CH628009A5 - Verfahren zur herstellung von optisch aktiven alpha-hydroxycarbonsaeuren. - Google Patents

Verfahren zur herstellung von optisch aktiven alpha-hydroxycarbonsaeuren. Download PDF

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CH628009A5
CH628009A5 CH921877A CH921877A CH628009A5 CH 628009 A5 CH628009 A5 CH 628009A5 CH 921877 A CH921877 A CH 921877A CH 921877 A CH921877 A CH 921877A CH 628009 A5 CH628009 A5 CH 628009A5
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Yasuji Suhara
Hiromi Maruyama
Toyoaki Sawada
Mayumi Ogawa
Kazuteru Yokose
Morio Fujiu
Kimihiro Watanabe
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Hoffmann La Roche
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven a-Hydroxycarbonsäuren, insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von optisch reinen D- oder L-a-Hydroxycarbonsäuren.
Die Herstellung von optisch aktiven a-Hydroxycarbonsäuren wurde bisher durch Racematspaltung von D,L-a-Hydroxycarbonsäuren mit Hilfsmitteln, wie optisch aktiven Aminen, durchgeführt. Dieses bekannte Verfahren hat sich jedoch als unwirtschaftlich erwiesen, insbesondere weil die Hilfsmittel kostspielig sind und die Auftrennung kompliziert ist.
Nach dem erfindungsgemässen Verfahren ist es nun möglich, optisch reine a-Hydroxycarbonsäuren mit hoher Ausbeute in sehr einfacher Weise zu erhalten. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine D,L-a-Hydroxycar-bonsäure der allgemeinen Formel
R-CH-COOH t
I 1
OH
worin R einen verzweigten oder geradkettigen Alkylrest mit 1-13 C-Atomen oder einen Pyridylrest darstellt, oder ein Salz davon mittels enantiospezifische Dehydrogenaseaktivität aufweisenden, zu den Genera Streptomyces, Pseudomonas oder Bacillus oder zur Coryneformgruppe gehörenden Mikroorganismen asymmetrisch zur a-Ketocarbonsäure bzw. zu einem Salz davon dehydriert, aus einem erhaltenen Salz die Säure freisetzt und schliesslich das nicht dehydrierte Enantiomere der a-Hydroxycarbonsäure aus dem Reaktionsmedium isoliert.
Die im Reaktionsmedium enthaltene a-Ketocarbonsäure kann gegebenenfalls isoliert, zur D,L-Hydroxycarbonsäure hydriert und diese als Ausgangsmaterial in den Prozess zurückgeführt werden.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird die erhaltene a-Ketocarbonsäure in an sich bekannter Weise zur a-Hydroxycarbonsäure reduziert und diese als Ausgangsmaterial in das Verfahren zurückgeführt.
Typische Beispiele von racemischen a-Hydroxycarbonsäuren der Formel I sind 2-Hydroxypropionsäure, 2-Hydroxybut-tersäure, 2-Hydroxyvaleriansäure, 2-Hydroxy-3-methyIbutter-säure, 2-Hydroxycapronsäure, 2-Hydroxy-4-methylvalerian-säure, 2-Hydroxy-3,3-dimethylbuttersäure, 2-Hydroxyheptylsäure, 2-Hydroxy-4-methylcapronsäure, 2-Hydroxycaprylsäure, 2-Hydroxypelargonsäure, 2-Hydroxydecansäure, 2-Hydro-xyundecansäure, 2-Hydroxydodecansäure, 2-Hydroxytridecansäure, 2-Hydroxytetradecansäure, 2-Hydroxypentadecansäure, a -Hydroxy-3 -pyridylessigsäure u. dgl.
Die im erfindungsgemässen Verfahren verwendbaren Mikroorganismen umfassen die zu den Genera Streptomyces, Pseudomonas oder Bacillus oder zur Coryneformgruppe gehörenden, enantiospezifische Dehydraseaktivität aufweisenden Mikroorganismen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck «enantiospezifische Dehydraseaktivität» die Fähigkeit, eines der Enantiomeren einer D,L-a-Hy-droxycarbonsäure der Formel I oder eines Salzes davon durch asymmetrische Dehydrierung selektiv in die entsprechende a-Ketocarbonsäure oder ein Salz davon überzuführen, während das andere Enantiomere in Form einer optisch aktiven a-Hydroxycarbonsäure oder eines Salzes davon übrig bleibt. Der Mikroorganismus kann in Form der Gärbrühe oder in Form eines Extraktes davon verwendet werden.
Bevorzugte im erfindungsgemässen Verfahren verwendbare Stämme sind die folgenden, aus Bodenproben von verschiedenen Gegenden von Japan isolierten Bakterien und Ac-tinomyceten sowie mit diesen verwandte Stämme und Varianten davon. In der nachstehenden Tabelle sind die taxonomi-schen Merkmale solcher Bakterien sowie der Fundort angegeben. Alle in dieser Tabelle erwähnten Bakterien sind im Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and Technology, Chiba, Japan unter den angegebenen FERM-P-Nummern deponiert worden. Entsprechende Kulturen sind ebenfalls in USA deponiert: die NRRL-Nummern beziehen sich auf in United States Department für Landwirtschaft, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois, deponierte Kulturen, die ATCC-Num-mern auf Kulturen, welche in American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, deponiert wurden.
Der jeweilige Tag der Hinterlegung der nachstehend aufgeführten Kulturen ist wie folgt:
FERM-P Nr. 3164: 18. Juli 1975
NRRL B-l 1084: 7. März 1977 FERM-P Nr. 3165: 18. Juli 1975 NRRL 11085: 7. März 1977 FERM-P Nr. 3169: 18. Juli 1975
ATCC 31301: I.Juli 1977 FERM-P Nr. 3166: 18. Juli 1975 NRRL B-l 1086: 7. März 1977
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
3
628 009
FERM-P Nr. 3167: 18. Juli 1975
ATCC 31303: I.Juli 1977
ATCC 31300: 1. Juli 1977
FERM-P Nr. 3659: 29. Juli 1976
FERM-P Nr. 3657: 29. Juli 1976
NRRL 11090: 7. März 1977
NRRL B-l 1088: 7. März 1977
FERM-P Nr. 3170: 18. Juli 1975
FERM-P Nr. 3168: 18. Juli 1975
s ATCC 31302: 1. Juli 1977
NRRL B-l 1087: 7. März 1977
FERM-P Nr. 3160: 18. Juli 1975
FERM-P Nr. 3658: 29. Juli 1976
NRRL 11083: 7. März 1977
NRRL 11089: 7. März 1977
FERM-P Nr. 3660: 29. Juli 1976
FERM-P Nr. 3172: 18. Juli 1975
NRRL 11091: 7. März 1977
1U
A-1) Morphologische Eigenschaften und Kultureigenschaften von grampositiven, Sporen bildenden Stäbchen
Stämme
NRS-85KH20B
NRS-112KH25B
NRS-137KH20B
(FERM-P No. 3164)
(FLRM-PNo. 316?)
(FERM-P No. 3169)
Eigenschaften
(NRRL B-l 1084)
(NRRL 11085)
(ATCC 31301)
a) Morphologie
1 Form
Stäbchen
Stäbchen
Stäbchen
2 Grösse («)
1,4-1,8x2,0-4,0
0,8-1,2x3,0-7,0
0,5-1,0x1,5-4,0
3 Pleomorphismus
-
-
—
4 Motilität
(-)
+
+
5 Sporen
+
+
+
(I) Grösse (u)
0,8-1,0x1,5-2,0
0,8-1,0x1,5-2,0
0,4-0,8x0,8-1,2
(II) Form elliptisch elliptisch elliptisch
(III) Ausdehnung des
Sporangiums
-
-
-
(IV) Position
Zentrum
Zentrum
Zentrum
6 Gram-Färbung
+
+
+
7 Säurefeste Färbung
—
-
-
b) Kultureigenschaften
1 Agar-Nährplatte
Form konvex, ganzrandig flach, wellig flach, schizoid
glatt rauh rauh
Opazität lichtdurchlässig undurchsichtig lichtdurchlässig
Farbe der Kolonie hellgelb bis hellbraun crème hellgelb bis crème
Lösliches Pigment bräunlich keines keines
2 Schrägagarkultur
Wachstum reichlich reichlich mässig
Form filiform ausbreitend stachelig
Glanz matt matt matt
Farbe der Kolonie crème bis hellbraun weiss-crème hellbraun bis orange
Lösliches Pigment braun keines keines
3 Bouillonflüssigkeit
Wachstum massig massig reichlich
Oberflächen-
Wachstum reichlich keines gering
Niederschlag gering reichlich mässig
Pigmentation keine keine keine
4 Gelatine-Stichkultur
Wachstum reichlich sehr reichlich reichlich
Verflüssigung
+
+
+
5 Lackmusmilch
Lackmus
—
—
alkalisch
Peptonisierung
+
+
-
Koagulation
—
—
—
A-2) Physiologische Eigenschaften von grampositiven, Sporen bildenden Stäbchen
Stämme
NRS-85KH20B
NRS-112KH25B
NRS137KK20B
(FERM-P No. 3164)
(FERM-P No. 3165)
(FERM-P No. 3169)
Eigenschaften
(NRRL B-l 1084)
(NRRL 11085)
(ATCC 31301)
c) Physiologische
Eigenschaften
1 Nitratreduktion
-
+
+
2 Ni trat respirati on
-
-
-
3 MR-Test
—
+
—
628 009
4
A-2) Physiologische Eigenschaften von grampositiven. Sporen bildenden Stäbchcn
Stämme
:nschaften
NRS-85KH20B i FF.RM-P No. 3164) (NRRL B- ! 1084)'
N'RS-l 12KH25B ( FERM-P No. 31651 (NRRL 11085)
NRS137KH2ÜB (FERM-P No. 3169) Î ATCC 31301 !
