CH629530A5 - Stabilisiertes glucoseisomerase-enzymkonzentrat und verfahren zu seiner herstellung. - Google Patents
Stabilisiertes glucoseisomerase-enzymkonzentrat und verfahren zu seiner herstellung. Download PDFInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein stabilisiertes Glucoseisomerase-Enzymkonzentrat, das 1. zellfreie Glucoseisomerase, die im wesentlichen nucleinsäurefrei ist, und 2. Mg++ enthält, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieses Enzymkonzentrates.
Die als Isomerisierung bekannte Umwandlung von Dextrose in Lävulose liefert ein Produkt, das in der Praxis einen vollwertigen Ersatz für handelsüblichen Invertzucker darstellt. Bei der Isomerisierung geht man von Dextrose aus, einem Monosaccharid, das nur etwa 70% der Süsskraft von Saccharose besitzt, und wandelt bis zu etwa 50% davon in einen Zuk-ker um, der etwa 140% der Süsskraft von Saccharose oder
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Invertzucker besitzt. Dieses besondere Süssungsvermögen ist es, das die Stärkeindustrie an lävulosehaltigem Maissirup (der heute üblicherweise als fructosereicher Maissirup [HFSC] bezeichnet wird) und dem Verfahren zur Herstellung derartiger Sirupe so stark interessiert.
Die Erforschung des enzymatischen Isomerisierungsver-fahrens begann 1955. Diese Arbeiten haben ihren Niederschlag im US-Patent Nr. 2 950 228 und einer Veröffentlichung von Marshall und Kooi in Science, 125,648 (1957) gefunden. Seit dieser Zeit sind die Veröffentlichungen über Arbeiten von Forschern, die durch die grundlegenden Arbeiten von Marshall und Kooi angeregt wurden, in Fachliteratur und Patenten buchstäblich explosionsartig angeschwollen.
Eine der wichtigeren Veröffentlichungen auf diesem Gebiet stellt der Vorabdruck des Manuskripts eines Berichts von Dr. Sato und Dr. Tsumura vom Japanese Food Research Institute auf der Jahrestagung der Agricultural Chemical Society of Japan in Sapporo am 20. Juli 1964 dar. In diesem 1964 erschienenen Vorabdruck und dem am 7. Okt. 1966 veröffentlichten japanischen Patent Nr. 17 640 offenbarten Dr. Sato und Dr. Tsumura, dass mehrere Stämme von Mikroorganismen der Gattung Streptomyces, wenn sie auf Xylose kultiviert werden, das Enzym Glucoseisomerase erzeugen, sowie, dass dieses Enzym die Isomerisierung von Glucose zu Fructose bewirkt. Im Zuge nachfolgender Entwicklungsarbeiten stellte eine andere Gruppe von Wissenschaftlern uner der Leitung von Dr. Takasaki vom Japanese Fermentation Research Institute,
einem Organ des Ministry of International Trade and Industry (MITI), fest, dass bestimmte Stämme von Mikroorganismen der Gattung Streptomyces, die Xylan, ein Polymer der Xylose, assimilieren, auf Xylan kultiviert werden können und dabei Glucoseisomerase erzeugen (jap. Patentschrift Nr. 27 525 und US-Patentschrift 3 616 221).
Die Hersteller von hochfructosehaltigem Maissirup haben festgestellt, dass die enzymatische Isomerisierung von Glucose vorzugsweise kontinuierlich durchgeführt werden sollte, um ein kommerziell annehmbares fructosereiches Maissirupprodukt wirtschaftlich herzustellen. In der Regel wird bei derartigen Verfahren in Glucosesirup mit einer grossen Menge eines auf einer inerten Trägersubstanz aufgebrachten Glucoseisome-rase-Enzympräparats in Berührung gebracht, d. h. einem immobilisierten Glucoseisomerase-Enzympräparat. Ein wesentlicher Punkt eines derartigen Verfahrens ist es, dass man ein immobilisiertes Glucoseisomerase-Enzympräparat verwendet, das pro Volumeneinheit eine hohe Isomeraseaktivitätskonzentration aufweist, so dass es sich für den Einsatz in einem kontinuierlichen enzymatischen Isomerisierungsverfahren eignet.
Glucoseisomerase wird in der Regel intrazellular erzeugt, d. h., dass der grösste Teil des Glucoseisomerase-Enzyms innerhalb der und/oder an den Zellwänden der Mikroorganismen sitzt, von denen es erzeugt wird. Bei einigen kontinuierlichen Isomerisierungsverfahren verwendet man die ganzen, die Glucoseisomerase enthaltenden Zellen. Bei derartigen Verfahren ist es in der Regel erforderlich, die Zellen einer speziellen Behandlung zu unterwerfen, durch die verhindert wird, dass die Glucoseisomerase aus den Zellen extrahiert wird, so dass bei dieser Behandlung somit im Endeffekt das Enzym in den Zellen selbst immobilisiert wird, und/oder spezielle Vorrichtungen zu verwenden, um die hydraulischen Probleme lösen zu können, die damit verbunden sind, die glucosehaltige Lösung durch das Bett aus das Glucoseisomerase-Enzym enthaltenden Zellen zu treiben. Verfahren, bei denen ganze Glucoseisomerase enthaltende Zellen verwendet werden, sind beispielsweise in den US-Patentschriften 3 694 314,3 753 858,3 779 869,3 817 832 und 3 821 086 sowie den deutschen Offenlegungsschriften 2 317 680 und 2 345 186 beschrieben. Diese Verfahren, bei denen ganze, Glucoseisomerase enthaltende Zellen verwendet werden, sind mit einer Reihe von Nachteilen behaftet. Nachteilig sind dabei u. a. das Auftreten hydraulischer Probleme, die Bildung von Verunreinigungen aufgrund der Anwesenheit anderer Enzyme als Isomerase, von Nucleinsäuren und anderen Stoffen in den Zellwänden sowie längerer notwendiger Kontaktzeiten zwischen der Glucoselösung und dem Zell-Enzympräparat, wobei letztere unter alkalischen Bedingungen zur Bildung unerwünschter, durch alkalikatalysierte Reaktion aus Fructose entstehender Produkte, wie Psicose und Hydroxymethylfurfural (HMF) einführen. Die vorstehenden Probleme führen zu höheren Herstellungskosten aufgrund der zur Entfernung der erzeugten Verunreinigungen erforderlichen Reinigung und/oder zur Erzeugung eines minderwertigen Produkts.
Um die bei der Verwendung ganzer, intrazelluare glucoseisomerase enthaltender Zellen auftretenden Problemen zu lösen, wurden nach dem Stand der Technik bereits Verfahren vorgeschlagen, bei denen die Glucoseisomerase aus den Zellen abgetrennt wird, um sie in eine lösliche Form zu bringen, worauf man sie an einem nicht-wasserlöslichen inerten Träger immobilisiert. Das immobilisierte Enzym eignet sich dann zur Verwendung bei der kontinuierlichen Umwandlung von Glucose in einen hochfructosehaltigen Maissirup. Beispiele derartiger Verfahren sind in den US-Patentschriften 3 708 397,3 788 945, 3 850 751 und 3 868 304, der belgischen Patentschrift 819 859 und der US-Patentanmeldung 505 823 bzw. der belgischen Patentschrift 810 480 beschrieben.
Diese Verfahren, bei denen zellfreie immobilisierte Glucoseisomerase verwendet wird, lösen zwar einige der mit der Verwendung ganzer Zellen verbundenen Probleme, erfordern jedoch die Solubilisierung der Glucoseisomerase, d. h. die Abtrennung der Glucoseisomerase von bzw. aus den ganzen Zellen. Verfahren zur Solubilisierung der Glucoseisomerase sind zwar bekannt, jedoch ist es wünschenswert, zellfreie und lösliche Glucoseisomerase in hochreiner Form zu erhalten, die ' eine hohe Isomeraseaktivität pro Volumeneinheit aufweist. Die Verwendung eines hoch-gereinigten und -konzentrierten Enzyms erhöht nämlich die Effizienz, mit der das Enzym auf den unlöslichen Träger aufgebracht werden kann.
Verfahren zum Extrahieren und Reinigen von Glucoseisomerase aus Mikroorganismenzellen in konzentrierter und gereinigter Form machten bislang die Anwendung teurer und komplizierter Arbeitsgänge erforderlich, die nur für Versuchsarbeiten im kleinen Labormassstab geeignet waren.
Ein derartiges Laborverfahren zum Extrahieren und Reinigen solubilisierter Glucoseisomerase ist von Danno und Mitarbeitern in Agr. Biol. Chem., Band 31, Seiten 284 bis 292 (1967) beschrieben worden. Danno und Mitarbeiter beschrieben ein Verfahren zum Reinigen von aus Bacillus coagulans Stamm HN-68 stammender Glucoseisomerase, bei dem man mit Äthy-lendiamintetraessigsäure (EDTA) behandelte Zellen der Einwirkung von Lysozym aussetzt, um einen zellfreien Extrakt herzustellen, aus dem man dann durch Behandeln mit Mangansulfat unerwünschte Stoffe ausfällt. Die überstehende Flüssigkeit wird dann mehrmals mit Ammoniumsulfat behandelt, um eine proteinhaltige Glucoseisomerasefraktion auszufällen, die durch Dialyse und Chromatographie an DEAE-Sephadex A-50 (eingetragenes Warenzeichen) weiter gereinigt wird. Auf diese Weise wird angeblich eine Konzentrationssteigerung auf das 60fache erreicht.
Eine andere Labormethode zum Reinigen von Glucoseisomerase wurde von Takasaki und Mitarbeitern beschrieben (Agri. Biol. Chem., Band 33, Seiten 1527 bis 1534 (1969) und «Fermentation Advances», Seiten 561 bis 589 (1969), Academic Press, Inc., New York, New York). Tabasaki und Mitarbeiter offenbarten, dass intrazellulare Glucoseisomerase von Streptomyces albus aus den Zellen durch Behandlung mit einem kationischen Netzmittel, Cetylpyridiniumchlorid, freigesetzt und dann fraktioniert werden kann, indem man den zellfreien Extrakt mit Aceton behandelt, dialysiert, anschliessend nach5
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einander in einer mit DEAE-Cellulose gefüllten und einer mit DEAE-Sephadex gefüllten chromatographischen Säule Chromatographien und schliesslich einer weiteren Dialyse unterwirft. Der gereinigte zellfreie Extrakt wurde dann weiter durch Dialyse in einer pro 10,005 Mol Magnesiumsulfat und 0,0002 Mol C0CI2 enthaltenden Lösung gereinigt. Zu der dabei erhaltenen Lösung wurde allmählich Aceton bis zu einer Konzentration von 40,45 und schliesslich 50% zugegeben, um das Gluco-seisomerase-Enzym zu kristallisieren. Dieses Verfahren ist zu kompliziert und zeitraubend, um beim Arbeiten in grossem Massstab angewendet werden zu können.
Aus der US-Patentschrift 3 708 397 ist ein weiteres derartiges Verfahren bekannt, bei dem Glucoseisomerase aus mit EDTA behandelten Zellen von auf Weizenkleie kultivierten Mikroorganismen der Spezies Streptomyces phaeochromoge-nes durch Behandeln mit einer Lysozym, Toluol, Magnesiumchlorid, einen Puffer und Wasser enthaltenden Lösung abgetrennt werden. Die lysierte Aufschlämmung wird dann mit Magnesiumchlorid behandelt, worauf man das Enzym schliesslich durch allmähliche Zugabe von kaltem Aceton ausfällt. Die so erhaltene Enzymfällung wird in Wasser gelöst und an DEAE-Cellulose immobilisiert, wodurch man einen zur Umwandlung von Glucose in einen fructosereichen Maissirup verwendbaren Biokatalysator erhält. Bei einem weiteren, aus der US-Patentschrift 3 788 945 bekannten Verfahren wird von auf Xylose und Xylanhydrolysat kultivierten Mikroorganismen vom Stamm Streptomyces sp ATCC 21 175 stammende intrazelluläre Glucoseisomerase mit einem kationischen Netzmittel (Arquad 18-50) und dann mit DEAE-Cellulose behandelt, um Nicht-Isomerasematerial abzutrennen. Das Glucoseisomerase enthaltende Filtrat wird dann an DEAE-Cellulose oder einem synthetischen Anionenaustauscherharz immobilisiert, wodurch man einen Biokatalysator für die kontinuierliche Umwandlung von Glucose in hochfructosehaltigen Maissirup erhält.
Auch in den US-Patentschriften 3 847 740 und 3 847 741 ist ein derartiges Verfahren beschrieben, bei dem intrazellulare Glucoseisomerase enthaltende Zellen mit einer kleinen Menge eines Netzmittels, Tween 80 (eingetragenes Warenzeichen), in einer gepufferten Glycinlösung behandelt werden. Nach innigem Durchmischen werden die Zelltrümmer entfernt, wobei man ein 17,5 Isomeraseaktivitätseinheiten pro ml enthaltendes Filtrat erhält.
Aus der US-Patentschrift 3 847 740 ist ein Verfahren zum Immobilisieren gereinigter Glucoseisomerase-Präparate an einem basischen Magnesiumcarbonat-Träger und aus den US-Patentschriften 3 850 751 und 3 868 304 ein Verfahren zum Immobilisieren von Glucoseisomerase-Präparaten an Alumi-niumoxyd-Trägern mit geregelter Porosität bekannt. Die Verwendung auf diese Weise erhaltener immobilisierter Enzympräparate ergibt zwar überlegene Verfahren zur Erzeugung hochfructosehaltiger Maissirupe, erfordert jedoch hochgereinigte und -konzentrierte Glucoseisomerase, um sie effizient und wirtschaftlich industriell nutzen zu können.
Trotz der vorstehend beschriebenen Verfahren besteht somit immer noch ein Bedarf an einem wirtschaftlichen Verfahren, nach dem in grossem Massstab im wesentlichen lösliche und gereinigte Glucoseisomerase-Präparate hergestellt werden können, die eine hohe Aktivität pro Volumeneinheit und eine hohe Stabilität besitzen und sich zur Herstellung von bei kontinuierlichen Verfahren zum Herstellen hochfructosehaltiger Maissirupe verwendbaren Biokatalysatoren durch Binden bzw. Immobilisieren des Glucoseisomerase-Präparats an einen wasserunlöslichen Träger eignen, aber auch an sich wertvoll und nützlich, sowie in anderen Immobilisierungsverfahren brauchbar sind.
Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, derartige Glucoseisomerase-Enzymkonzentrate zur Verfügung zu stellen und ein Verfahren zu ihrer Herstellung zu schaffen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss durch ein zeli- und im wesentlichen nucleinsäurefreie Glucoseisomerase sowie ein im wesentlichen wasserlösliches Magnesiumsalz enthaltendes, stabilisiertes GIucoseisomerase-Enzymkonzentrat der eingangs bezeichneten Art gelöst, das durch a) einen Proteirigehalt von 50 bis 80 Gew.-%, bezogen auf Trockensubstanz,
b) einen Mg++-Gehalt von 3 bis 45 mg/ml Enzymkonzentrat,
c) ein Mg++/Protein-Verhältnis von 0,02 bis 0,75,
d) eine spezifische Isomeraseaktivität von mindestens 10 IGIU (International-Glucose-Isomerase-Units = Internationale Glucoseisomeraseeinheiten)/mg Protein und e) eine so hohe Stabilität, dass es bei bis zu 30tägiger Lagerung bei 26 °C bis zu 95% seiner anfänglichen Isomeraseaktivität behalten kann, gekennzeichnet ist.
Die Glucoseisomerase-Enzymkonzentrate der Erfindung sind so stabil, dass sie bei Lagerung unter den angegebenen Bedingungen durchschnittlich etwa 95% ihrer anfänglichen Aktivität behalten, und vorzugsweise sogar so stabil, dass sie bis zu 70 bis 90% ihrer anfänglichen Isomeraseaktivität behalten, wenn sie bis zu 12 Monate lang bei 18 °C gelagert werden.
Die Enzymkonzentrate der Erfindung enthalten vorzugsweise etwa 5 bis 25 Gew.-% eines wassermischbaren organischen Lösungsmittels, wie Propan-2-ol, und besitzen vorzugsweise eine Isomeraseaktivität von mindestens etwa 5000 und insbesondere mindestens etwa 8000 IGIU/g Trockensubstanz.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Glucoseisomerase-Konzentrates, wie in Patentanspruch 9 definiert.
Die Behandlung mit dem Magnesiumsalz führt zur Bildung eines Glucoseisomerase-Magnesium-Niederschlags, der anschliessend nach beliebigen an sich bekannten Methoden, z. B. durch Zentrifugieren, abgetrennt und gewonnen werden kann. Das stabilisierte Enzymkonzentrat der Erfindung kann dazu verwendet werden, auf die meisten wasserunlöslichen Träger, z. B. DEAE-Cellulose, synthetische Anionenaustau-scherharze, poröse, wasserunlösliche Materialien, wie basisches Magnesiumcarbonat und poröse Aluminiumoxydmaterialien, hohe Enzymaktivitäten pro Volumeneinheit aufzubringen und dadurch Biokatalysatoren herzustellen, die zur kontinuierlichen Umwandlung von Glucose in Fructose geeignet sind. Das abgetrennte Enzymkonzentrat, das in Form eines dik-ken Breies bzw. einer dicken Aufschlämmung vorliegt, wird vorzugsweise mit einer kleinen Menge Wasser verdünnt, um es leichter auf wasserunlöslichen Trägern unter Bildung ausserordentlich stabiler, immobilisierter GIucoseisomerase-Biokataly-satoren mit hoher Isomeraseaktivität pro Trägervolumenein-heit sorbierbar zu machen. Das vorliegende Verfahren ermöglicht eine Steigerung der Enzymkonzentration auf mehr als das 70fache und insbesondere mehr als das lOOfache der in der ursprünglichen Kulturbrühe vorliegenden Konzentration. Das Enzymkonzentrat ist ausserdem im allgemeinen 10- bis 15mal reiner als das ursprüngliche Enzym.
