DD297843A5

DD297843A5 - Verfahren zur herstellung eines wasserunloeslichen, vernetzten kristallinen enzyms und seine verwendung

Info

Publication number: DD297843A5
Application number: DD89328567A
Authority: DD
Inventors: Kalevi Visuri
Original assignee: ��@��k��
Priority date: 1988-05-13
Filing date: 1989-05-12
Publication date: 1992-01-23
Also published as: EP0341503A2; IE63128B1; ATE95232T1; ES2059610T3; HU206134B; DK231989A; DK169039B1; FI882249A0; US5900364A; FI85285C; FI85285B; US5437993A; DE68909488D1; ZA893460B; DE68909488T2; CA1320463C; US5811280A; NO891943L; DK231989D0; EP0341503A3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines wasserunloeslichen, vernetzten kristallinen Enzyms, beispielsweise von wasserunloeslicher kristalliner Glucoseisomerase. Erfindungsgemaesz wird ein Dialdehyd zu einer kristallinen Isomerasesuspension hinzugegeben, wobei vor der Zugabe von Dialdehyd oder waehrend der Vernetzungsreaktion eine mindestens eine Aminogruppe enthaltende Verbindung wie Ammoniumsalz, Amin oder Aminosaeure hinzugegeben wird und die vernetzten Kristalle zur Entfernung von Reagenzrueckstaenden mit Wasser oder einer anderen Fluessigkeit gewaschen werden. Die nach dem erfindungsgemaeszen Verfahren hergestellte wasserunloesliche vernetzte kristalline Glucoseisomerase wird angewandt fuer die kontinuierliche Herstellung von Fructose in einem Reaktor.{kristalline Isomerase; Dialdehyd, vernetzen; wasserunloesliches Enzym; Anwendung; Herstellung von Fructose}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen, vernetzten kristallinen Enzyms, insbesondere einer neuartigen wasserunlöslichen Glucoseisomerase, die durch Vernetzung des kristallien Enzyms gebildet wird.

Charakteristik des bekannton Standes der Technik

Die Verwendung von immobilisierten Enzymen, d.h. von Enzymen, die an einen festen Träger gebunden sind, in kontinuierlich betriebenen Reaktoren ist eine zunehmend bevorzugte Methode, da die Einsparungen bei den Enzymkosten sowie bei der Reinigung des Endproduktes ermöglicht. Die Umwandlung von Glucose zu Fructose mit einer immobilisierten Glucoseisomerase ist ein Verfahren, das gewöhnlich eine solche Verfahrensweise anwendet.

Im allgemeinen sind Enzyme wasserlöslich, wodurch die Anwendung eines Immobilisierungsverfahrens in einem kontinuierlichen Prozeß erforderlich ist. Das Enzym muß an eine feste Phase gebunden werden, und zwar durch eine Methode, die dessen Auflösung in der wässrigen Phase verhindert und gleichzeitig die Aufrechterhaltung seiner Aktivität gestattet. Es sind verschiedene Verfahren zur Assoziierung von Enzymen mit festen Trägern vorgeschlagen worden, wonach das Enzym absorbiert, kovalent gebunden, vernetzt oder mikrogekapselt wird. Es kann aber auch der ganze Mikroorganismus, der das Enzym produziert, an eine feste Phase gebunden werden. Eine gute Zusammenfassung solcher Verfahren ist beispielsweise in Moo-Young, M. (Hg.), Comprehensive Biotechnology, 2, Pergamon Press, London 1985, S. 191-211, gegeben.

In früheren Verfahren wird das Enzym an eine gesondert hergestellte Trägersubstanz gebunden, welche als solche für die chemische Kinetik oder die Strömungstechnik des Substrats vorteilhaft sein kann. Die Trägersubstanz ist jedoch in den meisten Fällen teurer als das als Katalysator wirkende Enzym, insbesondere bei großtechnischen Herstellungsverfahren wie den in der Zuckerindustrie verwendeten. Das Enzym kann aber auch durch Vernetzen mit einer inerten Komponente wie Gelatine immobilisiert werden. Auf jeden Fall bildet das als Katalysator wirkende Ezym nach dem Stand der Technik nur einen Bruchteil, im allgen ^!nen weniger als 5%, meist 1 bis 2% der Masse und des Volumens des in jedem einzelnen Prozeß verwendeten Stoffes.

Technisch ist die Vernetzung mit Glutaraldehyd von großer Bedeutung beispielsweise bei der Immobilisierung von Glucoseisomerase. Glutaraldehyd ist bekanntlich für die Immobilisierung von Enzymen, die in Lebensmittelverfahren eingesetzt werden sollen, von der FDA genehmigt.

Andere angewendete Verfahren beinhalten die Verkettung an Ionenaustauscher und die Absorption an einen festen Trägerstoff.

Ein Beispiel für eine solche Anwendung ist in dem US-Patent 4.699.882 (K. Visuri; Stabilisierte Glucoeisor erase) zu finden.

Allerdings ist der in diesem Verfahren nach dem Stand der Technik verwendete Trägerstoff relativ teuer, und das Verfahren erfordert einen großen Reaktor.

Die Immobilisierung von Enzymen zur industi iellen Verwendung bringt Kosten mit sich, die nicht unbedingt mit dem verwendeten Enzym zusammenhängen. Dazu gehören Kosten für den Bau der Prozeßapparatur und das Werksgelände, Kosten für die Beschaffung (Wiederbeschaffung) des Trägerstoffs, Kosten für die Beseitigung von inaktiviertem Enzymmaterial, Arbeitskräftekosten für Befüllen und Entleeren der Reaktoren (oder für die Regeneration des Trägerstoffs), Sekundirkosten, die

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durch die Trägheit der Reaktoren hervorgerufen werden. Als eine Folge langer Verweilzeiten kann es oft zu nichtenzymatischen nachteiligen Nebenreaktionen, insbesondere bei der Herstellung von Fructose, kommen.