4 VP-Test
—
—
—
5 Indolproduktion
-
-
-
6 H2S-Produktion
—
—
—
7 Stärkehydrolyse
+
+
-
8 Citratverwertung
a. Koser-Medium
+
+
+
b. Christensen-
Medium
+
-
+
9 Verwertung von
NaN03
+
+
+
(NH4)2S04
+
+
+
Harnstoff
+
+
+
Na-Glutamat
+
+
+
10 Pigmentbildung
+ (unlöslich)
-
-
11 Urease
—
—
+
12 Oxidase
+
+
+
13 Katalase
+
+
+
14 Wachstumbereich
pH
5,0-9,5
5,0-10,0
5,0-10,0
Temperatur
20-45°C
20-37° C
10-40° C
15 Aerobes Wachstum
+
+
+
Anaerobes Wachstum
+
+
+
16 O-F-Test
Fermentation
Fermentation
Fermentation
17 Säure und Gas
Säure
Gas
Säure Gas
Säure Gas
1) L-Arabinose
+
-
- -
- -
2) D-Xylose
+
-
- ■ -
- -
3) D-Glucose
+
—
+
— —
4) D-Mannose
-
-
- -
- -
5) D-Fructose
+
-
+
- -
6) D-Galactose
+
-
- -
- -
7) Maltose
+
-
+ -
- -
8) Saccharose
+
-
+ -
- -
9) Lactose
+
—
- . -
- -
10) Trehalose
+
-
+ -
- -
11) D-Sorbit
-
-.
- -
- -
12) D-Mannit
+
-
- -
- -
13) Inosit
(+)
-
+
(-)
14) Glycerin
+
-
+
(-)
15) Stärke
+
-
+ -
- -
18 Casein-Hydrolyse
+
+
+
19 Tyrosin-Hydrolyse
/
/
+
Herkunft der Bodenprobe
Nerima-ku, Tokyo, Japan
Tobata-ku, Kita-Kyushu-shi, Japan
Kiyosato, Nagano Pref., Japan
B-l) Morphologische Eigenschaften und Kultureigenschaften von pleomorphen Bakterien
Eigenschaften
Stämme NRS-112KH31B
(FERM-P No. 3166) (NRRL B-l 1086)
NRS- 129KH5B2 (FERM-P No. 3167) (ATCC 31300)
NRS- 130-KH-20B (FERM-P No. 3657) (NRRL B-l 1088)
NRS-135KH9B (FERM-P No. 3168) (NRRL B-l 1087)
a) Morphologie
1 Pleomorphismus
2 Form
3 Grösse («) 24Std.
48 Std.
4 Motilität
5 Gram-Färbung
6 Säurefeste Färbung
7 Sporen
+
Stäbchen werden kokkoide Zellen 0,5-1,0x3,0-5,0
0,5-0,8x1,0-1,5 +
+
Stäbchen werden kokkoide Zellen 0,5-1,0x3,0-5,0
0,5-0,8x1,0-1,5 +
Stäbchen werden kokkoide Zellen 0,5-1,0x3,0-5,0
0,5-0,8x1,0-1,5 +
+
Stäbchen werden kokkoide Zellen 1,2-1,5x2,5-6,0
0,5-1,0x1,0-1,5 +
5 628 009
B-l ) Morphologische Eigenschaften und Kultureigenschatten von pleomorphen Bakterien
Stämme
Eigenschaften
N'RS-l 12KH31B (FERM-P No. 3166) (NRRL ES-11086)
NRS-129KH5B2 (FERM-P No. 3167; (ATCC 31300)
NRS-130-KH-20B (FERM-P No. 365" i (NRRL B-l 10881
NRS-I35KH9B (FERM-P No. 316*) (NRRL B-110871
b) Eigenschaftender Kultur
1 Agar-Nährplatte Form
Opazität
Farbe der Kolonie Lösliches Pigment
2 Schrägagarkultur Wachstum Form
Glanz
Farbe der Kolonie Lösliches Pigment
3 Bouillonflüssigkeit Wachstum Oberflächen-Wachstum Niederschlag Pigmentation
4 Gelatine-Stichkultur Wachstum konvex, ganzrandig glatt lichtdurchlässig crème keines reichlich filiform glänzend crème-weiss keines mässig keines gering keine mässig bis reichlich konvex, ganzrandig glatt lichtdurchlässig crème keines reichlich filiform glänzend crème-weiss keines mässig keines gering keine mässig bis reichlich konvex, ganzrandig glatt lichtdurchlässig crème-weiss keines reichlich filiform glänzend crème-weiss keines mässig keines gering keine mässig bis reichlich konvex, ganzrandig glatt undurchsichtig crème keines reichlich filiform glänzend crème-weiss keines reichlich reichlich mässig keine mässig
Verflüssigung + + + — 5 Lackmusmilch
Lackmus alkalisch alkalisch alkalisch alkalisch
Peptonisierung — — — —
Koagulation — — — —
B-2) Physiologische Eigenschaften von pleomorphen Bakterien
Stämme NRS-112KH31B NRS-129KH5B2 NRS-130KH20B NRS-135KH9B
(FERMPNo. 3166) (FERM; No. 3167) (FERMP No. 3657) (FERM-P No. 3168)
Eigenschaften (NRRL B-l 1086) (ATCC 31300) (NRRL B-l 1088) (NRRL B-l 1087)
c) Physiologische Eigenschaften
1 Nitratreduktion
2 Nitratrespiration
3 MR-Test
4 VP-Test
5 Indolproduktion
6 H2S-Produktion
7 Stärkehydrolyse
8 Citratverwertung a. Moser-Medium b. Christensen-Medium
9 Verwertung von NaN03 (NH4)2S04 Harnstoff Na-Glutamat
10 Pigmentbildung
11 Urease Oxidase Katalase
Wachstumbereich pH
Temperatur Aerobes Wachstum Anaerobes Wachstum
+
12
13
14
15
+ + + + + +
+
5,0-9,5
15-37° C +
+ + + + + +
+
5,0-9,0
10-37° C +
+
+
+
+
+
+
(-)
+
5,0-10,0
10-37° C +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
5,0-10,0
5-30° C +
+
628 009
6
B-2) Physiologische Eigenschaften von pleomorphen Bakterien
Eigenschaften
Stämme NRS-112KH31B
(FERMP No. 3166) (NRRL B-l 1086)
NRS-129KH5B2 (FERM; No. 3167) (ATCC 31300)
NRS-130KH20B (FERMP No. 3657) (NRRL B-11088)
NRS-135KH9B (FERM-P No. 3168) (NRRL B-l 1087)
16 O-F-Test
17 Säure und Gas
(Fermentation) Säure Gas
20 Wachstum in 5 % NaCl
21 Wachstum in 10% NaCl
Herkunft der Bodenprobe
(Fermentation) Säure Gas
+
Tobata-ku, Kitakyushu, Japan
(Fermentation) Säure Gas
+
Shinano-Ohmachi Nagano-Pref.,Japan
+
Fermentation Säure Gas
1)
L-Arabinose
- -
- -
- -
- -
2)
D-Xylose
+
(+)
(+)
(+)
3)
D-Glucose
+
+
(+)
+ -
4)
D-Mannose
- -
- " -
(+)
- -
5)
D-Fructose
+ -
+ -
(+)
+ -
6)
D-Galactose
+ -
(+)
- -
7)
Maltose
- -
(+)
- -
8)
Saccharose
- -
— -
(+)
+
9)
Lactose
-
- -
- -
10)
Trehalose
• -
(+)
- -
+ -
11)
D-Sorbit
+
+ -
- -
+ -
12)
D-Mannit
- -
- —
- --
+
13)
Inosit
- -
(+)
(+)
(+)
14)
Glycerin
- -
+
(+)
+ -
15)
Stärke
- -
- -
- -
- -
18 Caseinhydrolyse
-
-
+
-
19 DN-ase
—
—
+
—
Fuji-shi,
Shizuoka-Pref., Japan
+
Shosenkyo, Yamanashi-Pref., Japan
C-1) Morphologische Eigenschaften und Eigenschaften der Kultur von gramnegativen Stäbchen
Stämme
NRS-137CzH5B
NRS-146KH6B
NRS-140KH27B
NRS-139KH6B
(FERM-P No. 3658)
(FERM-P No. 3172)
(FERM-P No. 3659)
(FERM-P No. 3170)
Eigenschaften
(NRRL 11089)
(ATCC 31303)
(NRRL 11090)
(ATCC 31302)
a) Morphologie
1 Form
Stäbchen
Stäbchen
Stäbchen
Stäbchen
2 Grösse (u)
0,4-0,6x1,5-2,5
0,5-0,8x1,5-3,0
0,5-0,8x2,0-3,5
0,4-0,7x1,0-1,5
3 Pleomorphismus
-
-
-
-
4 Motilität
+
+
+
+
5 Sporen
-
-
-
-
6 Gram-Färbung
-
—
—
—
7 Säurefeste Färbung
—
—
—
—
b) Eigenschaften der Kultur
