CH628738A5

CH628738A5 - Immunologisches diagnose-reagenz.

Info

Publication number: CH628738A5
Application number: CH954277A
Authority: CH
Inventors: Gaetano Dr Roncari
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1977-08-03
Filing date: 1977-08-03
Publication date: 1982-03-15
Also published as: FR2399665A1; JPS5428816A; US4226747A; GB2001996A; DE2833886A1; EP0000772A1; NL7808143A; FR2399665B1; AU3840778A; GB2001996B; SE7808349L; DK343678A; CA1103153A; AU528150B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft wertvolle diagnostische Reagenzien, ein Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung bei immunologischen Bestimmungen.

Die Diagnose von pathologischen oder anderen Zuständen in Menschen und Tieren wird oft unter Anwendung von immunologischen Prinzipien durchgeführt. Diese Prinzipien werdeh zum Nachweis von Antikörpern oder Antigenen in den Körperflüssigkeiten des Lebewesens benützt. Ein Antigen ist eine fremde Substanz, welche, wenn sie dem Lebewesen appliziert wird, die Bildung von gewissen löslichen und als Antikörper bezeichneten Substanzen bewirkt. Irgendeine Substanz wie z. B. ein Protein, welche normal nicht in einem bestimmten Lebewesen vorhanden ist, kann die Bildung von Antikörpern verursachen, wenn sie dem Lebewesen unter geeigneten Bedingungen appliziert wird.

Nach ihrer Bildung reagieren die Antikörper mit den Antigenen und schützen auf diese Weise, im Fall eines Bakterienoder Virus-Fremdkörpers, gegen Infektionen.

Immunologische Testverfahren beruhen auf der Antigen-Antikörper-Reaktion, welche sich gewöhnlich durch Unlöslichkeit oder Agglutination manifestiert.

Im allgemeinen wird die Anwesenheit eines Antigens oder eines Antikörpers dadurch bestätigt oder bestimmt, dass man den entsprechenden Antikörper oder das entsprechende Antigen einer Körperflüssigkeit des Lebewesens, meistens Urin, Blutserum oder einem speziell behandelten Blutextrakt, zugibt. Es können jedoch auch andere Körperflüssigkeiten verwendet werden. Man stellt die Anwesenheit bzw. die Abwesenheit des Antikörpers oder des Antigens in der Körperflüssigkeit des Lebewesens fest, indem das Eintreten oder Nichteintreten einer Antigen-Antikörperreaktion festgestellt wird.

Weil einige Komplexe sich nur sehr langsam bilden und sehr geringe Teilchengrössen besitzen, ist es notwendig, Träger zu benützen, um sie sichtbar zu machen. In einer bisher bevorzugten Methode wurden der Antikörper bzw. das Antigen mittels eines Carbodiimids über eine Amidbindung an diskreten Teilchen von carboxylierten Latexpolymeren, wie z. B. von car-boxylierten Copolymeren aus Butadien und Styrol, gebunden.

Diese Methode hat jedoch den Nachteil, dass während der Kupplung des Proteins (Antikörper oder Antigen) an die Latexteilchen, wegen der Verwendung von Carbodiimiden als Nebenreaktion eine unerwünschte Vernetzung des eingesetz2

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ten Proteins eintritt und somit ein Teil der oft sehr teuren Proteine für die Kupplung mit dem Träger verloren geht.

Die vorliegende Erfindung betrifft nun neuartige polymere Träger, mit weichen die obigen Nachteile vermieden werden können und welche mit einem breiten Spektrum von immunologisch aktiven Materialien ein diagnostisch verwendbares Reagenz bilden können, das stabil, spezifisch und empfindlich ist und eine leicht nachweisbare visuelle Bewertung in sehr kurzer Zeit ermöglicht.

Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung ein wasserunlösliches Reagenz für eine immunologische Bestimmung mit einem etwa dem von Wasser entsprechenden spezifischen Gewicht in Form diskreter Latexteilchen, an welche ein immunologisch aktives Material gebunden ist, dadurch gekennzeichnet, dass der Latex aus einer Dispersion von Partikeln von Vinylpolymerisaten besteht, die als Endgruppen Gruppen der Formel:

nh2

tragen, wobei die Partikel aus einem Kern von Vinyl-und/oder Dienpolymerisat, das Carboxyl- und/oder Sulfonat-funktionen trägt, und aus einer äusseren Schicht von Vinylpo-lymerisat, das als Endgruppen Gruppen der Formel:

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nh2

trägt, gebildet sind und einen mittleren Durchmesser zwischen 0,03 und 5 |xm haben.

Weiter bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Reagens, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man den Latex nach Diazotierung oder in Gegenwart von geeigneten polyfunktionellen Reagenzien mit dem immunologisch aktiven Material umsetzt.

Als «immunologisch aktive Substanzen» können all jene Bestandteile in physiologischen Flüssigkeiten, Zell- und Gewebeextrakten genannt werden, für die ein immunologischer Reaktionspartner vorhanden ist oder gebildet werden kann. Dazu gehören Amine, Aminosäuren, Peptide, Proteine, Lipoproteine, Glycoproteide, Sterine, Steroide, Lipoide, Nuclein-säuren, Enzyme, Hormone, Vitamine, Polysaccharide und Alka-loide. Bevorzugte immunologisch aktive Substanzen sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:

Tabelle I

I. Antigene gewonnen aus Mikroorganismen Bakterien

1. Gram-positive Kokken Streptokokken (Pyogene, Fecalis und Viridans) Staphylokokken (aureus und albus) Pneumokokken (D. pneumoniae)

2. Gram-negative Kokken Neisseria (gonorrhoeae und meningitidis)

3. Gram-positive, aerobe Bazillen Bacillus anthracis Corynebacterium diphtheriae Erysipelothrix

Listeria monocytogenes

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4. Gram-positive, anaerobe Bazillen Clostridia (botulinum, perfringens, welchii und tetani)

