CH628373A5 - Verfahren zur herstellung des neuen antibioticums nikkomycin sowie seine verwendung in fungiziden mitteln. - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibioticums Nikkomycin sowie seine Verwendung in fungiziden Mitteln. 65

Es ist bereits bekanntgeworden, dass Polyoxine als fungi-toxische Mittel breite Anwendung im Pflanzenschutz gefunden haben. Ihr Nachteil besteht jedoch in einer Alkali-Labilität und weiterhin darin, dass sie nur als Gemische wechselnder Zusammensetzung vorkommen und somit schlecht exakt dosierbar und standardisierbar sind.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung des neuen Antibioticums Nikkomycin mit folgender vorgeschlagener Formel

3

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und der Kennzeichnung, dass es a) farblos ist, in Wasser und Pyridin sehr gut löslich ist, in sonstigen üblichen organischen Lösungsmitteln aber unlöslich ist, und welches eine positive Reatkion mit Ninhydrin, Na-triummetaperjodat-Benzidin und Kaliumpermanganat zeigt, 25 und welches mit Eisen-(III)-chlorid eine Gelbfärbung ergibt;

b) die in den Fig. 1 und 2 angegebenen UV- und IR-Spek-tren besitzt;

c) bei chemischem Abbau Uracil, eine Amino-hexuronsäure und eine einen Pyridinring enthaltende Aminosäure ergibt; 30

d) sich bei der Papierelektrophorese als amphotere Substanz erweist und einen isoelektrischen Punkt bei etwa pH 6 besitzt;

e) aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff besteht, durch aerobes Züchten von Mikrooganismen, ist da- 35 durch gekennzeichnet, dass man Stämme der Ordnung Acti-nomycetales, der Familie Streptomycetaceae in wässrigem Nährmedium züchtet und das Nikkomycin anschliessend isoliert.

Weiterhin wurde gefunden, dass das neue Antibioticum 40 Nikkomycin eine starke fungizide Wirkung gegen phytopatho-gene Pilze aufweist.

Überraschenderweise besitzt das erfindungsgemäss herstellbare Antibioticum eine wesentlich grössere pH-Stabilität als die aus dem Stand der Technik bekannten Polyoxine. Es ist 45 weiterhin als überraschend zu bezeichnen, dass sich das neue Antibioticum Nikkomycin praktisch als einheitliche Subtanz gewinnen lässt, weil man im Hinblick auf den Stand der Technik erwarten musste, dass sich ähnlich wie bei den Polyoxinen ein Gemisch chemisch ähnlicher Substanzen bei der Fermenta- so tion bilden müsste. Das erfindungsgemäss herstellbare neue Antibioticum stellt somit eine Bereicherung der Technik dar.

Der erfindungsgemäss herstellbare Stoff wird in der Regel durch submerse Kultur von geeigneten Mikroorganismen in geeigneten Nährlösungen unter geeigneten physikalischen Be- 55 dingungen erzeugt. Er wird normalerweise aus der Kulturlösung oder gegebenenfalls aus dem Mycel durch Extraktion, Adsorption und Fällung abgetrennt und durch weitere geeignete Methoden angereichert.

Für das erfindungsgemässe Verfahren kann der neue 60

Stamm Streptomyces tendae Ettlinger et al. Tü 901 aus der Ordnung der Actinomycetales, Familie Streptomycetaceae, Gattung Streptomyces eingesetzt werden. Dieser Stamm wurde aus einer Bodenprobe von Nikko/Japan isoliert. Er wurde unter der Nr. CBS 354.75 beim Centraalbureau voor Schimmel- es kultures, Baarn/Niederlande am 17. Juli 1975, unter der Nr. A I CC 31 160 bei der American Type Culture Collection, Rockville. Maryland/USA und unter der Nr. FRI 3136 beim