1 Agar-Nährplatte
Form konvex, ganzrandig gebuckelt, ganzrandig konvex, ganzrandig konvex, ganzrandig
glatt runzlig runzlig glatt
Opazität lichtdurchlässig lichtdurchlässig lichtdurchlässig undurchsichtig
Farbe der Kolonie hellgelb bis orange hellgelb bis orange hellgelb crème-weiss
Lösliches Pigment keines keines keines keines
2 Schrägagarkultur
Wachstum reichlich reichlich reichlich mässig
Form filiform filiform filiform filiform
Glanz glänzend glänzend glänzend glänzend
Farbe der Kolonie hellbraun bis orange hellbraun bis orange hellbraun crème-weiss
Lösliches Pigment keines keines keines keines
3 Bouillonflüssigkeit
Wachstum reichlich reichlich reichlich mässig
Oberflächenwachstum gering reichlich reichlich reichlich
Niederschlag mässig gering mässig gering
Pigmentation leicht gelblich leicht gelblich keine keine
4 Gelatine-Stichkultur
Wachstum mässig bis reichlich mässig mässig mässig
Verflüssigung
+
-
-
—
7 628 009
C-1 ) Morphologische Eigenschaften und Eigenschaften der Kultur von gramnegativen Stäbchen
Stämme
NRS-137CzH5B
NRS-146KH6B
NRS-140KH27B
NRS-139KH6B
(FERM-P No. 3658)
(FERM-P No. 3172)
(FERM-P No. 3659)
(FERM-P No. 3170)
Eigenschaften
(NRRL 11089)
(ATCC 31303)
(NRRL U 090)
(ATCC 31302)
5 Lackmusmilch
Lackmus alkalisch alkalisch alkalisch alkalisch
Peptonisation
+
-
-
-
Koagulation
"
"
—
C-2) Physiologische Eigenschaften von gramnegativen Stäbchen
Stämme
NRS-137CzH5B
NRS-146KH6B
NRS-140KH27B
NRS-139KH6B
(FERM-P No. 3658)
(FERM-P No. 3172)
(FERM-P No. 3659)
(FERM-P No. 3170)
Eigenschaften
(NRRL 11089)
(ATCC 31303)
(NRRL 11090)
(ATCC 31302)
c) Physiologische
Eigenschaften
1 Nitratreduktion
—
+
—
—
2 Nitratrespiration
-
-
-
-
3 MR-Test
—
—
—
4 VP-Test
—
—
—
—
5 Indolproduktion
-
-
—
—
6 H2S-Produktion
—
—
—
—
7 Stärkehydrolyse
-
-
-
8 Citratverwertung
a. Koser-Medium
■
+
+
+
b. Christensen-
Medium
+
+
+
+
9 Verwertung von
NaN03
+
+
+
+
(NH4)2S04
+
+
+
+
Harnstoff
+
+
+
+
Na-Glutamat
+
+
+
+
10 Pigmentbildung fluoreszierend fluoreszierend fluoreszierend keine
löslich löslich löslich keine
11 Urease
—
—
—
+
12 Oxidase
+
+
+
+
13 Katalase
+
+
+
+
14 Wachstumbereich
pH
5,0-10,0
5,0-10,0
5,0-9,0
5,0-9,5
Temperatur
5-30° C
5-37° C
5-37° C
20-30° C
15 Aerobes Wachstum
+
+
+
+
Anaerobes Wachstum
+
4*
4*
~h
16 O-F-Test
Oxydation
Oxydation
Oxydation
Oxydation
17 Säure und Gas
Säure Gas
Säure Gas
Säure Gas
Säure Gas
1) L-Arabinose
+
+
+ -
+ -
2) D-Xylose
+ -
+
+
+
3) D-Glucose
+
+ -
+
+
4) D-Mannose
+
+
+
+
5) D-Fructose
(-)
+ -
+
+
6) D-Galactose
+
+
+
+
7) Maltose
- —
— —
— —
+
8) Saccharose
— —
— —
(-)
+
9) Lactose
(-)
— —
+ -
10) Trehalose
— —
(-)
+ -
11) D-Sorbit
(+)
- -
(-)
+
12) D-Mannit
(+)
- -
(-)
+
13) Inosit
(+)
- -
(-)
+ -
14) Glycerin
(+)
+
+
+ -
15) Stärke
— -
— —
— —
— —
18 Caseinhydrolyse
+
-
-
—
19 Argininhydrolyse
+
+
+
-
Herkunft der Bodenprobe
Kiyosato, Nagano
Sarugakyo, Gumma
Shimada-shi
Kiyosato, Nagano
Pref., Japan
Pref., Japan
Shizuoka Pref., Japan
Pref., Japan
628 009
Aus diesen Resultaten geht hervor, dass man diese Stämme anhand von Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (8th Ed., 1974; 7th Ed., 1957); Riichi Sakazaki, «Identification of Medicai Bacteria», Kindai Shuppan, 1971; und Kazu-hiko Yamada and Kazuo Komagata., J. Gen. Appi. Microbiol., 18,417,1972 wie folgt identifizieren kann:
1. Stamm FERM-P Nr. 3164 (NRRL B-11084):
Eine aus Glucose anaerob säurebildende Variante von Bacillus megaterium.
2. Stamm FERM-P Nr. 3165 (NRRL 11085):
Bacillus species, mit gewisser Ähnlichkeit mit B. circulans und B. firmus. Der Stamm unterscheidet sich jedoch vom er-steren Stamm durch die Morphologie der Sporen und vom letzteren Stamm durch das anaerobe Wachstum.
2. Stamm FERM-P Nr. 3169 (ATCC 31301):
Als Bacillus freudenreichii identifiziert.
4. Stämme FERM-P Nr. 3166 (NRRL B-l 1086), FERM-P Nr. 3167 (ATCC 31300), FERM-P Nr. 3657 (NRRL B-l 1088) und FERM-P Nr. 3168 (NRRL 11087):
Diese vier Stämme sind aerob bis fakultativ anaerob, grampositiv, nichtbeweglich, nicht-sporenbildend und nichtsäurefest, gerade bis leicht gekrümmte Stäbchen in der ersten Wachstumsphase, und kugelförmig bis eiförmig nach mehr als 1 Tag Wachstum. Diese Eigenschaften zeigen, dass alle diese Stämme der sogenannten Coryneform-Gruppe angehören. Bekanntlich (siehe z.B. Yamada, Komagata, J. Gen. Appi. Microbiol., 18, 417, 1972) ist es schwierig, für diese Gruppe die Familie und Gattung anzugeben. Jedoch ist die folgende Identifizierung anhand von Bergey's Manual möglich. Die verschiedenen Gattungen der Coryneform-Gruppe unterscheiden sich alle von der Gattung Arthrobacter durch die Säureproduktion aus Glucose, Fructose und anderen Zuckern, von der Gattung Kuruthia durch die fehlende Motilität, von der Gattung Microbacterium dadurch, dass alle diese Stämme beim Erhitzen in abgerahmter Milch auf 72 °C während 15 Minuten nicht überleben, und von der Gattung Cellulomonas durch die Unfähigkeit, Cellulose zu verwerten.
Stamm FERM-P Nr. 3168 (NRRL B-11087):
Aus den in der Tabelle angegebenen Eigenschaften dieses Stammes geht hervor, dass er mit Corynebacterium callunae, Brevibacterium lactofermentum, B. vitaruman und C. hydro-carboclastus sehr nah verwandt ist. Die drei letzteren Stämme unterscheiden sich jedoch vom Stamm Nr. 3168 durch ihre pleomorphen Eigenschaften und durch Granulatbildung. Trotz des Unterschiedes in der Verwertung von Zuckern und in der Säureproduktion ist der Stamm FERM-P Nr. 3168 (NRRL B-11087) am nächsten mit C. hydrocarboclastus verwandt und wurde daher als eine Variante von C. hydrocarboclastus identifiziert.