Die Fachliteratur enthält einige Beispiele für die Vernetzung von kristallinen Enzymen mit Hilfe von Glutaralu'ehyd. Bei diesen Untersuchungen sind Enzymkristalle für Grundforschungszwecke vernetzt worden. Die Struktur von Enzymkristallen ist oft so schwach, daß die Kristalle dem bei den Röntgendiffraktionsuntersuchungen verwsndeten Strahlenbündel nicht standhalten. Mit Glutaraldehyd können sie jedoch oft für solche Zwecke stabilisiert werden. Darüber hinaus sind Kristalle zu dem Zweck vernetzt worden, um Stabilität und Katalysekinetik zu untersuchen. In solchen Fällen, wo die Vernetzung von Kristallen erfolgreich ist, ist nur Glutaraldehyd verwendet worden und das Medium bestand aus einer Lösung, in der jedes einzelne Enzym in kristalliner Form aufrechterhalten wurde. Es scheint, daß ein unlösliches Kristall durch eine Reaktion zwischen dem Glutaraldehyd und dem Enzymprotein gebildet worden ist. Quiocho und Richards (Proc.Natl.Acad.Sci.[USA| 52 [1964] S. 833 und Biochemistry 5 (1966) S.4062) waren die Ersten, die Glutaraldehyd bei der Vernetzung von Carboxypeptidasen einsetzten. Bishop und Richards (J.Mol.Biol.33 [1968] S.415-421) haben kristallines Beta-Lactoglobulin mit einer 1%igen wässrigen Glutaraldehydlösung bei Raumtemperatur vernetzt. Die Kristalle wurden zur Untersuchung der elektrischen Eigenschaften des Enzyms verwendet. Haas (Biophysic.Journ.8 [1968] S.549-555) hat Lysozymkristalle in Gegenwart einer4%igen Natriumnitratlösung (pH-Wert 8) unter Anwendung einer Glutaraldehydkonzentration von 12% vernetzt.

Dyer, Phillips und Townsend (Thermochimica Acta 8 [1974] S.456-464) haben die Thermostabilität einer durch Glutaraldehyd vernetzten kristallinen Carboxypeptidase untersucht. Sie haben festgestellt, daß die Vernetzung zu einer erhöhten Stabilität führt. Tuechsen und Ottesen (Carlsberg Res.commun.42 [1977] S.407-420) haben die kinetischen Eigenschaften eines kristallinen Subtilisin untersucht, das durch Glutaraldehyd in einer Natriumsulphatlösung vernetzt worden war. Bei niedrigmolekularen Substraten war die Aktivität der Kristalle hoch, während sie bei hochmolekularen Substraten wie Proteinmolekülen oder Polypeptiden (die nicht in die Kristalle diffundieren können) unbedeutend war. Wong et al. (Biochem. and Biophysic. Research Communications 80 [19781S. 886-890) haben saure Protease mikrowellen Ursprungs mit Glutaraldehyd in einer Ammoniumsulfatlösung vernetzt. Bei der Vernetzung wurde die Gegenwart von Ammoniumsulfat als ein technischer Nachteil betrachtet.

Morozov und Morozova (Biopolymers 20 [1981] S.451-467) haben kristallines Lysozym, Hämoglobin und Myoglobin unter Verwendung von 2 bis 6%igen Glutaraldehydlösungen und einer Reaktionszeit von 2 bis 10 Tagen bei Raumtemperatur vernetzt. Leo et al. (Bioorganic Chemistry 14 [19986], S. 202-210) haben Kristalle von Alkoholdehydrogenase mit Glutaraldehyd in Gegenwart von 1-Methyl-2,4-pentandiol (25%) vernetzt.

Es ist bekanntlich oft schwierig, unlösliche Enzyme mit Hilfe von Glutaraldohyd zu erzeugen, insbesondere wenn das Protein relativ wenig Lysin enthält. Diosem Problem wird oft dadurch begegnet, daß dem Enzym ein Protein wie Albumin beigemischt wird, das zur Herstellung einer unlöslichen Form vernetzt werden kann (G. B. Broun, Methods in Enzymology, 44 [1976] S. 263). Der Zusatz eines derart! jen inerten Fremdproteins ist allerdings nicht möglich, wenn das zu vernetzende Enzym kristallin ist. Bis heute gibt es kein Mittel der Vernetzung in solchen Fällen, wo es nicht möglich ist, ein Kristall nur durch Glutaraldehyd in die unlösliche Form zu vernetzen.

Wie oben erwähnt, ist bekannt, Glucosoisomerase mit Glutaraldehyd zu immobilisieren. Die Isomerase wird dabei an ein Trägermaterial vernetzt. Solche Prozesse werden industriell voll genutzt. In der Literatur sind keine Versuche zur Vernetzung von Glucoseisomarasekristallen in die unlösliche Form beschrieben.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist tue Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens zur Herstellung eines kristallinen wasserunlöslichen Enzyms, das für die Isomerisierung eines Substrats, wie z. B. Fructose eingesetzt werden kann.

Darlegung des Wesens d" Erfindung Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Vernetzung eines kristallinen Enzyms unter Bedingungen durchzuführen, daß eine

neuartige wasserunlösliche Glucoseisomerase erhalten wird.

Es wurde festgestellt, daß Glucoseisomerasekristalle so vernetzt werden können, daß der ursprüngliche kristalline Zustand

aufrechterhalten wird, während die enzymatische Aktivität des Enzyms sehr hoch bleibt, wobei die besten Verfahren die gleiche

Aktivität wie das ursprüngliche Enzym liefern. Erfindungsgemäß wird ein neuartiges Verfahren zur Verfügung gestellt zur Herstellung eines wasserunlöslichen vernetzten

kristallinen Enzyms, bei dem

a) ein Dialdehyd zu einer kristallinen Isomerasesuspension hinzugegeben wird, wobei vor der Zugabe von Dialdehyd oder während der Vernetzungsreaktion eine mindestens eine Aminogruppe enthaltende Verbindung wie Ammoniumsalz, Amin oder Amoniumsäure hinzugegeben wird, und

b) die vernetzten Kristalle zur Entfernung von Reagenzrückständen mit Wasser oder einer anderen Flüssigkeit gewaschen werden, wobei das Enzym Glucoseisomerase ist.