5. Gram-negative, anaerobe Bazillen Bacteroides

6. Gram-negative, intestinale Bazillen Escherichia

Klebsiella

Enterobacter

Proteus

Pseudomonas

Salmonella

Shigella

7. Gran-negative, nicht intestinale Bazillen Pasteurella (pestis und tularensis)

Hemophilus influenza

Brucella (melitensis, abortus und suis)

Brodetella pertussis Malleomyces

8. Spirocheten Treponema pallidum Leptospira Borrelia

9. Mycoplasma

10. Mycobakterien

11. Vibrio

12. Actinomyces

Protozoen

1. Intestinale Protozoen Amöben

2. Flagellates Trichomonas Leishmania Trypanosomes Toxoplasma (T. Gondii)

3. Sporozoen

Plasmodia (vivax, falciparum, malariae und ovale)

Pilze

1. Sporotrichum

2. Cryptococcus

3. Blastomyces

4. Histoplasma

5. Coccidioides

6. Candida

Viren und Rickettsien

1. Rickettsia

2. Viren Hundehepatidis Shope papilloma Influenza A & B Hühnerpest Herpes simplex Adenoviren Polyoma

Rous sarcoma

Vaccinia

Poliovirus

Röteln

Hundestaupe

Leukemia

Mumps

N ewcastle-Krankheit (Haushuhnkrankheit)

Sendai

ECHO

Maul- und Klauenseuche Psittacosis

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Rabis

Ectromelia

Arborviren

II. Fremde Antigene Polysaccharide Hyaluronidase Tetanus-toxin Eiovalbumin Schafserumalbumin menschliches Plasma-gamma-globulin menschliches Serum-albumin

III. Natürliche Antigene

1. Hormone Insulin Glucagon Thyroid-Hormone Choriongonadotropin Chorion-Wachstumshormon - Prolactin

2. Enzyme Pancreas-chymotrypsinogen Procarboxypeptidase Deoxyribonuclease Ribonuclease

Catalase

Creatin-Phosphokinase

3. Organspezifische Antigene Niere

Leber Haut

Herz (Myoglobin)

gastrointestinaler Trakt Prostata

Embryo-Antigene (z. B. CEA-Antigen)

Tumor-Antigene

4. Bindegewebekomponenten Muskel

Collagen Amyloid

5. Blutzellenantigene, Blutgruppensubstanzen und andere Isoantigene

Plättchen

Megakaryocyten

Leucocyten

Erythrocyten

Blutgruppensubstanzen

Forssman-Antigen

Histoverträglichkeits-Antigene

6. Plasmaproteine Fibrin und Fibrinoid Plasminogen und Plasmin

7. Pathologische Globuline

Myelamo, makroglobulinaemische und dysglobulinaemische Proteine

Rheumatoidfaktor C-reaktionsfähiges Protein

IV. Natürliche Antikörper

1. Natürliches Gammaglobulin

Natürliche Antikörper - nephrotoxische Antikörper Komplement

2. Auto-Antikörper antinuclearer Faktor Thyroidautoantikörper Adrenalautoantikörper

Autoantikörper für gastrisch-parietale Zellen bei perniziöser .Anämie

Autoantikörper für Spermatozoen

Muskel-Autoantikörper bei Myasthenia gravis Autoantikörper für Nervengewebe

Autoantikörper gegen faserartiges Gewebe und Vaskularkom-ponenten

5 Autoantikörper gegen Plättchen und Megakaryocyten Antikörper gegen Trophoblasten

3. Induzierte Antikörper gegen:

Immunoglobulinkiassen IgG, IgA, IgM oder unterschiedliche Spezies

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V. Haptenische Verbindungen Opiumalkaloid (Morphin)

Antipyrin Barbitursäure

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Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind besonders bevorzugte immunologisch aktive Substanzen Albumin, Rheumatoidfaktor, menschliches Immunoglobulin IgG und Antikörper gegen IgG.

20 Unter Vinylpolymerisaten, die den Kern der Partikeln bilden, versteht man Homopolymerisate von Monomeren, wie Styrol und seine Derivate: Methylstyrole, Äthylstyrole, Vinylto-luol; Vinylchlorid, Vinylidenchlorid; Vinylacetat; Acrylderivate, wie Alkylacrylate und -methacrylate (Alkyl mit 1 bis 10 Kohlen-25 Stoffatomen), die gegebenenfalls hydroxyliert sind, wie 2-HydroxyäthyIacrylat und-methacrylat und 2-Hydroxypro-pylacrylat und -methacrylat; Acrylnitril und Methacrylnitril; sowie Copolymerisate dieser Monomeren untereinander und/ oder mit modifizierenden Vinylcomonomeren, wie Divinylben-3o zol, Acrylamid und Methacrylamid und deren N-substituierte Derivate, wie z. B. Methylolacrylamid; diese Comonomere stellen bis zur 5 Gew.-% des Copolymerisates dar.

Unter Dienpolymerisaten, die den Kern biiden, versteht man Homopolymerisate des Butadiens und seiner Derivate: 35 Chloropren, Isopren; sowie die Copolymerisate dieser Monomeren untereinander und/oder mit Vinylmonomeren, wie sie oben genannt wurden, in allen Mengenverhältnissen und/oder mit modifizierend wirkenden Vinylmonomeren, wie sie oben aufgezählt wurden, deren Menge in dem Copolymerisat bis zu 5 40 Gew.-% ausmacht.

Die Vinylpolymerisate, welche die äussere Schicht der Partikel bilden, sind Homopolymerisate von Monomeren, wie Styrol und seine Derivate, z. B. Methylstyrole, Äthylstyrole Vinyl-toluol; gegebenenfalls hydroxylierte Alkylacrylate und Alkyl-*5 methacrylate (Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen); Acrylnitril und Methacrylnitril; sowie Copolymerisate dieser Monomeren untereinander und/oder mit modifizierend wirkenden Vinylcomonomeren, wie Divinylbenzol, Acrylamid und Methacrylamid sowie deren N-substituierte Derivate, wie Methylol-5o acrylamid, die bis zu 5 Gew.-% des Copolymerisats ausmachen können.