Stamm FERM-P Nr. 3657 (NRRL B-l 1088):
Die Eigenschaften dieses Stammes, nämlich fehlende Bildung von Granula, Säureproduktion, hydrolytische Aktivitäten gegen Gelatine und Casein, positive DN-ase, negative Urease und Fehlen von Wachstum in 10% NaCl lassen darauf schlies-sen, dass der Stamm Nr. 3657 mit Brevibacterium albidum sehr nah verwandt ist. Trotz einiger Unterschiede in der Säureproduktion aus D-Mannose, Saccharose, Inosit und Glycerin wurde der Stamm FERM-P Nr. 3657 (NRRL B-l 1088) auf Grund der Analogie zwischen allen anderen Eigenschaften als B. albidum identifiziert.
Stämme FERM-P Nr. 3166 (NRRL B-l 1086) und FERM-P Nr. 3167 (ATCC 31300):
Diese beiden Stämme sind sich sehr ähnlich und nicht voneinander unterscheidbar. Unter den in Bergey's Manual (7. und 8. Ausgabe) und Komagata et al. (J. Gen. Appi. Microbiol., 18, 399, 1972) beschriebenen Arten wurde Brevibacterium tegmenticola am nächsten verwandt gefunden. Da sich jedoch diese Stämme von B. tegmenticola durch die Grösse der Zelle, die Reaktionen in Lackmusmilch und die Säureproduktion aus Maltose und Saccharose unterscheiden, kann hier nicht von Identität gesprochen werden. Es scheint daher zweckmässig, diese Stämme als neue Arten, die eine gewisse Ähnlichkeit mit B. tegmenticola haben, anzusehen.
5. Stamm FERM-P Nr. 3658 (NRRL 11089):
Identifiziert als Pseudomonas fluorescens.
6. Stamm FERM-P Nr. 3172 (ATCC 31303) und FERM-P Nr. 3659 (NRRL 11090):
Identifiziert als Pseudomonas putida. Es wurden einige Unterschiede zwischen den Eigenschaften der beiden Stämme, wie z.B. der Nitratreduktion, festgestellt. Da man feststellen konnte, dass die Nitratreduktion bei 16—85% der Stämme dieser Art positiv war, kann der Stamm FERM-P Nr. 3659 (NRRL 11090) als eine Nitrat nicht-reduzierende Variante von Ps. putida angesehen werden.
7.Stamm FERM-P Nr. 3170 (ATCC 31302):
Pseudomonas species. Unter verschiedenen Pseudomonas-stämmen ist der Stamm FERM-P Nr. 3170 (ATCC 31302) am nächsten mit Ps. cepacia verwandt. Auf Grund der Unterschiede in der Gelatineverflüssigung, der Caseinhydrolyse, des Wachstums bei 42 °C und der Nitratreduktion kann der Stamm nicht als identisch mit Ps. cepacia angesehen werden.
Die isolierten Actinomyceten haben folgende Wachstumseigenschaften:
1. Stamm FERM-P Nr. 3160 (NRS-79KH-1A, NRRL 11083):
Dieser aus einer Bodenprobe von Uwajima-shi, Ehime Pref., Japan, isolierte Stamm entwickelt sich gut auf verschiedenen ISP-Agarmedien für Actinomyceten und bildet ein gutentwickeltes Luftmycel mit sporenbildenden Hyphen. Die Sporen, die in Form von Ketten von etwa 50 Sporen pro Kette vorkommen, sind zylindrisch, haben eine stachlige Oberfläche und eine Grösse von 0,4 ~ 0,8 x 0,8 — 1,4,«. Die Bildung von irgendeinem anderen spezifischen Organ wurde nicht beobachtet.
Auf den meisten getesteten Agarmedien ist das Wachstum (vegetatives Mycel) leicht bräunlich-grau bis hellbraun und das Luftmycel ist leicht grau bis grau. Das lösliche Pigment ist bräunlich bis rötlich. Die Bildung von Melanin-artigem Pigment wurde nicht beobachtet.
2. FERM-P Nr. 3660 (NRS-125KH-27A, NRRL 11091):
Dieser aus einer Bodenprobe von Suwa-shi, Nagano Pref.,
Japan isolierte Stamm entwickelt sich auch gut auf verschiedenen ISP-Agarmedien. Aus einem gut entwickelten vegetativen Mycel bildet sich ein relativ langes, gerades oder gekrümmtes Luftmycel. Weder Wirbel- noch Spiralbildungen werden beobachtet. Die Sporen, in Ketten von mehr als 50 Sporen pro Kette, sind zylindrisch, haben eine glatte Oberfläche und eine Grösse von 0,5-0,7 x 0,8—1,2 u.
Das Wachstum ist schwach gelblich-braun bis schwach gelb und das Luftmycel ist weiss. Es bildet sich ein gelbliches lösliches Pigment. Es wurde kein Melanin-artiges Pigment beobachtet.
Aus den obigen Eigenschaften geht klar hervor, dass die Stämme FERM-P Nr. 3160 (NRRL 11083) und FERM-P Nr. 3660 (NRRL 11091) typische Streptomyces Species sind.
Die erfindungsgemässe asymmetrische Dehydrierung kann beispielsweise dadurch durchgeführt werden, dass man die Kulturbrühe oder kultivierte Zellen der Mikroorganismen mit einer DL-a-Hydroxycarbonsäure oder einem Salz hiervon zusammenbringt. Die Kulturbrühe kann durch Beimpfen eines zweckmässigen Mediums mit dem Mikroorganismus hergestellt werden. Das Kulturmedium kann beispielsweise Fleischextrakt, Hefeextrakt, Pepton, Maisquellwasser, weitere üblicherweise verwendete Natursubstanzen oder Gemische davon sowie Saccharide oder andere Kohlenstoffquellen oder organische oder anorganische, Stickstoff enthaltende Verbindungen,
8
s io
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
9
628 009
wie Aminosäuren oder Salpetersäure, enthalten. Nötigenfalls kann das pH des Kulturmediums durch Zugabe von geeigneten Salzen, wie Natriumphosphat oder Natriumchlorid oder eines anderen Metallsalzes, auf 7 gestellt werden. Es können Sub-merskulturen, Schüttelkulturen oder sationäre Kulturen verwendet werden. Die Kultivierung wird jedoch vorzugsweise unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Die Kultivierungstemperatur liegt im allgemeinen im Bereich von 20-40 °C, vorzugsweise im Bereich von 25—35 °C. Die Kultivierung dauert zweckmässig 20-80 Stunden. Unter den oben beschriebenen Kultivierungsbedingungen erreicht das Wachstum der Stämme die stationäre Phase. Eine DL-a-Hydroxycarbonsäure der allgemeinen Formel I oder ein Salz hiervon kann als Substrat der Kulturbrühe zugesetzt werden, in der das Wachstum des Stammes die stationäre Phase erreicht hat. Die Konzentration des Substrats ist zweckmässig 1—200 mg/ml, vorzugsweise 3-120 mg/ml. Die asymmetrische Dehydrierung kann unter den oben beschriebenen Bedingungen durch Fortsetzung der Submerskultur, der Schüttelkulturen oder der stationären Kultur durchgeführt werden. Die Reaktionszeit hängt unter anderem von der Spezies und dem Stamm des verwendeten Mikroorganismus, der Zusammensetzung des Mediums, der Natur und der Konzentration des Substrats ab. Im allgemeinen genügt jedoch eine Reaktionszeit von 70-360 Stunden. Das Ende der Reaktion kann durch Messung der Menge an Reaktionsprodukt mittels gaschromatographischen oder kolorime-trischen Methoden, wie weiter unten beschrieben, bestimmt werden.
Die asymmetrische Dehydrierung kann unter den oben beschriebenen Bedingungen auch durch Zusatz des Substrats zum Kulturmedium und darauffolgendes Beimpfen mit den Mikroorganismen vorgenommen werden.
Die asymmetrische Dehydrierung kann ferner durch Zusammenbringen behandelter Zellsubstanz mit DL-a-Hydroxy-carbonsäuren oder Salzen hiervon durchgeführt werden. Der Ausdruck «behandelte Zellsubstanz» bezeichnet alle Materialien, die durch Behandlung der Mikroorganismen erhalten wurden und fähig sind, die enantiospezifische Dehydrogenaseaktivität beizubehalten oder zu erhöhen. Solche Materialien sind beispielsweise das Mycel oder Zellen, die aus der Kulturbrühe isoliert und gewaschen wurden, oder lyophilisierte Pulver davon; in an sich bekannter Weise aus den kultivierten Zellen oder aus dem Mycel erhaltener zellfreier Extrakt; oder gereinigte oder teilweise gereinigte Dehydrogenasepräparate, welche in an sich bekannter Weise durch Reinigung aus den besagten zellfreien Extrakten erhalten wurden. Falls eine solche behandelte Zellsubstanz verwendet wird, kann die asymmetrische Dehydrierung in einer wässrigen Lösung, beispielsweise einer Pufferlösung oder einem frischem Medium, durchgeführt werden. Das pH der Reaktionslösung liegt gewöhnlich zwischen 7 und 8,5, insbesondere bei etwa 8. Die Reaktionstemperatur liegt zweckmässig bei 20-60 °C, insbesondere bei 25-50 °C. Das Ende dieser Reaktion kann durch Messung der Menge und der optischen Reinheit der zurückbleibenden a-Hydroxycarbonsäure sowie der Menge der in der Kulturbrühe oder dem Reaktionsgemisch gebildeten Ketocarbonsäure mittels gaschromatographischer oder kolorimetrischer Methoden bestimmt werden.