Gemäss einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, ein zellfreie Glucoseisomerase enthaltendes wäss-riges Gemisch mit einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel in einer Menge zu behandeln, die ausreicht, um einen wesentlichen Teil der vorhandenen Nucleinsäuren auszufällen, jedoch geringer als diejenige Menge ist, die zu einer Ausfällung des Enzyms führen würde. Dieses konzentrierte und gereinigte Enzymzwischenprodukt ist als solches bereits wertvoll und verwertbar, obwohl es nicht ganz so stabil und konzentriert ist, wie das erfindungsgemässe mit Magnesium behandelte Enzymkonzentrat.
Wegen der Vielfalt und oftmals fehlenden Eindeutigkeit der im gegebenen Zusammenhang allgemein gebräuchlichen Fachausdrücke werden nachfolgend einige Definitionen gegeben,
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die das Verständnis der Beschreibung und der Ansprüche erleichtern und exakte und eindeutige Angaben ermöglichen sollen.
«DE» ist eine gebräuchliche Abkürzung für die Bezeichnung «Dextroseäquialent», die den Gehalt einer Substanz an reduzierenden Zuckern, berechnet als Dextrose und angegeben in Prozent des gesamten Feststoffgehalts bedeutet.
Der Ausdruck «Stärkehydrolysat» wird als allgemeiner Betriff zur Bezeichnung eines Sirup- oder Trockenprodukts benutzt, das durch Hydrolyse von Stärke hergestellt ist. Ein derartiges Produkt kann durch saure und/oder enzymatische Hydrolyse hergestellt werden. Für die erfindungsgemässe Isomerisierung bevorzugt verwendbare Stärkehydrolysate erhält man durch Verflüssigung bzw. Verdünnung von Stärke mit Säure oder Enzym bis zu einem DE von 10 oder weniger und anschliessende enzymatische Verzuckerung bis zu einem DE von über 90 und vorzugsweise über 95. Die Bezeichnung «Dextrose» ist im wirtschaftlichen Sprachgebrauch üblicherweise dem raffinierten, kristallinen Zucker (einem Monosaccharid) vorbehalten, der aus einem hochgradig konvertierten Stärkehydrolysat gewonnen wird. Die Bezeichnung «Glucose» wird in der Beschreibung und den Ansprüchen sowohl in ihrer im wirtschaftlichen Sprachgebrauch üblichen Bedeutung als auch zur Bezeichnung des Monosaccharids Dextrose in beliebiger Form, gleich ob in Lösung oder trocken, als Bestandteil eines Stärkehydrolysatsirups oder von Stärkehydrolysatfest-stoffen, oder aber in raffinierter kristalliner Form gebraucht.
Die Ausdrücke «Fructose» und «Lävulose» werden vom Fachmann in der Regel gegeneinander austauschbar zur Bezeichnung des linksdrehenden Isomeren der Glucose gebraucht, das süsser als Dextrose ist. Dieses Isomere kommt in der Natur im Honig und in Invertzucker zusammen mit Glucose vor und wird wegen seiner hohen Süsskraft geschätzt. Nachfolgend wird dieses Monosaccharid als «Fructose» bezeichnet.
«Glucoseisomerase» ist ein Enzym oder Enzympräparat, das Xylose zu Xylose und Glucose zu Fructose isomerisieren kann. Die vorherrschende Aktivität dieses Enzyms ist die Umwandlung von Xylose in Xylulose, so dass die Bezeichnung «Xyloseisomerase» die wissenschaftlich exakteste Benennung darstellt (EC 5.3.1.5.). Dieses Enzym ist fachsprachlich auch schon als «Dextroseisomerase», «Xylose-(Dextrose-)Isome-rase» und «Glucoseisomerase» bezeichnet worden. Die gebräuchlichste Bezeichnung ist «Glucoseisomerase», so dass nachstehend dieser Ausdruck der Einfachheit und leichteren Verständlichkeit wegen benutzt wird.
In der Beschreibung und den Ansprüchen beziehen sich Angaben in Teilen und Prozenten stets auf das Gewicht des jeweiligen Produkts, wenn nicht ausdrücklich etwas anderes angegeben ist
Die Angabe «IGIU» ist eine Abkürzung der englischen Bezeichnung International Glucose Isomerase Unit (Internationale Glucoseisomeraseeinheit). Eine IGIU ist diejenige Glu-coseisomerasemenge, die in einer 0,8molaren Glucoselösung bei pH 7,5 und 60 °C, sowie unter Anwendung der nachstehend beschriebenen Testmethode ein Mikromol Fructose pro Minute erzeugt.
Bei der zur Bestimmung der Isomeraseaktivität benutzten Testmethode wird die in einer Glucoselösung unter standardisierten Bedingungen erzeugte Ketose spektrophotometrisch bestimmt.
Zur Durchführung der Isomeraseaktivitätsbestimmung wird zunächst jeweils eine Probestammlösung nach folgender Rezeptur angesetzt:
Probe-Stammlösung
Komponente
Menge
0,1 mMgS04-7H20
0,01 mCoCl2.6H20
1,0 m Phosphatpuffer (pH 7,5)
Wasserfreie D-Glucose
Destilliertes Wasser
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1 ml 1 ml 0,5 ml 1,44 g
Rest zum Auffüllen auf ein Gesamtvolumen von 7,5 ml
Das Enzympräparat, dessen Aktivität bestimmt werden soll, wird zunächst so weit verdünnt, dass es 1 bis 6 IGIU/ml enthält. Dann führt man eine enzymatische Isomerisierung durch,
15 indem man 3 ml der Probe-Stammlösung mit 1 ml des verdünn ten Enzympräparats versetzt und das Gemisch 30 Minuten bei
60 °C bebrütet. Am Ende der Inkubationsperiode wird eine
1 -ml-Probe gezogen und in 9 ml 0,5normaler Perchlorsäure .
«abgeschreckt». Die abgeschreckte Probe wird dann auf ein
20 Gesamtvolumen von 250 ml verdünnt. Zu Vergleichszwecken wird jeweils auf analoge Weise ein Blindversuch durchgeführt,
wobei statt 1 ml der zu untersuchenden Enzympräparatlösung
1 ml Wasser am Beginn der Bebrütungszeit zugegeben wird.
Der Ketosegehalt wird dann nach der Cystein-Schwefelsäure-
25 Methode bestimmt. Wie vorstehend bereits erwähnt, wird die nach dieser Methode bestimmte Aktivität in IGIU angegeben,
wobei eine IGIU als diejenige Enzymaktivität definiert ist, die erforderlich ist, um unter den vorstehend beschriebenen Isome-
risierungsbedingungen ein Mikromol Fructose pro Minute zu
30 erzeugen.
«Lysozym» (EC 3.2.1.17) ist ein Enzym, das ß-l,4-Bindungen zwischen N-Acetylmuraminsäure (oder 2-Acetamido-2-desoxy-
D-glucose) und 2-Acetamido-2-desoxy-D-glucoseresten in
Mucopolysacchariden, Mucopolypeptiden oder in Chitin
35 hydrolysiert. Lysozym wird in der Regel aus Eiweiss erzeugt. Es katalysiert die Hydrolyse (Lyse) der Zellwände vieler Mikroor ganismen.
Die Enzymkonzentrate weisen bevorzugt a) einen Proteingehalt von 60 bis etwa 75 Gew.-%, bezogen
4o auf Trockensubstanz,
b) einen Mg++-Gehalt von 5 bis 25 mm Mg++ pro ml Enzym konzentrat,
c) ein Mg++/Protein-Verhältnis von 0,03 bis 0,5,
d) eine spezifische Isomeraseaktivität von mindestens 12
45 und insbesondere mindestens etwa 15 IGIU/mg Protein,
e) einen Gehalt an einem wassermischbaren Lösungsmittel von etwa 5 bis 25 und vorzugsweise 10 bis etwa 20 Gew.-% und f) eine Stabilität auf, die so hoch ist, dass bei bis zu 30tägiger Lagerung bei 26 °C bis zu 95% und bei bis zu einjähriger Lageso rung bei 18 °C bis zu 70 bis 90% der anfänglichen Isomeraseaktivität erhalten bleiben.
Die stabilisierten Enzymkonzentrate besitzen im allgemeinen eine Aktivität von mindestens etwa 5000, vorzugsweise mindestens etwa 8000 und insbesondere mindestens etwa 55 10 000 IGIU pro g Trockensubstanz.
Die erfindungsgemässen stabilisierten Enzymkonzentrate sind aufgrund des Verfahrens, nach dem sie erfindungsgemäss hergestellt werden, im wesentlichen frei von Nucleinsäuren, wie Ribonucleinsäure (RNA) und Desoxyribonucleinsäure 60 (DNA).
Die stabilisierten Enzymkonzentrate weisen, wenn sie in flüssiger Form vorliegen, in der Regel eine Magnesiummolari-tät in einem Bereich von etwa 0,1 bis etwa 2 und vorzugsweise etwa 0,2 bis 1,0 Mol Magnesium pro Liter auf. 65 Die Enzymkonzentrate liegen zwar in der Regel in flüssiger Form vor, können jedoch zu einem Feststoff getrocknet oder mit Wasser und anderen Materialien verdünnt werden. Die bevorzugten Enzymkonzentrate weisen einen Feuchtigkeits-
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bzw. Wassergehalt von etwa 50 bis 80 und insbesondere etwa sen Verfahrens wird zunächst eine zentrifugierte Paste aus 55 bis 70% auf. Der Trockensubstanzgehalt der Enzymkonzen- intrazellulare Glucoseisomerase enthaltenden Zellen mit träte liegt vorzugsweise in einem Bereich von etwa 5 bis 30 und einem Teil des zu verwendenden wassermischbaren Lösungsinsbesondere etwa 20 bis 30 Gew.-%. mittels behandelt. Die wässrige Aufschlämmung aus Zellen und
Besonders bevorzugte stabilisierte erfindungsgemässe 5 Lösungsmittel wird dann so behandelt, dass die Isomerase aus Enzymkonzentrate enthalten keinerlei zugesetztes Kobalt. Die den Zellen freigesetzt wird. Hierzu kann man die Zellauf-darin enthaltene Glucoseisomerase stammt vorzugsweise von schlämmung beispielsweise beschallen, einer Gefrier-Auftau-einem Mikroorganismus der Genus Streptomyces und insbe- Behandlung oder einer Behandlung mit Netzmitteln und/oder sondere von Mikroorganismen der zur Spezies Streptomyces lytischen Enzympräparaten, wie Lysozym, unterwerfen. Wenn olivochromogenes gehörenden Streptomyces-Stämme ATCC 10 das Enzym aus den Zellen freigesetzt worden ist, wird der Nr.21 713, ATCC Nr.21 714und ATCCNr. 21 715oder deren Lösung weiteres Lösungsmittel zugesetzt, und zwar so lange Varianten und Submutanten. bzw. so viel, bis bzw. dass Nucleinsäuren und andere Proteine
Das stabilisierte Enzymkonzentrat wird vorzugsweise her- ausfallen, das Isomeraseenzym jedoch löslich bzw. gelöst gestellt, indem man zuerst intrazellulare Glucoseisomerase ent- bleibt. Dann werden die Zelltrümmer und die ausgefällten Baihaltende Zellen ausreichend lang mit einem wassermischbaren 15 laststoffe abgetrennt. Hierauf wird das im wesentlichen wasserorganischen Lösungsmittel und einem lytischen Enzympräpa- lösliche Magnesiumsalz zugegeben, um einen Niederschlag des rat, z. B. einem aus Eiweiss stammenden Lysozympräparat, stabilisierten Enzymkonzentrats zu erzeugen.
behandelt, damit ein Abbau des Zellmaterials erreicht wird und Bei einer anderen Arbeitsweise bzw. Ausführungsform wird die Glucoseisomerase aus den Zellen in Lösung übergehen praktisch die gesamte einzusetzende Lösungsmittelmenge der kann. Dann werden die Zelltrümmer und Nucleinsäuren, bei- 20 glucoseisomerasehaltigen Zellpaste zugesetzt. Nach dieser spielsweise durch Zentrifugieren, abgetrennt, wobei eine die Arbeitsweise wird also die durch Zentrifugieren einer intrazel-zellfreie Glucoseisomerase, das wassermischbare organische lulare Glucoseisomerase enthaltende Zellen enthaltenden Kul-Lösungsmittel und Wasser enthaltende Lösung zurückbleibt. turbrühe erhaltene Zellpaste mit Wasser und der Gesamt-
Als wassermischbares organisches Lösungsmittel wird in menge des einzusetzenden, wassermischbaren organischen der Praxis vorzugsweise eine organische Flüssigkeit oder ein 25 Lösungsmittels behandelt, so dass man eine Zellaufschläm-Gemisch organischer Flüssigkeiten mit einer Wasserlöslichkeit mung in einem Lösungsmittel/Wasser-Gemisch erhält. Die das bei Raumtemperatur von mindestens 30 und insbesondere min- wassermischbare organische Lösungsmittel enthaltende Auf-destens etwa 40% verwendet. Das wassermischbare organische schlämmung wird dann einer Behandlung unterworfen, durch Lösungsmittel sollte so gewählt werden, dass es die Löslichkeit die die Glucoseisomerase aus den Zellen freigesetzt wird. Nach von Proteinen und Nucleinsäuren in wässrigen Lösungen senkt. 30 der Abtrennung des unlöslichen Materials, das die Zelltrümmer Typische für die Zwecke der Erfindung geeignete wassermisch- und Nucleinsäuren umfasst, wird die zellfreie Glucoseisome-bare organische Lösungsmittel sind beispielsweise Methanol, rase, Lösungsmittel und Wasser enthaltende geklärte Lösung Äthanol, Propanol, Propan-2-ol, t-Butylalkohol, Aceton und mit dem im wesentlichen wasserlöslichen Magnesiumsalz p-Dioxan. Besonders bevorzugt ist Propan-2-ol. behandelt, um das stabilisierte Enzymkonzentrat auszufällen.
Das wassermischbare organische Lösungsmittel wird beim 35 Die Temperatur- und pH-Wertbedingungen sollten wäh-Verfahren der Erfindung in der Regel in einer Menge verwen- rend des Verfahrens selbstverständlich so gewählt werden, det, die ausreicht, um einen Lösungsmittelgehalt von minde- dass das Enzym nicht inaktiviert wird. In der Regel sollte der stens etwa 30 und vorzugsweise mindestens etwa 40 Gew.-% im pH-Wert während aller Verfahrensstufen in einem Bereich von wässrigen Gemisch zu erreichen. Die verwendete Lösungsmit- etwa 6 bis 9 und insbesondere zwischen 7 und 7,5 liegen. Die telmenge sollte j edoch so gewählt werden, dass dadurch ein 40 Temperatur kann zweckmässigerweise in einem Bereich von wesentlicher Teil der Nicht-Isomeraseproteinmaterialien und etwa 5 bis 55, vorzugsweise 15 bis etwa 35 und insbesondere 25 der Nucleinsäuren, wie Ribonucleinsäure (RNA) und Desoxyri- bis 30 °C liegen.
bonucleinsäure (DNA) vor der Salzzugabe aus der Lösung aus- Als im wesentlichen wasserlösliches Magnesiumsalz wird gefällt wird. Der Höchstgehalt an Lösungsmittel schwankt beim Verfahren der Erfindung vorzugsweise ein Salz verwen-natürlich in Abhängigkeit davon, welches Lösungsmittel im 45 det, das bei Raumtemperatur in Wasser in einer Konzentration Einzelfall angewendet wird. Allgemein gesagt, stellen 60% für von etwa 0,02 bis 2 Mol/Liter im wesentlichen löslich ist. Typi-die meisten Lösungsmittel, die für die Zwecke der Erfindung in sehe geeignete Magnesiumsalze sind beispielsweise Magnesi-Betracht kommen, die obere Grenze dar. Wenn Propan-2-ol als umchlorid, -bromid, -nitrat, -sulfatheptahydrat, -acetat und -lac-wassermischbares organisches Lösungsmittel verwendet wird, tat. Vorzugsweise verwendet man Magnesiumchlorid und ins-enthält die wässrige Lösung der zellfreien Glucoseisomerase so besondere Magnesiumsulfat (wenn in dieser Beschreibung typischerweise etwa 40 bis 45 und vorzugsweise 42 ± 1 Gew.-% Magnesiumsulfat erwähnt wird, so ist damit stets die Heptahy-Lösungsmittel. dratform gemeint).