In den Partikeln stellt das Kernpolymerisat 30 bis 99,5 Gew.-%, vorzugsweise 60 bis 99 Gew.-%, und das Polymerisat der äusseren Schicht 70 bis 0,5 Gew.-%, vorzugsweise 40 bis 1 55 Gew.-%, dar.

Die Polymerisatpartikel, deren Kornverteilung je nach den gewünschten Eigenschaften des Latax und den in Betracht gezogenen Anwendungen breit oder eng sein kann, haben einen mitleren Durchmesser zwischen 0,03 und 5 |im, vorzugs-6o weise zwischen 0,05 und 1 um. Sie stellen bis zu 60Gew.-%, vorzugsweise bis zu 45 Gew.-%, des Latex dar. Jedoch kann der Latex ohne weiteres verdünnt oder konzentriert werden.

Das Kernpolymerisat kann hergestellt werden durch Emulsionspolymerisation des oder der Vinylmonomeren und/oder 65 Dienmonomeren in Gegenwart von mindestens einer äthylenischen Mono- oder Polycarbonsäure, die mit dem oder den Monomeren copolymerisierbar ist, und/oder mindestens eines copolymerisierbaren ungesättigten Alkaliorganosulfonats;

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dann wird das Polymerisat der äusseren Schicht hergestellt dem Reaktionsmedium beliebige Verbindungen zuzusetzen, die durch Emulsionspolymerisation des oder der Vinylmonomeren entweder die Ionenstärke des Mediums und demzufolge die in Gegenwart des Latex des Kernpolymerisates, der oben Kornverteilung zu modifizieren vermögen, wie Mineralsalze,

erhalten wurde, und in Gegenwart eines Kettenübertragungs- Elektrolyten, in einer Menge bis zu 3 Gew.-%, bezogen auf die mittels. s Monomeren, oder die den pH-Wert des Mediums zu modifizie-

Die bei der Polymerisation des Kernpolymerisates und bei ren vermögen, wie beispielsweise Puffer, Säuren, Basen. Jedoch der Polymerisation des Polymerisates der âusséren Schicht ver- wurde in bestimmten Fällen festgestellt, dass es zur Begünsti-wendeten Monomeren sind die oben aufgezählten Monome- gung der Copolymerisation zu bevorzugen ist, wenn das ren. Sie werden entweder alle vor der Polymerisation verwen- Medium neutral oder sauer ist.

det oder zum Teil vor der Polymerisation verwendet, wobei der io Die Polymerisationstemperatur, die eine Funktion des verrestliche Teil im Verlauf der Polyerisation in aufeinanderfol- wendeten Initiators und des herzustellenden Polymerisats ist, genden Fraktionen oder kontinuierlich zum Reaktionsmedium liegt im allgemeinen zwischen -5 und +90 °C.

gegeben wird, oder alle im Verlauf der Polymerisation in auf- Die erhaltenen Latices weisen Polymerisatpartikel mit einanderfolgenden Fraktionen oder kontinuierlich zugesetzt. einem Durchmesser zwischen 0,03 und 5 um, vorzugsweise zwi-

Als copoiymerisierbare äthylenische Mono- oder Polycar- is sehen 0,05 und 1 j-im, auf. Diese Partikel sind im allgemeinen bonsäuren seine Acrylsäure, Methacrylsäure, Maleinsäure, nicht kalibriert, aber es ist möglich, sie kalibriert zu erhalten, Fumarsäure, Crotonsäure, Sorbinsäure, Zimtsäure, Itacon- wenn man bekannte Kalibrierverfahren für die Emulsionspo-säure, Aconitsäure genannt, die in Mengen zwischen 0,5 und 15 lymerisation anwendet, wie die gesteuerte Zugabe des Emulga-Gew.-%, vorzugsweise zwischen 0,5 und 10 Gew.-%, bezogen tors und/oder des oder der Monomeren und insbesondere die auf das oder die Monomeren, verwendet werden. 20 -Animpfung. Im letzten Falle kann der Emulgator in dem Impf-

Die copolymerisierbaren ungesättigten Alkaliorganosulfo- material enthalten sein.

nate sind z. B. Natriumvinylsulfonat, Natriummethallylsulfonat, Die Partikel sind aus Homopolymerisat oder Copolymeri-Natrium-2-sulfoäthylacrylat, Natrium-2-sulfoäthylmetacrylat, sat mit einer Oberfläche von Carboxyl- und/oder Sulfonatfunk-2-Acrylamido-2-methylpropansulfonat; sie werden in Mengen tionen gebildet. Das Vorhandensein dieser Funktionen kann zwischen 0,1 und 3 Gew-%, bezogen auf das oder die Monome- 25 durch konduktometrische Titration bestätigt werden, ren, verwendet. Die Herstellung des Polymerisates der äussern Schicht

Die copolymerisierbaren äthylenischen Mono- oder Poly- wird in wässriger Emulsion in Gegenwart von Kernpolymeri-carbonsäuren und die copolymerisierbaren ungesättigten Alka- sat, Kettenübertragungsmittel, Initiator und gegebenenfalls liorganosulfonate können einzeln oder in Kombination in den Emulgator ausgeführt.

angegebenen Mengen verwendet werden. 30 Die verwendete Menge des Kernpolymerisats liegt zwi-

Die Herstellung des Kernpolymerisates erfolgt in Emulsion sehen 30 und 99,5 Gew.-% und beträgt vorzugsweise 60 bis 99 nach jedem beliebigen klassischen Verfahren in Gegenwart Gew.-%, bezogen auf die Summe von Kernpolymerisat und zu eines Initiators und eines Emulgators. polymerisierendem Monomeren.