Fermentation Research Institure Osaka/Japan hinterlegt. Dieser Stamm gehört zur Gattung Streptomyces und ist durch folgende Eigenschaften gekennzeichnet:

a) Die Sporen sind ellipsoid. Sie haben die Grösse von 0,4-0,6 x 1,2-1,4 m und eine glatte Oberfläche.

b) Die Farbe des Luftmycels ist zu Anfang kreideweiss, im ausgereiften Zustand aschgrau (cinereus).

c) Die Sporenketten sind monopodial verzweigt und in lok-keren Schrauben und Schlingen angeordnet.

d) Auf Pepton-Eisen-Agar wurde bei 27 °C ein schwarzes Pigment gebildet. Der Stamm ist chromogen.

Die zusammengefassten Bestimmungsmerkmale identifizieren den Stamm Tü 901 als zur Art Streptomyces tendae Ettlinger gehörend.

Für das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Nikkomycin verwendet man üblicherweise Nährmedien, die die üblichen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und die notwendigen Salze enthalten. Als Kohlenstoffquelle können verwendet werden: Kohlenhydrate, insbesondere Polysaccharide, wie z.B. Stärke, Disaccharide, wie z.B. Maltose und Rohrzuk-ker, Monosaccharide, wie z.B. Glukose und Fruktose. Weiterhin können noch verwendet werden Zuckeralkohole, wie z.B. Mannit und Glycerin, ausserdem auch natürlich vorkommende Gemische, wie z.B. Malzextrakt. Als Stickstoffquelle können die üblichen Stickstoffquellen Verwendung finden, so z. B. Ei-weissstoffe, Eiweisshydrolysate, Aminosäuren, Ammonium-Ionen, Nitrate, natürlich vorkommende komplexe Stoffe, wie Peptone, Casein-Hydrolysate, «Cornsteep-liquor», Sojamehl, Fleischmehl, Fleischextrakt und geeignete Mischungen derselben.

Als Hilfsstoffe werden im Nährmedium bevorzugt verwendet die Salze, z.B. Phosphate, Sulfate oder Chloride, des Magnesiums, Eisens, Zinks und Mangans. Die Konzentration dieser Stoffe kann in weiten Grenzen schwanken, zum Teil sind notwendige Konzentrationen in den oben genannten Kohlenstoff- oder Stickstoff quellen oder im verwendeten Wasser als Verunreinigungen enthalten.

Weiterhin können als Hilfsstoffe noch Antischaummittel der verschiedensten Art Verwendung finden, wie z.B. Sojaöl, Polyole oder Silikone. Zur Einhaltung eines gewünschten pH-Bereiches werden normalerweise Puffer verwendet, und zwar vorwiegend anorganische Phosphate und Carbonate, aber auch organische Puffer.

Als wichtigstes Verdünnungsmittel für die Nährmedien ist in der Regel Wasser zu nennen.

Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird unter aeroben Bedingungen gearbeitet; die Kultur kann gemäss üblichen Methoden, so z.B. unter Verwendung von

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Schüttelkulturen oder von belüfteten Fermenterkulturen, durchgeführt werden. Die Prozentverhältnisse der Nährlösungsbestandteile können in weiten Bereichen schwanken, im allgemeinen machen die Kohlenstoffquellen 1—10ÇÔ, vorzugsweise 2-5 Tc aus, die Stickstoffquellen 0,2-4%, vorzugsweise 0,5—2 e? aus; die Salze liegen in üblichen Konzentrationen vor, vorzugsweise im Bereich zwischen 0,01—1 Gew.-%. Die Antischaummittel liegen normalerweise in 0—1 %iger Konzentration vor. Die zur Sterilisation angewandten Temperaturen liegen im allgemeinen bei 100-140 °C, vorzugsweise bei 120-130°C.