Das wassermischbare organische Lösungsmittel dient meh- Die beim Verfahren der Erfindung verwendete Menge an reren verschiedenen Zwecken. Es dient nämlich als Schutz- im wesentlichen wasserlöslichen Magnesiumsalz sollte zumin-bzw. Konservierungsmittel für das Enzym während der Verar- 55 dest so hoch gewählt werden, dass die die wässrige Aufschläm-beitung (und, wenn es nicht vollständig abgetrennt wird, auch mung des wasserlöslichen organischen Lösungsmittels und der während der Lagerung) und vermindert ausserdem die Löslich- zellfreien Glucoseisomerase enthaltende Flüssigkeit bezüglich keit des Enzyms während der Salzzugabe. Weiterhin bewirkt es ihres Magnesiumionengehalts mindestens etwa 0,02-molar ist. eine Ausfällung der Nucleinsäuren und anderer Nicht-Isomera- Die obere Grenze der Magnesiumsalzkonzentration schwankt seproteinmaterialien aus der solubilisierten Glucoseisomerase «0 in Abhängigkeit von dem jeweils verwendeten Salz. Man sollte vor der Behandlung mit dem im wesentlichen wasserlöslichen nicht so viel Magnesiumsalz zusetzen, dass ein totaler «Aussalz-Magnesiumsalz. Man kann somit schon durch die Verwendung effekt» oder eine Salz-Wasser-Phasentrennung auftritt. Allge-des wassermischbaren organischen Lösungsmittels allein eine mein gesagt liegt die Höchstmenge an Magnesiumsalz in der konzentriertere und reinere Isomerase erhalten. Lösung bei etwa 0,3 Mol/Liter. Vorzugsweise sollte die Magne-
Hinsichtlich Zeitpunkt und Art der Zugabe des wasser- 65 siumsalzkonzentration in der Lösung in einem Bereich von mischbaren organischen Lösungsmittels zur zellfreie Glucose- etwa 0,02 bis etwa 0,2 Mol Magnesiumionen/Liter liegen. Die isomerase enthaltenden Lösung gibt es verschiedene Möglich- besten Ergebnisse erzielt man, wie gefunden wurde, wenn man keiten. Gemäss einer Ausführungsform des erfindungsgemäs- das Magnesiumsalz in einer Menge zusetzt, die eine Magne-
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siumionenkonzentration in der Lösung von etwa 0,05 Mol/Liter ergibt.
Die intrazellulare Glucoseisomerase, aus der die stabilisierten Enzymkonzentrate der Erfindung hergestellt werden, kann aus jedem geeigneten Mikroorganismus gewonnen werden, s der Glucoseisomerase erzeugen kann. Beispiele geeigneter Mikroorganismen sind Mikroorganismenstämme der Gattungen Streptomyces, Bacillus, Arthrobacter, Actinoplanes, Curto-bacterium und andere. Spezielle, besonders zur Herstellung bzw. Erzeugung des intrazellularen Glucoseisomerse-Enzym- io ausgangsmaterials geeignete Mikroorganismenstämme bzw. -arten sind u. a.Streptomyces fradiae, Streptomyces phaeochro-mogenes, Streptomyces albus ATCC Nr. 21 132, Streptomyces wedmorensis ATCC Nr. 21 230 (die beiden letztgenannten Stämme sind in der US-Patentschrift 3 616 221 beschrieben), is Streptomyces rubiginosus ATCC Nr. 21 175 und ATCC Nr. 21 176 (vgl. die US-Patentschriften 3 666 628 und 3 788 945), Streptomyces olivaceus NRRL 3583 (vgl. US-Patentschrift 3 625 828), Streptomyces olivaceus NNRL 3916 (vgl. GB-Patentschrift 1 376 787), Streptomyces olivochromogenes 20 ATCC Nr. 21 114 (vgl. die US-Patentschriften 3 622 463 und 3 770 589), Streptomyces olivochromogenes ATCC Nr. 21 713, 21 714und21 715(vgl. US-Patentschrift 3 818 318), Streptomyces venezuelae ATCC Nr. 21 113 (vgl. US-Patentschrift 3 622 463), Streptomyces glaucescens (vgl. GB-Patentschrift 25 1 410 579), Streptomyces violaceoniger (vgl. DT-OS 2 417 642), Arthrobacter nov sp NRRL B-3724, NRRL B-3725, NRRL B-3726, NRRL B-3727 und NRRL B-3728 (vgl. US-Patentschrift 3 826 714), Bacillus Stearothermophilus ATCC Nr.21 365,
NRRL B-3680, NRRL B-3681 und NRRL B-3682 (vgl. US- 30 Patentschrift 3 826 714), Lactobacillus brevis, Bacillus coagu-lans, NRRL Nrn. 5649 bis 5666 und insbesondere NRRL Nr. 5650 (vgl. DT-OS 2 400 323), Actinoplanes missouriensis NRRL B-3342, Actinoplanes philippinesis ATCC Nr. 12 427, Actinoplanes armeniacus ATCC Nr. 15 676 und Actinoplanes sp ATCC 35 23 342 (vgl. US-Patentschrift 3 834 988), Aerobacter levanicum NRRL B-1678 (vgl. US-Patentschrift 3 813 320), Nocardia aste-roides ATCC Nr. 21 943, Nocardia dassonvillei ATCC 21 944, Micromonospora coerula ATCC Nr. 21 945, Micobispora rosea ATCC Nr. 21 946 und Microellobospora flavea ATCC Nr. 40 21 947 (vgl. US-Patentschrift 3 829 362), sowie Curtobacterium (vgl. japanische Patentanmeldung 50/132176 [1975]).
Als Ausgangsmaterialien für das Verfahren der Erfindung bzw. die erfindungsgemässen Enzymkonzentrate besonders zweckmässig und bevorzugt sind die Glucoseisomerase- 45 Enzyme, die von Mikroorganismen der Streptomyces olivochromogenes ATCC Nr. 21713, ATCC Nr. 21 714 und ATCC Nr. 21 715, wobei der letztgenannte Stamm ein Einzelkolonie-isolat aus dem Stamm ATCC Nr. 21 713 ist (vgl. US-Patent-schrift 3 813 318 und die US-Patentanmeldung Nr. 589 115vom 50 23. Juni 1975), stammen, und zwar insbesondere dann, wenn sie nach dem in der US-Patentschrift 3 770 589 beschriebenen und beanspruchten Weise hergestellt worden sind.
Das intrazellulare Glucoseisomerase enthaltende Enzym wird vorzugsweise hergestellt, indem man einen Glucoseisome- 55 rase erzeugenden Mikroorganismus, wie einen der vorstehend erwähnten Mikroorganismenstämme, in einem geeigneten Kulturmedium, das eine geeignete Kohlenstoffquelle und andere entsprechende Nährstoffe enthält, kultiviert und das Enzym sich dabei bilden iässt. 60
Beispielsweise stellt man zunächst eine Impfkultur eines Glucoseisomerase erzeugenden Stammes, z. B. auf einer Agar-Platte, her und beimpft damit ein geeignetes Kulturmedium. Dann lässt man den Mikroorganismus wachsen und das intrazellulare Glucoseisomerase enthaltende Enzym (nachstehend kurz «intracellulare Glucoseisomerase») erzeugen. Die Inkubationsdauer kann je nachdem, welcher spezielle Mikroorganismus, auf welchem Kulturmedium jeweils gerade verwendet wird, innerhalb eines breiten Bereiches schwanken und liegt vorzugsweise zwischen 4 und 48 Stunden. Dann wird eine Teil- 1 menge der auf diese Weise erhaltenen Impfkultur dazu verwendet, ein geeignetes Kulturmedium in einer oder mehreren Entwicklungsstufen zu beimpfen, worauf das Inoculum aus der letzten Entwicklungsstufe zum Beimpfen eines geeigneten Kulturmediums in einem (Produktions-)Fermentor verwendet wird. Die die intrazellulare Glucoseisomerase enthaltende Kulturbrühe kann nach jeder beliebigen geeigneten Methode gewonnen und konzentriert werden, z. B. durch Zentrifugieren und/ oder Filtrieren. Die Zellpaste aus intrazellulare Glucoseisomerase enthaltenden Zellen liegt dann in zur weiteren Aufarbeitung nach dem erfindungsgemässen Verfahren geeigneter Form vor.
Die Beispiele erläutern die Erfindung. Es sei darauf hingewiesen, dass sich Angaben in Teilen jeweils auf das Gewicht beziehen, wenn nichts anderes angegeben ist. Die in den Beispielen angegebenen Glucoseisomeraseaktivitäten wurden nach der vorstehend beschriebenen Methode bestimmt und sind jeweils in IGIU angegeben.
Beispiel 1
a) Herstellung intracellularer Glucoseisomerase
Die zur Herstellung des statilisierten Enzymkonzentrats verwendete intrazellulare Glucoseisomerase wurde in vier mit 1 Liter fassenden Schüttel-Kolben beginnenden und bis zu 3785,4 Liter fassenden Impfkultur-Tanks führenden Impfkultur-Entwicklungsstufen, sowie einer abschliessenden Produktionsstufe in 75 708 Liter fassenden Fermentoren hergestellt. Jede der aufeinanderfolgenden Entwicklungsstufen und die Fermentoren der Produktionsstufe wurden jeweils mit einer 5 Vol.-% des Fassungsvermögens des beimpften Fermentationsgefässes entsprechenden Impfkulturmenge angeimpft. Die Zusammensetzung der Kulturmedien für die Impfkultur-Entwicklung und die Produktionsstufe sind aus der nachfolgenden Tabelle I zu ersehen. Die Kulturmedien für alle Stufen wurden jeweils 30 Minuten bei 120 °C sterilisiert. Die Fermentations- bzw. Bebrü-tungszeiten bei der Impfkultur-Entwicklung betrugen 48 Std. für die erste Stufe, 24 Std. für die zweite Stufe, 22 Std. für die dritte Stufe und 15 bis 17 Std. für die vierte Stufe. In der ersten Stufe wurde das Kulturmedium mit Zellen eines Sporen bildenden Mikroorganismenmutantenstamms, der als Streptomyces olivochromogenes ATCC Nr. 21 715(ein Einzelkolonieisolat aus dem Stamm ATCC Nr. 21713, vgl. die US-Patentschrift 3 813 318, auf deren Inhalt hiermit Bezug genommen wird) versetzt bzw. angeimpft. Die vier Impfkultur-Entwicklungsstufen wurden jeweils bei einer Temperatur von 28 °C und einem pH-Wert von 7,0 durchgeführt, der vor dem Sterilisieren mit lOnormaler Natronlauge eingestellt wurde.
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Tabelle I
Inoculum-Entwicklung/Medium-Zusammensetzung
Entwick- Kulturmedium Gew.-% Menge Arbeits-
lungsstufe volumen
1. Stufe
Maisquellwasser (Code E801)
3,6
7,2 g
200 ml
(3 1-Liter-Schüt
Maissirup-Feststoffe mit DE 15
1,0
2,0 g
200 ml telkolben)
Magnesiumsulfat- 7H2O
0,05
0,7 g
200 ml
Antischaummittel
(«HODAG 2000» = Polypropylenglycol)
-
0,07 ml
200 ml
2. Stufe
Maisquellwasser (Code E801)
3,6
271g
9 Liter
(14 Liter fassender
Maissirup-Feststoffe mit DE 15
2,0
180 g
9 Liter
Bench-Fermentator)
Magnesiumsulfat - 7H2O
0,05
4,5 g
9 Liter
Antischaummittel
(«HODAG 2000» = Polypropylenglycol)
-
1,3 ml
9 Liter
3. Stufe
Maisquellwasser (Code E801)
3,6
5,44 kg
151,41 Liter
(ca. 190 Liter fassender
Stärke (Code 3005)
2,0
3,04 kg
151,41 Liter
Inoculum-Tank)
Magnesiumsulfat- 7H2O
0,05
75,75 g
151,41 Liter
Antischaummittel
(«HODAG 2000» = Polypropylenglycol)
-
51ml
151,41 Liter
4. Stufe
Maisquellwasser (Code E801)
3,6
108,86 kg
3028,25 Liter
(ca. 3800 Liter fassen-'
Dextrose (Code 2001)
2,0
60,33 kg
3028,25 Liter der Impfkultur-Tank)
Magnesiumsulfat-7H20
0,05
1,497 kg
3028,25 Liter
Antischaummittel
(«HODAG 2000» = Polypropylenglycol)
-
1 Liter
3028,25 Liter
In der zweiten, dritten und vierten Impfkultur-Entwick- 30 lungsstufe wurde der Inhalt der Kolben bzw. Tanks während der Fermentation jeweils belüftet und gerührt.
Die abschliessende Produktionsfermentation wurde in ca. 75 m3 fassenden Fermentatoren durchgeführt. Die Kulturmediumingredienzien (ausser der Xylose und der Dextrose) wur- 35 den in 52 996 Litern Kondensat angesetzt. Dann wurde das Kulturmedium auf etwa 60 °C erhitzt und sein pH-Wert mit Natri-umcarbonatlösung mit einer Dichte von 16° Baumé auf 5,6 bis 5,8 eingestellt. Vor der Einstellung wurde die Kulturbrühe erhitzt, um das bei der Natriumcarbonatzugabe entwickelte 40 Kohlendioxyd abzutreiben. Nach der Einstellung des pH-Werts wurde dem Kulturmedium das Antischaummittel zugesetzt und der Fermentorinhalt dann 30 Minuten bei 120 °C sterilisiert, worauf es wieder auf 60 °C abgekühlt wurde. Die Zucker,
Xylose und Dextrose, wurden in dem ca. 3800 Liter fassenden 45 Impfkulturtank in 1514 Litern Kondensat angesetzt. Die Zuk-kerlösung wurde 30 Minuten bei 120 °C sterilisiert und nach dem Herunterkühlen mittels eines Inoculumschlauchs in den Produktionsfermentor überführt. Nach der Zugabe der Zucker wurde die Temperatur des Fermentors beim Betriebswert von 50 32 °C stabilisiert, worauf der Fermentor mit der Impfkultur angeimpft wurde. Ab der 20. Stunde nach dem Animpfen wurden alle zwei Stunden Proben aus der Fermentorkulturbrühe gezogen und auf ihre Isomeraseaktivität, das Zellengewicht, den Gehalt an reduzierenden Zuckern und den Gesamtkohlen- 55 hydratgehalt analysiert. Die Fermentation wurde als vollendet angesehen, wenn die Erzeugung von Isomeraseenzym das Maximum überschritten hatte. Während der Fermentation wurde der pH-Wert durch automatische oder manuelle Zufuhr von vorsterilisiertem Ammoniakgas durch die Fermentorluft- 60 einblasleitungen so eingestellt, dass er nicht unter 5,4 bis 5,6 fiel. Die Mediumzusammensetzung und die Betriebsparameter bzw. -bedingungen für die Fermentation im ca. 75 m3 Produk-tions-Fermentor, die bereits in den US-Patentschriften 3 770 589 und 3 813 318 beschrieben worden sind, sind in der 6.5 nachfolgenden Tabelle II wiedergegeben.
Tabelle II
Mediumansatzrezeptur für 75 m3 fassende Fermentoren, Mediumansatzvolumen - 64 352 Liter
Mediumkomponenten
Menge in Gew.-% kg
Maisquellwasser (Code E801) 4,0 2600,44
Stärke (Code 3005) 2,5 1625,22
Dextrose (Code 2001) 0,2 130,18
Xylose 1,0 649,99
Glycin 0,1 64,86
Ammoniumnitrat 0,2 130,18
Magnesiumsulfat 0,05 32,66 Antischaummittel («HODAG 2000» = Polypropylenglycol) 20,82 bis 22,71 Liter
Natriumbicarbonat (vor dem Sterilisieren zugesetzt, um den pH-Wert auf 5,8 bis 6,0 einzustellen)
Endvolumen: 68 137,4 Liter Betriebstemperatur: 31 °C
Weder während der Impfkultur-Entwicklungsstufen noch während der Produktions-Fermentation wurde Kobalt zugesetzt.
Die aus der Kulturbrühe gewonnene intrazellulare Glucoseisomerase besass eine Aktivität von 19,5 IGIU/ml. Zur Herstellung des stabilisierten Glucoseisomerase-Enzymkonzen-trats wurde eine Teilmenge von 8857,9 Litern der Kulturbrühe verwendet. Ein anderer Teil der Kulturbrühe wurde in Form ganzer Zellen unter Verwendung von Mg(OH)2, Filterhilfe (Sil-FIo 332) und Propan-2-ol gewonnen. Die auf diese Weise gewonnenen ganzen Zellen wurden dann zur enzymatischen Umwandlung von Glucose in Fructose in einem Chargenkon-vertor verwendet.
b) Herstellung von stabilisiertem GIucoseisomerase-Enzym-konzentrat
8857,9 Liter wie vorstehend beschrieben im Produktionsfermentor hergestellter intrazellularer Glucoseisomerase-Kultur-
9
629530
brühe mit einer spezifischen Aktivität von 19,5 IGIU/ml, entsprechend einer Gesamtisomeraseaktivität von 173x 106 IGIU, wurden in einer Feststoffe ausstossenden Zentrifuge (DeLaval BRPX-207) verarbeitet. Die Zentrifuge wurde mit einer Zufuhrgeschwindigkeit von 18,93 Litern/Minute und einem 2-Minuten- 5 Schusszyklus gespeist. Unmittelbar vor und nach dem Schüssel-schuss wurde jeweils eine Sekunde Wasch- und Spülwasser (wash and prime water) zugeführt. Die Zellpaste aus dem Schussauslass der Zentrifuge, insgesamt 917,6 kg mit einer Isomeraseaktivität von 187 IGIU/g, wurde mit 75,7 Litern Was- io ser in einen ca. 850 Liter fassenden Tank mit rundem Boden gegeben. Wenn 294,8 bis 317,5 kg Zellpaste gesammelt waren, wurde diese jeweils mit 8 g eines Lysozym-Enzympräparats, ein von der Fa. Miles-Sera vac hergestelltes, aus Eiweiss stammendes, zweimal kristallines, gefriergetrocknetes Pulver mit einer 15 Aktivität von 23 300 Einheiten/mg, behandelt bzw. versetzt, um den Abbau der Zellwände und damit die Freisetzung der intrazellularen Glucoseisomerase in löslicher Form in Gang zu setzen. Der Zellpaste wurde eine 85 Vol.-%ige, wässrige Propan-2-ol-Lösung in einer Menge von 21,2 Litern Lösung auf 45,36 kg 20 Zellpaste, zugesetzt. Dann wurde das Gemisch mit weiteren 41,64 Litern der wässrigen Propan-2-ol-Lösung versetzt, um den Alkoholgehalt der Flüssigkeit auf 30 Vol.-% zu bringen. Das so erhaltene Zellpaste-Propan-2-ol-Wasser-Gemisch wurde dann in einen ca. 3800 Liter fassenden Abbautank gepumpt, worauf 25 man den Zellwandabbau 24 Std. ablaufen liess. Die Temperatur der Flüssigkeit im Zellabbautank wurde bei etwa 26 °C gehalten. Nach 24 Std. wurde dem Gemisch so viel 85 Vol.-%ige Pro-pan-2-ol-Lösung zugesetzt, dass sein Propan-2-ol-Gehalt auf 52 Vol.-% gebracht wurde, d. h. auf eine Propan-2-ol-Konzentra- 30 tion, bei der die Nucleinsäuren, wie Ribonucleinsäure und Desoxyribonucleinsäure, im wesentlichen unlöslich sind, während das Enzymproteinmaterial löslich ist. Auf einem Vakuumrotationsfilter wurden zur Vorbeschichtung 90,7 kg Filterhilfe (Dicalite 4200) angeschwemmt. Nach der Vorbeschichtung 35 wurde dem in der angeschwemmten Filterhilfeschicht enthaltenen Wasser so viel Propan-2-ol zugesetzt, dass der Alkoholgehalt auf etwa 52 Vol.-% gebracht wurde, um die Nucleinsäuren in unlöslicher Form zu halten bzw., anders gesagt, um eine Lösung der Nucleinsäuren zu verhindern. Bei diesem Rota- 40 tionsfilter wurde kein Waschwasser verwendet, sondern nach beendeter Filtration des Zellpastenbreies das Vorbeschich-tungsanschwemm-Wasser/Alkohol-Gemisch durch den Filter geschickt. Der im Vorbeschichtungsfilterbett verbleibende Zellpastenbrei wurde zu einem Nutschenfilter gepumpt, um 45 den Enzymverlust so gering wie möglich zu halten. Beim Filtrieren auf dem Nutschenfilter wurde Dicalite 4200 zugesetzt.