Als Initiator verwendet man vorzugsweise Alkalipersulfate, Das Kettenübertragungsmittel vom Typ Aminophenyldisul-wasserlösliche Diazoderivate oder Redoxsysteme auf Basis 35 fid oder Aminophenylmercaptan ist insbesondere o,o'-Dithio-von Wasserstoffperoxyd, organischen Peroxyden oder bisantilin, p,p-Dithiobisanilin, 2-Mercaptoanilin, 3-Mercaptoani-

Hydroperoxyden in Mengen in der Grössenordnung von 0,01 lin, 4-Mercaptoanilin. Dieses Mittel wird im allgemeinen in bis 5 Gew.-%, vorzugsweise 0,03 bis 3 Gew.-%, bezogen auf auf Lösung in dem oder den Monomeren verwendet, und zwar in das oder die Monomeren. Mengen zwischen 0,1 und 10 Gew.-%, vorzugsweise zwischen

Der verwendete Emulgator kann anionaktiv und/oder nicht 40 0,5 und 5 Gew.-%, bezogen auf das oder die Monomere.

ionogen sein. Es handelt sich um klassische Produkte für die Die für die Polymerisation des oder der Monomeren der

Emulsionspolymerisation. äusseren Schicht erforderlichen Initiatoren sind Diazoinitiato-

Als anionaktive Emulgatoren seien genannt: Salze von Fett- ren, Azonitrile wie Azoi-bis-isobutyronitril oder wie sulfoniert säuren; Alkalialkylsulfate, Alkalialkylsulfonate, Alkalialkylaryl- Azonitrile, wie sie im französischen Patent Nr. 1 233 582 sulfonate, Alkalialkylsulfosuccinate, Alkalialkylphosphate; Sul- 45 beschrieben sind; von diesen kann man erwähnen: Azobis-(iso-fobernsteinsäurealkylester; Sulfonate von Alkylphenolpolygly- butyronitrilnatriumsulfonat), Azobis-(a-methylbutyronitrilnatri-coläthern ; Salze von Estern von Alkylsulfopolycarbonsäuren ; umsulfonat), Azobis-(a-methyl-ß-äthoxycarbonylbutyronitrilna-Kondensationsprodukte von Fettsäuren mit Oxyalkansulfon- triumsulfonat); carboxylierte Azonitrile, wie 4,4'-Azobis-(4-säuren und Aminoalkansulfonsäuren; sulfatierte Derivate von eyanpentansäure) und ihre Salze, Azobis-alkylamidiniumsalze, Polyglycoläthern; sulfatierte Ester von Fettsäuren und Polygly- so wie a,a'-Azobis-isobutyramidiniumchlorid, Azobis-N,N'-di-colen; Alkanolamide von sulfatierten Fettsäuren. methylenisobutyramidiniumchlorid.

Als nichtionogene Emulgatoren kommen Fettsäureester Der Initiator, der in einer Menge von 0,01 bis 3 Gew.-%, vor-

von Polyalkoholen, Alkanolamide von Fettsäuren, Polyäthylen- zugsweise 0,1 bis 2 Gew.-%, bezogen auf das oder die Monomeoxyde, Copolyäthylenoxyd/Propylenoxyd, oxyäthylierte Alkyl- ren, verwendet wird, wird ingesamt oder zum Teil vor der phenole in Betracht. 55 Polymerisation verwendet, wobei der andere Teil im Verlauf

Die zu verwendenden Mengen des oder der Emulgatoren der Polymerisation in nacheinanderfolgenden Fraktionen oder liegen in der Grössenordnung von 0,01 bis 5 Gew.-%, bezogen kontinuierlich zu dem Reaktionsmedium zugesetzt wird, insbe-auf das oder die Monomeren, und ihre Einführung erfolgt ent- sondere wenn die Lebensdauer des Initiators bei der Polymeri-weder insgesamt vor der Polymerisation oder zum Teil vor der sationstemperatur kurz ist. Der Initiator kann auch ingesamt im Polymerisation, wobei der restliche Teil im Verlauf der Polyme- 60 Verlauf der Polymerisation kontinuierlich zum Reaktionsme-risation in nacheinanderfolgenden Fraktionen oder kontinuier- dium zugegeben werden.

lieh zum Reaktionsmedium zugesetzt wird, oder insgesamt im Der allfällige Emulgator wird aus anionaktiven und/oder

Verlauf der Polymerisation in nacheinanderfolgenden Fraktio- nichtionogenen Emulgatoren gewählt, die für die Herstellung nen oder kontinuierlich. des Kernpolymerisats angegeben wurden; er kann gleich oder

Die für die Polymerisation des Kernpolymerisates zu ver- 65 verschieden wie der für die Herstellung der Kernpolymerisates wendende Menge Wasser muss derart sein, dass die Konzentra- verwendete Emulgator sein. Er wird in Mengen von bis zu 10 tion des oder der Monomeren 60 Gew.-% nicht übersteigt. Gew.-%, bezogen auf das oder die Monomeren, verwendet, und

Obgleich es nicht unbedingt erforderlich ist, ist es möglich, seine Einführung kann je nach dem mittleren Durchmesser der

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Latexpartikel, der erhalten werden soll, entweder ingesamt vor temperatur, mit dem diazotierten Träger zur Reaktion der Polymerisation oder zum Teil vor der Polymerisation erfol- gebracht.

gen, wobei der restliche Teil im Verlauf der Polymerisation in In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäs-

nacheinanderfolgenden Fraktionen oder kontinuierlich zuge- sen Verfahrens kann das immunologisch aktive Material mit geben wird, oder sie kann insgesamt im Verlauf der Polymerisa- s Hilfe einer polyfunktionellen Verbindung über ein Zwischen-tion in aufeinanderfolgenden Fraktionen oder kontinuierlich stück an den gemäss vorliegender Erfindung verwendeten erfolgen. Latex gebunden werden.