Durch die erfindungsgemässe asymmetrische Dehydrierung wird eines der Enantiomeren der DL-a-Hydroxycarbonsäure der allgemeinen Formel I oder ein Salz hiervon selektiv in die entsprechende a-Ketocarbonsäure oder ein Salz hiervon übergeführt, während das andere Enantiomere in Form der optisch aktiven a-Hydroxycarbonsäure oder eines Salzes davon zurückbleibt. Ob die zurückbleibende optisch aktive Substanz in D- oder L-Form vorliegt, hängt von der Natur des verwendeten Mikroorganismus ab.
Wünscht man die D-Form, können folgende Mikroorganismen verwendet werden:
- Bacillus megaterium (FERM-P Nr. 3164, NRRL B-l 1084)
- Bacillus sp. (FERM-P Nr. 3165, NRRL 11085)
- Pseudomonas fluorescens (FERM-P Nr. 3658, NRRL 11089)
- Brevibacterium sp. verwandt mit B. tegmenticola (FERM-P Nr. 3166, NRRL B-11086 und FERM-P 3167, ATCC 31300)
- Brevibacterium albidum (FERM-P Nr. 3657, NRRL B-11088)
- Streptomyces sp. (FERM-P Nr. 3160, NRRL 11083)
Wünscht man die L-Form, können folgende Mikroorganismen verwendet werden:
- Bacillus freudenreichii (FERM-P Nr. 3169, ATCC 31301)
- Pseudomonas putida (FERM-P Nr. 3172, ATCC 31303 und FERM-P 3659, NRRL 11090)
- Pseudomonas sp. (FERM-P Nr. 3170, ATCC 31302)
- Corynebacterium hydrocarboclastus var. (FERM-P Nr. 3168, NRRL B-11087)
- Streptomyces sp. (FERM-P Nr. 3660, NRRL 11091)
Falls die Reaktionsprodukte in Form von Salzen erhalten werden, können letztere durch Zusatz einer Säure in die freien optisch aktiven a-Hydroxycarbonsäuren und a-Ketocarbon-säuren übergeführt werden.
Die optisch aktiven a-Hydroxycarbonsäuren und die a-Ke-tocarbonsäuren können in an sich bekannter Weise, beispielsweise auf Grund von Löslichkeitsunterschieden, durch chromatographische Fraktionierung mittels eines Ionentauscher-ftarzes oder Silicagel oder fraktionierte Destillation, aus der Reaktionslösung isoliert werden. Die Verbindungen können auch mit Hydrazinen in an sich bekannter Weise behandelt werden, wobei die a-Ketocarbonsäuren selektiv in die Hydrazone übergeführt werden, welche durch übliche Fraktionie-rungsmethoden abgetrennt werden können.
Nach dem erfindungsgemässen Verfahren werden optisch reine D- oder L-a-Hydroxycarbonsäuren und a-Ketocarbonsäuren mit hoher Ausbeute in einfacher Weise erhalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird die erhaltene a-Ketocarbonsäure in an sich bekannter Weise hydriert und das Hydrierungsprodukt als Ausgangsmaterial in die asymmetrische Dehydrierung zurückgeführt. Die Hydrierung kann in an sich bekannter Weise, vorzugsweise mittels eines Katalysators, wie Raney-Nickel, durchgeführt werden. Falls bei der katalytischen Hydrierung Wasser als Lösungsmittel verwendet wird, wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat konzentriert und das Konzentrat kann dann direkt für die asymmetrische Dehydrierung verwendet werden.
Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltenen a-Hydroxycarbonsäuren können als Zwischenprodukte für die Herstellung von pharmazeutischen Produkten, beispielsweise von Penicillinen (vgl. die US-Patentschrift 3 839 322 und die Reissue davon Nr. 29 003 sowie die US-Patentschriften 3 956 323 und 3 957 758), Aminosäuren u.dgl., sowie als biochemische Reagenzien verwendet werden. Als wichtige Vertreter der besagten a-Hydroxycarbonsäuren können die D-und die L-Milchsäure genannt werden.
Die in den nachstehenden Beispielen verwendeten Medien sind wässrige Medien folgender Zusammensetzung:
Medium A (pH 7,0)
Glucose 0,1 %
Pepton 1,0%
Fleischextrakt 0,3 %
Natriumchlorid 0,5 %
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
628 009
10
Medium B (pH 7,0)
Glucose 0,1%
Maisquellwasser 2,0%
Die in den Beispielen angegebene Menge an verbleibender a-Hydroxycarbonsäure, deren optische Reinheit und die Menge an erhaltener a-Ketocarbonsäure kann durch folgende Methoden bestimmt werden.
1. Quantitative Bestimmung der 2-Hydroxycarbonsäuren in den Fermentationsbrühen
2,0 ml Fermentationsbrühefiltrat werden in einem 1,6 g Ammoniumsulfat enthaltendem 10 ml Zentrifugenglas aufge- . nommen, mit 10%iger Schwefelsäure angesäuert und dann mit 2,0 ml Äthylacetat extrahiert. 1,5 ml des Äthylacetatextraktes werden unter vermindertem Druck eingedampft. Dem Rückstand werden 2 ml Toluol zugesetzt und das Gemisch wird erneut zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 0,2 ml Pyridin gelöst und 0,1 ml Benzoylchlorid werden zugesetzt. Nach 20 Minuten bei Raumtemperatur wird das Gemisch im Eisbad abgekühlt, mit 1,0 ml eines 0,4% Diäthylterephthalat (interner Standard, I.S.) enthaltenden 5:1-Gemisches von Toluol und n-Propanol behandelt und 20 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Nach Zusatz von 2,0 ml Wasser wird das Gemisch geschüttelt und dann 5 Minuten unter 3000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Die Toluolschicht wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und ein Teil der Lösung (gewöhnlich 2 liX) wird unter den folgenden Bedingungen durch Gaschromatographie analysiert:
Temperatur: Kolonne 185° C, Injektor 225° C,
Detektor 205° C Säule: Glasschlange
Länge 2 m interner Durchmesser 3 mm Packung der Säule: 5 % QF- 1/chromosolve W, MMCS
80-900 mesh Trägergas: 30 ml/min Helium
Detektion: - FID
Die Retentionszeiten des I.S. und der Derivate der a-Hydroxycarbonsäuren, z.B. der a-Hydroxy-)'-methylvalerian-säure und der a-Hydroxyhexansäure, sind unter den obigen Bedingungen 4,4, 6,6 bzw. 7,8 Minuten. Die den Peaks zugehörigen Flächen werden mittels der Eichkurve in Konzentrationswerte umgerechnet.
2. Bestimmung der optischen Reinheit der a-Hydroxycarbonsäuren in Fermentationsbrühen
7 ml des Fermentationsbrühefiltrats werden mit 1 ml 10%iger Schwefelsäure angesäuert und mit 5 ml Äthylacetat extrahiert. 4 ml Teilmengen des Äthylacetatextrakts werden unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit 2 ml 4% HCl enthaltendem n-Propanol behandelt. Nach 3 Stunden bei Raumtemperatur wird das Gemisch unter vermindertem Druck eingedampft und die letzten Spuren von n-Propanol werden mittels Toluol entfernt. Dem Rückstand werden 0,2 ml L-(—)-Menthyloxycarbonyl-chloridlösung (hergestellt nach der Methode von J.W. Westley, J. Org. Chem. 33, 3798, 1968) und 0,2 ml Pyridin zugesetzt. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wird das Gemisch mit 2 ml kaltem Wasser behandelt. Dann werden 0,8 ml Toluol zugesetzt. Das Gemisch wird geschüttelt und zentrifugiert. Nach Trocknen mit Natriumsulfat wird ein Teil der Toluolpha-sen unter den gleichen Bedingungen wie für die quantitative Bestimmung der a-Hydroxycarbonsäuren durch Gaschromatographie analysiert. Beispiele von Retentionszeiten für einige aus a-Hydroxycarbonsäuren abgeleitete diastereomere Carbonate sind aus der nachstehenden Tabelle ersichtlich. Die optische Reinheit kann mittels folgender Gleichung ermittelt werden:
AL: Fläche des Peaks des L-Enantiomers AD: (Fläche des Peaks des D-Enantiomers)/k k: Verhältnis zwischen den Detektorangaben der Diastereomeren (LD/LL)
Optische Reinheit = x 100 (%)
R in der Formel I Retentionszeit des Retentionszeit des k L-Enantiomeren D-Enantiomeren
CH3(CH2)2 8,5 (Min) 9,2 (Min) 0,96
15 (CH3)2CHCH2 8,8 9,6 1,00
CH3(CH2)3 10,8 11,8 1,16
CH3(CH2)4 14,0 15,3 1,14
CH3(CH2)5 18,4 20,2 1,17
CH3(CH2)6 24,5 26,7 1,15
20 CH3(CH2)7 32,4 35,3 1,05
CH3(CH2)9 57,8 63,0 1,00
3. Quantitative Bestimmung der a-Ketocarbonsäuren
Es wird die kolorimetrische Methode von H. Katsuki et al., 25 Anal. Biochem. 43, 349 (1971) verwendet.
