CH629509A5 - Verfahren zur herstellung von spezifischen sorbentien. - Google Patents

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CH629509A5
CH629509A5 CH524875A CH524875A CH629509A5 CH 629509 A5 CH629509 A5 CH 629509A5 CH 524875 A CH524875 A CH 524875A CH 524875 A CH524875 A CH 524875A CH 629509 A5 CH629509 A5 CH 629509A5
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gel
amino
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CH524875A
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Jiri Coupek
Jaroslava Turkova
Karel Dr Blaha
Olga Valentova
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Ceskoslovenska Akademie Ved
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Sorbentien.
Auf solche Weise entstehen synthetische Inhibitoren mit hervorragenden Eigenschaften für die Verwendung in der Affinitätschromatographie.
Unter Verwendung von insolubilisierten Inhibitoren gehört die Affinitätschromatographie zu einer der modernsten Isolierungsmethoden der Enzyme. Für die Isolierung von proteolytischen Enzymen verwendete man bisher am häufigsten natürliche hochmolekulare Inhibitoren, welche aber infolge ihres Ei weisscharakters nach mehrfacher Verwendung der irreversiblen Inaktivation unterstehen und für die technologische Ausnutzung nicht geeignet sind.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von spezifischen Sorbentien ist im Patentanspurch 1 definiert.
Für die Isolierung von Proteasen ist die Verwendung von spezifischen, aus niedermolekularen synthetischen Inhibitoren hergestellten Sorbentien, wie z.B. D-Analoga der peptidischen Substrate, mehr geeignet, weil diese Sorbentien in Gegenwart von proteolytischen Enzymen keinen Änderungen unterstehen. Kommt es nach mehrfacher Verwendung zur Kapazitätserniedrigung der Sorbentien, kann man sie beispielsweise durch Durchwaschen mit 6-M-Lösung von C-isanidinhydrochlorid regenerieren.
Ein Vorteil von derart hergestellten Sorbentien liegt darin, dass man sie einfach ohne Zugabe von Schutzmitteln austrocknen und in trockenem Zustand aufbewahren kann. Eine beträchtliche mechanische und hydrolytische Beständigkeit gemeinsam mit Anwesenheit von unspezifischen Sorptionserscheinungen bestimmt sie zur Ausnutzung in technologischem Ausmass.
Im Hinblick auf den niedermolekularen Charakter der auf die polymere Matrix gebundenen Peptiden ist es erwünscht, zwischen den Inhibitoren und die Geloberfläche die die Funktionsmoleküle von der Oberfläche entfernende Kette «SPACER» einzulegen.
Die Herstellung von Aminoacyl-, bzw. Peptidylderivaten, welche auf Hydroxyalkylmethacrylat-Gel gebunden werden, kann man nach dem Prinzip der Synthese von Peptiden durchführen. Als Milieu wählt man mit Vorteil ein organisches Lösungsmittel, am besten Tetrahydrofuran, im Falle der niedrigeren Löslichkeit von Peptidderivaten Dimethyl-formamid oder N,N',N"-Hexamethylphosphortriamid in Kombination mit den gebräuchlichen Kondensationsmitteln.
Zu den geeigneten Schutzgruppen für die Aminogruppe gehören tert.-Butyloxycarbonyl (welches durch Trifluoressig-säure abgespalten werden kann) oder Benzyloxycarbonyl (die Abspaltung wird mit 33% Bromwasserstoff in Essigsäure durchgeführt). Die Carboxylgruppe kann man durch tert.-Butyl- oder Benzhydrylgruppe, welche man durch Trifluores-sigsäure abspalten kann, schützen. Zum Träger mit gebundenen primären Aminogruppen kann man direkt ein geeignet geschütztes Derivat der Aminosäure oder des Oligopeptids anschliessen. Nach der Durchführung der Reaktion, Auswaschen mit Lösungsmittel, in welchem die Kondensationsreaktion durchgeführt wurde, und mit wässriger Lösung von 6% Guanidinhydrochlorid und nach Austrocknen kann man entweder alle Schutzgruppen oder selektiv die Not-Gruppen abspalten. Die Menge der eingebauten Aminosäure hängt von ihrer Struktur ab. Allgemein bindet sich am meisten Glycin, welches man für die Bestimmung des Gehaltes an acylierten, im Gel anwesenden NH2-Gruppen verwenden kann.