Die Filtrate aus dem Anschwemm-Rotationsfilter und dem Nutschenfilter wurden jeweils in einen als Lager- bzw. Vorratstank für die Beschickung eines Beschickungstanks dienenden 50 ca. 3800 Liter fassenden Tank gepumpt, in dem 56,8 Liter l.Omolare Magensiumsulfat-(MgS04• 7 H2O)-Lösung und 49,2 Liter 85 Vol.-%iger Propan-2-oI zugesetzt wurden. Das so erhaltene Gemisch wurde mit einer Geschwindigkeit von 62,8 Litern/Minute in einem 5-Minuten-Schusszyklus einer Zentri- 55 fuge (DeLaval BRPX-207) zugeführt. Nach dem Zentrifugieren wurde die Schüssel durch fünf aufeinanderfolgende, jeweils eine Sekunde dauernde Spülwasserzufuhren und Schüsse gespült. Der in der Schüssel und der Schusskammer verbleibende, das stabilisierte Enzymkonzentrat enthaltende Rück- 60 stand wurde ausgekratzt, worauf die Schüssel und die Kammer mit etwas leichter Ablaufphase aus der Zentrifuge gewaschen wurden. Sowohl der Rückstand als auch das Waschwasser gingen in das stabilisierte Enzymkonzentratprodukt. Das Produkt wurde mit einem Labormischer gerührt und in ca. 3,8 Liter fas- 65 sende Plastikbehälter zur Auswertung und zum weiteren Gebrauch zur enzymatischen Umwandlung von Glucose in Fructose abgefüllt. Die Gesamtausbeute an stabilisiertem Glu-
coseisomerase-Enzymkonzentrat (Ansatz 1) betrug 41,64 Liter konzentrierte Flüssigkeit, die eine Aktivität von insgesamt 109x 106 IGIU, entsprechend einer Isomeraseaktivität von etwa 11 261 IGIU/g Trockensubstanz enthielt. Dies entsprach einer Aktivitätsausbeute von 63% der in der als Ausgangsmaterial verwendeten, ganze Zellen enthaltenden Kulturbrühe enthaltenen Gesamtaktivität. Eine vollständigere Übersicht über die Analysenkennwerte des stabilisierten Enzymkonzentrats ist der nachstehenden Tabelle III zu entnehmen.
Tabelle III Analysenkennwerte des stabilisierten Glucoseisomerase-Enzymkonzentrats
Ansatz Nr. 1
Isomeraseaktivität (IGIU/g T.S.)
11261
Spezifische Aktivität (IGIÜ/mg Protein)
15,1
Trockensubstanzgehalt (Gew.-%)
22,2
Wassergehalt nach Karl Fischer (Gew.-%)
63,8
Proteingehalt nach Kjeldahl (Gew.-%, bez. auf
74,7
T.S.)
Aschegehalt als Oxid (Gew.-%, bez. auf T.S.)
11,4
Unlösliche Trockensubstanz (Gew.-%, bez. auf
5,3
T.S.)
Mg+ +-Gehalt (mg/ml)
5,8
Mg++-Gehalt (Mol/Liter)
0,24
Mg++/Protein-V erhältnis
0,035
Propan-2-olgehalt (Differenz) (Gew.-%)
14
Beispiel 2
Analog Beispiel la) wurden unter Verwendung von 7,5 Liter, 40 Liter und 400 Liter fassender Fermentatoren für die Impfkulturentwicklung und eines 4000 Liter fassenden Fermen-tors für die abschliessende Produktionsstufe mehrere Chargen bzw. Ansätze intrazellularer Glucoseisomerase aus Streptomyces olivochromogenes ATCC Nr. 21 715 hergestellt. Nach der Fermentation wurde die Temperatur der ganze Zellen intrazellularer Glucoseisomerase enthaltenden Chargen bzw. Ansätze jeweils von 32 auf 22 °C herabgesetzt, um das weitere Mikrobenwachstum und eventuelle Zellautolyse zu verzögern. Die Ansätze wurden dann zentrifugiert, um die Zellen zu einer Zellpaste zu konzentrieren. Die schwere Zellpastenphase wurde in ca. 38 Liter fassenden Eimern aufgefangen, gewogen und dann zum Zellabbau in einen ca. 3800 Liter fassenden Abbautank gepumpt. Dort wurde die Zellpaste unter Rühren mit dem auch in Beispiel 1 verwendeten Lysozym-Enzympräparat versetzt, um die Zellwände abzubauen und die intrazellulare Glucoseisomerase in löslicher Form freizusetzen. Das Lysozym wurde den Ansätzen jeweils in einer 6,8 Einheiten/mg Zelltrockensubstanz entsprechenden Menge zugesetzt. Das in der Zellpaste enthaltene Gesamtzelltrockensubstanzgewicht wurde aus dem Zelltrockensubstanzgehalt der Fermentorkulturbrühe und dem Fermentorkulturbrühenvolumen berechnet. Dieser Berechnung lag somit die Annahme zugrunde, dass die Zelltrockensubstanzausbeute bei der ersten Konzentrationsstufe 100% betragen hatte. Das Lysozym wurde der Zellpaste nach dem Zentrifugieren der Gesamt-Kulturbrühe und vor der Zugabe von Alkohol zugesetzt. Nach der Zugabe des Lysozyms wurde eine azeotrope, wässrige Propan-2-ol-Lösung in einer eine Pro-pan-2-ol-Konzentration von 42 ± 1 Gew.-% ergebenden Menge zugesetzt. Die anfängliche Zugabe von Propan-2-ol wurde auf der Basis des Zellpastengewichts minus 8% für Unlösliches (T.S.) und der Qualität des zugesetzten Alkohols errechnet. Nach der Einstellung der Alkoholkonzentration wurde der pH-Wert des Lysats, d. h., der Zellpasten/Alkohol-Aufschläm-mung mit wasserfreiem Mononatriumphosphat (zur Verringerung des pH) auf 7,0 eingestellt. Das Mononatriumphosphat
629530 10
wurde in 250-g-Anteilen nach Bedarf zugesetzt. Um örtliche Zentrifuge mit einer Geschwindigkeit von 6 bis 10 g/Minute «Hitzenester» zu vermeiden, wurde das Reagens vor der zugeführt und die Schale während jeder Charge zweimal
Zugabe in Wasser gelöst. Die Lysate wurden dann unter turbu- geschossen (entleert).
lentem Rühren bei einer Temperatur von 28 bis 30 °C gehalten, Bei einem Ansatz (Ansatz 10) wurde die Fällung kontinuier-bis das Enzym 100%ig solubilisiert war. Der Solubilisierungs- 5 lieh durchgeführt, wobei der Vorratstank als kontinuierlich grad wurde durch eine Vergleichsenzymanalyse einer ganzen arbeitender Rührkesselreaktor (CSTR) benutzt wurde. Das Lysatprobe und eines Teils der gleichen Probe, aus dem die geklärte Lysat und die Magnesiumsulfatlösung wurden dabei in Zellfeststoffe durch Zentrifugieren abgetrennt worden waren, den Vorratstank kontinuierlich durch ein Misch-T-Rohr eindo-bestimmt. siert. Der Propan-2-ol-Gehalt des geklärten Lysats wurde auf 44
Am Ende der Abbauperiode wurde die Alkoholkonzentra- 'o bis 45 Gew.-% eingestellt, um die Verdünnung durch die Magnetion im Lysat nachgeprüft und auf den Sollwert von 42 ± 1% ein- siumsulfatlösung auszugleichen und so einen Alkoholgehalt gestellt. Dann wurden die Zelltrümmer aus dem Lysat unter von 42 ± 1% während der Fällung einzuhalten. Der Zufluss von Verwendung eines Anschwemmfilters abgetrennt, der mit geklärtem Lysat wurde mittels eines Durchflussreglers gere-
einer in 44- bis 46%igen wässrigen Propan-2-ol-Lösung aufge- gelt. Die 1,0molare Magnesiumsulfatlösung wurde mittels einer schlämmten Diatomeenerde-Filterhilfe (wahlweise Dicalite is kleinen Membranpumpe in einer Menge von 0,05 Litern/Liter 4200 und Dicalite Speedflow, wie weiter unten angegeben) geklärtem Lysat zudosiert. Zunächst wurden beide Lösungen beschichtet bzw. angeschwemmt worden war. Beim so lange ohne Entnahme in den Vorratstank eingespeist, bis
Anschwemmen wurde also mit einem etwas über 42± 1% lie- sich darin ein Volumen angesammelt hatte, das bei den gegebe-genden Alkoholgehalt gearbeitet, um den infolge von Entspan- nen Zuflussgeschwindigkeiten des geklärten Lysats und der nungsverdampfung im Inneren des Vakuum-Anschwemmfilters 20 Magnesiumsulfatlösung einer Verweilzeit von 15 Minuten entauftretenden Alkoholverlusten Rechnung zu tragen. Das abge- sprach. Dann wurde damit begonnen, aus dem Vorratstank das baute Lysat wurde wie es war, d. h. mit einem pH-Wert von Gemisch mit der gleichen Geschwindigkeit abzuziehen und der 7,0+0,3 und bei einer Temperatur von 28 bis 30° filtriert. Die Zentrifuge zuzuführen, mit der der Vorratstank gespeist wurde, vom Anschwemmfilter abgezogenen Filtrate wurden einem ca. Die Zufuhrgeschwindigkeit zur Zentrifuge wurde also, anders 3800 Liter fassenden Tank zugeführt, der als Vorratstank für 25 gesagt, so eingestellt, dass das Flüssigkeitsniveau im Vorrats-die Ausfällungsstufe verwendet wurde. tank konstant blieb. Der Schale wurde alle 10 Minuten ein
Bei vier Ansätzen wurde die Ausfällung chargenweise unter «Teilschuss» verpasst, indem der Schalenbetriebswasserdruck Verwendung eines Vorratstanks als Ausfällgefäss durchge- vermindert wurde.
führt. Die geklärten Filtrate wurden jeweils in Chargen von Nachdem die jeweiligen Ansätze vollständig zentrifugiert etwa 643,5 Litern im Tank vorgelegt. Dann wurden pro Liter 30 waren, wurde der Enzymrückstand von der Oberfläche der geklärtem Lysat jeweils 0,05 Liter l,0molare Magnesiumsulfat- Zentrifuge mit destilliertem Wasser entfernt und jeweils mit lösung und so viel azeotrope Propan-2-ol-Lösung zugesetzt, dem stabilisierten Enzymkonzentratprodukt vereinigt. Die auf dass der Gesamtgehalt an Propan-2-ol bei etwa 42 Gew.-% diese Weise gewonnenen stabilisierten Enzymkonzentrate gehalten wurde. Während der Zugabe wurde die Lösung wurden jeweils geführt, bis sie homogen waren, in Flaschen jeweils gerührt und mittels einer Einspeispumpe umgepumpt, 35 abgefüllt und bei 4 °C gelagert.
um die Durchmischung zu erleichtern. Der Enzymniederschlag Die Tabellen IV und V geben eine Zusammenfassung der in wurde 10 bis 15 Minuten ruhengelassen, damit er sich zu grosse- den verschiedenen Verfahrensschritten jeweils erzielten ren Flocken agglomerieren konnte, und dann mittels einer Zen- Enzymausbeuten wieder. Tabelle V zeigt insbesondere eine trifuge (DeLaval BRPX-207) abgetrennt. Die Lösung wurde der vollständige Analyse der stabilisierten Enzymkonzentrate.
Tabelle IV
Analysenwerte zur Gewinnung von stabilisiertem Enzym
Gesamte Kulturbrühe Zellpaste Lysat Filtrat
Ansatz Volumen Aktivität Menge (kg) Aktivität Menge (kg) Aktivität Volumen Aktivität
Nr. (Liter) (IGIU/g) (IGIU/g) (IGIU/g) (Liter) (IGIU/ml)
6 3190
7 3065
8 3125
9 3220
10a 3200
15,1 18,8 18,0 18,5 16,0
584.3 75,3
578.4 79,7 602,7 84,7 658,1 89,9 587,9 89,1
1167,2 40,8
1123,2 42,8
1124,8 47,3
1419,2 40,4
1105,8 42,4
117 3,4b 32,4
1362,6b 29,2
1627,6e 24,6
1618,1e 24,9
1627,6e 18,9
a Kontinuierliche Fällung b «Dicalite 4200» Filterhife verwendet c «Dicalite Speedflow» verwendet
11
629530
Tabelle V Analysenwerte der stabilisierten Glucoseisomerase-Enzymkonzentrate
Ansatz Nr. 6 7
8
9
10
Isomeraseaktivität (IGIU/g 8012,5
9089,3
9532,1
6680,6 8963,6
T.S.)
Spezifische Aktivität
12,3
14,9
14,7
13,6
15,0
(IGIU/mg Protein)
T rockensubstanzgehalt
25,61
28,0
21,8
21,4
24,7
(Gew.-%)
Wassergehalt nach Karl
61,9
60,9
59,4
61,4
66,2
Fischer (Gew.-%)
Proteingehalt nach
64,9
61,0
64,8
49,4
59,9
Kjeldahl (Gew.-%, bez. auf
T.S.)
Oxydaschegehalt (Gew.-%,
37,6
13,5
13,6
35,5
13,4
bezogen auf T.S.)
Unlösliche Trockensubst.
9,7
4,6
3,7
31,6
3,3
(Gew.-% bez. auf T.S.)
Mg++-Gehalt (mg/ml)
3,8
11,6
3,3
6,73
18,6
Mg++-Gehalt (Mol/Liter)
0,16
0,48
0,14
0,28
0,77
Mg+ +/Protein-VerhäItnis
0,023
0,068
0,023
0,11
0,125
Propan-2-oIgehalt
12,5
11,1
18,8
17,0
9,1
(Differenz) (Gew.-%)
Phosphorgehalt (Gew.-%,
-
2,33
1,80
8,1
2,10
bezogen auf T.S.)
Endgewichtsmenge
18278
14939
16453
24649
12939
gewonnenes, stabilisiertes
Enzymkonzentrat (g T.S.)
Beispiel 3
Analog Beispiel 1 a) wurde ein weiterer grosser Ansatz intrazellularer Glucoseisomerase aus Streptomyces olivochromogenes ATCC Nr. 21175 hergestellt. Nach beendeter Fermentation wurde die Kulturbrühe im ca. 75 m3 fassenden Fermen-tor auf etwa 20 °C abgekühlt und vor dem Konzentrieren der Zellfeststoffe eine kurze Zeit ohne Belüftung und Rühren ruhengelassen.
Die fertige Kulturbrühe (60 565,6 Liter) besass eine Isomeraseaktivität von 21,0 IGIU/g Kulturbrühe, eine maximale Zelltrockensubstanzkonzentration von 16,5 g/1 und eine Gesamtaktivität von 1270,7 x 106 IGIU.
Die die intrazellulare Glucoseisomerase enthaltende ganze Kulturbrühe wurde dann durch Zentrifugieren in einer Zentrifuge (DeLaval BRPX-207) bei einer Einspeisrate von etwa 18,93 Liter/Minute mit einer Schalen-Schuss-Zeit von 1,75 Minuten konzentriert. Der Leichtphasenüberlauf wurde in regelmässigen Abständen analysiert und dann verworfen. Die Schwerphasen-Zellpasten-Schüsse wurden in einem Aufnahmekanister gesammelt und dann kontinuierlich zu einem der drei Tanks gepumpt, in denen der Zellabbau durchgeführt wurde. Die Konzentrationsstufe führte zu einer etwa 6,4fachen Erhöhung der Zellfeststoffkonzentration (auf Volumenbasis). Es wurden insgesamt 9463,5 Liter Zellpaste mit einem Gewicht von 9393,4 kg und einem Gesamttrockensubstanzgehalt von 1102,6 kg gewonnen. Die Analyse der Zellpaste ergab einen Aschegehalt von 131,09 kg, einen Proteingehalt von 649,66 kg, einen Wasergehalt von 8290,76 kg, eine Isomeraseaktivität von 132 IGIU/g und eine Gesamtaktivität von 1240,0x 106 IGIU (98% der Theorie).