Die pH-Werte der wachsenden Kulturen liegen in der Regel bei 5,5-8, vorzugsweise bei 7-7,5. Die Züchtungstemperatur kann zwischen 18 und 37 °C, vorzugsweise bei 27—30 °C, liegen. Es hat sich herausgestellt, dass die Menge des sich in der Kulturbrühe anreichernden Antibioticums im allgemeinen ihr Maximum etwa 1—14, vorzugsweise etwa 3-5 Tage nach Züchtungsbeginn erreicht. Der Endpunkt der Bebrütung wird normalerweise mit Hilfe von biologischen Tests ermittelt, und zwar wird die Wirkung gegen Botrytis cinerea (Testverfahren nach R. Hütter et al., Arch. Mikrobiol. 51, 1-8 [1965]) und Mucor hiemalis (Testverfahren nach Dissertation G. Kirst, Tübingen [1971], ferner nach Kneifel et al., J. Antib. A. 27, 20-27 [1974]) ermittelt.

Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens kann zur Aufarbeitung der Kulturlösungen zunächst eine Filtration durchgeführt werden, wobei das Mycel abgetrennt wird. Letzteres kann der Ionenaustausch-Chromatographie an geeigneten Austauschern unterworfen werden. Die Chromatographie kann in Form der Säulenchromatographie oder der präparativen Dünnschichtchromatographie durchgeführt werden. Als Adsorptionsmittel können alle üblichen (nicht sauren) anorganischen oder organischen Adsorptionsmittel eingesetzt werden, wie z.B. Aluminiumoxid, Kieselgel, Magnesiumsilikat, Aktivkohle, Cellulose, Cellulosederivate, Kunstharze wie Polyamide, Derivate von Polyamiden usw., z.B. acetyliertes Polyamid oder Dextrangele. Als Laufmittel bei der präparativen Dünnschichtchromatographie können die verschiedensten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische verwendet werden, in welchen das erfindungsgemäss hergestellte Antibioticum löslich ist. Anschliessend kann eine Gel-Chromatographie und eine Reinisolierung an einer weiteren Säule mit anschliessender Gefriertrocknung durchgeführt werden.

Das erfindungsgemäss herstellbare Antibioticum Nikkomycin ist neu. Es kann durch folgende Angaben charakterisiert werden:

a) Löslichkeit und Eigenschaften: Nikkomycin ist eine farblose, in Wasser und Pyridin sehr gut lösliche, in den sonstigen üblichen organischen Lösungsmitteln unlösliche Substanz. Es zeigt eine positive Reaktion mit Ninhydrin, Natriummetaper-

5 jodat-Benzidin und Kaliumpermanganat. Mit Eisen-(III)-chlo-rid erhält man eine Gelbfärbung.

b) Das UV-Spektrum und das IR-Spektrum liegen vor (vgl. die entsprechenden Darstellungen in Fig. 1 und 2). In Fig. 1 ist das UV-Spektrum von Nikkomycin, aufgenommen in (a) 1 rito Salzsäzre und (b) in 0,1 n-Natronlauge, aufgetragen. Die Ordinate gibt die Extinktion, die Abszisse die Wellenlänge (nm-Einheiten) wieder. In Fig. 2 ist das IR-Spektrum von Nikkomycin, aufgenommen in Kaliumbromid, angegeben. Die Ordinate zeigt die Durchlässigkeit in %, die Abszisse die Wellen-

15 zahl (cm-1) bzw. Wellenlänge («m-Einheiten) auf.

c) Mit Hilfe der Massenspektrometrie und des chemischen Abbaus durch saure Hydrolyse konnten Uracil, eine Amino-hexuronsäure und eine neue, einen Pyridinring enthaltende Aminosäure nachgewiesen werden.

2o d) Papierelektrophorese: Das Antibioticum ist amphoter. Um den pH-Wert von 6 ist die Wanderungsstrecke klein, hier dürfte somit der isoelektrische Punkt liegen. Das Verhalten des Nikkomycins bei der Elektrophorese zeigt die nachfolgende •Tabelle, in welcher die Laufstrecken bei der Papierelektropho-25 rese in Abhängigkeit von den pH-Werten des Puffersystems angegeben sind.