Ein fortschreitender Aufbau von Peptiden auf dem Träger, welcher Aminogruppen enthält, mit dem carboxyterminalen Rest von Aminosäuren beginnend, ist als Verwendung möglich. Die Abspaltung der vorübergehend Na-schüt-zenden Gruppe erreicht man auf übliche Weise und die Bindung eines weiteren Aminosäurederivates oder Peptidfrag-ments kann man wieder durch ein aktiviertes Ester oder durch 1 -Äthoxycarbonyl-2-äthoxy-l ,2-dihydrochinolin durchführen. Nach fortschreitender Synthese, bzw. Kupplung von Fragmenten auf dem polymeren Gel wird allerdings ein Gemisch von Peptiden, von denen einige unvollständige Ketten im Hinblick auf verschiedene Reaktivität von einzelnen Resten der Aminosäuren bei der Kondensationsreaktion besitzen, angeschlossen. Die makroporöse Struktur der Sorbentien ist für das Erreichen von höheren Ausbeuten bei der Kondensation geeigneter als das homogene quellbare dreidimensionale Netz von Polystyrol-Gelen, welche man für den geregelten Aufbau der Peptide gewöhnlich verwendet. Wenn man zur Kondensation schon ein fertiges Oligopeptid verwendet, wird die Gesamtsubstitution niedriger, man gewinnt aber ein homogenes Produkt. Bei fortschreitendem Aufbau von alalogem Hexapeptid wurde eine niedrigere Ausbeute sogar bei der Kondensation von zwei tripeptidischen Fragmenten registriert.
Dieselben Methoden verwendet man auch bei der Kondensation von Peptiden oder Aminosäuren mit Carboxyderivat der Hydroxyalkylmethacrylat-Gele. Die Carboxylgruppe der reagierenden peptidischen Komponente wird durch sauer abspaltbare Estergruppe geschützt. Die Ergebnisse der Bindung von Aminosäuren und Peptiden mit Hydroxyaikylmeth-acrylat-Gelen auf Basis von SPHERON werden in der Tabelle, welche die Art der Reaktion und den Gehalt an den kovalent im entsprechenden Derivat gebundenen Aminosäuren beschreibt, übersichtlich zusammengefasst.
2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
3
629509
Tabelle
Ergebnisse der Kondensation von Aminosäuren und Peptiden mit substituierten Spheron in Tetrahydrofuran mit Hilfe von l-Äthoxycarbonyl-2-äthoxy-l,2-dihydrochinc : : (Sph-Hydroxyalkylmethacrylat-Gel auf Basis von SPHERON)
Reaktion
Gehalt an Aminosäure3 umol g"
Gly 88, Leu 70
Gly 115, Phe 100 Lys 36
Z-Gly-D-Leu-CH +
NH2-Sph
Z-Gly-D-Phe-OH +
NH:-Sph
Ac-DL-Lys(Z)-OH +
NH2-Sph
Z-D-Leud + NH2-Sph Leu 13
Nps-D-Leu-OH + NH2-Sph Leu 3 Z-Gly-D-Phe-L-Leu-OH + Gly 33, Leu 33, Phe 29 NH2-Sph
Z-Gly-L-Phe-L-Leu-Gly- Gly 24, Leu 25, Phe 24 l.Phe-D-Leu-OH + NH2-Sph H-D-Phe-OCH(CôH5)2+ Phe 40 HOOC-Sph
H-D-Ala-OCH(C6H?)2 + Ala 18 HOOC-Sph u durch Aminosäureanalyse bestimmt;
b nach Abspaltung der Schutzgruppen;
c Trichlorphenylester;
d in wässriger Lösung mit Hilfe des l-Äthyl-3{3'-dimethylaminopropyl)carbodiimids von Methojodid; e in Dimethvlformamid.