Wenn das in einem Abbautank vorgelegte Zellpastenvolumen 757 Liter erreicht hatte, wurden jeweils 757 bis 870,6 Liter 91,5%iger Propan-2-ol zugesetzt, bis der Abbautank voll war. Nach jedem Alkoholzusatz wurde der pH-Wert der dabei erhaltenen Aufschlämmung in dem betreffenden Abbautank geprüft und erforderlichenfalls mit wasserfreiem Mononatriumphosphat auf 7,0 bis 7,2 gesenkt. Nach dem Beginn der Alkoholzugabe in den jeweiligen Abbautanks wurde während des Rests der Auffüllperiode jeweils portionsweise Lysozym-5 enzym (wie in Beispiel 1) in einer ungefähr 6,8 Einheiten/mg Zelltrockensubstanz entsprechenden Menge zugegeben. Wenn der Tank gefüllt war, wurde jeweils eine Endeinstellung der Alkoholkonzentration in der Aufschlämmung auf 42 ± 1 Gew.-% vorgenommen. Das Lysat (Alkohol/Zellpaste/Lyso-io zym-Aufschlämmung) wurde ständig gerührt, sowie durch aus-senliegende Wärmeaustauscher umgepumpt, um die Temperatur beim Sollwert zu halten. Der Mantel der Wärmeaustauscher wurde jeweils mit temperiertem Wasser gespeist, um die Temperatur des Lysats in einem Bereich von 28 bis 30 °C zu 15 halten. Der Grad der Enzymsolubilisierung wurde mittels Enzymvergleichsanalysen überwacht und verfolgt, wobei der analytisch ermittelte Enzymgehalt einer ganzen Lysatprobe und einer Vergleichsprobe, aus der die Zellfeststoffe durch Zentrifugieren abgetrennt worden waren, miteinander vergli-20 chen wurden. Wenn der Abbau in einem Abbautank so weit fortgeschritten war, dass die Solubilisierung in etwa 100% betrug, war die Lysat-Aufschlämmung jeweils für die Klärung zum Entfernen der Zelltrümmer bereit. Die hierfür erforderlichen Abbauzeiten lagen in einem Bereich von etwa 52 bis 73 25 Stunden, vom Beginn des Auffüllens an gerechnet. Die Gesamtmenge der Lysat-Aufschlämmungen aus den drei Abbautanks betrug 19 944,94 Liter und hatte ein Gesamtgewicht von 17 957,72 kg, sowie einen Gesamttrockensubstanzgehalt von 1019,2 kg. Die Analyse der Lysat-Aufschlämmung ergab einen 3o Aschegehalt von 187,78 kg, einen Proteingehalt von 649,09 kg, einen Propan-2-oI-Gehalt von 7221,2 kg und einen Wassergehalt von 9717,3 kg. Das Lysat hatte eine Isomeraseaktivität von 66,6 IGIU/g und eine Gesamtaktivität von 1178,9 x 106 IGIU, entsprechend 93% der Theorie, d. h. der ursprünglich in der als 35 Ausgangsmaterial verwendeten Fermentationsbrühe enthaltenen Gesamtaktivität.
Die Lysat-Aufschlämmung wurde mit einem Anschwemmfilter, der mit Filterhilfe (Dicalite Speedflow der Fa. Grefco Inc.) 5,72 bis 6,35 cm dick vorbeschichtet worden war, geklärt, •»o Zur Klärung der Lysat-Aufschlämmung wurden insgesamt 272,16 kg Filterhilfe verwendet. Die Vorbeschichtungsauf-schlämmung, deren Filterhilfegehalt 5% betrug, wurde mit 50%iger Propan-2-ol-Lösung angerührt. Um die Vorbeschich-tungs-Ansetz-Lösung zu erhalten, Hess man den Vorbeschich-45 tungsablauf in den Vorbeschichtungsabsetztank zurücktropfen bzw. -fliessen, sobald die Vorbeschichtung aufgetragen war. Unmittelbar nach dem Austropfen des Vorbeschichtungs-ablaufs wurde die abgebaute Lysat-Aufschlämmung in den Filter gebracht. Die Filtrationsgeschwindigkeiten bei der Klärung so schwankten zwischen 1,06 und 1,59 Liter/Stunde und dm2 Filter fläche, wobei der durchschnittliche Durchsatz 1,18 Liter/ Stunde und dm2 betrug. Nach dem Filtrieren wurde das geklärte Filtrat in ca. 3800 Liter fassende Lagertanks gepumpt. Die vom Filter abgenommenen Filterkuchen-Schnittstücke 55 wurden in regelmässigen Zeitabständen geprüft und verworfen. Das Lysat hatte ein Gesamtvolumen von 17 556,7 Litern, wog 16 200,5 kg und enthielt insgesamt 351,08 kg Trockensubstanz. Die Analyse des geklärten Lysats ergab einen Aschegehalt von 48,08 kg, einen Proteingehalt von 223,17 kg, einen Pro-60 pan-2-ol-Gehalt von 7165,9 kg und einen Wassergehalt von 8673,59 kg. Die Isomeraseaktivität des geklärten Lysats betrug 54,0 IGIU/g, und seine Gesamtaktivität 875,7 x 106 IGIU, entsprechend 69% der Theorie, bezogen auf die ursprüngliche Aktivität der Fermentationsbrühe.
65 Nach dem Klären wurde die Alkoholkonzentration in den einzelnen, das geklärte Lysat enthaltenden Lagertanks jeweils auf 44 bis 45 Gew.-% (bestimmt durch Dichtemessung) erhöht. Danach wurde die Ausfällung und Stabilisierung der in der
629530
12
geklärten Lysat-Lösung enthaltenen Glucoseisomerase durchgeführt, indem das geklärte Lysat und 439,1 Liter einer 2mola-ren wässrigen Magnesiumsulfatheptahydrat-Lösung aus 105,23 kg MgS04 und 426,8 kg Wasser kontinuierlich durch ein Misch-T-Rohr in einen mit einer Zentrifuge (DeLaval BRTX-207) ver- s bundenen Versorgungstank eingespeist, wobei pro Liter geklärten Lysats 0,025 Liter 2,0molare Magnesiumsulfatlösung zugeführt wurden, um eine Endlösung mit einem Magnesiumsulfatgehalt von 0,05 Mol/Liter zu erhalten. Dabei wurden zunächst nur die Magnesiumsulfat- und die geklärte Lysat- ' o Lösung solange in den Versorgungstank eingespeist, bis darin ein Volumen vorgelegt war, das bei den gegebenen Fliessgeschwindigkeit einer Verweilzeit von 15 Minuten entsprach.
Wenn dieses Volumen erreicht war, wurde damit begonnen, kontinuierlich das im Versorgungstank enthaltene Gemisch i5 abzuziehen und in eine Zentrifuge einzuspeisen, wobei die Entnahmegeschwindigkeit der Zuflussgeschwindigkeit zum Tank entsprach, d. h. so gewählt wurde, dass das Füllniveau im Versorgungstank und damit die Verweilzeit konstant blieb.
Der Überlauf aus der Zentrifuge wurde einem ca. 30 m3 fas- 20 senden Tank zugeführt und nachfolgend in einer Destillationsanlage zur Wiedergewinnung des darin enthaltenen Propan-2-ols aufgearbeitet, der wiederverwendet wurde. Das stabilisierte Enzymkonzentrat wurde in 75,7 Liter fassenden Eimern aus nicht-rostendem Stahl gesammelt und dann in einem ca. 380 25 Liter fassenden Kessel vereinigt. Das stabilisierte Enzymkonzentrat wies eine schlammartige Konsistenz auf und war mittelbraun gefärbt. Zum stabilisierten Enzymkonzentrat wurde intermittierend destilliertes Wasser zugesetzt, um das Enzym in der erforderlichen Weise zu resolubilisieren (die Wiederauflö- 30 sung wurde visuell bestimmt). Wenn das destillierte Wasser zugesetzt war und das stabilisierte Enzymkonzentrat sich löste, schlug die Farbe in ein verhältnismässig klares Kaffeebraun bzw. -schwarz um, und das Produkt wies eine derjenigen eines leichten Öls gleichende Konsistenz auf. 35
Auf diese Weise wurden 276,3 Liter (287,57 kg) stabilisiertes Enzymkonzentrat in resolubilisierter Form gewonnen, deren Trockensubstanzgehalt 76,66 kg betrug. Die Analyse des stabilisierten Enzymkonzentrats ergab einen Aschegehalt von 8,6 kg, einen Proteingehalt von 57,15 kg, einen Propan-2-ol-Gehalt von40 47,17 kg und einen Wassergehalt von 163,29 kg. Das stabilisierte Enzymkonzentrat besass eine Isomeraseaktivität von 11 654 IGIU/g Trockensubstanz und eine Gesamtaktivität von 892,8 x 106 IGIU, entsprechend einer Aktivitätsausbeute von 7 0,3% der Theorie, wobei der grösste T eil des Aktivitäts Verlustes (23 bis 24%) beim Klären des Lysats auftrat. Von diesem Teil des eingetretenen Aktivitätsverlusts ging rd. die Hälfte (etwa 11,8%) mit den abgeschälten Filterkuchenstücken verloren. Der Rest der Verluste war auf Inaktivierung zurückzuführen.
Die nachfolgenden Tabellen VI und VII geben einen zusammenfassenden Überblick über die in den einzelnen Verfahrensschritten erzielten Enzymgewinnungsausbeuten. Die Tabelle VII gibt insbesondere eine vollständige Aufstellung aller wesentlichen Analysenkennwerte des stabilisierten Enzymkon- 55 zentrats wieder.
Tabelle VI
Analysenwerte zur Gewinnung von stabilisiertem Enzymkonzentrat (Ansatz 11)
45
50
Verfahrensstufe
Gewichts
Aktivität je
Gesamtakti-
menge (kg)
Gewichtseinheit vität (IGIU)
(IGIU/g)
Ganze Fermentar-
Kulturbrühe
60454,79
21,0
1270,7-106
Zellpastea
9 393,44
132,0
1240,0-106
Rohes Lysat
17 698,72
66,6
1178,9- 106c
Stabilisiertes
Enzymkonzentrat
287,58
11 654b
892,8-106c a Durch Differenzrechnung oder Schätzung erhaltener Wert. b Wert bezieht sich auf Trockensubstanz.
c Die Gesamtaktivität des geklärten Lysats wurde aus der geschätzten Gewichtsmenge und dem gemessenen Wert der darin je Gewichtseinheit vorhandenen Aktivität errechnet. Offensichtlich lag jedoch die tatsächliche Gewichtsmenge über dem Schätzwert, denn die gewonnene Menge an stabilisiertem Enzymkonzentrat war grösser als die sich aus den Werten des geklärten Lysats rechnerisch ergebende.
Tabelle VII Analysenwerte des stabilisierten Glucoseisomerase-Enzymkonzentrats
Ansatz Nr.
11-336
Isomeraseaktivität (IGIU/g T.S.) 11 654
Spezifische Aktivität (IGIU/mg Protein) 15,5 Trockensubstanzgehalt (Gew.-%) 26,6
Wassergehalt nach Karl Fischer (Gew.-%) 56,9 Proteingehalt nach Kjeldahl (Gew.-%, bez. auf 75,0 T.S.)
Oxydaschegehalt (Gew.-%, bez. auf T.S.) 11,3
Unlösliche Trockensubstanz (Gew.-%, bez. auf 0,53 T.S.)
Mg+ +-Gehalt (mg/ml) 5,99
Mg++-Gehalt (Mol/Liter) 0,25
Mg++/Protein-Verhältnis 0,032
Propan-2-ol-GehaIt (Gew.-%) (Differenz) 16,5 Endmenge an gewonnenem Enzym (kg T.S.) 287,58
Beispiel 4
Mehrere Proben der nach den Beispielen 1 bis 3 erhaltenen stabilisierten Glucoseisomerase-Enzymkonzentrate und andere gleichartige Proben unterschiedlicher Aktivität wurden bezüglich ihrer Lagerungsstabilität bei verschiedenen Temperaturen untersucht. Die Proben wurden bei 4,18,26 bzw. 37 °C gelagert und nach 4,8 und 12 Monaten jeweils hinsichtlich ihrer Glucoseisomeraseaktivität untersucht. Die nachfolgende Tabelle VIII gibt die Ergebnisse dieser Untersuchung wieder.
13 629530
Tabelle Vili
Untersuchung der Temperaturstabilität von stabilisierten Enzymkonzentraten
Prozent der anfänglichen Isomeraseaktivität11 Lagerungstemperatur und -dauer
An- Anfängliche3 4°C 18 °C 26 °C 37 °C
satz Aktivität Monate Monate Monate Monate
Nr. (IGIU/g T.S.) 4 8 12 4 8 12 4 8 12 4 8 12
1 10162
101
101
105
-
97
98
92
96
96
43
10
6
2 10 289,8
100
102
105
-
103
107
96
103
106
77
46
40
3 3910,7b
94
100
101
-
80
81
76
80
80
39
28
6
4 2 441,47b
100
105
102
88
89
82
84
80
61
1
0
-
5 5 823,7
96
103
107
-
91
91
86
90
86
3
1
0
6 7 960,9
95
100
105
-
99
100
91
98
97
44
5
0
7 9 228,57
95
100
107
-
98
97
89
96
101
62
23
21
8 10215,59
101
93
82c
85
88
82
83
88
78
5
3
-
9 7 504,6
100
95
91
88
89
82
83
84
69
5
1
-
10 9113,36
90°
96
90
86
87
81
86
86
80
58
48
42
11 11654,0
88c
93
-
85
90
-
83
88
-
33
26
-
Durchschnitt
96
99
100
86
92
90
86
90
85
34
17
13
a Dies ist der am Beginn der Stabilitätsprüfung und nicht etwa der in den vorhergehenden Beispielen angegebene ursprüngliche, gleich nach der Enzymherstellung bestimmte Aktivitäts- 25 wert.
b Diese Proben besassen infolge fehlerhafter Arbeitsbedingungen nur eine ungewöhnlich niedrige anfängliche Aktivität.
c Die niedrigen Werte sind auf Kristallisation von Proteinmaterial während der Enzymherstellung zurückzuführen, die 30 nicht in die Gesamtanalyse einbezogen wurde.
d Die Bestimmung der Isomeraseaktivität war auf etwa 10% der anfänglichen Isomeraseaktivität genau, worauf die über 100% der anfänglichen Aktivität liegenden Werte zurückzuführen sind. 35
Die in der Tabelle VIII angegebenen Werte lassen erkennen, dass die erfindungsgemässen stabilisierten Enzymkonzentrate bei bis zu 12monatiger Lagerung bei 4 und bei 18 °C mehr als 80 ± 10 und im allgemeinen sogar mehr als 90 ± 10% ihrer 40 anfänglichen Isomeraseaktivität, d. h. ihrer Isomeraseaktivität am Beginn des Stabilitätstest bzw. der Lagerung behalten,
sowie dass sie, selbst wenn man sie bei 26 °C lagert, immer noch bis zu 8 Monate lang etwa 80 ± 10% ihrer anfänglichen Isomeraseaktivität behalten können. Anders gesagt, verloren die sta- 45 bilisierten Enzymkonzentrate im Durchschnitt weniger als 5% ihrer anfänglichen Isomeraseaktivität, wenn sie 12 Monate bei 4 °C gelagert wurden, durchschnittlich weniger als etwa 15%
ihrer anfänglichen Isomeraseaktivität, wenn sie 12 Monate bei 18 oder bis 26 °C gelagert wurden. so
Beispiel 5
64,35 Liter einer analog Beispiel la) hergestellten, intrazellulare Glucoseisomerase enthaltenden Kulturbrühe wurden zur Herstellung einer Zellpaste zunächst mit Wasser verdünnt und 55 dann zentrifugiert (die Ausgangsmaterialcharge stammte aus zwei Fermentoransätzen von je 37,85 Litern, von denen die eine eine spezifische Isomeraseaktivität von 18,0 IGIU/ml und die andere eine spezifische Isomeraseaktivität von 16,8 IGIU/ml aufwies; die beiden Fermentoransätze wurden für die 60 Verwendung als Ausgangsmaterial für die Herstellung der Zellpaste vereinigt). Der Zentrifugenkuchen bzw. die Zellpaste wurde in einen 7,5 Liter fassenden Fermentorkolben gegeben und mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 4,5 Litern verdünnt. Die dabei erhaltene Aufschlämmung wurde 2 Tage bei 65 einer Raumtemperatur von 4 °C stehengelassen und dann 77 mg eines aus Eiweiss stammenden Lysozym-Enzympräparats mit etwa 8000 Lysozymeinheiten/mg und 1930 ml Propan-2-ol versetzt. Die Aufschlämmgun wurde 4 Stunden gerührt, worauf weitere 500 mg Lysozym-Enzympräparat zugesetzt wurden. Nachdem hierauf zunächst seine Temperatur auf 20 bis 30 °C eingestellt worden war (die Temperatur war nach der zweiten Lysozymzugabe auf etwa 35 bis 40 °C gestiegen, was vermutlich zu einer gewissen Enzymdesaktivierung führen dürfte), wurde die Aufschlämmung über Nacht gerührt. Nach dem Abbau wurde eine 500-ml-Probe des rohen Lysats mit 500 ml Wasser verdünnt. Proben von jeweils 123 ml des verdünnten Lysats wurden dann mit so viel Propan-2-ol versetzt, dass ihr Propan-2-ol-Gehalt etwa 50 Vol.-% (V/V) betrug. Eine Lysat-probe wurde für einen Blindversuch verwendet. Die Lysatpro-ben wurden dann mit den in der nachstehenden Tabelle IX angegebenen Mengen Natriumchlorid (zum Vergleich) bzw. Magnesiumsulfatheptahydrat (MgSOt • 7H2O) versetzt. Nach der Salzzugabe wurden die Suspensionen, einschliesslich der Blindprobe, zentrifugiert und auf ihre Glucoseisomeraseaktivi-tät und ihren Proteingehalt, der anhand des Verhältnisses der optischen Dichte bei 260 und 280 nm unter Verwendung des Nomographen von E. Adams auf der Basis der von Warburg und Christian in Biochem. Z. 310,384 (1942) angegebenen Extinktionskoeffizienten für Enolase und Nucleinsäuren bestimmt wurde, analysiert. Die weiteren Einzelheiten bezüglich der Durchführung und Ergebnisse dieser Versuche sind aus der nachstehenden Tabelle IX zu ersehen.