Puffer pH

Zeit (min)

Laufstrecke (mm)

30

Pyridin-Eisessig Pyridin-Eisessig Barbital*

3,9 6,1 8,9

60 60 60

-12 - 1 + 16

: Barbital ist 5,5-Diäthvl-Barbitursäure.

40

e) Dünnschichtchromatographie: Hierbei treten in allen verwendeten Fliessmitteln, die Essigsäure enthalten, drei nin-hydrin-positive Flecken auf, wobei jeweils nur ein Fleck mit der im Bioautogramm aktiven Substanz korrespondiert. Diese Tatsache konnte auf die Labilität des Antibioticums in essigsaurer Lösung zurückgeführtwerden. In neutralen Fliessmitteln zeigt sich jeweils nur ein ninhydrin-positiver Fleck.

f) Die vorgeschlagene Strukturformel lautet folgendermas-

45 sen:

Ijr-

CH-

r

OOH

CH~CH-CH-CO-NH~CH

?

Öl

ÄH,

HI? ^ *

OK OH

P

Die Elementaranalyse von Nikkomycin ergab folgende Werte: C 48,21; H 5,08; N 13,58; O 31,58. Daraus errechnet 65 sich eine Elementarzusammensetzung von C4H5N02. Kryo-skopisch wurde das Molekulargewicht mit 404 bestimmt. Die hier vorgeschlagene Struktur für Nikkomycin entspricht jedoch dem Molekulargewicht von 495 und der Formel C2oH25NsOio = (C4H5NO2):;. Die daraus errechnete Elementarzusammensetzung ergibt:

C 48,49 H 5,09 N 14,14 O 32,29

g) Im Gegensatz zu den literaturbekannten Polyoxinen (vgl. J. Am. Chem. Soc. 91, 7490 [1961]), welche dem Nikkomycin am nächsten stehen, fehlt im Nikkomycin der Azacy-clobutan-Rest. Die heterocyclische Aminosäure ist in keinem der beschriebenen Polyoxine enthalten.

Der erfindungsgemäss herstellbare Wirkstoff weist eine starke fungitoxische Wirkung auf. Er schädigt normalerweise Kulturpflanzen in den zur Bekämpfung von Pilzen und Bakterien notwendigen Konzentrationen nicht und hat eine geringe Warmblütertoxizität. Aus diesen Gründen ist er im allgemeinen für den Gebrauch als Planzenschutzmittel zur Bekämpfung von Pilzen geeignet. Fungitoxische Mittel im Pflanzenschutz werden beispielsweise eingesetzt zur Bekämpfung von Plasmo-diophoromycetes, Chytridiomycetes, Zygomycetes, Ascomyce-tes. Basidiomycetes, Deuteromycetes.

Besonders gute Wirkung zeigt der erfindungsgemäss herstellbare Wirkstoff gegen Rosterkrankungen an verschiedenen Kulturpflanzen, wie Puccinia-Arten, Uromyces-Arten, Phrag-midium mucronatum, Botrytis-Arten, vor allem Botrytis cinerea bei Wein, Erdbeeren und Gemüsekulturen, gegen Scleroti-nia-Arten, gegen Echte Mehltaupilze, wie Erysiphe, und Spha-erotheca-Arten. Ferner kann der erfindungsgemäss erhaltene Wirkstoff auch gegen Venturia-Arten, Alternaria-Arten, Pellicularia sasakii, Pyricularia oryzae und Cercospora Arten eingesetzt werden. Ausser der Behandlung der oberirdischen Pflanzenteile können mit dem erfindungsgemäss hergestellten Wirkstoff auch Krankheitserreger bekämpft werden, die die Pflanzen vom Boden her angreifen oder mit dem Saatgut übertragen werden.