Das erfindungsgemäße Produkt nt in Lösungsmitteln, die bei der technischen Anwendung des Enzyms vorhanden sein können, nicht löslich. Vernetztes kristallines Enzym kann als solches zum Füllen einer Isomerisierungskolonne in einem technischen Isomerisationsprozeß verwendet werden. Mit Hilfe des neuen vernetzten kristallinen Enzyms kann ein kontinuierlicher Isomerisationsprozeß in weitaus kleineren und leistungsfähigeren Kolonnen als zuvor durchgeführt werden. Der Fachmann wird erkennen, daß die Erfindung den Einsatz einer Kolonne ermöglicht, die anstelle von Enzym, das an einen inerten Stoff gebunden ist, der oft den größten Teil des Raumes der Kolonne einnimmt und den größten Teil der Kosten ausmacht, mit reinem Enzym gefüllt ist.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Glucoseisomerasekristaile mit Hilfe eines Oialdehyds wie Glutaraldehyd und einer mindestens eine Aminogruppe enthaltenden Verbindung wie einer Ammoniurnverbindung, Amin oder Aminosäure, vorzugsweise ein Ammoniumsalz oder Lysin, vernetzt. Es sind verschiedene Amine und Aminosäuren zur Verwendung geeignet.

Es ist ebenfalls offensichtlich, daß neben Glutaraldehyd viele andere Dialdehyde und mit Aminogruppen reagierende Substanzen, die als Vernetzungsmittel bekannt sind, in dem Verfahren eingesetzt werden können.

Die Aktivität eines nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten festen kristallinen Enzyms ist sehr hoch oder praktisch genauso hoch wie die eines freien Enzyms. Festes kristallines Enzym kann als solches als ein Kolonnenfüllstoff in einem kontinuierlichen Verfahren verwendet werden. Es ist extrem stabil und hält mechanischer Beanspruchung gut stand. Vernetzte Kristalle können, falls dies gewünscht wird, unter Bildung größerer Körper, z. B. in kugelförmiger, plattenähnlicher, streifenartiger oder ähnlicher Form, auf bekannten chemisch-physikalischen Wegen weiter gebunden werden. So gewonnene Enzympräparate können verschiedenen mechanischen Behandlungen standhalten.

Der Fachmann wird erkennen, daß das hier beschriebene Vernetzungsverfahren zur Herstellung von unlöslichen Präparaten von praktisch jedem kristallinen Enzym angewendet werden kann, welches im allgemeinen aufgrund seiner Aminosäurezusammensetzung bis jetzt noch nicht für die Vernetzung als dienlich gefunden worden war. Nachfolgend wird das erfindungsgemäße Verfahren ausführlicher beschrieben.

Herstellung von kristalliner Glucoseisomerase als Rohstoff

Ammoniumsulfat (ca. 10Ma.-%) wird in einer Glucoseisomeraselösung (1 bis 10Ma.-% Isomerase bestimmt als Trockenprotein) aufgelöst. Die Lösung wird langsam unter ständigem Rühren auf ca. 1 bis 2°C abgekühlt. Es kommt dabei zu einer im wesentlichen vollständigen Kristallisation der Isomerase (mehr als 95%). Anstelle von Ammoniumsulfat kann beispielsweise Magnesiumsulfat oder Natriumsulfat als Kristallisationsmittel verwendet werden. Die Konzentration der verwendeten Salze kann innerhalb eines großen Bereichs liegen, z. B. von 5 bis 25Ma.-%. Auch die für den Kristallisationsprozeß erforderliche Zeit schwankt in einem großen Bereich, z. B. von einer Stunde bis zu mehreren Tagen. Bei der Herstellung von großen Kristallen sollte vorzugsweise ein allmähliches Kühlen angewendet werden und die Isomerase sollte so rein wie möglich sein. Die Kristallisation ist in dem US-Patent 4.699.882 (Visuri) beschrieben, das hierin aufgenommen ist.

Nach der Kristallisation wird die Kristallmasse durch Sedimentation oder durch Zentrifugieren von der Mutterlauge getrennt. Erforderlichenfalls wird die Kristallmasse mit reinen Lösungen von Ammoniumsulfat, Magnesiumsulfat oder einer anderen zur Kristallisation geeigneten Substanz gewaschen. Die Vernetzung wird an einer Kristallmasse vorgenommen, die keinen freien Mutterlaugenüberschuß enthält und die zu einer kompakten form sedimenteirt oder zentrifugiert worden ist. Die typische Aktivität einer solchen Kristallmasse beträgt lOOOOGIU/g. Sie enthält 20 bis 30Ma.-% reines Enzymprotein, das als Trockensubstanz bestimmt wird. Es sollte erwähnt werden, daß Enzymkristalle ihre Struktur verlieren, wenn sie getrocknet werden.

Vernetzung

Die Kristallmasse wird in einer Salzlösung aufgeschwemmt, so daß die Kristalle sich nicht darin auflösen. Die Konzentration der Enzymkristalle in der Lösung kann sehr unterschiedlich sein, z. B. 2 bis 17Ma.-% Trockensubstanz.

