu immobilisieren.

2. Markierung

Herstellung einer Markierune

Eine Auswahl von Markern, die eingesetzt werden können, sind nachfolgend beschrieben. Diese Liste ist nicht erschöpfend.

A) Goldsol-Herstellung

Goldsole können für die Verwendung in Immunoassays aus kommerziell erhältlichem kolloidalem Gold und einer Antikörper-Präparation, wie Anti-α-Human-Choriongonadotropin, hergestellt werden. Metallische Solmarker sind beispielsweise im europäischen Patent EP 7654 beschrieben.
Zum Beispiel wird kolloidales Gold G20 (20 nm Partikelgröße, vertrieben von Janssen Life Sciences Products) mit 0,22 u filtrier tem 0,1 M K&sub2;CO&sub3; auf pH 7 eingestellt, und 20 ml werden in ein sauberes Becherglas gegeben. 200 ul Anti-α-hCG-Antikörper, vorbereitet in 2 mM Boraxpuffer pH 9 mit 1 mg/ml und 0,22 u filtriert, werden zum Goldsol zugegeben, und die Mischung wird 2 Minuten kontinuierlich gerührt. 0,1 M K&sub2;CO&sub3; wird eingesetzt, um den pH- Wert der Antikörper-Goldsolmischung auf 9 einzustellen und 2 ml 10% (Gew./Vol.) BSA werden zugegeben.
Das Antikörpergold wird in einer Reihe von drei Zentrifugationsschritten bei 12.000 g, 30 Minuten und 4ºC gereinigt, wobei nur der lose Teil des Pellets für den weiteren Gebrauch wieder resuspendiert wird. Das Endpellet wird in 1% (Gew./Vol.) BSA in 20 mM Tris, 150 mM NaCl bei pH 8,2 resuspendiert.

B) Farbsolherstellung

Farbsole (siehe beispielsweise Beschreibung des europäischen Patents EP 32270) können aus kommerziell erhältlichen hydrophoben Farbstoffen, wie Foron Blue SRP (Sandoz) und Resolin Blue BBLS (Bayer) hergestellt werden. Zum Beispiel werden 50 g Farbstoff in 1 Liter destilliertem Wasser durch 2- bis 3-minütiges Mischen mit einem Magnetrührer dispergiert. Die Fraktionierung der Farbstoffdispersion kann durch einen anfänglichen Zentrifugationsschritt bei 1 500 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt werden, um größere Solpartikel als Feststoffpellet zu entfernen, wobei der Überstand der Suspension für weitere Zentrifugation zurückbehalten wird.
Die Suspension wird 10 Minuten bei 3.000 g und Raumtemperatur zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet in 500 ml destilliertem Wasser resuspendiert. Dieses Verfahren wird weitere 3 Male wiederholt, wobei das Endpellet in 100 ml destilliertem Wasser resuspendiert wird.
Die Spektren der wie oben beschrieben hergestellten Farbstoffsole können aufgenommen werden, wobei sich λ-max-Werte von etwa 675 nm für Foron Blue und 690 nm für Resolin Blue ergeben. Die Absorption bei λ-max für 1 cm Weglänge wird als frei gewähltes Maß für die Farbstoffsol-Konzentration eingesetzt.