Der erfindungsgemäss herstellbare Wirkstoff kann in die üblichen Formulierungen überführt werden, wie Lösungen, Emulsionen, Suspensionen, Pulver, Pasten und Granulate. Diese können in bekannter Weise hergestellt werden, z.B. durch Vermischen der Wirkstoffe mit Streckmitteln, als flüssigen Lösungsmitteln, unter Druck stehenden verflüssigten Gasen und/oder festen Trägerstoffen, gegebenenfalls unter Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln, also Emulgiermitteln und/oder Dispergiermitteln und/oder schaumerzeugenden Mitteln. Im Falle der Benutzung von Wasser als Streckmittel können z.B. auch organische Lösungsmittel als Hilfslösungsmittel verwendet werden. Als flüssige Lösungsmittel kommen im wesentlichen in Frage: stark polare Lösungsmittel, wie Di-methylformamid und Dimethylsulfoxid, sowie Wasser; mit verflüssigten gasförmigen Streckmitteln oder Trägerstoffen sind solche Flüssigkeiten gemeint, welche bei normaler Temperatur und unter Normaldruck gasöfrmig sind, z.B. Aerosol-Treibgas; als feste Trägerstoffe: Natürliche Gesteinsmehle, wie Kaoline, Tonerden, Talkum, Kreide, Quarz, Attapulgit, Montmorillonit und Diatomeenderde, und synthetische Gesteinsmehle, wie hochdisperse Kieselsäure, Aluminiumoxid und Silikate; als Emulgier- und/oder schaumerzeugende Mittel: Nicht-ionogene und anionische Emulgatoren, wie Polyoxyäthylen-Fettsäure-ester, Polyoxyäthylen-Fettalkohol-Äther, z. B. Alkylaryl-poly-

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glycol-äther, Alkylsulfonate, Alkylsulfate, Arylsulfonate sowie Eiweisshydrolysate; als Dispergiermittel: z.B. Lignin, Sulfitablaugen und Methylcellulose.

Die Formulierungen enthalen im allgemeinen zwischen 0,1 und 95 Gew.-% Wirkstoff, vorzugsweise zwischen 0,5 und 90%,

Der Wirkstoff kann als solcher, in Form seiner Formulierungen oder in den daraus bereiteten Anwendungsformen, wie gebrauchsfertige Lösungen, emulgierbare Konzentrate, Emulsionen, Suspensionen, Spritzpulver, Pasten, lösliche Pulver, Stäubemittel und Granulate, angewendet werden. Die Anwendung geschieht in üblicher Weise, z.B. durch Verspritzen, Versprühen, Vernebeln, Verstäuben, Verstreuen, Verräuchern, Vergasen, Giessen, Beizen oder Inkrustieren.

Die Wirkstoffkonzentrationen in den anwendungsfertigen Zubereitungen können in grösseren Bereichen variiert werden. Im allgemeinen liegen sie zwischen 0,0001 und 10%, vorzugsweise zwischen 0,001 und 0,1%.

Bei der Saatgutbehandlung werden im allgemeinen Wirkstoffmengen von 0,1—10 g je kg Saatgut, vorzugsweise 0,5—5 g, benötigt. Zur Bodenbehandlung sind normalerweise Wirkstoffmengen von 1—500 g je cbm Boden, vorzugsweise 10-200 g, erforderlich.

Beispiel A

Sprossbehandlungs-Test / Getreiderost / protektiv (blattzerstörende Mykose)

Zur Herstellung einer zweckmässigen Wirkstoffzubereitung nimmt man 975 Gew.-Teile Wasser und gibt 25 Gew.-Teile Dimethylformamid und 0,06 Gew.-Teile Emulgator (Alkyl-aryl-polyglykoläther) hinzu. Mit diesem Wasser, Dimethylformamid und Emulgator enthaltenden Gemisch wird der Wirkstoff bis zur gewünschten Endkonzentration verdünnt.

Zur Prüfung auf protektive Wirksamkeit inokuliert man einblättrige Weizenjungpflanzen der Sorte Michigan Amber mit einer Uredosporensuspension von Puccinia recondita in 0,l%igem Wasseragar. Nach Antrocknen der Sporensuspension besprüht man die Weizenpflanzen mit der Wirkstoffzubereitung taufeucht und stellt sie zur Inkubation für 24 Stunden bei etwa 20 °C und einer 100%igen Luftfeuchtigkeit in ein Gewächshaus.