Die Lösung wird mit Ammoniumsalz, falls die Salzlösung anfänglich kein Ammonium enthält, oder einem geeigneten Amin oder Aminsäure wie Lysin versetzt. Der pH-Wert des Gemisches wird durch Zugabe von beispielsweise Natriumhydroxidlösung auf einen Wert von 5 bis 9, vorzugsweise von 6 bis 8 eingestellt. Die Azidität wird durch einen Phosphatpuffer, z. B. 0,05 M Natriumphosphat, oder durch automatische pH-Wert-Einstellung mit einer alkalischen Lösung (wie Natriumhydroxid) kontrolliert. Die Nutzkonzentration des zugesetzten Amins oder Aminosäure schwankt innerhalb eines großen Bereichs und ist von der Konzentration der anderen Komponenten abhängig. Das erfindungsgemäße Produkt wird mit einer hohen Ausbeute mit einer Amin- oder Aminosäurekonzentration von 1 bis 15% der Endmasse des Gemischs hergestellt.

Anschließend wird das Gemisch zur Auslösung der Vernetzungsreaktion mit Glutaraldehyd versetzt. Die Menge Glutaraldehyd kann in einem großen Bereich liegen, und zwar von 1 bis 45Ma.-% bezogen auf die Feuchtenzymkristallmasse. Die bevorzugte Menge hängt beispielsweise von der Konzentration des in dem Gemisch enthaltenen Amins ab. Im allgemeinen liegt die bevorzugte Konzentration zwischen 3 und 4,5g Glutaraldehyd pro 3g Isomerase berechnet als Trockenenzym. Während der Reaktion wird die Lösung ständig umgerührt. Die Temperatur liegt zwischen 2 und 25°C. Eine niedrige Temperatur ist vorteilhaft, obwohl die Temperatur nicht kritisch zu sein scheint. Die Reaktion kann sehr schnell ablaufen, innerhalb von wenigen Minuten, insbesondere bei höheren Temperaturen. Bei einer niedrigen Temperatur kann die Reaktionszeit bis zu 20 Stunden betragen. Nach der Reaktion werden die unlöslichen Kristalle durch Sedimentation oder Zentrifugieren von dem Gemisch getrennt. Die Kristallmasse wird durch Aufschwemmen in Wasser oder einer geeigneten Salzlösung und durch erneutes Zentrifugieren gewaschen. Das Waschen wird mehrere Male wiederholt, bis die Kristallmasse genügend rein ist, um als ein Katalysator verwendet zu werden. Im Zusammenhang mit dem Waschen ist auch ein Ausspülen von feinkörnigem Niederschlag vorteilhaft. Es ist nicht ratsam, die gewonnene Kristallmasse zu trocknen, wenn sie als Katalysator in einem enzymatischen Verfahren eingesetzt werden soll. Feuchte Kristallmasse behält vollständig ihre Aktivität über mindestens sechs Monate ohne besondere Maßnahmen.

Charakterisierung des Endprodukts

Erfindungsgemäß hergestellte vernetzte Kristalle sind in Aussenen und Größe den ursprünglichen Rohsioffkristallen ähnlich.

Die Größe der Kristalle ist nicht kritisch. Kristalle mit oinem Durchmesser von 100 bis 200 Mikrometer oder größer, bis zu 1 Millimeter, sind für den technischen Gebrauch besonders geeignet.

Die wichtigste Eigenschaft der erfindungsgemäßen Kristalle besteht darin, daß sie in Wasser, Salzlösungen und Zuckerlösungen unlöslich sind. Es ist von besonderer Bedeutung, daß die Isomerasekristalle selbst bei hohen Temperaturen sich nicht in konzentrierten Lösungen von Glucose und Fructose auflösen. In industriellen Verfahren ist es üblich, eine Temperatur von 6O⁰C und eine Zuckerkonzentration von 45Ma.-% anzuwenden. Vernetzte Kristalle sind unter solchen Bedingungen und bei jeder anderen Zuckerkonzentration und höheren Temperaturen (bis zu 100⁰C) unlöslich. Die Aktivität der vernetzten Kristalle ist von der gleichen Größenordnung wie die des ursprünglichen Enzyms. Technisch ist es ein Vorteil und von Bedeutung, daß ihre Aktivität um ein Vielfaches höher ist als die eines auf einem inerten Träger immobilisierten Enzyms.

Beim Vernetzen eines Enzyms in kristalliner Form wird ein weiterer Vorteil dadurch gewonnen, daß das Enzym in einem merklichen Umfang durch Kräfte stabilisiert wird, die in dem Kristall wirken und dieses natürlich zusammenhalten.

Angewendete Methoden zur Charakterisierung des Ausgangsstoffes und des Endprodukts

Die Aktivität der Isomerase wurde als internationale Glucoseisomeraseeinheiten, abgekürzt GIU, pro Gramm eines getrockneten Enzympräparats bestimmt. Eine Einheit (GIU) stellt eine Enzymmenge dar, die Glucose mit einer Geschwindigkeit von

1 Mikromol/Miiiute unter den folgenden Bedingungen zu Fructose umwandeln kann: Glucosekonzentration 2,0 Mol/Liter, pH-Wert 7,0 und Temperatur 60⁰C.

Für die Aktivitätsbestimmung wurde 0,1 bis 1 g eines Enzympräparats (ursprüngliche Kristallmasse oder gründlich gewaschene vernetzte Kristallmasse) in eine wie oben beschriebene Substratlösung (100ml) gemischt. Nach einer geeigneten Zeitspanne, z. B. 10 Minuten, wurde der Fructosegehalt der Lösung bestimmt und die Aktivität wurde berechnet und in den obengenannten Einheiten ausgedrückt. Die Enzymmenge und die Reaktionszeit wurden so gewählt, daß die gebildete Fructose weniger als 5% des G.esamtzuckergehalts ausmachte, so daß das Meßergebnis die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit betreffen würde. Der Trockengehalt des Ausgangsstoffes und des Produkts wurde nach einer herkömmlichen Methode durch Trocknen der Probe bei 105⁰C auf eine konstante Masse bestimmt.

Isomorlsationsprozeß

Kristallines vernetztes Enzym ist zum Einsatz in einem diskontinuierlichen Isomerisationsprozeß auf herkömmliche Weise geeignet, wobei das verwendete Enzym nach der Reaktion beispielsweise durch Filtration abgetrennt wird und wiederverwendet werden kann, wenn dies gewünscht wird.

