CH628681A5 - Procede d'obtention de proteines a partir de methanol. - Google Patents

Procede d'obtention de proteines a partir de methanol. Download PDF

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CH628681A5 CH1529577A CH1529577A CH628681A5 CH 628681 A5 CH628681 A5 CH 628681A5 CH 1529577 A CH1529577 A CH 1529577A CH 1529577 A CH1529577 A CH 1529577A CH 628681 A5 CH628681 A5 CH 628681A5
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Description

628681
2
REVENDICATION
Procédé d'obtention de protéines à partir de méthanol utilisant des micro-organismes méthylotrophes, caractérisé par le fait que l'on utilise des souches méthylotrophes facultatives utilisant le méthanol par la voie de la serine, ayant une affinité accrue pour le méthanol et une diminution du temps de génération sur le substrat méthanol, et pouvant croître dans un milieu à substrat méthanol contenant 0,5 à 2% de glycine, et cultivées de façon aérobie.
La présente invention concerne un procédé d'obtention de protéines à partir de méthanol à l'aide de souches de microorganismes améliorées quant à leurs performances d'utilisation du méthanol (vitesse, rendement biomasse/méthanol, affinité pour le méthanol).
Dans les procédés de production de protéines à partir d'organismes unicellulaires, la souche de micro-organisme a une importance considérable. Pour l'utilisation d'un substrat carboné donné, de la souche dépendent, d'une part, la valeur biologique du produit (absence de toxicité, valeur nutritionnelle, etc.), d'autre part, les conditions économiques de la production industrielle en continu des protéines. Ce sont en particulier les performances cinétiques delà souche qui imposent la taille de l'installation industrielle et donc l'investissement nécessaire.
Le procédé mis au point par la titulaire permet d'utiliser les souches améliorées de micro-organismes méthylotrophes utilisant le méthanol par la voie métabolique dite de la sérine. L'amélioration des souches, rendant leurs performances cinétiques compatibles avec le développement d'un procédé industriel de production en continu de protéines à partir de méthanol, peut s'appliquer à un grand nombre de micro-organismes. Citons, de façon non limitative, les micro-organismes des genres suivants: Bacillus, Micrococcus, Arthrobacter, Flavobacterium, Pseudomonas, Aeromonas, Methylo-monas, Rhodopseudomonas, Methylococcus, Klebsiella, Rhodospiril-lum, Rhodomicrobium, Hyphomicrobium, Acinetobacter, Achromo-bacter, Moraxella.
Les micro-organismes méthylotrophes facultatifs utilisant le méthanol par la voie de la sérine sont très répandus. Ceux qui ont été isolés par les méthodes traditionnelles (repiquages successifs sur milieu avec du méthanol comme seule source carbonée) ont des performances cinétiques souvent médiocres.
Quelques-uns sont décrits dans la littérature, en particulier dans les textes suivants: W. Härder, MM. Atwood, J.R. Quayle, «J. Gen. Microbiol.» (1973), 78,155-163, Asthana et coll., «Biotechnol. Bioeng.» (1971), 13,923, et (1971), 8, 923, M. Reuss et coll., «Eur. J. Appi. Microbiol.» (1975), 1,295-305, Whittenbury et al., «J. Gen. Microbiol.» (1970), 61,205, Hirsh et Conti, «Archiv. Fin. Mikrobiologie» (1964), 45:358, Ogata et coll., «J. Ferment. Technol.» (1970), 75:470.
Les méthodes d'isolement de souches par sélection continue permettent certes d'isoler des souches performantes, mais l'expérimentation est longue (au moins un mois d'expérimentation en fermenteur continu), délicate et les résultats aléatoires. D'autre part, on ne réalise ainsi qu'un enrichissement, et il est indispensable d'isoler à partir de la flore complexe obtenue le micro-organisme le plus performant.
La titulaire a découvert que, parmi les souches métabolisant le méthanol par la voie de la sérine, la résistance à la glycine entraîne habituellement une utilisation accrue du méthanol (augmentation de um, diminution du Ks méthanol).
Elle a élaboré un procédé qui permet d'utiliser, pour la fabrication de protéines à partir de méthanol, une souche améliorée de l'une quelconque des souches présentant la caractéristique précitée (utilisation du méthanol par la voie de la sérine). L'amélioration de cette souche méthylotrophe consiste, d'une part, en une augmentation de l'affinité pour le méthanol (diminution du Ks) et, d'autre part, en une diminution du temps de génération sur substrat carboné méthanol.
Ces souches méthylotrophes améliorées se distinguent des souches sauvages dont elles sont issues par leur résistance à l'effet de la glycine.
1. La souche méthylotrophe améliorée reste insensible à l'action de la glycine, pour des concentrations en cet acide aminé au moins dix fois supérieures à celles provoquant un début d'inhibition de l'utilisation du substrat méthanol (augmentation du Ks) chez la souche sauvage.