Nach 10 Tagen Verweilzeit der Pflanzen bei einer Temperatur von 20 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 80—90% wertet man den Besatz der Pflanzen mit Rostpusteln aus. Der Befallsgrad wird in Prozenten des Befalls der unbehandelten Kontrollpflanzen ausgedrückt. Dabei bedeutet 0% keinen Befall und 100 % den gleichen Befallsgrad wie bei der unbehandelten Kontrolle. Der Wirkstoff ist umso wirksamer, je geringer der Rostbefall ist.

Wirkstoffe, Wirkstoffkonzentrationen in der Spritzbrühe und Befallsgrade gehen aus der nachfolgenden Tabelle A hervor:

5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

628 373 6

Tabelle A

Sprossbehandlungs-Test/Getreiderost/protektiv

Wirkstoff Wirkstoffkonzentration Befall in %

in der Spritzbrühe in Gew.-% der unbehandelten Kontrolle unbehandelt 100

jT\

kaX CG-NH-V y 0,0025 70

^ ^ 0 (bekannt)

Polyoxin 0,001 0

(bekannt) 0,00025 20

0,0001 70

Nikkomycin 0,001 0

0,00025 15

0,0001 45

Beispiel B Botrytis-Test (Bohnen)/protektiv Lösungsmittel: — Gewichtsteile

Dispergiermittel: — Gewichtsteile

Wasser: 100 Gewichtsteile

Man vermischt die für die gewünschte Wirkstoffkonzentration in der Spritzflüssigkeit nötige Wirkstoffmenge mit der entsprechenden Menge Wasser.

Mit der Spritzflüssigkeit bespritzt man Pflanzen von Vicia faba mit 2-4 Blattpaaren bis zur Tropfnässe. Nach 24 Std. werden je Pflanze 2 Blattpaare abgenommen und in je eine mit feuchtem Fliesspapier ausgelegte Petrischale gelegt. Danach werden Filterpapierscheibchen von 1 cm Durchmesser in eine wässrige Konidiensuspension von Botrytis cinerea getaucht und auf die Blätter ausgelegt. Die Schalen werden verschlossen. Nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden und einer Inkubationstemperatur von 20 °C werden die unter den Scheibchen sichtbaren Nekrosen nach Häufigkeit des Auftretens bonitiert. Die erhaltenen Boniturwerte werden auf Prozent Befall umgerechnet. 0% bedeutet keinen Befall, 100% bedeutet, dass die Pflanzen vollständig befallen sind.

Wirkstoffe, Wirkstoffkonzentration und Ergebnisse gehen aus der nachfolgenden Tabell B hervor:

Tabelle B Botrytis-Test (Bohnen)/protektiv

Wirkstoff Befall in % bei einer

Wirkstoffkonzentration von 0,0062% 0,0031%

Polyoxin (bekannt) 31 80

Nikkomycin 12 16

Beispiel C Uromyces-Test (Bohnenrost)/protektiv Lösungsmittel: — Gewichtsteile

Emulgator: - Gewichtsteile

Wasser: 100 Gewichtsteile

Man vermischt die für die gewünschte Wirkstoffkonzentration in der Spritzflüssigkeit notwendige Wirkstoffmenge mit der entsprecheden Menge Wasser.

Mit der Spritzflüssigkeit bespritzt man die jungen Bohnenpflanzen, die sich im 2-Blattstadium befinden, bis zur Tropfnässe. Die Pflanzen verbleiben zum Abtrocknen 24 Stunden bei 20-22 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 70% im Gewächshaus. Anschliessend werden sie mit einer wässrigen Uredosporensuspension des Bohnenrosterregers (Uromyces phaseoli) inokuliert und 24 Stunden lang in einer dunklen Feuchtkammer bei 20-22 °C und 100% relativer Luftfeuchtigkeit inkubiert.