Im Industriemaßstab ist jedoch zu bevorzugen, die Isomerisation als einen kontinuierlichen Prozeß durchzuführen, wodurch die zu isomerisierende Zuckerlösung durch eine Enzymkolonne fließen kann. Durch Variieren der Verweilzeit und/oder der Temperatur ist der Isomerisationsprozeß leicht einzustellen. Das Enzym ist innerhalb eines großen Temperaturbereiches, d. h.

vom Gefrierpunkt bis zu Temperaturen über 100"C, aktiv. Bei niedrigen Temperaturen liegt ein Nachteil darin, daß die Reaktion langsam ist und die Zuckerhydrate (von Glucose und Fructose) kristallisiert werden, während bei hohen Temperaturen die Zerstörung sowohl des Enzyms als auch der Fructose wesentlich schneller stattfindet.

Die kontinuierliche Isomerisation wird im typischen Fall so durchgeführt, daß die Kolonne mit vernetzten Enzymkristallen von 100 bis 300 Mikrometer gefüllt wird. Die Größe und Höhe der Kolonne kann entsprechend der in jedem einzelnen Fall erforderlichen Kapazität verändert werden. In einer kleinen Kolonne liegt die geeignete Betthöhe bei 5 bis 50cm. Auch die Temperatur kann in einem großen Bereich variiert werden. Die Raumtemperatur ist leicht zu verwirklichen. Wenn mikrobiologische Verunreinigungen ein Problem darstellen, können sie durch Anheben der Temperatur auf mindestens ca. 6O⁰C beseitigt werden.

Der Prozeß ist leicht durch Variieren der linearen Strömungsgeschwindigkeit zu steuern. Bei einer kleinen Kolonne liegt die lineare Strömungsgeschwindigkeit im Bereich von 2 bis 30cm/min. Die für Frischenzym geeignete Verweilzeit beträgt 1 bis

2 Minuten. Der Druck ist atmosphärischer. Der Druckverlust ist signifikant (<0,2 bar pro Betthöhe von 50cm). Die Verweilzeit wird durch Variieren der Betthöhe der Kolonne und durch die Strömungsgeschwindigkeit eingestellt. Die Isomerisationsreaktion kann durch Erhöhen der Temperatur beschleunigt werden.

In einem herkömmlichen industriellen Verfahren besteht das Ziel in den meisten Fällen darin, eine Zuckerlösung zu bekommen, in der 40 bis 45% des Zuckers Fructose ist. Wenn die Aktivität des Enzyms mit dem Altern der Kolonne abnimmt, wird die gewünschte Höhe durch Reduzieren der Strömungsgeschwindigkeit aufrechterhalten.

Ausführungsbeispiel

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung näher:

Beispiel 1

Es wurden 850g einer in einer 10%igen Ammoniumsulfatlösung kristallisierten Glucoseisomerasekristallmasse, wie im US-Patent 4.699.882 beschrieben ist, abgewogen, und zu dieser Kristallmasse wurden 1000 ml einer Sulfatlösung mit einem pH-Wert von 7.4 (gepuffert mit 0,5 M Natriumphosphat) hinzugegeben. Das Gemisch wurde auf 10⁰C abgekühlt. Das entstehende Gemisch wurdo ständig mit einem Propellerrührer mit niedriger Geschwindigkeit (200 bis 400 U/min) zur Verringerung der Kristallbeschädigung umgerührt. Das Gemisch wurde mit 160m) 25%igen Glutaraldehyds vei se'.rt. Nach einer Stunde wurde die Reaktion durch Zugabe von 20 Liter reinen Wassers in das Gemisch abgebrochen. Das Umrühren wurde unverzüglich beendet, und die Kristallmasse ließ man sich zwei Stunden lang auf dem Boden des Behälters absetzen. Die Mutterlauge wurde abgegossen, so daß keine Kristalle mit weggespült wurden. Es wurden nochmals 20 Liter reinen Wassers in die Kristallmasse gemischt, und das Waschwasser wurde durch Dekantieren entfernt. Noch eine weitere Wäsche mit Wasser wurae durchgeführt. Die so gewonnene, dreimal mit Wasser gewaschene, feuchte Isomerasekristallmasse wurde als solche in Isomerisationsstests, Aktivitätsbestimmungen und anderen Versuchen verwendet.

Die so hergestellte vernetzte Glucoseisomerase war in einem kristallinen Zustand (mikroskopisch). Die Kristalle waren unlöslich in Wasser, verdünnten Lösungen von verschiedenen Salzen (innerhalb des pH-Bereiches von 2 bis 9), verdünnten Säuren (1 Mol/Liter), heißem Wasser und heißen Salzlösungen bis zu 100⁰C und konzentrierten Glucose-, Fructose- und Zuckerlösungen bis zu 100⁰C. Das Aussehen der Kristalle blieb unter allen obengenannten Bedingungen unverändert, während kristalline Isomerase, die nicht vernetzt worden war, aufgelöst oder als amorpher Niederschlag ausgefällt wurde. Die enzymatische Aktivität der vernetzten Isomerase betrug 52% der Aktivität der ursprünglichen Isomerase, die nicht vernetzt worden war. Das heißt, wenn die Aktivität der ursprünglichen Isomerase 40000 GIU/g betrug, lag die Aktivität der vernetzten Kristalle entsprechend bei über 20000 GIU/g, berechnet pro Trockenenzym protein.