Die bei der Polymerisation der äusseren Schicht zu verwen- Als polyfunktionelle Verbindungen eignen sich diejenigen, dende Menge Wasser muss derart sein, dass die Konzentration welche mit den aromatischen Aminogruppen des Latexpoly-von Kernpolymerisat und zu polymerisierendem oder zu 10 meren reagieren oder an dem aromatischen Ring des Latexpo-polymerisierenden Monomeren 60 Gew.-%, vorzugsweise 45 lymeren eine Substitutionsreaktion eingehen und gleichzeitig Gew.-%, nicht übersteigt. mit funktionellen Gruppen des immunologisch aktiven Mate-

Die Polymerisationstemperatur, die eine Funktion des rials, wie Amino-, Mercapto-, Carboxyl- und Hydroxylgruppen,

gewählten Initiators ist, liegt im allgemeinen zwischen 5 und reagieren oder eine Substitutionsreaktion an dem aromati-100 °C, vorzugsweise zwischen 40 und 90 °C. i s sehen Ring des immunologisch aktiven Materials eingehen.

Die erhaltenen Latices weisen Polymerisationspartikel auf, Repräsentative Vertreter derartiger polyfunktioneller Verderen Durchmesser zwischen 0,03 und 5 p,m, vorzugsweise zwi- bindungen sind Azo-, Isocyano-, Isothiocyano- oder Aldehyd-schen 0,05 und 1 (j.m, liegt; da die Menge der äusseren Schicht gruppen enthaltenden Verbindungen wie z. B. Bis-diazobenzi-nicht sehr gross ist, modifiziert sie nicht in merklicher Weise din, Bis-diazobenzidin-disulfonsäure, Bis-diazo-p-phenyldiamin, die Grösse der Partikel des Kernpolymerisates. Die Partikel 20 Phenyldiisocyanat, Toluoldiisocyanat, Glutardialdehyd.

können kalibriert sein oder nicht, aber bei bestimmten Anwen- Bei Umsetzung in Gegenwart einer bifunktionellen Verbindungen wird es aus Gründen der Reproduzierbarkeit bevor- dung wird das immunologisch aktive Material in wässrigem zugt, dass sie kalibriert sind, d. h. dass sie eine schmale Korn- Medium, vorzugsweise bei Zimmertemperatur (20 bis 25 °C) grössenverteilung haben. mit dem Träger zur Reaktion gebracht. Die Temperatur kann

Die Latices sind mechanisch und bei der Lagerung sowie 25 jedoch auch zwischen 0 und 40 °C liegen.

gegen Elektrolyten beständig, d. h. sie flocken nicht aus, wenn Die Menge der verwendeten bifunktionellen Verbindung man ihnen Mineralsalze, wie z. B. die Chloride, Nitrate, Borate, hängt ab von der Zahl der Aminogruppen auf dem Latex. VorPhosphate des Natriums, Calciums, Magnesiums Kaliums zugsweise wird ein zehn- bis hundertfacher molarer Überzusetzt. schuss der bifunktionellen Verbindung gegenüber der Zahl der

Die Partikel sind aus Polymerisaten gebildet und weisen 30 Aminogruppen des eingesetzten Latex verwendet.

eine Oberfläche mit Carboxyl- und/oder Sulfonatfunktionen In beiden Ausführungsformen zur Herstellung des erfin-

sowie Gruppen der Formel dungsgemässen Reagenz ist der pH-Wert der Reaktion wichtig.

Er darf nicht so gewählt werden, dass ein Protein-Reaktions-/ \ partner denaturiert wird. In der Regel liegt der pH-Wert zwi-

_ g / Q \ 35 sehen 5 und 9. Dieser pH-Wert wird unter Verwendung von

\ ^ geeigneten üblichen Puffer-Systemen wie Phosphatpuffer und j^j j_| dergleichen, aufrechterhalten.

2 Das Endprodukt ist ein wasserunlösliches Material, welches in einer wässrigen Pufferlösung vom pH-Wert 5,0 bis 9 suspen-auf. 40 diert ist, wobei der pH-Wert der Lösung von dem im einzelnen

Obgleich die äussere Schicht auf dem Kernpolymerisat verwendeten System und von den Anforderungen an die Stabi-polymerisiert wird, bleiben die Carboxyl- und/oder Sulfonat- lität des immunologisch aktiven Materials abhängig ist. Das funktionen zugänglich, wie durch konduktometrische Titration spezifische Gewicht des Produktes entspricht etwa demjeni-gezeigt werden kann, und die Gruppen der Formel: gen von Wasser (0,97 bis 1,02), wodurch eine stabile Suspension

45 des Produkts erreicht wird. Die Produkte können z. B. durch Zentrifugieren in Form eines weissen oder gelblichen Niederschlags isoliert werden.

Die Menge an immunologisch aktivem Material, das an die immunologisch inerten Latexpolymerträger gebunden ist, nh2 50 beträgt in der Regel 0,01 bis 15,0 Gew.-%. Jedoch wird jedes ein zelne immunologisch aktive Material in einer Menge benützt, stehen für weitere Reaktionen zur Verfügung. welche sich in einem diagnostischen Test am zweckmässigsten

Die immunologisch aktiven Materialien (Antigen oder Anti- erweist. Aus diesem Grunde wird jedes Material mit dem Trä-körper) können physikalisch und/oder chemisch an den erfin- ger in einem Verhältnis kombiniert, welches den jeweiligen dungsgemäss verwendeten Latexpolymeren gebunden werden. 55 spezifischen Anforderungen am besten entspricht. Die vorlie-

In einer Ausführungsform wird das erfindungsgemässe Rea- gende Erfindung umfasst deshalb die Verwendung einer sol-genz durch Bildung einer Azobindung zwischen dem Latex und chen Menge an immunologisch aktivem Material in Kombina-dem immunologisch aktiven Material hergestellt. Zu diesem tion mit einem immunologisch inerten Latexpolymerträger, die Zweck werden durch Behandlung des Latex in wässriger sau- geeignet ist, ein für derartige diagnostische Zwecke nützliches rer Lösung mit einem Nitrit die primären aromatischen Amino- 60 Reagens zu liefern.

gruppen des Latex in ein Diazoniumsalz überführt. Nach seiner Herstellung kann das Produkt in spezifischen

Als Säure kann z. B. eine anorganische Säure wie Salzsäure, diagnostischen Tests, welche auf immunologischen Prinzipien Schwefelsäure oder Perchlorsäure verwendet werden. Als aufgebaut sind, verwendet werden.