Die Pflanzen werden dann unter intensiver Belichtung für 9 Tage bei 20-22 °C und einer relativen Luftfeuchigkeit von 70-80% im Gewächshaus aufgestellt.

10 Tage nach der Inokulation wird der Befall der Pflanzen in % der unbehandelten, jedoch ebenfalls inokulierten Kontrollpflanzen bestimmt.

0% bedeutet keinen Befall, 100% bedeutet, dass der Befall genau so hoch ist wie bei den Kontrollpflanzen.

Wirkstoffe, Wirsktoffkonzentrationen und Ergebnisse gehen aus der nachfolgenden Tabelle C hervor:

Tabelle C Uromyces-Test/protektiv

Wirkstoff Befall in % des Befalls der

45 unbehandelten Kontrolle bei einer Wirkstoffkonzentration (in % ) von 0,0031 'Yc

50

31

Herstellung von Nikkomycin Die Nährlösung, in der der Produzentenstamm Streptomy-60 ces tendae TÜ 901 kultiviert wird, setzt sich aus 2% Sojamehl und 2% Mannit zusammen; der pH wird vor dem Sterilisieren auf pH 7,5 eingestellt. 10 x 500-ml-Erlenmeyerkolben mit 1 seitlichen Einstich, die je 100 ml Nährlösung enthalten, werden mit dem Produzentenstamm beimpft und 48 Stunden bei 65 27 °C auf einer rotierenden Schüttelmaschine bei 120 Umdrehungen/Minute inkubiert. Mit dieser Vorkultur wird ein 10 1-Fermenter («New Brunswick»), der 10 1 Nährlösung enthält, beimpft, bei 220 Umdrehungen/Minute, 41 Luftzufuhr/Minute

30

35

'0

CH-

55

—CG-NH—f' S \ /

0 G (bekannt) Nikkomycin

7

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und 27 °C 48 Stunden inkubiert. Mit diesem Vorfermenter wird ein 1001-Fermenter («New Brunswick»), der 100 1 Nährlösung enthält, beimpft, bei 150 Umdrehungen/Minute, 450 1 Luftzufuhr/Minute und 27 °C 78 Stunden inkubiert.

Die Kultur wird unter Zugabe von 2% Filterhilfsmittel s (Hyphlo SuperceI(RI, Johns Mansville) mit einer Filterpresse zuerst über ein Vorklärfilter (C 150, Schenk) und danach über ein Nachklärfilter (U 1000, Schenk) abgepresst. Das klare Kulturfiltrat wird mit Essigsäure auf pH 4,0 angesäuert und auf eine mit Dowex 50 W X 4(Ri (50—100 mesh, Na+-Form) io gefüllte Säule (100 x 450 mm) aufgetragen. Die Fliessgeschwindigkeit beträgt 10 1/Stunde. Es wird so lange mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis die aus der Säule austretende Flüssigkeit völlig farblos ist. Das Antibioticum wird mit je 30 ml 0,01 n-Ammoniak und 0,05 n-Ammoniak eluiert. Das 15 biologisch aktive Eluat wird am Rotationsverdampfer vom Ammoniak befreit, mit Essigsäure auf pH 4,0 angesäuert und auf eine mit «Amberlite 252»(R1 (Na+-Form) gefüllte Säule (70 x 900 mm) aufgetragen. Die Fliessgeschwindigkeit beträgt 5 1/Stunde. Es wird so lange mit entionisiertem Wasser gewa- 20 sehen, bis die aus der Säule austretende Flüssigkeit völlig farblos ist. Das Antibioticum wird mit 15 ml 0,05 n-Ammoniak eluiert. Das biologisch aktive Eluat wird am Rotationsverdampfer vom Ammoniak befreit, auf ein kleines Volumen eingeengt (11), mit Essigsäure auf pH 4,0 angesäuert und auf eine 25 mit SP-Sephadex C-25 gefüllt Säule (25 x 850 mm) aufgetragen. Die Fliessgeschwindigkeit beträgt 100 ml/Stunde. Mit entionisiertem Wasser wird so lange gewaschen, bis im UV-