10
15
20
25
30
Bei der Verwendung der spezifischen Sorbentien in der Affinitätschromatographie ist das Erreichen grosser Ausbeute und hoher Reinheit des isolierten Proteasen wichtig. So z.B. 35 bei Isolierung der Aminopeptidase aus dem proteolytischen vom Schimmelpilz Aspergilus flavus gewonnenen Präparat. Man kann dabei die erreichte spezifische Aktivität des Produktes nach einstufiger Affinitätschromatographie (2,19 E./mg Eiweisstoff) mit der Aminopeptidase, welche von 40 japanischen Autoren (Nakedei et al. Agr. Biol. Chem.
37/1973 757) aus roher enzymatischer Lösung aus Aspergillus oryzae isoliert wurde, und 2,12 E./mg Eiweisstoff betrug, vergleichen. Für die Isolierung wurde aber eine ausserordentlich mühevolle Sorptionsmethode auf Amberlit 45 IRC 50 (vernetzte Methacrylsäure), Fraktionierung mit Natriumsulfat, Fällung mit Rivanol, Chromatographie auf DEAE Zellulose und Gelchromatographie auf Sephadex G-200 und G-100 verwendet. Die Ausbeute betrug nur 0.438% der ursprünglichen Aktivität des verarbeiteten Materials. Die 50 Ausbeute der Aktivität von Aminopeptidase auf spezifischen Sorbentien, welche diese Erfindung betrifft, beträgt beinahe 100%.
Die Erfindung wird in weiterem in den Beispielen erklärt.
55
Beispiel 1
Z-Gly-D-Leu-N H-Spheron
1 g Mischpolymerisat aus 2-Hydroxyäthylmethacrylat und Äthylendimethacrylat (SPHERON 300) wurde durch die Reaktion mit 1,6-Hexamethylendiamin unter Aktivierung durch 60 Bromcyan chemisch modizifiert. Zur Suspension dieses Geles in 5 ml Tetrahydrofuran wurden 0,5 ml Triäthylamin zugegeben und die Suspension wurde bei Raumtemperatur und unter periodischem Durchführen innerhalb von 10 Minuten stehen gelassen. Danach wurde das Gel abfiltriert und auf der 65 Fritte mit dreimal je 5 ml Tetrahydrofuran durchgewaschen. Nach dem Übertragen des Materials in den Kolben wurden 5 ml Tetrahydrofuran, 89 mg Benzoyloxyvarbonyl-glycyl-D-
leucin und 125 mg l-Äthoxycarbonyl-2-äthoxy-l,2-dihydro-chinolin zugefügt. Nach dem fünfstündigen Schütteln wurden weitere 50 mg chinolinisches Reagens zugegeben. Die Suspension wurde innerhalb von weiteren 10 Stunden geschüttelt, anschliessend mit 50 ml Tetrahydrofuran durchgewaschen, und das Gel abfiltriert und ausgetrocknet. Das Produkt wurde auf seinen Gehalt an Aminosäuren analysiert (Tabelle) und in weiterem zur Affinitätschromatographie verwendet (siehe Tabelle).
Isolierung von hochaktivem Chymotrypsin durch die Affinitätschromatographie auf Z-Gly-D-Leu-NH-Spheron.
100 mg Chymotrypsin (Aktivität der Esterase auf ATEE 135 jimol/min • mg) wurden in 10 ml 0,05 mTRIS-HCl Puffer pH 8,0 aufgelöst und in die Säule des Geles von Z-Gly-D-Leu-NH-Spheron (mit Gehalt an 100 umol Pha/g Gel) des Volumens cca. 40 ml (Säulenmasse: 22 x 100 mm) eingesik-kert. Nach dem Einsickern wartete man 10 Minuten, damit sich die bindenden Stellen der Molekeln von Enzymen und Inhibitoren orientieren könnten, und danach fing man mit der Elutio durch 0,05 m TRIS-HC1 Puffer an. In der ersten Fraktion kam Material ohne chymotryptische Aktivität. Aktives Chymotrypsin wurde aus dem Gel durch ca. 0,1 m Essigsäure, welche mit Zugabe von Ammoniak auf pH 3,7 eingestellt wurde, verdrängt. Nach Entsalzen auf Sephadex G 25 in 0,02 m Ammoniumacetat wurden 4 mg Chymotrypsin mit der Esteraseaktivität von 248 umol/min • mg gewonnen. Die Aktivität wurde auf ATEE nach Axen und Ernback (Europ. J. Biochem. 18/1971 /351) bestimmt.