Nitrit wird vorzugsweise Natriumnitrit oder Kaliumnitrit ver- Die Bestimmung der immunologisch aktiven Substanz kann wendet. Die Reaktion wird wegen der Instabilität der Diazoni- 65 sowohl in einem direkten wie auch in einem indirekten (Inhibi-umsalze vorzugsweise bei 0 bis 5 °C ausgeführt. tions-)Testverfahren durchgeführt werden.

Das immunologische aktive Material wird anschliessend im Im direkten Testverfahren werden zur Bestimmung einer wässrigen Medium, vorzugsweise zwischen 0 °C und Zimmer- immunologisch aktiven Substanz die Analysenprobe und die

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mit dem entsprechenden immunologischen Reaktionspartner beschichteten Latexteilchen vermischt und das Auftreten einer Agglutination beobachtet. Der Test ist positiv, wenn eine Agglutination festgestellt wird.

Beim indirekten (Inhibitions-)Testverfahren wird zur s

Bestimmung einer immunologisch aktiven Substanz die Analysenprobe mit einer bestimmten Menge des entsprechenden immunologischen Reaktionspartners (z. B. Antiserum) und Latexteilchen, die mit der immunologisch aktiven Substanz beschichtet sind, vermischt und das Auftreten einer Agglutina- io tion beobachtet. Der Test ist positiv, wenn keine Agglutination festgestellt wird.

Die in derartigen immunologischen Testverfahren nutzbaren Reagenzien können vorteilhaft für kommerzielle Zwecke in eine diagnostische Testgarnitur abgepackt werden. 15

Im Falle eines direkten Tests enthält die Reagenziengarnitur zur Bestimmung einer immunologisch aktiven Substanz in einem Behälter eine wässrige Suspension von mit dem entsprechenden immunologischen Reaktionspartner beschichteten Latexteilchen. 20

Im Falle eines indirekten Tests enthält die Reagenziengarnitur zur Bestimmung einer immunologisch aktiven Substanz in einem ersten Behälter eine Lösung des entsprechenden immunologischen Reaktionspartners (z. B. Antiserum) und in einem zweiten Behälter eine wässrige Suspension von mit dem immu- 25 nologisch aktiven Material beschichteten Latexteilchen.

In beiden Fällen kann die wässrige Suspension des an Latex' gebundenen immunologisch aktiven Materials oder des an Latex gebundenen immunologischen Reaktionspartners in irgendeiner Konzentration vorhanden sein. Jedoch ist eine 30 Konzentration von 0,5 bis 5 Gew.-% bevorzugt.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele veranschaulicht.

Beispiel 1 35

In einem Autoklaven von 25 Liter stellt man einen Latex von Kernpolymerisat her, wobei man verwendet: 4800 g entionisiertes Wasser 50 g Kaliumpersulfat

50 g Natriumpyrophosphat 40

10g N atriumlaurylsulfat 50 g Natriummethallylsulfonat 100 g Acrylsäure 100 g Itaconsäure 2135g Styrol 45

2865 g Butadien

Die Polymerisation wird bei 75 °C unter Stickstoffatmo-sphäre ausgeführt, wobei die Monomeren im Verlauf von 7 Stunden kontinuierlich eingeführt werden und die Reaktion 8 50 Stunden lang fortgesetzt wird.

Nach dem Abkühlen erhält man einen Latex vom pH = 2,5, dessen Konzentration an Polymerisatpartikeln 51 Gew.-% beträgt.

Durch Elektronenmikroskopie stellt man fest, dass die Par- 55 tikel einen mittleren Durchmesser von 0,145 ji.m haben; 90% der Partikel haben einen Durchmesser zwischen 0,14 und 0,15 (im.

Die Zusammensetzung des Polymerisates ist im wesentlichen gleich wie diejenige der verwendeten Monomeren. Die 60 Partikel tragen auf ihrer Oberfläche Carboxyl- und Sulfonat-funktionen, die durch konduktometrische Titration bestimmt werden.

406 g des erhaltenen Latex und 1541 g entionisiertes Wasser werden in einen Reaktor eingeführt. Das Gemisch wird 65 unter Rühren auf 70 °C erhitzt; diese Temperatur wird während der ganzen Dauer der Reaktion aufrechterhalten.

Sobald das Gemisch 70 °C erreicht hat, wird es unter Stick-

stoffatrtiosphäre gehalten; man gibt in 3 Stunden mit konstanter Geschwindigkeit gleichzeitig 1,25 g Natriumdihexylsulfo-succinat in 150 g Wasser, 0,20 g a,a'-Azobis-isobutyramidini-umchlorid in 210 g Wasser, 18 g Styrol, die 0,25 g p,p'-Dithiobi-sanilin enthalten, zu.

Dann wird die Polymerisation 5 Stunden lang fortgesetzt. Das Gemisch wird danach abgekühlt.

Eigenschaften des erhaltenen Latex:

pH: 3,1, Konzentration an Polymerisationspartikeln: 9,3 Gew.-%, Elektrolytbeständigkeit: 5, mittlerer Durchmesser der Partikel: 0,15 um, wobei 90% einen Durchmesser zwischen 0,145 und 0,155 (im haben.