Beispiel 2

Mit der Anordnung von Beispiel 1 wurde das folgende Reaktionsgemisch bei 25⁰C hergestellt:

14g Isomerase berechnet als Reinenzymprotein

10g Ammoniumsulfat

1,5g Glutaraldehyd (ca. 8ml einer 25%igen Lösung)

0,05M Natriumphosphatpufferlötung {pH-Wert der Lösung 7,4)

100 ml Wasser

Nach einer Reaktionszeit von einer Stunde wurde freie Lösung mit Hilfe einer Laborzentrifuge aus dem Gemisch entfernt, indem bei 1000 U/min fünf Minuten lang zentrifugiert wurde. Die gewonnene Kristallmasse wurde in 200ml reinen Wassers aufgeschwemmt und nochmals zentrifugiert, wie oben beschrieben ist. Das Waschen mit Wasser wurde noch einmal wiederholt, wie oben beschrieben ist. Feuchte gewaschene Kristallmasse wurde wiedergewonnen und zur weiteren Forschung eingesetzt.

Die Aktivität der so hergestellten Kristallmasse betrug 49% der der ursprünglichen Kristallmasse.

Beispiele 3 bis 8

Reaktionsgemische mit der gleichen Ausgangszusammensetzung wie in Beispiel 2 wurden mit der Anordnung von Beispiel 1 bei 10°C hergestellt. Nach unterschiedlich langen Reaktionszeiten wurde die Reaktion abgebrochen, und die Kristallmasse wurde gewascban, wonach die Aktivität einer jeden Kristallmasse bestimmt wurde. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1

Reaktionszeit	10min	Aktivität (% der Aktivität der ursprünglicl <>in
	30 min	Kristallmasse)
Beispiel3	60 min	45
BeispieU	90 min	46
Beispiels	2h	49
Beispiele	3h	48
Beispiel 7	40
Beispiele	40

Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß die Reaktion sehr schnell abgeschlossen ist und sich die Aktivität bei einer Erhöhung der Reaktionszeit in keinem größeren Grad mehr verändert.

Beispiele 9 bis 16

Mit der Anordnung von Beispiel 1 wurden Reaktionsgemische mit der folgenden Ausgangszusammensetzung bei 10°C hergestellt:

14g Glucoseisomeraseprotein (in kristalliner Form)

10g Ammoniumsulfat

90ml 0,5M Natriumphosphatlösung (pH 6,0,7,0,8,0 oder 8,4, wie in Tabello Il gezeigt ist) Glutaraldehyd 0,12,0,5,2,0 3,5 oder 4,12g (wie in Tabelle Il gezeigt ist)

Die Reaktionszeit war eine Stunde. Die Aktivität jeder entstandenen Kristallmasse (% der ursprünglichen Aktivität der Kristallmasse) ist in Tabelle Il angegeben.

Tabelle Il

	pH-Wert	Glutaraldehyd	Ak
		(g)	(%
Beispiel 9	6,0	0,5	22
Beispiel 10	6,0	3,5	24
Beispiel 11	7,0	0,12	60
Beispiel 12	7,0	2,0	65
Beispiel 13	7,0	4,12	59
Beispiel 14	8,0	0,5	41
Beispiel 15	8,0	3,5	44
Beispiel 16	8,4	2,0	39

Aus den Ergebnissen geht hervor, daß die Menge Glutaraldehyd in ziemlich großen Grenzen variiert werden kann und trotzdem hohe Aktivitäten erzielt werden. Die Azidität beeinflußt das Ergebnis stark. Der bevorzugte pH-Wert liegt bei ca. 7,0, obwohl nützliche Präparate innerhalb des gesamten getesteten pH-Bereiches, d. h. von 6,0 bis 8,4, gewonnen werden können.

Beispiele 17 bis 27

Es wurde eine Versuchsreihe ähnlich den vorangegangenen Beispielen durchgeführt. Die Temperatur betrug jedoch 2° C und die Reaktionszeit 18 Stunden. Die Zusammensetzung des Reaktionsgemische war wie folgt:

3g Isomerasokristalle berechnet als Trockenprotein

50ml Wasser als ein Medium

7,5g Salz (Natriumsulphat, Magnesiumsulphat und/oder Ammoniumsulfat, siehe Tabelle IfI) Natriumhydroxid zur Einstellung des pH-Wertes auf 7,0 (nicht mehr als 2meq, d. h. 80mg) 0,125 bis 2,5g Glutaraldehyd (siehe Tabelle III)

Tabelle III	(NH₄I₂SO₄	Salz(g)	Na₂SO₄	Glutaral	Ak
		MgSO₄	7,5	dehyd	(%
			7,5	0,5	0
Beispiel 17				2,5	0
Beispiel 18		7,5		0,125	0
Beispiel 19		7,5		0,5	0
Beispiel 20		7,5		0,75	0
Beispiel 21	0,45	7,5		1,25	0
Beispiel 22	0,90	7,05		0,75	20
Beispiel 23	1,8	6,6		0,75	19
Beispiel 24	3,75	5,7		0,75	28
Beispiel 25	7,5	3,75		0,75	40
Beispiel 26				0,75	60
Beispiel 27

Aus den Ergebnissen geht hervor, daß bei Durchführung der Vernetzung in Abwesenheit eines Ammoniumsalzes unlösliche Kristalle nicht gewonnen werden, nicht einmal bei einer hohen Glutaraldehydkonzentration. Schon eine geringe Menge Ammoniumsalz fördert die Bildung von unlöslichen Kristallen.

Beispiele 28-38

Es wurden unlösliche Isomerasekristalle unter Verwendung verschiedener Stickstoffverbindungen nach der folgenden allgemeinen Methode hergestellt:

3g kristalline Isomerase berechnet als Trockenprotein 7,5g Magnesiumsulfat

10 mmol Stickstoffverbindung (siehe Tabelle IV) 2,5g Glutaraldehyd (berechnet als 100%ig) Temperatur 2°C und

Reaktionszeit 18 Stunden

Tabelle IV	Stickstoff	Menge	Ak
	verbindung	(g)
	Lysin	1,83	HO
Beispiel 28	Arginin	1,74	Ί
Beispiel 29	Histidin	1,55	;!6
Beispiel 30	Glutamin	1,46	ti
Beispiel 31	Leucin	1,31	21
Beispiel 32	Isoleucin	1,31	18
Beispiel 33	Prolin	1,15	10
Beispiel 34	Methionin	1,49	i!7
Beispiel 35	Phenylalanin	1,65	17
Beispiel 36	Tryptophan	2,04	44
Beispiel 37	Betain	1,17	23
Beispiel 30

Aus den Ergebnissen geht hervor, daß eine Reihe von unterschiedlichen Aminen eine ähnliche Wirkung auf den Vernetzungsprozeß hat.