Beispiel 2
Das durch Carboxy-Spheron acylierte D-Phenylalanin (D-Pha-COO-SPHERON)
Zu 0,50 g HOOC-Spheron, welches durch die Reaktion des Mischpolymerisates aus 2-Hydroxyäthylmethacrylat und Äthylendimethacrylat (Spheron 700) mit e-Aminocapron-säure hergestellt wurde, wurden 5 ml Tetrahydrofuran, 2,23 g Benzydrylester des D-Phenylalanins und 0,172 g 1-Äthoxy-carbonyl-2-äthoxy-l,2-dihydrochinolin zugegeben. Das Gemisch wurde innerhalb von 6 Stunden geschüttelt, danach wurden weitere 50 mg des Chinolinderivats zugefügt, das Gemisch noch weitere 4 Stunden geschüttelt, abfiltriert und das feste Produkt auf dem Filter mit Tetrahydrofuran,
Wasser, Äthanol, Äther durchgewaschen und ausgetrocknet. Die Probe (50 mg) wurde auf den Gehalt an Aminosäuren analysiert.
Für die Abspaltung der Schutzgruppe wurde das polymere Material in Trifluoressigsäure (3 ml) suspendiert, das Gemisch wurde 30 Minuten stehen gelassen, danach mit Wasser verdünnt, der feste Stoff abfiltriert, auf dem Filter bis zur neutralen Reaktion mit Wasser, anschliessend mit Äthanol und Äther durchgewaschen und ausgetrocknet. Das auf solche Weise gewonnene Material wurde auf Gehalt an freien Carboxylgruppen analysiert und zur Affinitätschromatographie verwendet.
10 mg Carboxypeptidase A wurden in 2 ml 0,05 M TRIS-HC1 Puffer pH 8,0, welcher 0,3 N NaCl enthielt, aufgelöst. Die Lösung wurde auf die Säule von D-Phe-COO-Spheron (mit Gehalt 40 jimol Phe/g Gel) mit Rauminhalt 8 ml (lOx 100 mm) aufgesetzt. Nach der Verweilzeit von 10 Minuten wurde die Säule mit dem Puffer eluiert. Es kam zur vollständigen Retention von allem Enzym, welches erst durch die Änderung des pH-Puffer durch 0,1 M Essigsäure frei gemacht wurde.
Beispiel 3
Fortschreitender Aufbau des Tripeptids von Z-Gly-D-Phe-L-Leu auf NH2-Spheron
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Zur Suspension 3 g Mischpolymerisat des 2-Hydroxyäthyl-methacrylats und Äthylendimethacrylats (Speron 500), welches durch die Reaktion mit 1,6-Hexamethylendiamin modifiziert wurde, wurden 1,5 ml Triäthylamin zugegeben und die Suspension wurde unter periodischem Durchrühren 10 Minuten stehen gelassen. Danach wurde das Gel abfiltriert, dreimal mit je 10 ml Tetrahydrofuran durchgewaschen und in den Kolben in welchem 15 ml Tetrahydrofuran, 0,21 g (0,90 mmol) tert.-Butyloxycarbonyl-L-leucin und 0,23 g 1 -Äthoxycarbonyl-2-äthoxyl-1,2-dihydrochinolin vorgelegt wurden, übergeführt. Das Gemisch wurde innerhalb von 8 Stunden geschüttelt, danach wurden weitere 50 mg Chino-linderivat zugefügt und noch 5 Stunden geschüttelt. Das feste Material wurde abfiltriert, mit Tetrahydrofuran und Äther durchgewaschen und ausgetrocknet. Die Probe (70 mg)
wurde auf Gehalt an Aminosäuren analysiert.