Tabelle IX
optische
Aktivität
Dichte (%)
in überste
bei
hender Flüs
Salzmen
260
280
sigkeit
Salz ge (g)
nm nm pHa
(IGIU/ml)
Blind
versuch
-
1,5
1,19
6,5
2,79
NaCl
1,0
1,53
1,06
6,40
3,33
NaCl
2,0
1,55
1,08
6,38
3,14
NaCl
5,09
1,82
1,30
6,35
2,76
MgS04
0,25
1,50
1,03
6,45
2,87
MgS04
0,50
1,48
0,995 6,45
2,36
MgSÛ4
1,0
1,65
1,12
6,30
1,17
MgSÜ4
2,0
1,68
1,11
6,25
0,20
a Der pH-Wert war bei diesen Versuchen relativ niedrig, was der Grund für die verhältnismässig geringe Isomeraseaktivität
629 530
14
sein könnte. Er war jedoch nicht so niedrig, als dass er die Ursache für das fast völlige Fehlen der Isomeraseaktivität in der überstehenden Flüssigkeit beim Versuch mit 2 g MgSOt sein könnte. Es wird angenommen, dass die Enzymdesaktivierung bei diesem Versuch grösstenteils durch den Temperatur- s anstieg auf 35 bis 40 °C nach der zweiten Lysozymzugabe verursacht wurde.
Die in Tabelle IX angegebenen Versuchsergebnisse zeigen, dass die Zugabe des Magnesiumsulfats zu dem alkoholisch-wässrigen Lysat zu einer Abnahme der Isomeraseaktivität in "> der überstehenden Flüssigkeit führt, ohne den in der überstehenden Flüssigkeit vorhandenen Nucleinsäuregehalt (Nucleinsäuren absorbieren Licht einer Wellenlänge von 260 nm) wesentlich zu verringern. Dieser Effekt trat bei der Zugabe von Natriumchlorid nicht auf. Der Zusatz des Magnesiumsulfats 15 zum alkoholisch-wässrigen Lysat bewirkt somit eine Trennung der Glucoseisomerase von den löslichen Nucleinsäuren. Dieser Effekt war offensichtlich kein typischer «Aussalzeffekt», da die Magnesiumsulfatkonzentration hierfür zu niedrig war und mit Natriumchlorid eine derartige Trennung nicht erreicht wurde. 20 Die unter Verwendung von Natriumchlorid durchgeführten Versuche ergaben nämlich keinerlei nennenswerte Abnahme der Isomeraseaktivität in der überstehenden Flüssigkeit.
Beispiel 6 25
Dem Rest des 4,5 Liter rohen, solubilisierte Glucoseisomerase enthaltenden Lysats von Beispiel 5 wurden Filterhilfe und so viel Propan-2-ol zugesetzt, dass die Aufschlämmung einen Propan-2-ol-Gehalt von 50 Vol.-% (V/V) besass. Die Aufschlämmung wurde langsam filtriert, um die solubilisierte Glucoseiso- 30 merase zu klären. Eine Probe von 335 ml dieses Filtrats mit einer analytisch bestimmten Isomeraseaktivität von 65,2 IGIU/ml, entsprechend einem Gesamtaktivitätsgehalt der Probe von 21 842 IGIU, wurde bei einem pH-Wert von 8 mit je 16,5 ml Propan-2-ol und 1 molarer Magnesiumsulatheptahydrat- 35 lösung versetzt. Der Magnesiumsulfatgehalt des Gemisches betrug somit 1%, bezogen auf das ganze Gemisch, bzw. 2%, bezogen auf das darin enthaltene Wasser. Nach der Zugabe des Magnesiumsalzes bildete sich sofort ein öliger Niederschlag. Die den Niederschlag enthaltende Lösung wurde zentrifugiert 40 und der Niederschlag dadurch abgetrennt. Der Niederschlag wurde mit Wasser in einer ein Volumen von insgesamt 10,5 ml ergebenden Menge wieder aufgelöst. Diese Probe wurde mit Wasser im Verhältnis (zu Probe) von 402:1 verdünnt, worauf die optische Dichte der verdünnten Lösung bei 260 und 280 nm 45 bestimmt wurde, die 0,284 bzw. 0,350 betrug. Aus diesen Werten wurde der Proteingehalt der verdünnten Lösung zu 0,33 mg/ml ermittelt, entsprechend einem Proteingehalt der unverdünnten Probe (10,5 ml-Lösung) von 133 mg/ml. Die Bestimmung der Isomeraseaktivität der Lösung ergab einen Wert von so 2040 IGIU/ml, so dass die Gesamtaktivität der Probe 21400 IGIU betrug, entsprechend einer Ausbeute von 98%, bezogen auf die anfängliche Aktivität des geklärten Lysats. Das stabilisierte Glukoseisomerase-Enzymkonzentrat besass eine spezifische Isomeraseaktivität von 15,3 IGIU/mg Protein. Diese 55 Werte zeigen in Verbindung mit den in der Tabelle IX aufgeführten Ergebnissen, dass das Magnesiumsulfat die Isomerase selektiv ausfällt und reinigt.
Beispiel 7 60
Eine Probe (67 ml) resolubilisierten Alkoholfraktionats, die solubilisierte, zellfreie Glucoseisomerase enthielt, wurde mit 67 ml der Propan-2-oI-Lösung verrührt. Dabei konnte keine Niederschlagsbildung beobachtet werden. Hierauf wurden der geklärten, Isomerase enthaltenden Alkohol/Wasser-Lösung je 65 2 ml einer 1 molaren Magnesiumsulfatheptahydrat-Lösung und der Propan-2-ol-Lösung zugesetzt, worauf sich sofort eine grau-weisse, feste Fällung bildete, die anschliessend abgetrennt und in Wasser zu einem Volumen von 13,0 ml gelöst wurde. Das stabilisierte Enzymkonzentrat wurde erneut zentrifugiert und im Verhältnis 101:1 (Wasser:Enzymkonzentrat) mit Wasser verdünnt, um dann analysiert zu werden. Die Lichtdurchlässigkeit der verdünnten Lösung bei 260 nm betrug 0,288 und diejenige bei 280 nm Wellenlänge 0,437. Hieraus wurde der Proteingehalt der verdünnten Lösung zu 0,46 mg/ml ermittelt. Die das solubilisierte, stabilisierte Enzymkonzentrat enthaltende unverdünnte Lösung, deren Isomeraseaktivität mit 482 IGIU/ml ermittelt wurde, besass somit einen Proteingehalt von 46,5 mg/ml und eine spezifische Isomeraseaktivität von 10,4 IGIU/mg Protein. Die in den 13,0 ml stabilisierten Enzymkonzentrats vorhandene Gesamtaktivität betrug 6266 IGIU. Das Zentrifugat enthielt dagegen nur 150 IGIU.
Beispiel 8
Eine Probe von 3250 ml des geklärten, solubilisierte Glucoseisomerase enthaltenden Lysats der ursprünglich 4,5 Liter grossen Charge von Beispiel 5 mit einer Isomeraseaktivität von 109 IGIU/ml, wurde mit je 162 ml der Propan-2-ol-Lösung und der 1 molaren Magnesiumsulfatheptahydrat-Lösung versetzt. Dabei bildete sich sofort ein öliger Niederschlag, der durch Zentrifugieren abgetrennt und gewonnen wurde. Der Niederschlag hatte ein Volumen von 69 ml und wies, wie die Analyse ergab, eine Isomeraseaktivität von 4040 IGIU/ml, entsprechend einer Gesamtaktivität von 278 760 IGIU auf. Zur Durchführung der Proben bzw. Analysen wurde ein kleiner Teil des stabilisierten Enzymkonzentrats in einem Verhältnis von 1:1000 verdünnt. Die bei einer Wellenlänge-von 260 bzw. 280 nm gemessene Lichtdurchlässigkeit betrug 0,315 bzw. 0,345. Daraus wurde der Proteingehalt zu 0,299 mg/ml und die spezifische Aktivität zu 13,5 IGIU/mg Protein bestimmt. Der Rest des stabilisierten Enzymkonzentrats wurde 48 Stunden lang stehengelassen, worauf sich drei Schichten gebildet hatten. Die dreischichtige Aufschlämmung wurde zentrifugiert und analysiert, wobei sich zeigte, dass die oberste, lipidhaltige Schicht (18,2 ml) eine Isomerasoaktivität von 565 IGIU/ml, die mittlere (39 ml) eine Isomeraseaktivität von 1970 IGIU/ml und die unterste Schicht (36 ml) eine Isomeraseaktivität von 50,80 IGIU/ml besass. Die Bodenschicht bzw. unterste Schicht wies den niedrigsten Lichtdurchlässigkeitsmesswert bei 260 nm und den höchsten Lichtdurchlässigkeitsmesswert bei 280 nm auf. Die oberste Schicht wies den höchsten Lichtdurchlässigkeitsmesswert bei 260 nm auf.
Beispiel 9
104,096 Liter analog Beispiel la) hergestellter, intrazellu-, lare Glucoseisomerase enthaltender Kulturbrühe mit einer Isomeraseaktivität von 17,5 IGIU/ml wurden mit der gleichen Volumenmenge Wasser vermischt und dann zu einem festen Kuchen zentrifugiert. Der Kuchen wurde bei pH 7,45 mit so viel Wasser vermischt, dass das sich ergebende Volumen 26 Liter betrug. Diese Aufschlämmung wurde mit 0,250 g Lysozym und 11,5 Liter Propan-2-oI bei einer Temperatur von 27 °C vermischt. Ausserdem wurde eine kleine Menge eines Anti-schaummittels zugesetzt und die Aufschlämmung dann gerührt. Die wässrige Suspension (37,5 Liter) enthielt 37 bis 44 IGIU/ml. Nach 20,5 Stunden wurden zwei Proben von je 8 Litern entnommen, worauf Propan-2-ol in einer Menge zugesetzt wurde, die einen Alkoholgehalt von 50 Vol.-% (V/V) ergab. Dann wurden die Aufschlämmungen zunächst mit Filterhilfe (Sil-Flo) in einer Menge von 3 g/g Zellen versetzt und dann filtriert, sowie anschliessend mit 2 Litern 50%iger Propan-2-ol-Lösung gewaschen. Die Analyse des Filtrats ergab eine Isomeraseaktivität von 15 IGIU/ml. In die restlichen 21,5 Liter des rohen Lysats wurde ein weiteres Gramm Lysozym eingerührt, wodurch man eine Isomeraseaktivität von 24,3 IGIU/ml im Filtrat erhielt. Das im Filtrat enthaltene Enzym wurde durch Zugabe von je 1,1
15 629530
Liter Propan-2-oI-Lösung und 1 molarer Magnesiumsulfatiö- ist es, die Wirksamkeit und Effektivität verschiedener erfin-
sung sofort ausgefällt. Die das stabilisierte Enzymkonzentrat dunsgemäss zu verwendender wasserlöslicher Magnesiumsalze enthaltende Fällung wurde abzentrifugiert und in einer kleinen im Vergleich zur Verwendung anderer für ihre Fähigkeit, Pro-
Menge Wasser zu einem Volumen von 200 ml gelöst. Die dabei teine auszufällen bekannter Salze, wie Ammoniumsulfat, Natri-
erhaltene Lösung besass eine Isomeraseaktivität von 3450 s umsulfat und Natriumchlorid, aufzuzeigen. In den Vergleich
IGIU/ml, entsprechend einer Gesamtaktivität von 690 000 wurden auch andere Salze zweiwertiger Metalle einbezogen.
IGIU, und eine spezifische Aktivität von etwa 12,5 IGIU/mg Eine grosse Probe des Lysats (Alkohol/Wasser/Glucoseiso-
Protein. merase-Lösung) von Ansatz 6 (vgl. Beispiel 2 und Tabelle IV)
Zwei Proben des so erhaltenen stabilisierten Enzymkonzen- wurde in einer Laborzentrifuge mit 18 000 UpM vor ihrer Ver-trats (200 ml), von denen eine mit Propanol «parasept» als Kon- "> wendung 10 Minuten zentrifugiert. Der Alkoholgehalt wurde servierungsmittel versetzt wurde, die andere dagegen nicht, zu 41,6 Gew.-% bzw. 49,3 Vol.-% (V/V) bestimmt. Jeder der wurden einem Lagerungsstabilitätstest bei Raumtemperatur jeweils aus 30 ml geklärtem Lysat (bei Raumtemperatur) beste-(etwa 26 °C) unterworfen. Am Beginn des Lagerungsstabilitäts- henden Proben wurde eine 1 molare Lösung eines der in der tests wiesen beide Proben eine Isomeraseaktivität von 3300 nachfolgenden Tabelle X aufgeführten Salze in der weiter IGIU/ml auf. Die Proben wurden in regelmässigen Zeitabstän- > s unten angegebenen Menge sowie die gleichhohe Volumenden geprüft. Nach 31tägiger Lagerung wies die Probe mit dem menge an Propan-2-ol zugesetzt. Nach dem Zusatz von Salz Konservierungsmittelzusatz eine Isomeraseaktivität von 3165 und Alkohol wurden die Proben durchgemischt und dann IGIU/ml und die andere Probe (ohne Konservierungsmittel) jeweils 10 Minuten bei 18 000 UpM zentrifugiert. Die überste-eine Isomeraseaktivität von 3140 IGIU/ml auf. Dieses Ver- hende Flüssigkeit wurde jeweils entfernt und der Niederschlag suchsergebnis zeigt, dass die stabilisierten Enzymkonzentrate 20 aus den Zentrifugengläsern ausgewaschen und auf ein Gesamt-der Erfindung (mit oder ohne Konservierungsmittel) ziemlich volumen von 25 ml mit einem Kobaltphosphatpuffer ( 10~3 m lagerungsstabil sind und, wenn sie bei Raumtemperatur über 30 Co++; pH 7,5; 0,05 mPC>4) verdünnt, worauf die Glucoseisome-Tage lang gelagert werden, bis zu 95% oder mehr ihrer raseaktivität und der Proteingehalt bestimmt wurden. Die Wir-Anfangsaktivität behalten können. kung der Verwendung verschiedener Salze und Konzentratio-
25 nen bezüglich der Selektivität der Fällung und der Reinigung
Beispiel 10 (Vergleichsversuche) der solubilisierten Glucoseisomerase ist aus der nachfolgenden
Der Zweck der in diesem Beispiel beschriebenen Versuche Tabelle X zu ersehen.
Tabelle X
Einfluss der Anwendung verschiedener Salze und Salzkonzentrationen auf die Enzymfällung
Vol.-% zugesetzte 1 m Salzlösung3
Salze Gewonnenes Enzym 1 2,5 5 10 20
Magnesiumsalze
MgSCWHiO
%
1
97
100
100
95
spezif. Aktivität15
2,4
15,7
15,8
13,6
11,0
MgCk
%
15
100
103
103
105
spezif. Aktivität
9,5
15,4
15,6
16,4
16,9
Mg (C2H3O2)
%
3
94
100
99
98
spezif. Aktivität
3,7
15,1
15,4
15,3
15,9
Salze einwertiger Kationen
Na2SC>4
%
0
0
0
1
16
spezif. Aktivität
0
0
0
2,6
8,4
(NH4)2SC>4
%
0
0
0
1
1
spezif. Aktivität
0
0
0
2,6
2,9
NaCl
%
0
0
0
1
1
spezif. Aktivität
0
0
0
1,8
1,9
Salze anderer zweiwertiger
Kationen
BaCh
%
-
93
76
18
-
spezif. Aktivität
-
11,9
8,8
8,4
-
SrCI2
%
-
104
94
28
spezif. Aktivität
-
14,3
12,7
12,7
-
CaCh
%
-
65
57
19
-
spezif. Aktivität
-
8,9
7,9
6,2
-
C0CI2
%
-
61
18
1
-
spezif. Aktivität
-
9,1
5,6
0,8
-
MnCh
%
-
21
29
8
-
spezif. Aktivität
-
2,8
3,9
2,6
-
3 Die sich jeweils ergebenden und molaren Konzentrationen sind: 0,01,0,025,0,048,0,09 und 0,17.
b Protein für spezifische Aktivität (sp. Akt.): Bestimmt durch Messung der optischen Dichte bei 280/260 nm; angegeben in IGIU/mg Protein.