Beispiele 39 bis 51

Es wurden unlösliche Isomerasekristalle mit verschiedenen Dosisrungen sn Glutaraldehyd und Lysin nach dem folgenden allgemeinen Prinzip hergestellt:

3g kristalline Isomerase berechnet als Trockenprotein 7,5g Magnesiumsulfat

0,47 bis 2,34g Lysin (siehe Tabelle V) pH-Wert mit Natriumhydroxidlösung auf 8,0 eingestellt 0,5 bis 1,25g Glutaraldehyd (100%ig; siehe Tabelle V) Die Lösung konnte 18 Stunden lang bei 2°C reagieren.

Tabelle V	Glutaraldehyd	Lysin	Akt!
	(g)	(g)	(%)
	0,5	0,47	67
Beispiel 39	0,5	0,94	77
Beispiel 40	0,5	1,40	60
Beispiel 41	0,75	0,47	72
Beispiel 42	0,75	0,94	83
Beispiel 43	0,75	1,40	92
Beispiel 44	0,75	1,87	81
Beispiel 45	0,75	2,34	75
Beispiel 46	1,25	0,47	68
Beispiel 47	1.25	0,94	78
Beispiel 48	1,25	1,40	90
Beispiel49	1,25	1,87	102
Beispiel 50	1,25	2,34	100
Beispiel 51

Aus den rgebnissen geht hervor, daß das Verhältnis zwischen der Lysin- und der Glutaraldehyddosis die Bildung von unlösliclidn Kristallen beeinflußt, d.h. bei jeder Glutaraldehyddosishöhe ist eine optimale Lysindosishöhe zu sehen.

Beispiele 52 bis 57

Es wurden Isomerasekristalle in den Lösungen von Ammoniumsulfat und Lysin nach dem folgenden allgemeinen Prinzip hergestellt:

10g Isomerasekristalle in 10% Ammoniumsulfat (d. h. 3,72g reines Isomeraseprotein borechnet als Trockensubstanz, 0,63g Ammoniumsulfat und 5,65g Wasser)

5g Ammoniumsulfat

45g Wasser

1,25g Gkitaraldehyd berechnet als 100%ig

0 bis 3g Lysin (siehe Tabelle Vl)

Der pH-Wert aller Reaktionskomponenten wurde mit Hilfe von Natriumhydroxid vor dem Umrühren auf 8,0 eingestellt. Die Gemische wurden 18 Stunden lang bei 3°C umgerührt.

Tabelle IV	Lysin (g)	Aktivität (%)
	0	40
Beispiel 52	0,3	62
Beispiel 53	0,6	66
Beispiel 54	1,2	72
Beispiel 55	1,8	92
Beispiel 56	3,0	96
Beispiel 57

Aus den Ergebnissen geht hervor, daß Lysin die Vernetzungsausbeute sehr günstig beeinflußt. Ammoniumsulfat hat keine größere Wirkung auf das Ergebnis wenn Lysin vorhanden ist, selbst wenn Ammoniumsulfat allein ein zufriedenstellendes Ergebnis liefert.

Beispiele 58 bis 69

Die Menge an Isomerase und Lysin wurde konstant gehalten, und die anderen Komponenten wurden gemäß der Darstellung in Tabelle VII verändert:

3 g Glucoseisomerase berechnet in Trockenform

1 g Lysin

0,01 g Natriumhydroxid (Lösung pH-Wert 8)

Die Reaktionszeit betrug 18 Stunden und die Temperatur 2⁰C.

	Glutaraldehyd	MgSO₄	Wasser	Reaktions	-8- 297 843	Akti
Tabelle VII				lösung		vität
	(g)	(g)	(g)	insges.(g)	(%)
	0,5	2,1	11,9	18,5	39
	0,5	2,7	15,3	22,5	70
Beispiel 58	0,5	4,2	23,8	32,5	70
Beispiel 59	0,5	5,3	32,7	42,5	73
Beispiel 60	0,5	10,2	57,8	72,5	75
Beispiel 61	0,5	16,2	91,8	112,5	77
Beispiel 62	1,25	2,1	11,9	19,25	86
Beispiel 63	1,25	2,7	15,3	23,25	99
Beispiel 64	1,25	4,2	23,8	33,25	101
Beispiel 65	1,25	5,3	32,7	43,25	89
Beispiel 66	1,25	10,2	57,8	73,25	83
Beispiel 67	1,25	16,2	91,8	113,25	89
Beispiel 68
Beispiel 69

Aus den Ergebnissen geht hervor, daß die Konzentration des Reaktionsgemische wenig Einfluß auf das Endergebnis hat. Die Masseverhältnisse zwischen den Reaktionskomponenten (Enzym, Lysin [oder Amin] und Gutaraldehyd) haben eine viel größere Wirkung.

Beispiel 70

1 g verne'.zter Gtucoseisomerasemasse (aus Beispiel 56; 0,4g Trockensubstanz), die mit Wasser gewaschen worden war, wurde in 100g 'iiner 40%igen Glucoselösung gemischt, deren pH-Wert auf 7,0 eingestellt worden war. Das Gemisch wurde ständig bei 60°C verrührt. Es wurden periodisch dem Gemisch Proben entnommen, und der Fructosegehalt der Proben wurde mit einem Polarimeter, der Glucosegehalt enzymatisch mit einer He.(c" !!'äie gemessen. Der Fructosegehalt der Lösung stieg auf 42% des Gesamtzuckergehalts der Lösung (Glucose + Fructose = 100%) innerhalb von 3 Stunden. Nach dem Versuch wurde die vernetzte Isomerase durch Filtern von dem Gemisch getrennt und mit Wasser gewaschen. Die gewonnene Kristallmasse wurde auf ihre Aktivität und Trockengehalt geprüft, und es wurde festgestellt, daß kein aktives enzym aufgelöst worden war oder in dem Test verschwunden war. Der Test konnte mehrere Male mit der gleichen Enzymchargt> wiederholt werden.