2. La souche méthylotrophe améliorée peut croître sur un milieu composé de substrat méthanol et de glycine (0,5 à 2%), alors que la souche sauvage correspondante est incapable de croître en présence de ces concentrations de glycine.
Le procédé selon l'invention est défini à la revendication.
La culture de la souche à améliorer est effectuée de préférence de la manière suivante:
Les cellules sont récoltées de préférence en phase exponentielle de croissance, puis étalées sur le crible de sélection (milieu solide pour micro-organismes méthylotrophes + 0,5 à 2% de glycine) soit directement, soit après l'action préalable d'un agent mutagene physique ou chimique.
Toutes les souches ainsi sélectionnées présentent le caractère de résistance à la glycine (en concentration de 0,5 à 2%).
On décrit ci-après un mode d'exécution avantageux du procédé.
Les souches améliorées sont inoculées dans un milieu de culture qui comprend des sels minéraux, de l'azote sous forme minérale et du méthanol en une concentration variable de 0,1 à 2% (poids/volume). Le méthanol stérilisé par filtration est ajouté au milieu autoclavé à 120°C durant 30 min. Le pH est à ajuster entre 6 et 8.
La culture est effectuée en fioles stériles, avec une agitation telle que l'aération ne soit pas limitante, et à des températures pouvant varier de 25 à 45° C.
Les récoltes de cellules sont faites par centrifugation. La mesure des taux de croissance spécifique est faite en mesurant l'augmentation du poids sec de cellules par unité de volume en fonction du temps. La concentration du méthanol dans le milieu de culture est mesurée par Chromatographie en phase gazeuse.
Les souches obtenues peuvent être employées non seulement pour la synthèse de protéines à partir du méthanol, mais aussi pour l'épuration biologique du méthanol d'un effluent, la diminution éventuelle du méthanol dans des boissons fermentées et en général dans toute fermentation impliquant le méthanol en tant que substrat carboné.
Les exemples suivants illustrent l'invention.
Exemple 1:
Une souche identifiée comme étant du genre Pseudomonas stuzeri est mise en culture sur le milieu suivant:
Milieu de culture (Mi)
NH4C1:
3g
Na2HP04:
3g
KH2P04:
0,5 g
CaCl2:
0,01g
FeS04:
0,001 g
ZnCl2:
0,001 g
MnS04:
0,001 g
MgS04:
0,5 g
CH3OH:
5g eau q.s.p.
11
pH ajusté à 6,8
La température de culture est de 30° C.
Le temps de génération de cette souche est alors de 120 min et sa constante d'affinité apparente pour le méthanol est Ks = 1090 ppm.
La production effective de biomasse au bout de 3 d de culture est de 0,30 g/1 g de méthanol.
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La suspension cellulaire récoltée de cette culture est diluée dans Souche sauvage l'eau physiologique de manière à établir 108 à 10® cellules/ml, avant g = 120 min étalement sur milieu M, gélosé à 2,5% et complété avec 2% de Ks = 1090 ppm glycine.
Les boîtes de Pétri sont placées à l'étuve à 30° C. L'apparition de mutants résistants se manifeste au bout de quelques jours. Les colonies sont prélevées et ensemencées en milieu liquide (Mj) afin de tester leurs caractères méthylotrophes.
On obtient plusieurs mutants résistants à la glycine. L'étude des performances cinétiques d'un de ces mutants a donné les résultats suivants sur le milieu de culture
— temps de génération: 100 min
— Ks de méthanol: 20 ppm
La production effective de biomasse au bout de 3 d de culture est de 0,40 g/1 g de méthanol.
Exemple 2:
D'autres mutants de la souche citée en 1, résistant à 2% de glycine, ont été isolés avec un traitement préalable de la suspension cellulaire avec 2% d'éthylméthanesulfonate durant 2 h à 30° C à pH 7,4. On constate les mêmes améliorations que sur le mutant de Souche sauvage l'exemple 1, à savoir diminution du temps de génération et surtout g = 4 h 20 min forte diminution du Ks: Ks = 450 ppm
Souche mutante g = 88 min Ks = 20 ppm
Exemple 3:
Le traitement utilisé dans le premier exemple est appliqué à une souche de Pseudomonas aeruginosa méthylotrophe. On isole sur crible de sélection (milieu + 0,5% glycine) les mutants résistant à la glycine.
Les performances cinétiques de ces nouvelles souches (sur milieu Mj) sont nettement améliorées par rapport au sauvage.
Souche sauvage g = 5% h Ks = 830 ppm
Souche mutante g = 3 Vi h Ks = 100 ppm
Exemple 4:
Le traitement utilisé dans le premier exemple est appliqué à une souche de Micrococcus varions méthylotrophe et a permis d'isoler des souches présentant sur méthanol des performances améliorées par rapport à la souche sauvage.
Souche mutante g = 31/2 h Ks = 150 ppm
R
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