C) Gefärbte Partikel

Latex(polymer)partikel zur Verwendung in Immunoassays sind kommerziell erhältlich. Diese können auf einer Reihe von synthetischen Polymeren basieren, wie Polystyrol, Polyvinyltoluol, Polystyrol-Acrylsäure und Polyacrolein. Die eingesetzten Monomeren sind normalerweise wasserunlöslich und werden in wässerigen oberflächenaktiven Mitteln emulgiert, so dass sich Monomermyzellen bilden, die dann durch Zugabe von Initiator zur Emulsion zur Polymerisation gebracht werden. Es werden im wesentlichen kugelförmige Polymerpartikel hergestellt.
Gefärbte Latexpartikel können entweder durch Einverleibung eines geeigneten Farbstoffs, wie eines Anthrachinons, in die Emulsion vor der Polymerisation oder durch Anfärben der vorgeformten Partikel hergestellt werden. Beim letzteren Weg sollte der Farbstoff in einem wasserunlöslichen Lösungsmittel, wie Chloroform, gelöst werden, das dann zu einer wässerigen Suspension der Latexpartikel zugegeben wird. Die Partikel nehmen das nicht-wässerige Lösungsmittel und den Farbstoff auf und können dann getrocknet werden.
Bevorzugt weisen solche Latexpartikel einen maximalen Durchmesser von weniger als etwa 0,5 um auf.
Gefärbte Latexpartikel können mit Protein und insbesondere Antikörper sensibilisiert werden, um Reagenzien für den Gebrauch in Immunoassays bereitzustellen. Zum Beispiel können Polystyrolkugeln mit etwa 0,3 um Durchmesser (vertrieben von Polymer Laboratories) mit Anti-α-Human-Choriongonadotropin im nachfolgend beschriebenen Verfahren sensibilisiert werden:
0,5 ml (12,5 mg Feststoff) einer Suspension wird mit 1 ml 0,1 M Boratpuffer mit pH 8,5 in einem Eppendorf-Glasfläschchen verdünnt. Diese Partikel werden viermal in Boratpuffer gewaschen, wobei jeder Waschvorgang aus 3-minütigem Zentrifugieren bei 13.000 U/min in einer MSE-Mikrozentrifuge bei Raumtemperatur besteht. Das Endpellet wird in 1 ml Boratpuffer resuspendiert, mit 300 ug Anti-α-hCG-Antikörper vermischt, und die Suspension wird 16 bis 20 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Antikörper- Latexsuspension wird 5 Minuten bei 13.000 U/min zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet in 1,5 ml Boratpuffer, enthaltend 0,5 mg Rinderserum Albumin, resuspendiert. Nach dem Schütteln für 30 Minuten bei Raumtemperatur wird die Suspension dreimal mit 5 mg/ml BSA in Phosphat-gepufferter Salzlösung bei pH 7,2 durch Zentrifugieren bei 13.000 U/min für 5 Minuten gewaschen. Das Pellet wird in 5 mg/ml BSA/5% (Gew./Vol.) Glycerol in Phosphat-gepufferter Salzlösung bei pH 7,2 resuspendiert und bei 4ºC gelagert, bis es verwendet wird.

(A) Anti-hCG-Farbstoffsol-Herstellung

Ein Protein kann an das Farbstoffsol in einem Verfahren gekoppelt werden, das passive Adsorption einschließt. Das Protein kann z. B. eine Antikörperzubereitung, wie Anti-α-Human-Choriongonadotropin sein, hergestellt in Phosphat-gepufferter Salzlösung bei pH 7,4 mit 2 mg/ml. Eine Reaktionsmischung wird hergestellt, die 100 ul Antikörperlösung, 2 ml Farbstoffsol, 2 ml 0,1 M Phosphatpuffer mit pH 5,8 und 15,9 ml destilliertes Wasser enthält. Nach vorsichtigem Mischen dieser Lösung läßt man die Zubereitung 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Überschüssige Bindungsstellen können durch die Zugabe von beispielsweise Rinderserum Albumin blockiert werden: 4 ml von 150 mg/ml BSA in 5 mM NaCl mit pH 7,4 werden zu der Reaktionsmischung zugegeben, und nach einer Inkubation von 15 Minuten bei Raumtemperatur wird die Lösung für 10 Minuten bei 3.000 U/min zentrifugiert und das Pellet in 10 ml 0,25% (Gew./Vol.) Dextran/0,5% (Gew./Vol.) Lactose in 0,04 M Phosphatpuffer resuspendiert. Dieses Antikörper-Farbstoffsol-Konjugat wird am besten in gefriergetrockneter Form gelagert.