629530 16
Die in Tabelle X wiedergegebenen Versuchsergebnisse zei- mit 0,1 ml Kalilauge auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt. Das gen, dass Natrium- und Ammoniumsulfat Glucoseisomerase rohe Glucoseisomerase-Enzym wurde aus einer 6,5 g Probe nicht so wirksam und in so niederen Konzentrationen auszufäl- (wie Material vorlag) trockenem Zellpräparat mit 50 ml Extrak-len vermögen, wie die Magnesiumsalze. Ammoniumsulfat fällte tionsmittel extrahiert. Das Gemisch wurde 45 Minuten bei überhaupt kein Enzym und Natriumsulfat ergab nur eine Aus- 5 Raumtemperatur gerührt und dann bei 4 °C zentrifugiert.
beute von 19%. Abgesehen davon, dass diese Ausbeute sehr Dabei wurden 42 ml eines Extraktes mit einer Isomeraseaktivi-gering ist, war sie nicht notwendigerweise auf eine Fällung tät von 26 bis 27 IGIU/ml erhalten. Die so hergestellte Gluco-
zurückzuführen, sondern könnte auch einer Phasentrennung in seisomerase-Enzymlösung und das erfindungsgemässe stabili-eine Alkohol/Wasser- und eine Salzwasserphase zuzuschreiben sierte Enzymkonzentrat (hergestellt nach Beispiel lb) wurden sein. Das Protein ist in der Salzwasserphase besser löslich als in io nach folgenden Verfahren an eine Vielzahl verschiedener was-der Alkohol/Wasser-Phase. Die Salzwasserphase extrahiert serunlöslicher Träger sorbiert:
somit (nicht spezifisch) Protein aus der Alkohol/Wasser-Phase. In einem 150 ml fassenden Becherglas wurden jeweils 2 g Da die Salzwasserphase eine höhere Dichte besitzt, wird sie als (Trockensubstanz) des wasserunlöslichen Trägers mit 30 ml Produkt gewonnen. Auch das als weiteres Salz eines einwerti- einer mit KOH auf pH 8,0 eingestellten O.Olmolaren Magnesigen Metalls in die Untersuchung einbezogene Natriumchlorid is umsulfatheptahydratlösung vermischt. Diesem Gemisch wurde fällte die Glucoseisomerase nicht aus. so viel Isomeraseflüssigkeit (entweder die auf herkömmliche
Die geprüften Salze anderer zweiwertiger Metalle als Weise solubilisierte Isomerase oder das erfindungsgemässe
Magnesium fällten die Glucoseisomerase zwar ebenfalls aus, Enzymkonzentrat) zugesetzt, dass der Träger (je nach seiner jedoch waren bei ihrer Verwendung die Ausbeuten und Rein- Kapazität) mit 1000 bis 2000 IGIU in Kontakt gebracht wurde, heiten nicht so hoch wie bei der Verwendung der erfindungsge- 20 Danach wurde durch Zugabe weiterer 0,01molarer Magnesi-mäss einzusetzenden Magnesiumsalze. Die Barium- und Stron- umsulfatheptahydratlösung das Flüssigkeitsvolumen auf 50 ml tiumsalze erwiesen sich von den geprüften Nicht-Magnesium- ergänzt. Das das Enzym und den wasserunlöslichen Träger entsalzen als noch am besten geeignet bzw. leistungsfähigsten, haltende Gemisch wurde dann zunächst 30 Minuten durch Rüh-jedoch sind diese Salze im Hinblick auf eine Verwendung für ren gründlich durchgemischt, und darauf filtriert und mit der Lebensmittel unerwünscht. 25 0,01 molaren Magnesiumsulfatheptahydratlösung gewaschen.
Von den geprüften Salzen fällten nur die Magnesiumsalze Die Filtrate und Waschflüssigkeiten wurden dann vereinigt und das Enzym wirksam mit hoher spezifischer Aktivität aus. Die in einen 250-ml-MesskoIben überführt, wo sie durch Auffüllen angewandte Magnesiumsalzkonzentration beträgt nur einen bis zur Eichmarke mit 0,01 molarer Magnesiumsulfatheptahy-Bruchteil derjenigen, die erforderlich ist, um Proteine aus einer dratlösung verdünnt und danach im Vergleich zum ursprüngli-wässrigen Lösung nach klassischen «Aussalztechniken», d. h. 30 chen löslichen Isomerase-Enzympräparat mit Hilfe eines autounter Verwendung von Ammonium- und Natriumsulfat, auszu- matischen Analysengeräts (Technician Auto Analyzer) auf ihre fällen. Tatsächlich steht dieses Phänomen im Gegensatz zu den Isomeraseaktivität untersucht wurden.
einschlägigen Angaben in der Literatur (vgl. z. B. Advances in Die «Bindungskapazität» («BC») der jeweiligen wasserun-
Protein Chemistry, Band XI, Seiten 416 bis 418 [1956] und löslichen Träger wurde durch Differenzrechnung nach folgen-
Advances in Protein Chemistry, Band 16, Seite 216 [1961]). Ins- 35 der Formel berechnet:
besondere die letztgenannte Literturstelle behauptet, dass
Magnesiumsulfat beim Aussalzen von Proteinen weniger effek- «BC» [IGIU/g T.S.] = Gesamte vorhandene Aktivität [IGIU] -tiv als Natrium- oder Ammoniumsulfat sei. Gesamte Aktivität in Filtrat- und Waschwasser [IGIU] pro g
Aus den in der Tabelle X angegebenen Werten ist auch klar Trägertrockensubstanz zu ersehen, dass beim Erhöhen der Magnesiumsulfatlösungs- 40
konzentration (über 0,08molar) die spezifische Aktivität In der Tabelle XI sind die Ergebnisse dieser Versuchsreihe abnimmt, was darauf hinweist, dass dann eine weniger selektive zusammengefasst, in der die Bindungskapazitäten verschiede-Fällung stattfindet, d. h. mehr anderes Protein zusammen mit ner Träger für auf normale bzw. bekannte Wiese solubilisierte der Glucoseisomerase ausgefällt wird. Es wurde beobachtet, Glucoseisomerase einerseits und das stabilisierte Enzymkon-dass mit dem Magnesiumsulfat Phasentrennung stattfand. Die 45 zentrat der Erfindung andererseits miteinander verglichen wer-Abnahme der spezifischen Aktivität entspricht der anschei- den.
nend erhöhten Löslichkeit von Protein in der Salzwasser-
Phase. Bei der Verwendung von Magnesiumchlorid und -acetat Tabelle XI
trat keine Phasentrennung auf und die spezifischen Aktivitäten Bindungskapazität verschiedener Träger bei Verwendung blieben mit steigender Magnesiumsalzkonzentration konstant, 50 solubilisierter Glucoseisomerase soweit sie nicht, wie bei Magnesiumchlorid, sogar zunahmen. Trägervorbe- Verwendete Bindungs-
Anionenaustauscherharz handlung Isomerase3 kapazität Beispiel 11 (IGIU/g T.S.) Immobilisierung löslicher Glucoseisomerare
Dieses Beispiel zeigt, dass die hochgereinigten und stabili- 55 Amberlite IRA-938 sierten erfindungsgemässen Enzymkonzentrate eine immobili- Amberlite IRA-938 sierte Glucoseisomerase mit höherer Bindungskapazität liefern Amberlite IRA-93 können als auf übliche Weise solubilisierte Glucoseisomerase. Amberlite IRA-93 Aus gemäss Beispiel la) hergestellten, intrazellulare Glucoseisomerase enthaltenden ganzen Zellen wurde solubilisierte 60 DEAE Cellulose Glucoseisomerase hergestellt. Um die Gewinnung der ganzen Selectacel Type 20 Zellen zu unterstützen, wurden der Kulturbrühe Filterhilfe (Sil- Selectacel Type 20 Fio) und Magnesiumhydroxyd zugesetzt und das Gemisch dann Selectacel Type 40 mit Propan-2-ol gewaschen, getrocknet und in einer Wiley-
Mühle gemahlen. Während der Extraktion der Glucoseisome- 65 3 N = Normale lösliche Glucoseisomerase; SEC = Erfin-rase aus den Zellen wurde das die Zellen enthaltende Gemisch dungsgemässes, stabilisiertes Enzymkonzentrat.
mit so viel Magnesiumsulfatheptahydrat behandelt, dass die b Pufferlösung, enthaltend 0,05 m pH 7,5 Kaliumphosphat-
AufschlämmungO.Ol Mol Magnesiumsalz/Liter enthielt, und puffer, 0,01 m MgSCk- 7H2O und 0,001 mCoCb-öHiO.
Pufferb
N
152
Puffer0
SEC
333
Puffer15
N
37
Pufferc
SEC
113
MgSCM N 851
Pufferb SEC 1487
MgSCV N 936
17 629530
c Tris-Puffer (0,05 m, pH 7,5) enthaltend 0,01 m wurden vereinigt und auf ihre Glucoseisomeraseaktivität unter-
MgSQt • 7 H2O. sucht. Die in der Kolonne sorbierte Enzymmenge wurde durch d 0,01 m MgSOf 7H2O, eingestellt auf pH 8,0 mit 0,1 n KOH. Differenzrechnung ermittelt.
Die in der Tabelle XI angegebenen Werte zeigen, dass die Bei der Verwendung immobilisierter ganzer Zellen'(das Sil-
Bindungskapazität von DEAE-Cellulose für das erfindungsge- s FIo-Filterhilfe enthaltende Produkt von Beispiel la) wurden 5 g mässe stabilisierte Enzymkonzentrat nahezu zweimal so hoch des Enzympräparats mit oder ohne Zusatz von 100 mg Magne-wie die für in herkömmlicher Weise solubilisiertes Enzym ist, siumhydroxyd in die Kolonnen gefüllt, worauf ebenfalls Glas-sowie dass auch die synthetischen Anionenaustauscherharze wollpfropfen aufgesetzt wurden.
für die erfindungsgemässen Enzymkonzentrate eine zwei- bis Zur Durchführung der kontinuierlichen Umwandlung wur-
dreimal so hohe Bindungskapazität aufweisen, wie für das zum 10 den die Kolonnen jeweils kontinuierlich mit einer durch Auflö-Vergleich untersuchte, in herkömmlicher Weise solubilisierte sen kristalliner Dextrose erhaltenen, 50 Gew.-%igen, d. h. 600 g Enzym. Im Verlauf dieser Versuche wurde ausserdem gefunden Glucose/Liter Lösung enthaltenden Glucoselösung beschickt, bzw. festgestellt, dass die Bindungskapazität von DEAE-Cellu- die pro Liter 0,004 bis 0,0055 Mol Magnesiumsulfat enthielt und lose für das erfindungsgemässe stabilisierte Enzymkonzentrat einen pH-Wert von 8,4 bis 8,6 besass. Die Kolonnen wurden beträchtlich gesteigert wird, wenn man den Träger bei einem 15 erforderlichenfalls ins Gleichgewicht gebracht und die kontinu-niedrigeren pH-Wert vorkonditioniert. Beispielsweise bindet ierliche enzymatische Isomerisation bei 60 °C durchgeführt, der Träger bei einem pH-Wert von 6,5 3120 IGIU/g, während indem durch den Mantel der Kolonnen jeweils 60 °C warmes der unbehandelte Träger nur 1634 IGIU/g zu binden vermag. Wasser gepumpt wurde. Der Durchfluss der den Kolonnen Durch die Verwendung des erfindungsgemässen stabilisierten zugeführten Lösung durch die Kolonnen wurde durch Anlegen Enzymkonzentrats war es möglich, an DEAE-Cellulose (Type 20 eines Vakuums am Kolonnenboden und durch Aufpressen von 20) pro dm3 0,386 Mill. («MM») IGIU zu binden. Der so erhal- Stickstoffgas auf die Beschickung aufrecht erhalten. Die tene Biokatalysator konnte dann zur Umwandlung von Glu- Durchflussgeschwindigkeit wurde durch Variieren des auf der cose in hochfructosehaltigen Maissirup durch kontinuierliches Beschickung lastenden Gasdrucks reguliert.
Durchleiten einer Glucoselösung durch den Biokatalysator, der Die anscheinende Enzymaktivität «KE» wurde nach der in Kolonnen bzw. Säulen oder in Druck-Blattfilter-Elementen 25 Beziehung angeordnet werden konnte, verwendet werden.
Aus Tabelle XI ist auch zu ersehen, dass die höchste unter KE = BVH x log [% Le/% Le - % L]
Verwendung auf herkömmliche Weise solubilisierter Glucoseisomerase erreichte Bindungskapazität 936 IGIU/g betrug und bestimmt bzw. errechnet, in der BVH die Säulenfliessgeschwin-bei Selectacel Type 40 erreicht wurde, das eine Austauschkapa- 30 digkeit in Bettvolumina/h, % Le den Dextrose/FIuctose-Gleich-zität von 0,89 mäqVg besass. Obwohl Selectacel Type 20, das gewichtswert, der bei 60 °C 51,2 beträgt, und % L den Ketose-eine Austauscherkapazität von 0,87 mäq/g hatte, eine etwas nie- gehalt des Kolonnenablaufs bedeuten.
drigere Bindungskapazität als die Type 40 aufwies, ist es für den Die Säulenfliessgeschwindigkeit in Bettvolumina pro Einsatz in der industriellen Praxis besser geeignet, weil es eine Stunde bei einem Lävulosegehalt von 45%, abgekürzt «BVH45» grössere Teilchengrösse besitzt und daher bessere Fliessge- 35 ist somit gleich KE/0,916.
schwindigkeiten zu erzielen sind. Die Halbwertszeit, d. h. diejenige Zeit, die erforderlich ist,
bis die Hälfte der «anscheinenden Aktivität» der Kolonne verBeispiel 12 loren gegangen ist, wurde bestimmt, indem während einer 2
Bei den nachfolgenden Versuchen wurde das erfindungsge- Wochen oder länger dauernden Kolonnenbetriebsperiode Promésse stabilisierte Enzymkonzentrat an einer Anzahl verschie- 40 ben gezogen und an ihnen die «KE» gemessen wurde. Die dener wasserunlöslicher Träger immobilisiert und dann jeweils dabei erhaltenen Analysenwerte wurden graphisch ausgewer-bezüglich seiner Verwendbarkeit bei der kontinuierlichen enzy- tet, indem in einem Diagramm 1 nKE gegen die Zeit aufgetra-matischen Umwandlung von Glucose in hochfructosehaltigen gen und aus der Steigung der dabei erhaltenen Kurve, die nach Maissirup erprobt. Zum Vergleich wurden auch kontinuierliche der Methode der kleinsten Felderquadrate bestimmt wurde, die Umwandlungen unter Verwendung immobilisierter ganzer Zel-45 Halbwertszeit erhalten. Bei dieser Methode wird unterstellt, len durchgeführt. Für die Umwandlungen wurde ausser in den dass der Abfall der Enzymaktivität wie eine Reaktion erster Fällen, in denen in der Tabelle XII etwas angegeben ist, jeweils Ordnung verläuft. Die anfängliche bzw. ursprüngliche Säulen-eine Kolonne bzw. Säule mit den Abmessungen 1,5 x 8 cm ver- fliessgeschwindigkeit in Bettvolumina/h bei einem Lävulosege-wendet. halt von 45%, BVH45, wurde aus dem Schnittpunkt der Regres-
Die Kolonnen wurden vorbereitet, indem zunächst am 50 sionsgeraden (intercept of the least square line) bestimmt, unteren Ende ein Glaswollpfropfen eingesetzt und die Kolonne Die Effizienz, «Eff», wurde nach der Beziehung dann teilweise mit Wasser gefüllt wurde. Bei der Verwendung wasserunlöslicher Träger wurden diese dann in die Kolonnen Eff = BVH45/MM IGIU/dm3
gefüllt und mit einem Glaswollpfropfen abgedeckt. Dann wurde das erfindungsgemässe stabilisierte Enzymkonzentrat 55 bestimmt.
(Beispiel 1 b, Ansatz 1 ) langsam durch die Kolonne geführt, Die bei diesen kontinuierlichen Umwandlungen erzielten worauf mit ether kleinen Menge destillierten Wassers nachge- Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle XII wiedergege-waschen wurde. Die Wasch- und anderen Kolonnenabläufe ben.
629 530 18
Tabelle XII
Ergebnisse der kontinuierlichen Umwandlung unter Verwendung verschiedener immobilisierter
Glucoseisomerase-Enzympräparate
Kontinuierliches Konversionssystem Durchschnitts- Effizienz Halbwertszeit Aktivität nach zwei beladung (Tage) Halbwertszeiten (at 2 Half-Lines)
(MM IGIU/dm3) (IGIU/g T.S.)
«Aluminiumoxyd mit geregelter Porosität:1
0,499
0,61
48
0,09
Basisches Magnesiumcarbonat
0,0689
0,29
36
0,26
DEAE-Reis2
0,114
0,57
14
0,35
DEAE-Cellulose (Selectacel-20)
0,314
0,51
12
0,42
DEAE-Stärke
0,0353
0,39
11,2
0,60
DEAE-Holzchips2
0,372
0,22
18,3
0,65
Darco S-51 Carbon
0,00566
0,22
5,6
2,12
Amberlite IRA-904
0,228
0,49
37,0
0,15
Amberlite IRA-937
0,0138
1,13
4,3
0,54
Sil-Flo/Zellen (kein Mg (OH)2)
0,0676
0,49
14
0,38
Sil-flo/Zellen + Mg(OH)2
0,0781
0,44
17
0,36
Angebotene Sorbierte
SorbiertesEffizienz
Halbwerts
Isomerase-(gesa- Isomerase-
Enzym
zeit
25 mt)-aktivität aktivität
<W
(Tage)
(MM IGIU/dm3) (MM IGIU/dm3)
14,2 13,9
98
0,5
66
20,2 18,4
91
0,45
67
30 26,3 19,6
75
0,43
60*
20
1 Es wurden das in den US-Patentschriften 3 850 751, Tabelle XIII
3 868 304 und 3 982 997 beschriebene «Aluminiumoxyd mit Effekt der Enzymbeladung bei kontinuierlicher Umwandlung1 geregelter Porosität» als Enzymträger und - wie bei allen anderen Versuchen dieser Reihe - eine (3,0x 18 cm) Mantelkolonne verwendet, die wie folgt gefüllt und vorbereitet wurde: In die Kolonne wurde zuerst eine 3 mm hohe Schicht aus Glasperlen eingefüllt, die mit einem feinmaschigen Sieb abgedeckt wurde.