Beispiel 1
Vier mit Schikane versehene 500 ml Erlenmeyer-Kolben mit je 100 ml des Mediums A wurden im Autoklav behandelt 30 und dann mit Bacillus sp. NRS-112KH25B (FERM-P Nr. 3165, NRRL 11085) aus der Schrägkultur beimpft. Die Inkubation wurde 26 Stunden bei 27 °C unter Schütteln (180 Bewegungen pro Minute) durchgeführt. Danach wurden jedem Kolben 3,54 g Natrium-DL-2-hydroxy-4-methylvalerianat zu-35 gesetzt und die Fermentation wurde 84 Stunden bei 27 °C unter Schütteln fortgeführt. Mittels der oben beschriebenen gas-chromatographischen Methode wurde gefunden, dass das in der Kulturbrühe zurückbleibende Substrat 15,5 mg/ml freie D-Hydroxysäure (optische Reinheit: 100%) enthielt. 40 Die so erhaltene Gärbrühe (390 ml) wurde mit 50 ml 20%iger Schwefelsäure angesäuert und mit 300 ml Äthylacetat extrahiert. Die wässrigen Schichten wurden nochmals mit 100 ml Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Äthylacetatex-trakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und 45 unter vermindertem Druck eingeengt. Nach Kristallisation des Rückstandes aus Diäthyläther-Petroläther erhielt man 4,95 g D-2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure, Schmelzpunkt 79,6 °C, [a]D25 = +26,3° (c = 2, IN NaOH), durch Massenspektro-metrie mit hoher Auflösung ermittelte Bruttoformel: C6H1203. so Die Mutterlauge wurde unter vermindertem Druck eingeengt und der gelbliche braune, ölige Rückstand der fraktionierten Destillation unterworfen, wobei man 3,6 g 4-MethyI-2-oxo-valeriansäure in Form eines farblosen Öls erhielt, Siedepunkt 65-75 °C (10 mmHg), durch Massenspektrometrie 55 mit hoher Auflösung ermittelte Bruttoformel: C6H10O3.
Beispiel 2
Ein mit Schikane versehener 500 ml Erlenmeyer-Kolben mit 90 ml des Mediums A wurde mit Bacillus freundenreichii 60 NRS-137KH20B (FERM-P Nr. 3169, ATCC 31301) von der Schrägkultur beimpft. Die Inkubation wurde unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen 24 Stunden durchgeführt. Danach wurden 3,17 gNatrium-DL-2-hydroxy-4-methylvale-rianat zugesetzt und die Gärung wurde 82 Stunden fortgesetzt. 65 Das in der Fermentationsbrühe zurückbleibende Substrat enthielt 15,2 mg/ml freie L-Hydroxysäure, optische Reinheit 100%. Die so erhaltene Gärlösung wurde dann in zu Beispiel 1 analoger Weise behandelt und man erhielt 1,18 g kristalline
11
628 009
L-2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure, Schmelzpunkt 79,1 °C, [ö|d2s = -26,8° (c = 2, IN NaOH) und 0,7 g 4-Methyl-2-oxovaleriansäure, Siedepunkt 65-75 °C (10 mmHg).
Beispiel 3
Zehn mit Schikane versehene 500 ml Erlenmeyer-Kolben, enthaltend je 100 ml des Mediums B, wurden mit Coryne-form-Stamm NRS-130KH20B (FERM-P Nr. 3657, NRRL B-l 1088) von der Schrägkultur beimpft und 24 Stunden unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 bebrütet. Jedem Kolben wurden als Substrat 8,19 g Natrium-DL-2-hydroxy-4-methylvalerianat zugesetzt und die Gärung wurde 120 Stunden unter den gleichen Bedingungen fortgesetzt. Nach der oben beschriebenen Methode wurde gefunden, dass 120 Stunden nach Zusatz des Substrats 35 mg/ml 4-Methyl-2-oxovale-riansäure und 37 mg/ml reine D-Hydroxysäure vorlagen. Die Gärung wurde daher abgestellt und die Gärlösungen wurden kombiniert und zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 38 ml 50%iger Schwefelsäure auf pH 1,5 angesäuert und dreimal mit 1 Liter Diäthyläther extrahiert. Die vereinigten Ätherextrakte wurden dreimal mit 10 ml gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und unter vermindertem Druck eingedampft. Dem Rückstand wurden 100 ml Toluol zugesetzt und das Gemisch wurde unter vermindertem Druck zwecks Entfernung von Wasser eingeengt. Der gelblich-braune, ölige Rückstand wurde in 400 ml Petroläther gelöst und die Lösung über Nacht im Kühlschrank gehalten. Das Kristallisat wurde durch Filtrieren gesammelt, mit 50 ml kaltem Petroläther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhielt 28,1 g D-2-Hydroxy-4-me-thylvaleriansäure in Form von farblosen Kristallen, Schmelzpunkt 79,9 °C, [a]D20 = +26,67° (c = 2, IN NaOH).
Beispiel 4
Die 4-Methyl-2-oxovaleriansäure und eine kleine Menge D-2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure enthaltende Mutterlauge und Waschwässer aus Beispiel 3 wurden vereinigt und in einen Scheidetrichter verbracht. Dann wurde unter Schütteln IN NaOH zugesetzt, bis das pH der wässrigen Schichten 7,0 erreichte (Zugabe von 299 ml IN NaOH). Die wässrige Schicht wurde abgetrennt und unter vermindertem Druck auf etwa 150 ml eingeengt. Dem Rückstand wurden 100 ml destilliertes Wasser, enthaltend Raney-Nickel T4 (hergestellt aus 36 g ei-5 ner 42% Nickel enthaltenden Nickel/Aluminiumlegierung nach der Methode von Nishimura, Bull. Chem. Soc. Japan, 32, 62-64, 1959), zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur unter normalem Druck bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert. Das Fil-io trat wurde mit 25 ml 50%iger Schwefelsäure angesäuert und dann viermal mit 500 ml Äthyläther extrahiert. Die Ätherextrakte wurden vereinigt, mit 10 ml gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und unter vermindertem Druck eingeengt. Dem Rückstand wurden 100 ml Toluol zugesetzt und das Geis misch wurde nochmals unter vermindertem Druck zu einem leicht gelben Öl eingeengt. Zwecks Kristallisation wurden 160 ml Petroläther zugesetzt. Das Gemisch wurde über Nacht im Kühlschrank behalten, dann filtriert, und die Kristalle wurden mit kaltem Petroläther gewaschen, wobei man 32,3 g 2-20 Hydroxy-4-methyIvaleriansäure in Form von farblosen Kristallen erhielt, Schmelzpunkt 73,9 °C, [a]D20 = +4,24° (c = 2, IN NaOH).