(B) LH-Farbstoffsol-Zubereitung

Aufgrund der strukturellen Homologie zwischen den α-Untereinheiten hCG und LH kann α-hCG-Antikörper eingesetzt werden, um LH in einem Kreuzreaktionsimmunoassay zu detektieren. Somit kann ein markierter Antikörper für die Verwendung in einem LH-Assay in identischer Art und Weise wie in Beispiel 1 beschrieben unter Verwendung eines Anti-α-hCG-Antikörpers hergestellt werden.

3. Herstellung von Reagenzstreifen

Zonenweises Imprägnieren von flüssigkeitsleitenden Materialien

Flüssigkeitsleitendes Material mit einer beschränkten Zone immobilisierten Proteins, insbesondere Antikörper, kann beispielsweise wie folgt hergestellt werden:
Eine rechteckige Lage von Schleicher und Schuell verstärkter 8 u- Nitrocellulose mit den Abmessungen 25 cm Länge und 20 cm Breite kann eine Reaktionszone aufweisen, die durch Aufbringen einer Linie Material von 1 mm Breite in 5 cm-Intervallen entlang der Länge gebildet wird und sich über die ganze Breite von 20 cm erstreckt. Das Material kann z. B. eine entsprechend ausgewählte Antikörper-Präparation sein, wie Anti-β-Human-Choriongonadotropin einer Affinität Ka von 10&sup9;, hergestellt in Phosphat-gepufferter Salzlösung bei pH 7,4 mit 2 mg/ml, geeignet für ein Immunoassay von Human-Choriongonadotropin unter Verwendung eines zweiten (markierten) Anti-hCG-Antikörpers in einem Sandwich-Format. Diese Lösung kann mit einer durch einen Mikroprozessor kontrollierten Mikrospritze abgeschieden werden, die durch eine Spitze, bevorzugt von 2 mm Durchmesser, exakte Reagenzvolumina liefert. Nachdem man das aufgebrachte Material 1 Stunde bei Raumtemperatur trocknen läßt, werden die überschüssigen Bindungsstellen auf der Nitrocellulose mit einer inerten Verbindung, wie Polyvinylalkohol (1% Gew./Vol. in 20 mM Tris mit pH 7,4), 30 Minuten bei Raumtemperatur blockiert und die Lagen werden mit destilliertem Wasser gründlich gespült, bevor sie 30 Minuten bei 30ºC getrocknet werden.
Der Marker kann in/auf einer beschränkten Zone verteilt/abgeschieden werden, bevor man das flüssigkeitsleitende Material in Streifen schneidet. Beispielsweise kann dieses Reagenz ein Farbstoffsol oder Farbpolymer-konjugierter Anti-hCG-Antikörper, hergestellt wie bei der Farbstoffsol-Herstellung beschrieben, sein, wobei das Reagenz in der Zone zurückgehalten wird, wenn das Material sich im trockenen Zustand befindet, aber durch das Trägermaterial frei wandern kann, wenn das Material befeuchtet wird, beispielsweise durch das Aufbringen einer den zu bestimmenden Analyten enthaltenden Flüssigkeitsprobe. Diese mobile Reagenzzone wird z. B. wie folgt aufgebracht:
Eine Lage Schleicher und Schuell verstärkte 8 u Nitrocellulose mit 25 cm Länge und 20 cm Breite mit Zonen immobilisierten Antikörpers in 5 cm-Intervallen über ihre Länge wird wie zuvor beschrieben hergestellt. Vor der Abscheidung von Farbstoffmarkiertem Antikörper wird eine Unterschicht z. B. aus 60% Gew./Vol. Saccharose in destilliertem Wasser durch Airbrush mit einem durch einen Mikroprozessor gesteuerten System in 6 cm- Intervallen über die Länge der Lage aufgebracht. Dann werden in mehreren Durchgängen (z. B. drei) Farbstoff-markierte Antikörper, hergestellt in 1% Methacel KAM (Handelsmarke für Methylcellulose von der Firma Dow Chemical) und 0,6% (Gew./Vol.) Polyvinylalkohol durch Airbrush oder durch eine Mikrospritze direkt zuoberst der Unterschicht aufgebracht. Man läßt die Lagen dann trocknen und schneidet in Streifen mit 5 cm Länge und 1 cm Breite, die in der vollständigen Vorrichtung eingesetzt werden.
Goldsole oder gefärbte Polystyrolpartikel können durch ein ähnliches Verfahren abgeschieden werden.
Zusätzlich zu der Testzone können verschiedene Kontrollzonen- Varianten eingesetzt werden. Zum Beispiel kann eine Zone von antispezifischem IgG nach der Testzone abgeschieden werden.