Die Partikel tragen auf ihrer Oberfläche Carboxyl- und Sul-fonatfunktionen, die durch konduktometrische Titration bestätigt werden, und Gruppen der Formel:

nhr

1 ml von dem oben hergestellten 10%igen Latex wird 20 ml Wasser zugesetzt und die Mischung 1Vi Stunden bei 35 000 g zentrifugiert. Der Überstand wird abdekantiert, der Rückstand in 20 ml Wasser aufgenommen und nochmals 1 Vi Stunden bei 35 000 g zentrifugiert. Diese Operation wird zweimal wiederholt und der so erhaltene Latex wird in den folgenden Beispielen als «gewaschener Latex» bezeichnet.

5 mg humanes Immunoglobulin G (Cohn Fraktion II) wird durch Erhitzen auf 60 °C während 3 Stunden in 1 ml 0,1 M Gly-cerin-HCl Puffer pH 4 denaturiert.

1 ml gewaschener Latex wird 5 ml 0,05 M HCl zugesetzt und die Mischung auf 0 °C abgekühlt. Zu dieser Mischung wird 0,1 ml einer 0,01 M NaNOî-Lösung gegeben, und es wird 15 Minuten bei 0 °C gerührt. Der diazotierte Latex wird bei 5 °C 1 Vi Stunden bei 35 000 g zentrifugiert und der Überstand abdekantiert. Der Rückstand wird in 5 ml eisgekühltem 0,1 M Gly-cin-HCl Puffer pH 4,0 aufgenommen und im gleichen Puffer 1 ml 0,5%iges denaturiertes humanes Immunoglobulin G zugegeben, 1 Stunde im Eisbad gerührt und anschliessend über Nacht bei 10° stehengelassen. Der Latex wird 1 Vi Stunden bei 35 000 g abzentrifugiert, der Überstand abdekantiert und der Rückstand zweimal mit je 25 ml 0,1 M Glycin-NaOH Puffer pH 8,2 gewaschen, durch Zentrifugieren und Aufschlämmen des Rückstandes. Dem Latex wird nun soviel Puffer zugesetzt, dass eine Lösung mit 30 mg/ml resultiert.

Agglutinationstest:

Für den Röhrchen-Agglutinationstest wird der folgende Puffer verwendet: 7,5 g Glycin, 6,0 g CaCh, 3 g Rinderalbumin, 1 g NaN3 gelöst in 1 Liter Wasser. Der pH-Wert wird mit NaOH auf 8,2 eingestellt. Für den Nachweis der Rheumafaktoren im Serum wird in einem kleinen Reagenzglas 20 jil Latex mit 3 ml Puffer verdünnt und 25 jj.1 des zu untersuchenden Serums zugegeben. Nach dem Durchmischen werden die Röhrchen während 2 Stunden in einem Wärmeblock bei 37 °C gehalten. Ein positives Serum agglutiniert unter diesen Bedingungen während ein negatives Kontrollsystem keine Agglutination zeigt.

Beispiel 2

1 ml gewaschener Latex wird wie in Beispiel 1 hergestellt und diazotiert. Dem diazotierten Latexrückstand wird 5 ml eiskalter 0,1 M Glycin-NaOH Puffer pH 6,0 zugesetzt und 5 mg Ziegen anti-Humanalbumin Immunoglobulin G in 1 ml obigem Puffer gelöst, zugegeben, und die Mischung wird nach Rühren

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während 1 Stunde bei 10 °C über Nacht stehengelassen. Der Latex wird bei 35 000 g während 1 Stunden abzentrifugiert, der Überstand verworfen und das Sediment zweimal mit je 25 ml 0,1 M Glycin-NaOH pH 8,2 gewaschen. Nach dem Waschen wird der Latex mit soviel Puffer vermischt, dass eine 3%ige Lösung erhalten wird.

Agglutinationstest:

Für den Röhrchen-Agglutinationstest wird der folgende Puffer verwendet: 7,5 g Glycin, 6,0 g CaCh. 3 g Rinderalbumin und 1,0 g NaN3 werden in 1 Liter Wasser gelöst und das pH mit Salzsäure auf 6,0 eingestellt. Es wird in kleinen Reagenzgläsern eine Konzentrationsreihe von Humanalbumin in 3 ml Puffer erstellt, je 20 p.1 Latex zugegeben und nach Durchmischen 2 Stunden bei 37 °C in einem Wärmeblock gehalten.

(j.g Humanalbumin/ml Puffer

20

10

1

0,1

0,05 0,01 0

+

+ - -

+ = agglutiniert in 2 Stunden - = nicht agglutiniert in 2 Stunden

Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, dass mit dem so hergestellten Latex 0,05 (ig Humanalbumin/ml bestimmt werden kann.

Beispiel 3

1 ml gewaschenem Latex von Beispiel 1 wird 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 5,0 zugesetzt und 5 mg Schaf anti-Human IgG Immunoglobulin G in 1 ml Puffer zugegeben, und es wird gut gerührt. Anschliessend wird 0,1 ml einer 0,01 M p-Phenyldi-isothiocyanatlösung in Dimethylformamid zugegeben, 1 Stunde gerührt und bei Raumtemperatur über Nacht stehengelassen. Der Latex wird 1Vi Stunden bei 35 000 g zentrifugiert, der Überstand verworfen und der Rückstand zweimal mit je 25 ml 0,1 M Glycin-NaOH Puffer pH 8,2 gewaschen. Für den Agglutionationstest wird der Latex in einer Konzentration von 30 mg/ml eingesetzt.

Agglutinationstest:

Für den Röhrchen-Agglutinationstest wird ein 0,1 M Phosphatpuffer pH 6,0 mit 0,1 % Rinderalbumin verwendet. Es wird eine Konzentrationsreihe von Human IgG in 3 ml Puffer hergestellt. Zu jedem Röhrchen werden 20 (il Latexreagens gegeben, durchmischt und 2 Stunden bei 37 °C inkubiert im Wärmeblock.