Beispiel 5
DL-2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure wurde bis zu einer 25 Konzentration von 3,0 mg/ml im Medium A gelöst und das pH durch Zugabe von 5N NaOH auf 7,0 gestellt. Drei 500 ml Er-lenmeyer-Kolben, enthaltend je 100 ml des so hergestellten Mediums, wurden im Autoklav sterilisiert und dann mit einem der folgenden Stämme beimpft: Bacillus megaterium 30 NRS-85KH20B (FERM-P Nr. 3164, NRRL B-l 1084), Pseudomonas fluorescens NRS-137CzH5B (FERM-P Nr. 3658, NRRL 11089) und Streptomyces sp. NRS79KH1A (FERM-P Nr. 3160, NRRL 11083). Die Kultivierung wurde unter Schütteln (180 Bewegungen/Minute) bei 27 °C durchgeführt. Nach 35 72 und 144 Stunden wurde das Substrat, wie oben beschrieben, gaschromatographisch analysiert. Es wurden folgende Resultate ermittelt:
Stämme
Menge des zurückbleibenden Substrats (optische Reinheit als D-Enantiomer) 0 Stunden 72 Stunden 144 Stunden
(Beginn der Kultivierung)
FERM-P No. 3164, NRRL B-l 1084 FERM-P No. 3658, NRRL 11089 FERM-P No. 3160, NRRL 11083
3,0 mg/ml (0%) 3,0 (0%)
3,0 (0%)
1,9 mg/ml (76%) 1,2 (100%)
1,2 (100%)
1,8 mg/ml (92%)
1.1 (100%)
1.2 (100%)
Beispiel 6
Nach der Methode von Beispiel 5 wurden folgende Stämme im Medium A, das 3,0 mg/ml DL-2-Hydroxy-4-me-thylvaleriansäure enthielt, kultiviert: Bacillus freudenreichii NRS-137KH20B (FERM-P Nr. 3169, ATCC 31301), Pseudomonas putida NRS-146KH6B (FERM-P Nr. 3172, ATCC 31303), Pseudomonas sp. NRS-139KH6B (FERM-P Nr. 3170, ATCC 31302), Coryne-Form NRS-135KH9B (FERM-P Nr. 3168, NRRL B-l 1087) und Streptomyces sp. NRS-125KH27A (FERM-P Nr. 3660, NRRL 11091). Die Gärlösung wurde unter Verwendung der oben angegebenen Methode nach 72 und 144 Stunden analysiert. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle angegeben:
628 009
12
Stamm
Zurückbleibende Menge des Substrats (optische Reinheit als L-Enantiomer) 0 Stunden 72 Stunden 144 Stunden
(Beginn der Kultur)
FERM-P No. 3169,
ATCC 31301
3,0 mg/ml
(0%)
1,6 g/ml
(93%)
1,4 mg/ml
(100%)
FERM-P No. 3172,
ATCC 31303
3,0
(0%)
1,4
00
1,4
(100%)
FERM-P No. 3170,
ATCC 31302
3,0
(0%)
1,3
(93)
1,0
o
O
FERM-P No. 3168,
NRRL B-11087
3,0
(0%)
1,6
(83%)
0,6
C"
o o
FERM-P No. 3660,
NRRL 11091
3,0
(0%)
1,3
(97%)
1,2
(97%)
Beispiel 7
Ein mit Schikane versehener, 100 ml Medium A enthaltender Erlenmeyer-Kolben wurde mit einem der Stämme FERM-P Nr. 3166, (NRRL B-11086), FERM-P Nr. 3657 (NRRL B-l 1088), FERM-P Nr. 3658 (NRRL 11089), FERM-P Nr. 3167 (ATCC 31300), FERM-P Nr. 3659 (NRRL 11090) und FERM-P Nr. 3170 (ATCC 31302) ab einer 2-10 Tage alten Agar-Schrägkultur beimpft und 24—72 Stunden unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 2 kultiviert. Die Kulturbrühe wurde 10 Minuten unter Kühlung zentrifugiert und die ausgeschiedenen Zellen wurden zweimal mit 100 ml 0,85% NaCl enthaltendem Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und dann in 100 ml dieses Puffers suspendiert. Die Zellsuspension wurde in 5-ml-Portionen mit DL-a- Hy-droxycarbonsäure versetzt, so dass die Konzentration 20 mg/ml betrug. Das Reaktionsgemisch wurde 20 Minuten bei 27 °C inkubiert. Die Aktivität jedes Organismus für die verschiedenen Substrate wurde durch die oben beschriebene spektrophotometrische Analyse der entsprechenden entstandenen 2-Oxocarbonsäure ermittelt. Die Resultate sind in der nachstehenden Tabelle angegeben, worin die Reaktivität als relative Reaktivität gegenüber dem Substrat DL-2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure (100) ausgedrückt ist. Die spezifische Aktivität jedes Stamms mit 2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure ist: 5,8; 6,0; 0,95: 5,5; 3,5 und 0,54 nMoI/min/mg Protein mit den Stämmen FERM-P Nr. 3166, 3657, 3658, 3167, 3170 bzw. 3659.
Die Zellen wurden durch Beschallung (70 W, 15 Minuten) aufgebrochen und 10 Minuten unter Kühlung zentrifugiert. Der erhaltene Überstand (Rohextrakt) wurde, wie oben beschrieben, mit verschiedenen Substraten in einem 0,02 M Phosphatpuffer (pH 7,0) oder einem 0,02 M Tris-hydrochloridpuf-fer (pH 8.0) inkubiert. Es wurden ähnliche relative Aktivitäten gefunden, obwohl die spezifische Aktivität kleiner war, z.B. 0,50 nMol/Min/mg Protein mit dem Stamm Nr. 3657.
FERM-P No. Relative Aktivität in jedem Stamm
20
(DL)
Substrat: R-CH-COOH I
OH
Beispiel 8
Ein mit Schikane versehener, 100 ml Medium A enthal-25 tender Erlenmeyer-Kolben wurde mit Brevibacterium albidum NRS-130KH20B (FERM-P Nr. 3657, NRRL B-l 1088) von der Schrägkultur beimpft und unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 2 24 Stunden kultiviert. Die Kulturbrühe (90 ml) wurde zu 22 ml sterilisiertem 50 %igem Glycerin gege-30 ben, suspendiert und bei -196 °C in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
Ein mit Schikane versehener, 100 ml des Mediums B enthaltender Erlenmeyer-Kolben wurde durch Zugabe von 2 ml der obigen, aufgetauten Zellsuspension beimpft und 24 Stun-35 den unter identischen Bedingungen kultiviert. Dieser Kultur wurden 8,8 g Natrium-DL-2-hydroxy-4-methylvalerianat als Substrat zugesetzt und die Fermentation wurde fortgesetzt. 72 und 120 Stunden nach Zusatz des Substrats wurden die zurückbleibenden Mengen des Substrats in der Brühe, die opti-40 sehe Reinheit (ausgedrückt in % des D-Enantiomeren) und die Menge der erhaltenen 4-Methyl-2-oxovaIeriansäure durch die oben beschriebenen Methoden ermittelt. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle angegeben:
Hydroxy-
3166
3657
3658
3167
3170
3659
säure = R
D
D
D
D
L
L
ch3-
_
1310
159
_
chjchi-
1,9
—
560
14
41
-
ch3(ch2)2-
32
32
130
42
150
-
(ch3)2ch-
69
16
19
25
—
-
ch3(ch2)3-
72
68
194
59
39
400
(ch3),chch,-
100
100
100
100
100
100
(ch3)3c-
-
-
-
-
-
71
ch3(ch2)4-
120
133
200
80
30
1220
ch3(ch2)s-
68
79
160
49
13
693
ch3(ch2)6-
52
55
53
25
12
250
ch3(ch-,)7-
39
13
23
6,5
6,8
-
ch3(ch->)y-
3,5
0,6
14
6,3
0,9
—
ch3(ch2)„-
3,4
-
-
14
-
-
45
Beim Zusatz
72
120
des Substrats
Stunden
Stunden
2-Hydroxy-4-methyl-
valeriansäure (mg/ml)
75
41
39
so Optische Reinheit
des D-Enantiomeren in %
0
85
100
4-Methyl-2-oxo-
valeriansäure (mg/ml)
0
32
33
Beispiel 9
Ein 1 Liter-Glasfermentor mit 300 ml des Mediums B wurde sterilisiert, dann mit 6 ml der wie in Beispiel 8 hergestellten Zellsuspension Nr. 3657 beimpft und 16 Stunden bei 60 27 °C unter aeroben Bedingungen (Luftströmung 0,5 I/Min, 300 Umdrehungen/Minute) kultiviert. Als Substrat wurden 24,6 g Natrium-2-hydroxy-4-methylvalerianat zugesetzt und das pH der Kultur durch Zusatz von 2N HCl auf 8,5 eingestellt. Die Fermentation wurde bei pH 8,5 unter den gleichen 65 Bedingungen fortgeführt (Luftströmung 0,3 1/Min, 300 Umdrehungen/Minute). Die Analyse des Substrats, 72 und 120 Stunden nach Substratzugabe, ist in der folgenden Tabelle angegeben:
13
628 009
Bei Zugabe des Substrats
72
Stunden
120
Stunden
2-Hydroxy-4-methyl-
valcriansäure (mg/ml)
70
39
35
Optische Reinheit
des D-Enantiomeren in Vc
0
89
98
4-Methyl-2-oxo-
valeriansäure (mg/ml)
0
36
36
Beispiel 10
Ein mit Schikane versehener 500 ml Erlenmeyer-Kolben mit 100 ml des Mediums B wurde mit 1 ml der gemäss Beispiel 8 hergestellten Zellsuspension von B. albidum NRS-130KH20B (FERM-P Nr. 3657, NRRL B-l 1088) beimpft und 24 Stunden bei 27 °C unter Rühren und den in Beispiel 2 beschriebenen Bedingungen kultiviert. Dann wurden 1.48 g des Natriumsalzes der DL-ct-Hydroxy-3-pyridylessig-säure zugesetzt und die Fermentation wurde 120 Stunden fortgeführt. Die Kulturbrühe (pH 9,2) wurde zentrifugiert und durch eine Säule mit 71 ml Dowex-lx4 (Acetatform, 200-400 mesh) geführt. Der Anionenaustauscher wurde dann mit Wasser gewaschen und mit einem Gemisch von 2N Essigsäure/Methanol (1:1, v/v) eluiert. Das Eluat wurde durch Dünnschichtchromatographie (Platte: Silicagel, Lösungsmittel: Äthylace-tat-Essigsäure-Wasser-Methanol, 10:2:1:2, v/v; Nachweis: UV-Strahlen) kontrolliert. Die UV-Absorptionsflecken (Rf
0.12) aufweisenden Fraktionen wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde in
20 ml Wasser gelöst und zu 793 mg Pulver lyophilisiert. Nach Kristallisation aus Methanol-Äthylacetat erhielt man 625 mg optisch aktive a-Hydroxy-3-pyridylessigsäure in Form von farblosen Kristallen, Schmelzpunkt 140 °C, [«]D24 = -119° (c =
1, H20), Mol. Formel: C7H7N03.