4. Sandwich-Assay unter Verwendung von Streifenformaten

Eine Reaktion von Sandwich-Typ kann für die Detektion von humanem Choriongonadotropin (hCG) in einer Flüssigkeitsprobe durchgeführt werden. Bevorzugt ist der eingesetzte Marker ein Direktmarker, der ohne weiteres für das Auge sichtbar ist. Farbstoffsole, Goldsole oder gefärbte Latexpartikel können mit Anti-hCG-Antikörpern, wie zuvor beschrieben, verbunden werden.
Mit Direktmarkern können Assays durchgeführt werden, in denen frische Urinproben direkt vom Urinstrahl oder durch Freisetzung eines geeigneten Volumens (z. B. 100 ul) aus einem Behälter unter Verwendung einer Pipette auf den Absorptionsdocht der Testvorrichtung aufgebracht werden. Man läßt jede Probe 5 Minuten in der Vorrichtung fließen und die in der Reaktionszone erzeugte Farbe kann entweder mit dem Auge oder unter Verwendung eines Lichtreflexionsmessers abgelesen werden.
Eine ähnliche Ausführungsform kann unter Verwendung des lutenisierenden Hormons (LH) anstelle von hCG hergestellt werden.

Claims

1. Spezifisches Bindungsassay, umfassend die Verwendung eines für einen Analyt spezifischen markierten Reagenz, wobei das markierte Reagenz durch einen porösen Träger (206) frei wandern kann, der durch Aufbringen einer vermutlich den Analyt enthaltenden wässerigen Probe befeuchtet wird, wobei es auf dem porösen Träger eine Detektionszone (209) gibt, in der Detektionszone ein unmarkiertes spezifisches Bindungsagens für den Analyt permanent immobilisiert und daher im feuchten Zustand nicht beweglich ist, wobei das unmarkierte spezifische Bindungsagens mit dem Analyt und dem markierten Reagenz an einer Sandwich-Reaktion teilnehmen kann, und der poröse Träger einen Teil einer analytischen Testvorrichtung umfaßt, dadurch gekennzeichnet, dass

a) die Markierung eine partikelförmige Direktmarkierung ist;

b) es auf dem porösen Träger stromabwärts von der Detektionszone eine Kontrollzone (210) gibt, wobei die Kontrollzone immobilisierten Antikörper enthält, der an das markierte Reagenz oder den immobilisierten Analyt, der an das markierte Reagenz binden kann, binden kann, und

c) das markierte Reagenz aus dem trockenen Zustand in der analytischen Testvorrichtung durch die wässerige Probe aufgenommen wird und mit dieser durch die Detektionszone und Kontrollzone wandert, wodurch sich ein positives Assayergebnis durch sichtbares Binden desselben markierten Reagenz sowohl in der Detektionszone als auch der Kontrollzone zeigt und sich ein negatives Assayergebnis durch sichtbares Binden des markierten Reagenz nur in der Kontrollzone zeigt.

2. Assay nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die partikelförmige Direktmarkierung ein Farbstoffsol oder ein Goldsol darstellt.

3. Assay nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die partikelförmige Direktmarkierung einen gefärbten Latexpartikel darstellt.

4. Assay nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der poröse Träger in einem hohlen Körper (200) enthalten ist, der einen Teil der analytischen Testvorrichtung bildet, umfassend eine Öffnung (204), um die Detektionszone zu zeigen, und eine weitere Öffnung (205), um die Kontrollzone zu zeigen.

5. Assay nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der poröse Träger einen Streifen oder eine Lage porösen Materials umfaßt.

6. Assay nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das poröse Material Nitrocellulose ist.

7. Assay nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt hCG ist.