(j.g Human IgG/ml Puffer

100

10 -1

0,1

0,05 0

+

+ +

+

-

+ = agglutiniert in 2 Stunden - = agglutiniert nicht in 2Stunden

Die Tabelle zeigt, dass mit diesem Latexreagens 0,1 (ig/ml Human IgG noch bestimmt werden können.

Beispiel 4

36,8 mg Benzidin werden in 0,5 ml 2 NaCl gelöst und mit 7,5 ml Wasser verdünnt. Die Mischung wird im Eisbad gekühlt und unter Rühren 27,2 mg NaNOî in 2 ml Wasser zugetropft. Das so erhaltene bisdiazotierte Benzidin ist bei -20° während Wochen haltbar.

1 ml gewaschener Latex von Beispiel 1 wird in 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,0 aufgenommen und 5 mg humanes Immunoglobulin G in 1 ml obigem Puffer zugegeben. Die Suspension wird auf 0° abgekühlt und unter Rühren 0,01 ml einer 0,02 M bisdiazotierten Benzidinlösung zugegeben und anschliessend bei 10° über Nacht stehengelassen. Der Latex wird bei 30 000 g während 1 Vi Stunden zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Sediment zweimal mit je 25 ml 0,1 M Glycin-NaOH pH 8,2 gewaschen. Nach dem Waschen wird der Latex mit soviel Puffer vermischt, dass eine 3%ige Lösung erhalten wird.

Agglutinationstest :

Für die Bestimmung von IgG im Inhibitionstest wird ein 0,1 M Phosphatpuffer pH 6,0 verwendet. In kleine Reagenzgläser wird je 3 ml eines Vsoo verdünnten Schaf anti-human IgG Serums und steigende Mengen von human IgG gegeben. Nach Inkubation während 15 Minuten bei 37 °C wird in jedes Röhrchen 20 jü Latexreagenz gegeben und 3 Stunden bei 37 °C inkubiert.

ug human IgG/3ml

0,01 0,05 0,10 0,50 1,0 5,0

+ + + + --

+ = agglutiniert in 3 Stunden - = nicht agglutiniert in 3 Stunden

Es lassen sich mit dem oben beschriebenen Latexreagenz 0,16 (ig human IgG/ml bestimmen.

8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Claims

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PATENTANSPRÜCHE 1. Wasserunlösliches Reagenz für eine immunologische Bestimmung, mit einem etwa dem von Wasser entsprechenden spezifischen Gewicht in Form diskreter Latexteilchen, an welche ein immunologisch aktives Material gebunden ist, dadurch gekennzeichnet, dass der Latex aus einer Dispersion von Partikeln von Vinylpolymerisaten besteht, die als Endgruppen Gruppen der Formel:

nh2

tragen, wobei die Partikel aus einem Kern von Vinyl- und/oder Dienpolymerisat, das Carboxyl- und/oder Sulfonatfunktionen trägt, und aus einer äusseren Schicht von Vinylpolymerisat, das als Endgruppen Gruppen der Formel:

nh2

trägt, gebildet sind und einen mittleren Durchmesser zwischen 0,03 und 5 um haben.
2. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Vinylpolymerisates entweder Homopolymerisate von Monomeren sind, die aus Styrol und seinen Derivaten, Vinyl-chlorid, Vinylidenchlorid, Vinylacetat, Acrylderivaten gewählt sind, oder Copolymerisate dieser Monomeren untereinander und/oder mit modifizierend wirkenden Vinyl-Comonomeren sind, die bis zu 5 Gew.-% des Copolymerisats ausmachen.
3. Reaganz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet. dass die Dienpolymerisate Homopolymerisate des Butadiens und seiner Derivate oder Copolymerisate dieser Monomeren untereinander und/oder mit Vinylmonomeren und/oder modifizierend wirkenden Vinylcomonomeren, die bis zu 5 Gew.-% des Copolymerisats ausmachen, sind.
4. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Vinylpolymerisate, die die äussere Schicht bilden, Homopolymerisate des Styrols und seiner Derivate, von Alkylacrylaten und Alkylmethacrylaten (Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoff atomen), von Acrylnitril oder Methacrylni-tril, sowie Copolymerisate dieser Monomeren untereinander und/oder mit modifizierend wirkenden Vinylcomonomeren sind, die bis zu 5 Gew.-% des Copolymerisates ausmachen.
5. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Kernpolymerisat 30 bis 99,5 Gew.-% der Partikel und das Polymerisat der äusseren Schicht 70 bis 0,5 Gew.-% de Partikel ausmacht.
6. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge des immunologisch aktiven Materials 0,01 bis 15,0 Gew.-% beträgt.
7. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das immunologisch aktive Material kova-lent an die diskreten Teilchen des Latexpolymeren gebunden ist.
8. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das immunologisch aktive Material humanes Immunoglobulin G ist.
9. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, das das immunologisch aktive Material Ziegen anti-Humanalbumin Immunoglobulin G ist.
10. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das immunologisch aktive Material Schaf anti-Human IgG Immunoglobulin G ist.
11. Verfahren zur Herstellung eines Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den Latex nach Diazotierung oder unter Verwendung von geeigneten polyfunktionellen Verbindungen mit dem immunologisch aktiven Material umsetzt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man den Latex nach Diazotierung mit Ziegen anti-Humanalbumin Immunoglobulin G umsetzt.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man den Latex unter Verwendung von p-Phenyldiisothio-cyanat mit Schaf anti-Human IgG Immunoglobulin G umsetzt.
14. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man den Latex unter Verwendung von Bis-diazobenzidin mit humanem Immunoglobulin G umsetzt.
15. Verwendung eines Reagens nach Anspruch 1 für immunologische Bestimmungen.
16. Verwendung gemäss Anspruch 15 eines Reagens nach einem der Ansprüche 2 bis 10.