Zu 2,5 g Reaktionsprodukt aus der vorherigen Stufe wurden 5 ml Trifluoressigsäure zugegeben, die Suspension wurde 15 Minuten stehen gelassen, dann mit Wasser verdünnt, der feste Stoff wurde abfiltriert, mit Wasser bis zur neutralen Reaktion durchgewaschen und nach weiterem Durchwaschen mit Äthanol, Äther und nach Austrocknen in 15 ml Tetrahydrofuran suspendiert. Zur Suspension wurden 0,335 g tert.-Butyloxycarbonyl-D-phenylalanindicyklohexal-ammoniumsalz und 0,192 g 1 -Äthoxycarbonyl-2-äthoxy-1,2-dihydrochinolin zugegeben. Das Gemisch wurde 6 Stunden geschüttelt, anschliessend wurden noch 50 mg Chinolinde-rivat zugefügt und das Gemisch wurde weitere 6 Stunden geschüttelt. Festes Material wurde danach abfiltriert, stufenweise mit Tetrahydrofuran, Wasser, Äthanol, Äther durchgewaschen und ausgetrocknet. Die Probe wurde auf Gehalt an Aminosäuren analysiert.
Zu 2 g auf solche Weise gewonnenem Material wurden 4 ml Trifluoressigsäure zugegeben, die Suspension wurde 15 Minuten stehen gelassen, mit Wasser verdünnt, der feste Stoff wurde abfiltriert, mit Wasser bis zur neutralen Reaktion durchgewaschen, danach mit Äthanol und Äther durchgewaschen, ausgetrocknet und in 10 ml Tetrahydrofuran suspen-siert. Zur Suspension wurden 0,115 ml Dicyclohexylamin, 0,113 g Benzyloxycarbonylglycin und 0,138 g 1-äthoxycar-bonyl-2-äthoxy-l ,2-dihydrochinolin zugegeben, das Gemisch wurde 6 Stunden geschüttelt, weitere 50 mg Chino-linreagens wurden zugegeben und wiederum 6 Stunden geschüttelt. Der feste Stoff wurde abfiltriert, mit Tetrahydrofuran, Wasser, 1 m HCl, Wasser, Äthanol und Äther durchgewaschen und ausgetrocknet. Das auf solche Weise gewonnene Produkt wurde auf den Gehalt an Aminosäuren analysiert und zur Affinitätschromatographie verwendet.
Beispiel 4
D-Leu-NH-Spheron
100 mg N-Benzyloxycarbonyl-D-Leucin wurden in 10 ml Dimethylformamid aufgelöst und nach Zugabe von 10 ml aufgequollenem Mischpolymerisat des 2-Hydroxyäthylm-ethacrylats mit Äthylendimethacrylat (Spheron 300), welches durch Reaktion mit 1,6-Hexamethylendiamin modifiziert wurde, wurde der pH der Suspension durch 1 m-HCl-Lösung auf den Wert 4,7 adjustiert. Zur Suspension wurde dann innerhalb von 5 Minuten 1 ml 15%ige Lösung von 1-Äthyl-3(3'-dimethylaminopropyl)-carbodiimid des Methojodids zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde danach 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Reaktionsende wurde das Gel mit 50%iger Lösung von Dimethylformamid und Wasser durchgewaschen. Im Hydrolysat nach saurer Hydrolyse wurde von dem auf solche Weise hergestellten Gel D-Leucin bestimmt. Es wurde festgestellt, dass auf 1 ml aufgequollenem NH2-Spheron 300 3,6 (imol Z-D-Leucin (entspricht 13 umol/g Gel) angebunden wurden. Aus dem in solcher Weise hergestellten Derivat des Z-D-Leucins wurde dann die Benzylcarbonylschutzgruppe durch die Reaktion von 2,5 g trockenem Gel mit 15 ml HBr-Lösung in Essigsäure (Raumtemperatur, 30 Minuten) abgespalten. Das Gel wurde mit Wasser, Äthanol und Äther durchgewaschen und zur Affinitätschromatographie der Aniopeptidase aus dem rohen proteolytischen Präparat vom Schimmelpilz Aspergillus flavus verwendet.