Dann wurde die Kolonne teilweise mit 0,1 m Magnesiumacetat-lösung gefüllt, worauf 55,6 g Träger eingefüllt wurden und die Kolonne mit der 0,1 m Magnesiumacetatlösung rückgespült wurde, um das Bett zu fluidisieren. Dann wurde der Träger mit einem feinmaschigen Sieb abgedeckt, auf das Glasperlen gefüllt wurden. Schliesslich wurde auf die Kolonne stabilisier- . 1 Der Aluminiumoxydträger mit geregelter Porosität und tes Enzymkonzentrat in einer 40 000 bis 45 000 IGIU entspre- einer spezifischen Oberfläche von 80 m2/g enthält, bezogen auf chenden Menge aufgegeben und die Kolonne dann mit der 35 Trockensubstanz, 97 bis 98% AI2O3 und 2 bis 2,4% MgO, wie in 0,1 m Magnesiumacetatlösung gewaschen. der US-PS 3 982 997 beschrieben.
2 Es wurde eine(3,0x 18 cm) Mantelkolonne wie in Fussnote
1 beschrieben vorbereitet, wobei jedoch abweichend davon Das stabilisierte Enzymkonzentrat der Erfindung lässt sich statt der Magnesiumacetat- eine Magnesiumsulfatlösung ver- effizient an dem Aluminiumoxydträger mit geregelter Porosi-wendet wurde und das Enzym schon vor dem Füllen der 40 tät unter Bildung eines Biokatalysators sorbieren, der zur konti-
Kolonne bzw. Säule auf bzw. an den Träger wie folgt aufge- nuierlichen Umwandlung von Glucose in hochfructosehaltige bracht bzw. sorbiert wurde: Maissirupe gut geeignet ist. Die hohe Bildungseffizienz und die
38 g Reis bzw. Holzchips wurden mit HCl behandelt, mit lange Halbwertszeit dieses Biokatalysators ermöglichen seinen Wasser gewaschen und danach in 750 ml 0,1 m Magnesiumsul- wirtschaftlichen Einsatz in grosstechnischen Verfahren, fatlösung, die 8 ml des stabilisierten Enzymkonzentrats von 45 Ansatz 1 enthielt, suspendiert. Beispiel 13
Wenn auch in den vorhergehenden Beispielen nur die Ver-Die in der Tabelle XII angegebenen Daten zeigen, dass das wendung von Propan-2-ol als wassermischbares organisches stabilisierte Enzymkonzentrat der Erfindung effizient an einer Lösungsmittel bei der Herstellung der stabilisierten Enzymkon-Vielzahl wasserunlöslicher Träger sorbiert und zur kontinuierli- 50 zentrate erläutert ist, so können erfindungsgemäss, wie bereits chen Umwandlung von Glucose in hoch-fructosehaltige Maissi- erwähnt, jedoch auch noch andere wassermischbare organi-rupe verwendet werden kann. Die beste Enzymausnutzung sehe Lösungsmittel verwendet werden. Der nachfolgende Verwurde beim Sorbieren bzw. Immobilisieren des stabilisierten such wurde durchgeführt, um die Verwendbarkeit anderer was-Enzymkonzentrats an dem Aluminiumoxydträger mit geregel- sermischbarer organischer Lösungsmittel als Propan-2-ol auf-ter Porosität erzielt. Die dabei erreichte hohe Enzymausnut- 55 zuzeigen.
zung ist das Ergebnis der dadurch erzielten hohen Effizienz und Gemäss Beispiel 1 a) wurde eine intrazellulare Glucoseiso-langen Halbwertszeit. Das basische Magnesiumcarbonat und merase enthaltende Kulturbrühe mit einer Isomeraseaktivität die synthetischen Anionenaustauscherharzträger (Amberlite von 18,1 IGIU/g Kulturbrühe hergestellt. Diese Kulturbrühe IRA-904) lieferten in Kombination mit dem erfindungsgemäs- wurde filtriert, wobei eine Zellpaste mit einer Isomeraseaktivi-sen stabilisierten Enzymkonzentrat bei der kontinuierlichen 60 tät von 120 IGIU/g erhalten wurde. Die Zellpaste wurde mit Umwandlung ebenfalls gute Ergebnisse. einem Lysozym-Enzympräparat behandelt, um die Zellwände
Die vorstehend in bezug auf den Aluminiumoxydträger mit der intrazellularen Glucoseisomerase abzubauen. Die löslichen geregelter Porosität beschriebene Arbeitsweise wurde unter Bestandteile des so erhaltenen Lysats besassen eine Isomerase-Verwendung des stabilisierten Enzymkonzentrats von Beispiel aktivität von 123 IGIU/g. Das Lysat wurde mit so viel Wasser
3 wiederholt. In der Taelle XIII sind die bei diesem Versuch 65 verdünnt, dass seine Isomeraseaktivität nach dem Verdünnen erhaltenen Ergebnisse zusammengefasst. 110 IGIU/ml betrug. Proben von jeweils 50 ml dieses Lysats wurden jeweils allmählich mit einem der nachstehend angegebenen wassermischbaren organischen Lösungsmittel versetzt.
19
629530
Dabei wurde jeweils so lange Lösungsmittel zugesetzt, bis das Isomeraseprotein gerade auszufallen begann. Das Lösungsmit-tel/Lysat-Gemisch wurde dann jeweils 5 bis 10 Minuten gerührt, worauf das unlösliche Material, einschliesslich der Zelltrümmer und Nucleinsäuren durch Zentrifugieren abgetrennt wurde. Proben von jeweils 20 ml der dabei gewonnenen überstehenden Flüssigkeiten wurden dann unter Rühren mit 1 ml einer 1 molaren Magnesiumsulfatheptahydratlösung (5 Vol.-%) und so viel Lösungsmittel versetzt, wie erforderlich war, um die durch die zugesetzte Magnesiumsulfatlösung bedingte Verdünnung der Probe in bezug auf den Lösungsmittelgehalt auszugleichen. Die die zellfreie Glucoseisomerse, das wassermischbare organische Lösungsmittel und Magnesium-sulfatheptahydrat enthaltenden wässrigen Gemische wurden dann jeweils etwa 15 Minuten stehengelassen, wobei sie zwischendurch gelegentlich gerührt wurden. Dann wurden die Gemische zentrifugiert, wobei die ausgefällten stabilisierten Enzymkonzentrate als Produkt gewonnen wurden. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der nachfolgenden Tabelle XIV wiedergegeben.
Tabelle XIV
Lösungsmittel
Pro Volumen
Aktivitäts
Spezifische
Lysat zug.
ausbeute (%)
Aktivität3
Lösungsmittel
(IGIU/mg
volumina0
Protein)
Propan-2-ol
1
100
11,8
Aceton
0,8
92
10,0
Methanol
2,4
87
12,0
Äthanol
1,3
98
11,6
Propan-2-ol
0,8
82
10,5
t-Butanol
0,65
95
6,4
p-Dioxanb
0,7
25
5,7
a Protein für spezifische Aktivität wurde anhand der optischen Dichte bei 280/260 nm bestimmt.
b Fällung mit 10 Vol.-% m MgSC>4-Lösung; alle anderen Fällungen mit jeweils 5 Vol.-% 1 m MgSCU-Lösung.
c Das Lysat hatte eine spezifische Aktivität von etwa 2 IGIU/mg Protein.
5
Aus den vorstehenden Versuchsergebnissen bzw. -werten ist zu ersehen, dass eine Reihe verschiedener wassermischbarer organischer Lösungsmittel wirksam für die Zwecke der Erfindung verwendet werden kann. Die Alkohole und Ketone io mit bis zu 3 C-Atomen erwiesen sich als die bezüglich der selektiven Gewinnung des Isomeraseenzyms wirksamsten Lösungsmittel. Ihre Verwendung stellt daher eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung dar. Aus den vorstehend angegebenen Werten ist weiterhin zu ersehen, dass um so 15 mehr Lösungsmittel erforderlich ist, um die Isomerase wirksam bzw. in hoher Ausbeute und selektiv zu gewinnen, je niedriger das Molekulargewicht des betreffenden Lösungsmittels ist. Beispielsweise benötigt man zur selektiven Abtrennung bzw. Gewinnung pro Volumen Lysat bei der Verwendung von Me-20 thanol 2,4 Volumina (etwa 67 Gew.-%), bei der Verwendung von Propan-2-ol dagegen nur 1 Volumen (42 Gew.-%).
Es sei darauf hingewiesen, dass der Fachmann die in den vorstehenden Beispielen erläuterte Erfindung ohne weiteres in vielerlei Hinsicht abwandeln und modifizieren kann, ohne den 25 Rahmen des in der Beschreibung offenbarten und in den Ansprüchen gekennzeichneten Erfindungsgedankens zu verlassen.
Es sei abschliessend darauf hingewiesen, dass ein wichtiges Definitionskriterium der erfindungsgemässen stabilisierten 30 Glucoseisomeraseenzymkonzentrate neben dem Proteingehalt, dem Magnesiumgehalt, dem Verhältnis dieser beiden Grössen und der spezifischen Isomeraseaktivität eben die Stabilität ist, die so gross ist, dass das Präparat z. B. bei bis zu 30tägiger Lagerung bei 26 °C mindestens 70 bis 90% seiner 35 ursprünglichen Stabilität beibehält. Bei bevorzugten Ausführungsformen werden mehr als 90% der anfänglichen Isomeraseaktivität unter diesen Bedingungen beibehalten.
Claims (19)
1. Stabilisiertes Glucoseisomerase-Enzymkonzentrat, das [A] zellfreie Glucoseisomerase, die im wesentlichen nucleinsäu-refrei ist, und [B] Mg++ enthält, gekennzeichnet durch (a) einen Proteingehalt von 50 bis 80 Gewichtsprozent, bezogen auf die Trockensubstanz, (b) einen Mg++-Gehalt von 3 bis 45 mg/ml Enzymkonzentrat, (c) ein Mg++/Protein-Verhältnis von 0,02 bis 0,75, (d) eine spezifische Isomerase-Aktivität von mindestens 10 IGIU (International-Glucose-Isomerase-Units = Internationale Glucoseisomeraseeinheiten) pro mg Protein und (e) eine solche Stabilität, dass es bei bis dreissigtägiger Lagerung bei 26 °C bis zu 95% seiner anfänglichen Isomerase-Aktivität behält.
2. Enzymkonzentrat nach Patentanspruch 1, gekennzeichnet durch einen Proteingehalt von 60 bis 75 Gewichtsprozent, bezogen auf die Trockensubstanz.
3, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich 5 bis 25 Gewichtsprozent eines wassermischbaren organischen Lösungsmittels, insbesondere Propan-2-ol, enthält.
3. Enzymkonzentrat nach Patentanspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch ein Mg++/Protein-Verhältnis von 0,03 bis 0,5 und einen Mg++-Gehalt von 5 bis 25 mg/ml Enzymkonzentrat.
4, gekennzeichnet durch einen Wassergehalt von 50 bis 80 und einen Trockensubstanzgehalt von 5 bis 30 Gewichtsprozent.
4. Enzymkonzentrat nach einem der Patentansprüche 1 bis
5, gekennzeichnet durch eine Aktivität von mindestens 5000, vorzugsweise mindestens 8000 IGIU/g Trockensubstanz, und vorzugsweise eine so hohe Stabilität, dass es bei bis zu einjähriger Lagerung bei 18 °C mindestens 70% seiner Anfangs-Isome-raseaktivität behält und vorzugsweise eine spezifische Isomerase-Aktivität von mindestens 12 IGIU/mg Protein aufweist.
5. Enzymkonzentrat nach einem der Patentansprüche 1 bis
6, dadurch gekennzeichnet, dass es kein zugesetztes Kobalt enthält.
6. Enzymkonzentrat nach einem der Patentansprüche 1 bis
7, dadurch gekennzeichnet, dass es 20 bis 30 Gewichtsprozent Propan-2-ol und 55 bis 70 Gewichtsprozent Wasser enthält, sowie, dass sein Mg++-Gehalt aus Magnesiumacetat, -chlorid und/oder -sulfat stammt.
7. Enzymkonzentrat nach einem der Patentansprüche 1 bis
8. Enzymkonzentrat nach einem der Patentansprüche 1 bis
9. Verfahren zur Herstellung eines stabilisierten Glukose-isomerase-Enzymkonzentrates nach Patentanspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, dass man (a) durch Behandeln eines zellfreien Glucoseisomerase und wassermischbares organisches Lösungsmittel enthaltenden wässerigen Gemisches mit einem im wesentlichen wasserlöslichen Magnesiumsalz in einer Menge, die eine Magnesiummolarität von 0,002 bis 0,3 Mol Magnesiumsalz pro Liter Gemisch im Gemisch ergibt, im Gemisch ein stabilisiertes Enzymkonzentrat aus einer Enzym-Magnesium-Fällung erzeugt, und (b) das stabilisierte konzentrierte Glucoseisomerase-Magnesium in einer einer Mg++-Molarität von 0,1 bis 2 entsprechenden Menge, Wasser und wassermischbares organisches Lösungsmittel umfassende Enzymkonzentrat gewinnt.
10. Verfahren nach Patentanspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man als im wesentlichen wasserlösliches Magnesiumsalz Magnesiumacetat, -chlorid und/oder -sulfat verwendet.
11. Verfahren nach Patentanspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass man als wassermischbares organisches Lösungsmittel Methanol, Äthanol, Propanol, tert.-Butanol, Aceton, p-Dioxan und/oder vorzugsweise Propan-2-ol verwendet, und dass man dieses Lösungsmittel in der Verfahrensstufe (a) vorzugsweise in einer einem Gehalt von 30 bis 60 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gemisch, entsprechenden Menge verwendet.
12. Verfahren nach einem der Patentansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das zellfreie Glucoseisomerase und wassermischbares organisches Lösungsmittel enthaltende wässerige Gemisch hergestellt wird, indem man (a) intrazellulare Glucoseisomerase enthaltende Zellen in Anwesenheit von Wasser mit wassermischbarem organischen Lösungsmittel und einem Lysozym-Enzympräparat behandelt, (b) das Lysozym-Enzym auf das Zellmaterial einwirken lässt, wodurch dieses unter Bildung von unlöslichen Substanzen aus Zelltrümmern und Nukleinsäuren und löslichen Substanzen aus zellfreier Glucoseisomerase, wassermischbarem organischen Lösungsmittel und Wasser abgebaut wird, (c) die unlöslichen Substanzen abtrennt und (d) dabei ein wässeriges, zellfreie Glucoseisomerase und wassermischbares organisches Lösungsmittel enthaltendes Gemisch gewinnt.
13. Verfahren nach Patentanspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass man dem die Zellen enthaltenden wässerigen Gemisch so viel wassermischbares organisches Lösungsmittel, insbesondere Propan-2-ol, zumischt, dass der Lösungsmittelge-halt der erhaltenen wässerigen Mischung 40 bis 45 Gewichtsprozent beträgt.
14. Verfahren nach Patentanspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass man jeweils so viel Lösungsmittel zusetzt, wie erforderlich ist, um in den Verfahrensstufen (a), (b) und (c) einen Lösungsmittelgehalt von 42+1 Gewichtsprozent aufrechtzuerhalten.
15. Verfahren nach einem der Patentansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Lysozym-Enzym vor dem Lösungsmittel, insbesondere Alkohol, zugesetzt wird.
16. Verfahren nach einem der Patentansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass in den Verfahrensstufen (a), (b), (c) und (d) jeweils so viel Lösungsmittel, vorzugsweise Propan-2-ol, zugesetzt wird, wie erforderlich ist, um die Lösungsmittelkonzentration bei 42 ± 1 Gewichtsprozent zu halten.
17. Verfahren nach einem der Patentansprüche 9 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass Glucoseisomerase verwendet wird, die von einem Mikroorganismus der Gattung Streptomy-ces, insbesondere Mikroorganismen der Stämme Streptomyces olivochromogenes ATCC No. 21713, ATCC No. 21714 und/ oder ATCC No. 21715, einschliesslich ihrer Varianten und Submutanten stammt und vorzugsweise gemäss einem der Patentansprüche 12 bis 16 aus den Zellen abgetrennt und gewonnen wird.
18. Verfahren nach einem der Patentansprüche 9 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das die zellfreie Glucoseisomerase und das Lösungsmittel, insbesondere Propan-2-ol, enthaltende wässerige Gemisch mit Magnesiumsulfatheptahydrat in einer Menge behandelt wird, die einer Konzentration von etwa 0,05 Mol dieses Salzes pro Liter entspricht.
19. Verfahren nach einem der Patentansprüche 9 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass man das in der Verfahrensstufe gewonnene stabilisierte Enzymkonzentrat mit einer kleinen Menge Wasser verdünnt.
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| PL | Patent ceased | ||
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