Durchfluss-Detektor bei 280 nm (Uvicord II, LKB) keine Absorption mehr angezeigt wird. Mit 0,01 m-Pyridin-Acetat-Puf-fer (pH 4,7) werden Verunreinigungen und mit 0,02 m-Pyri-din-Acetat-Puffer (pH 4,7) wird das Antibioticum eluiert. Die biologisch aktiven Fraktionen werden vereinigt, am Rotationsverdampfer vom Puffer befreit und auf ein sehr kleines Volumen eingeengt. Das Konzentrat (10 ml) wird auf eine mit Bio-Gel P 2 (200-400 mesh) gefüllte Säule (25 x 1500 mm) aufgetragen und mit entionisiertem Wasser eluiert. Die Fliessgeschwindigkeit beträgt 100 ml/Stunde. Zur Reinheitskontrolle wird mit einem UV-Durchfluss-Detektor bei 28 nm de-tektiert. Die biologisch aktiven Fraktionen werden vereinigt und in einer Gefriertrocknungsanlage lyophilisiert.

Im obigen Herstellungsbeispiel werden, zum Teil mit Warenzeichenbezeichnung, Reagenzien, Hilfsmittel und technische Geräte folgender Firmen genannt:

a) Fermenter der Firma New Brunswick Scientific Corporation Inc., New Brunswick, New Jersey/USA

b) Hyphlo Supercel(R1, Firma Johns, Mansville, Cal., USA

c) Filterpressen C 150 und U 1000 der Firma Schenk, Filterbau, Schwäbisch-Gmünd, BRD

d) Dowex(R\ Warenzeichen der Firma Dow Chemical Co., Midland, Michigan/USA

e) Amberlite(Rl, Warenzeichen der Firma Rohm and Haas Co., Philadelphia, Pennsylvania/USA

f) SP-Sephadex(RI, Warenzeichen der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Upsala/Schweden g) Uvicord(RI II, Firma LKB, Bromma, Schweden.

1 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

1. 628 373

   2

   PATENTANSPRÜCHE

   1. Verfahren zur Herstellung des neuen Antibioticums Nikkomycin mit folgender vorgeschlagener Formel

   HN"'

   HO

   C

   ÇH,

   :00;

   r* rj pt* r%r\ AT'

   w *"* .Tl"" v i

   OH

   und welches a) farblos ist, in Wasser und Pyridin sehr gut löslich ist, in sonstigen organischen Lösungsmitteln aber unlöslich ist, und welches eine positive Reaktion mit Ninhydrin, Natriummeta-perjodat-Benzidin und Kaliumpermanganat zeigt, und welches mit Eisen-(III)-chlorid eine Gelbfärbung ergibt;

   b) die in den Fig. 1 und 2 angegebenen UV- und IR-Spek-tren besitzt;

   c) bei chemischem Abbau Uracil, eine Amino-hexuron-säure und eine einen Pyridinring enthaltende Aminosäure ergibt;

   d) sich bei der Papierelektrophorese als amphotere Substanz erweist und einen isoelektrischen Punkt bei etwa pH 6 besitzt;

   e) aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff 25 besteht,

   durch aerobes Züchten von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, dass man Stämme der Ordnung Actinomyceta-les, der Familie Streptomycetaceae in wässrigem Nährmedium züchtet und das Nikkomycin anschliessend isoliert.

   30 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendeten Stämme aus der Gattung der Streptomy-ces stammen.
2. 3. Verwendung des neuen Antibioticums Nikkomycin mit 35 folgender vorgeschlagener Formel v

   ; 1

   n.*

   i i

   ■ j

   C-irH~;

   als Wirkstoffkomponente in fungiziden Mitteln.