300 mg dialysiertes, rohes proteolytisches Präparat aus dem Schimmelpilz Aspergillus flavus (alkoholische Fällung der Züchtungsflüssigkeit) wurden in 100 ml Puffer A (0,05 m TRIS-HCl + 0,01 m CaCh - pH 8,0) aufgelöst. In die Lösung wurden 70 ml vom abgesaugten D-Leu-NH-Spheron (13 umol Leu/g Gel) zugegeben und massig 15 Minuten geschüttelt. Dann wurde die Lösung mit dem Gel in die Säule mit einem Durchmesser von 3 cm übertragen und mit Puffer A durchgewaschen. Fraktionen vom Volumen 18 ml wurden in den viertelständigen Intervallen abgenommen. In den ersten 6 Fraktionen wurde das Material, welches alle Proteasen mit Hämoglobinaktivität gemeinsam mit unaktiven Komponenten, enthielt, eluiert. Die Elution wurde fortgesetzt und es wurden weitere 14 Fraktionen gesammelt, in denen wurde keine proteolytische Aktivität und kein Eiweissgehalt aufgrund der Absorptionsmessung bei 280 mm gefunden. In der Säule wurden allerdings Verbindungen gehalten, die sämtliche Aminopeptidaseaktivität, die durch die Spaltung von L-Leucin-p-nitranilid bestimmt wurde, aufwiesen. Sämtliche Aktivität von Aminopeptidase wurde desorbiert und durch Puffer B (Puffer A + 2 N NaCl-Lösung) eluiert. Das eluierte Material wies.keine proteolytische Aktivität auf Hämoglobin auf.
Die Aktivität der Aminopeptidase wurde durch eine modifizierte Methode nach Pfleiderer (G. Pfleiderer, Methods in Enzymology 19/1970/514) bestimmt. Als Substrat für die Aktivitätsbestimmung diente 1,66 mM L-Leucin-p-nitrina-nilid in 0,05 m TRIS-HCl Puffer mit einem pH von 8,0. Die Menge von freigemachten Nitranilid nach der 10 Minuten Inkubation bei 37°C wurde aufgrund der Absorption bei 405 nm gemessen. Als Substrat für die Messung der proteolytischen Aktivität wurden Lösungen von denaturiertem Hämoglobin bei pH 6 und pH 8 benutzt. Die Eiweisskonzen-tration in Lösungen wurde mit Hilfe des Folin's Reagens nach der von Lowry ausgearbeiteten Methode (H. O. Lowry et al. J. Biol. Chem. 193/1951/265) bestimmt. Die Einheit der enzymatischen Aktivität von Aminopeptidase wurde als Menge des Enzyms, welches 1 (imol p-Nitranilid pro Minute unter beschriebenen experimentellen Bedingungen frei macht, definiert. Die spezifische Aktivität wurde aus diesen Einheiten, die auf 1 mg Eiweisstoff bezogen wurden, berechnet.
Die spezifische Aktivität des Ausgangsmaterials betrug 0,336 E./mg Eiweisstoff (3 mg des dialysierten proteolytischen Präparats enthielten 0,5 mg Eiweisstoff). Aus der vorgelegten Menge wurden 7,7 mg Aminopeptidase von spezifischer Aktivität 2,17 E./mg Eiweisstoff gewonnen.
Beispiel 5
Z-Gly-D-Phe-NH-Spheron
100 g Mischpolymerisat des 2-Hydroxyäthylacrylats mit Äthylendiacrylat (Spheron A) wurden durch Reaktion mit 1,6-Hexamethylendiamin und mit 10 g Benzyloxycarbonyl-glycyl-D-phenylalanin analog wie im Beispiel 1, chemisch modifiziert. 100 mg Chymotrypsin von niedriger Aktivität (Aktivität der Esterase auf N-Acetyl-L-tyrosinäthylester bei pH 7,9, gemessen betrug 135 umol/min • mg) wurden in 200 ml 0,05 m TRIS-HCl Puffer bei pH 8,0 aufgelöst und es wurden 40 ml abgesaugte Z-Gly-D-Phe-NH-Spheron A (Gehalt 70 [xmol/Leu/g Gel) zugegeben und 15 Minuten
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massig geschüttelt. Nach Übertragen auf die Säule (dieselben Masse wie im Beispiel 1) wurde die Eluation mit TRIS-HCl Puffer 0,05 m mit dem ähnlichen Resultat wie im Beispiel 1 durchgeführt.