Die Säule wurde dann mit einem Gemisch von IN HCl und Aceton (1:1, v/v) eluiert. Das Eluat wurde nach dem gleichen Dünnschichtchromatographiesystem kontrolliert. Die UV-Ab-sorptionsflecken (Rf 0,37) aufweisenden Fraktionen wurden vereinigt, mit Wasser verdünnt und dann durch eine Säule, enthaltend 30 ml Dowex-50 (H+-Form), gegeben. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit 1 %igem wässrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck eingeengt, lyophilisiert und das entstandene Pulver aus Methanol kristallisiert. Man erhielt 362 mg a-Oxo-3-pyridyl-
essigsäure in Form von farblosen Kristallen, Schmelzpunkt 177-179 °C (Zers. j, Mol. Formel: C7HsN03.
Beispiel 11
5 Ein mit Schikane versehener 500 ml Erlenmeyer-Kolben, enthaltend 100 ml des Mediums B, wurde mit 2 ml der nach Beispiel 8 hergestellten Zellsuspension von B. albidum NRS-130KH20B (FERM-P Nr. 3657, NRRL B-l 1088 beimpft und 24 Stunden bei 27 CC unter Schütteln (180 Bewegun-io gen/Minute) kultiviert. Die Kulturbrühe wurde 10 Minuten zentrifugiert, die ausgeschiedenen Zellen wurden dreimal mit 100 ml 0,85 % Natriumchlorid enthaltendem 0,02M Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen und dann in 100 ml des gleichen Puffers suspendiert. 50 ml dieser Suspension wurden in einen 15 500 ml Erlenmeyer-Kolben umgeschüttet, mit 1,14 g Natrium-DL-2-hydroxyoctanoat versetzt und der Kolben 48 Stunden bei 27 °C geschüttelt. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren aus dem Reaktionsgemisch entfernt, der Überstand durch Zusatz von 50%iger Schwefelsäure auf pH 1,5 angesäuert und 20 dreimal mit 50 ml Diäthyläther extrahiert. Die vereinigten Ätherextrakte wurden mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde mit 26 ml 2,4-Dinitrophenylhydrazin-Reagens, hergestellt nach der Methode von C.D. Johnson, J. Am. Chem. Soc. 73, 5888, (1951), 25 versetzt und das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Die entstandenen gelben Kristalle wurden gesammelt und aus Benzol umkristallisiert. Man erhielt 761 mg 2,4-Dinitrophenylhydrazon der 2-Oxooctansäure, Schmelzpunkt 137 °C, Mol. Formel: C14H18N406. 30 Die Hydrazon-Mutterlauge wurde zweimal mit 50 ml Diäthyläther extrahiert. Die vereinigten Ätherextrakte wurden mit einer kleinen Menge Wasser gewaschen und das pH der wäss-rigen Schicht unter Schütteln und Zugabe von IN NaOH auf 7,0 eingestellt. Die wässrige Schicht wurde zweimal mit 20 ml 35 Diäthyläther gewaschen und unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde zu 237 mg Natrium-D-2-hydro-xyoctanoat, [a]D20 = +9,6° (c = 2, H20) lyophilisiert.
Beispiel 12
40 Die Spaltung von verschiedenen DL-a-Hydroxycarbonsäu-ren wird wie in Beispiel 11 mit den restlichen Zellen von B. albidum NRS-130KH20B (FERM-P Nr. 3657, NRRL B-l 1088) durchgeführt. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle angegeben:
45
Substrat
Zugesetzte Inkubierungs- D-a-Hydroxycarbonsäure Menge (mg) zeit (Std.) Ausbeute1 [«]n201 Optische2
(mg) (c = 2, H20) Reinheit a-Ketocarbonsäure Ausbeute3 Schmelzpunkt (mg)
ch,(ch2)2ç:hcooh oh ch3(ch2)3chcooh oh ch3(ch2)4^hcooh oh
1510
890
820
ch,
ÇHÇHCOOH
ch3ch2 oh
840
72
48
48
72
474 389 372
200
+ 10,1°
90
1 als Natriumsalz
- gaschromatographisch ermittelt
' als 2,4-Dinitrophenylhydrazon
4 umkristallisiert aus Benzol * umkristallisiert aus Benzol-Hexan
+ 12,1° 100 + 12,5° 100
+8,9°
96
4054
3684
4404
6194
166,5-167
134
103-104
169-171
628 009
14
Beispiel 13
Das gewaschene Zellpräparat, hergestellt aus 100 ml der nach Beispiel 11 hergestellten Kultur von B. albidum NRS-130KH20B (FERM-P Nr. 3657, NRRL B-l 1088) wurde nochmals mit destilliertem Wasser gewaschen und lyophilisiert, wobei man 478 mg Lyophilisat (trockenes Zellpulver) erhielt. Das trockene Zellpulver wurde in 100 ml 0,02 M Phosphatpuffer (pH 7,5) suspendiert. Das Gemisch wurde mit 2,34 g Natrium-DL-2-hydroxy-4-methylvalerianat versetzt und nach Einstellen des pH auf 7,5 bei 27 °C geschüttelt (180 Bewegungen/Minute). Nach 48 und 72 Stunden Schütteln wurde das im Puffer zurückbleibende Substrat, die optische Reinheit und die Menge der erhaltenen 4-Methyl-2-oxovaleriansäure durch die oben beschriebene Methode ermittelt. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle angegeben:
5 Vor dem 48 72
Schütteln Stunden Stunden
2-Hydroxy-4-methyI-
valeriansäure (mg/ml) 20,0 io Optische Reinheit des
D-Enantiomeren in % 0 4-MethyI-2-oxo-
valeriansäure (mg/ml) 0
11,6 10,9 100 100 9,6 9,9
s

Claims (4)

628 009 PATENTANSPRÜCHE
1—13 C-Atomen oder einen Pyridylrest darstellt, oder ein Salz davon mittels enantiospezifische Dehydrogenaseaktivität aufweisenden, zu den Genera Streptomyces, Pseudomonas, Bacillus oder zur Coryneformgruppe gehörenden Mikroorganismen asymmetrisch zur a-Ketocarbonsäure bzw. zu einem Salz davon dehydriert, aus einem erhaltenen Salz die Säure freisetzt und schliesslich das nicht dehydrierte Enantiomere der a-Hy-droxycarbonsäure aus dem Reaktionsmedium isoliert.
1. Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven a-Hydro-xycarbonsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass man eine D,L-a-Hydroxycarbonsäure der allgemeinen Formel
R-CH-COOH
I I
OH
worin R einen verzweigten oder geradkettigen Alkylrest mit
2-Hydroxydecansäure, 2-Hydroxyundecansäure, 2-Hydroxy-dodecansäure, 2-Hydroxytridecansäure, 2-Hydroxytetradecan-säure, 2-Hydroxypentadecansäure oder a-Hydroxy-3-pyridyl-essigsäure verwendet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die im Reaktionsmedium enthaltene a-Ketocarbonsäure isoliert, zur D,L-a-Hydroxycarbonsäure hydriert und diese als Ausgangsmaterial in den Prozess zurückführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangssäure der Formel 12-Hydro-xypropionsäure, 2-Hydroxybuttersäure, 2-Hydroxyvalerian-säure, 2-Hydroxy-3-methylbuttersäure, 2-Hydroxycapronsäu-re, 2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure, 2-Hydroxy-3,3-dime-thylbuttersäure, 2-Hydroxyheptylsäure, 2-Hydroxy-4-methyl-capronsäure, 2-Hydroxycaprylsäure, 2-Hydroxypelargonsäure,
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus den Stamm Bacillus megaterium FERM-P No. 3164, NRRL B-11084; Bacillus sp. FERM-P No. 3165, NRRL 11085; Bacillus freudenreich« FERM-P No. 3169, ATCC 31301; einen der Coryneform-Gruppe angehörenden Stamm FERM-P No. 3166, NRRL B-11086; FERM-P No. 3167, ATCC 31300; FERM-P No. 3657, NRRL B-11088; oder FERM-P No. 3168, NRRL B-11087; Pseudomonas fluorescens FERM-P No. 3658, NRRL 11089; Pseudomonas putida FERM-P No. 3172, ATCC 31303 oder FERM-P No. 3659, NRRL 11090; Pseudomonas sp. FERM-P No. 3170, ATCC 31302, Streptomyces sp. FERM-P No. 3160, NRRL 11083 oder FERM-P No. 3660, NRRL 11091 verwendet.
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