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Beispiel 6
1 g Mischpolymerisat von 2-Hydroxypropylmethacry-Iamid mit Äthylendimethacrylat mit der Ausschlussgrenze des Molekulargewichts 300,000 wurde durch die Reaktion mit BrCN aktiviert und mit 1,6-Hexamethylendiamin rea- io gieren gelassen. Das entstandene Produkt wurde auf ähnliche Weise wie im Beispiel 1 mit 90 mg Benzyloxycarbonyl-glycyl-D-leucin in 5 ml Tetrahydrofuran kondensiert. Nach dem Durchwaschen und Austrocknen wurde der Sorbent zu der Affinitätschromatographie von Chymotrypsin verwendet. is
Beispiel 7
1 g Mischpolymerisat des 2-Hydroxyäthylhexoxymeth-
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acrylats mit Trimethyloläthantrimethacrylat, welches mit der Ausschlussgrenze 100 000 hergestellt wurde, wurde mit Bromcyan aktiviert und mit Äthylendiamin reagieren gelassen. Das erhaltene Produkt wurde, ähnlich wie im Beispiel 1, mit 80 mg )-Gly-D-Ph-L-Leucin in 50 ml Tetrahydrofuran kondensiert. Nach Durchwaschen und Austrocknen wurde der Sorbent zur Affinitätschromatographie des Chymotrypsins verwendet.
Beispiel 8
1 g Mischpolymerisat des Tetraäthylglykolmonomethacry-lats mit 2,2'-Dimethylglykolmonomethacrylat und 2,2'-Dimethylpropantrioldimethacrylat mit der Ausschlussgrenze 500 000 wurde mit Bromcyan aktiviert und mit 1,10-Decan-diamin reagieren gelassen. Das entstandene Produkt wurde in 5 ml Tetrahydrofuran mit D-Phenylalanin kondensiert und nach dem Durchwaschen und Austrocknen zur Affinitätschromatographie von Chymotrypsin verwendet.
B

Claims (5)

  1. 629509
    PATENTANSPRÜCHE
    1. Verfahren zur Herstellung von spezifischen Sorbentien, in denen D-Aminosäure-Reste oder Peptidketten, welche D-Aminosäure-Reste enthalten, kovalent an einen hydrophilen, vernetzten Träger gebunden sind, dadurch gekennzeichnet, dass man in als Gel vorliegende, hydrophile, ver-
    n;%2te Mischpolymerisate von Acrylsäure- oder Methacryl-s ' ::re-Hydroxyalkylester oder -Hydroxyalkylamid mit ver-r-eGeTjdem Aerylat- oder Methacrylat-Comonomerem durch ein ? Jrnsetzung mit terminale Amino- bzw. Carboxyl-Funk-tionea aufweisenden Verbindungen, die Diamine mit nicht mehr als 10 C-Atomen oder Aminosäuren mit nicht mehr als 6 C-Atomen oder Dicarbonsäuren mit nicht mehr als 6 C-Atomen sind, terminale Amino- bzw. Carboxyl-Funk-tionen einführt, und dass man an so eingeführten terminalen Amino- bzw. Carboxyl-Funktionen durch Kondensation D-Aminosäure-Reste oder Peptidketten, welche D-Aminosäure-Reste enthalten, in die Mischpolymerisate einführt.
  2. 2. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die in Gelform eingesetzten hydrophilen .Mischpolymerisate einen makroporösen Charakter besitzen.
  3. 5. Verfahren gemäss Patentanspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die in Gelform eingesetzten Mischpolymerisate als Suspensionsmischpolymerisate sphärische Form haben.
  4. 4. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Einführung von D-Aminosäure-Reste enthaltenden Peptidketten in die Mischpolymerisate so erfolgt, dass die Peptidketten an den Mischpolymerisaten durch fortschreitende Kondensation synthetisiert werden.
  5. 5. Spezifische Sorbentien, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1.
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