Beispiel 71

Kristallmasse, die wie in Beispiel 1 hergestellt worden war, wurde zur Entfernung von feinkörnigem Niederschlag und während des Prozesses feinzerkleinertem Kristallmaterial gewaschen, indem sie in Wasser aufgeschwemmt und dekantiert (3x) wurde. Die so gewonnene große Kristallfraktion mit einer mittleren Größe von 100 Mikrometer wurde in einen zylindrischen Reaktor mit einem Durchmesser von 2,6cm und einer Höhe von 5cm gefüllt. Glucoselösung mit der nachfolgenden Zusammensetzung wurde bei 6O⁰C durch die Kolonne gepumpt:

582g Glucosemonohydrat

590 g Wasser

0,37 g MgSO₄ -7H₂O

0,19g NaHSO₃

pH 6,9 (1M NaOH, Verbrauch unter 1 ml)

Zu Beginn des Tests betrug der Durchsatz 11 ml/min, wodurch der Fructosegehalt der aus der Kolonne ausgestoßenen Lösung auf 42% des Gesamtzuckergehalts angestiegen war. Der Test wurde 200 Stunden lang fortgesetzt, wonach der Durchsatz zur Aufrechterhaltung der ursprünglichen Umwandlung auf 9ml/min reduziert werden mußte (Fructosagehalt 42%). Die Aktivität des Enzyms ist in dieser Zeit entsprechend auf 81 % des ursprünglichen Wertes gefallen. Während des Tests konnte koine Reduzierung oder Auflösung der Kristallmasse beobachtet werden.

Beispiele 72 bis 76

Es wurden 43,42g feuchte aktive Isomerasemasse, die mit Wasser gewaschen worden war (hergestellt nach der Methode von Beispiel 67; 10,0g Enzym auf Trockensubstanzbasis), abgewogen.

200ml einer wie in Beispiel 71 hergestellten Glucoselösung wurden auf die Kristallmasse gegossen. Das Gemisch wurde bei 6O⁰C unterschiedlich lang geschüttelt und dann durch eine Filterpapierscheibe gefiltert. Die auf dem Papier zurückbleibende Kristallmasse wurde zur Entfernung allen löslichen Materials sorgfältig mit Wasser gewaschen. Die Kristallmasse wurde bei 105°C in einem Brutschrank getrocknet und abgewogen. Die Beobachtungen sind in der folgenden Tabelle VIII wiedergegeben:

Tabelle VIII	Rührzeit	Trockenmasse der Kristallmasse
		nach dem Test (g)
	10min	9,9
Beispiel 72	2h	11,0
Beispiel 73	4h	10,9
Beispiel 74	6h	10,7
Beispiel 75	21h	10,4
Beispiel 76

Aus den Ergebnissen geht hervor, daß die erfindungsgemäß hergestellte vernetzte kristalline Isomerase sich unter herkömmlichen industriellen Betriebsbedingungen nicht in dem Substrat auflöst.

Beispiel 77

Vernetzte kristalline Isomerase, an DEAE gebundene Isomerase und ursprüngliche freilösliche Isomerase wurden miteinander verglichen, indem sie unter identischen chemischen und physikalischen Bedingungen gehalten wurden. Die Bedingungen wurden so ausgewählt, daß jede Enzymprobe ihre Aktivität innerhalb einer vertretbar kurzen Zeit, d. h. innerhalb von 1O-30 Stunden, bis zu einem meßbaren Grad verloren hat. Eine Menge von 5g von jedem Enzympräparat wurde in 150ml einer 0,05M Natriumphosphatpufferlösung (pH-Wert 6,0) gemischt, die zudem noch 1,5 mmol/l MgSO₄ und 2 mmol/l NaHSO₃ enthiejt. Das Gemisch wurde mehrere Stunden bei 70°C geschüttelt. Dem Gemisch wurden periodisch Proben entnommen, und es wurde die Aktivität der restlichen Isomerase von den Proben bestimmt. Die Halbwertzeit einer jeden Enzymprobe (d. h. die Zeit, in der die Aktivität auf die Hälfte des ursprünglichen Wertes abfällt) wurde auf der Grundlage des Aktivitätsabfalls bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IX dargestellt.

Tabelle IX

Enzymprobe Halbwertzeit (h) ursprüngliche lösliche Isomerase 2,2

an DEAE-Zelluiose gebundene Isomerase 3,3

vernetzte kristalline Isomerase 19,0

Aus den Ergebnissen geht hervor, daß vernetzte Kristalle ihre enzymatisch^ Aktivität wesentlich besser behalten als ein freies Enzym oder ein auf herkömmliche Weise immobilisiertes Enzym.

Beispiel 78

Vernetzte kristalline Isomerase und an DEAE-Zellulose gebundene Isomerase wurden in einen ähnlich dem in Beispiel 71 beschriebenen zylindrischen Säulenreaktor gefüllt. Glucoselösung wurde kontinuierlich durch die Säulen gepumpt. Die Glucoselösung hatte die gleiche Zusammensetzung wie in Beispiel 71, nur daß der pH-Wert auf 6,0 eingestellt war. Die Temperatur der Säulen betrug 6O⁰C während des Tests. Die Aktivität des in den Säulen enthaltenen Enzyms wurde auf der Grundlage des Durchsatzes und des Fructosegehalts der Lösung berechnet, die durchgeströmt war. Die Ergebnisse sind in Tabelle X dargestellt.

Tabelle X

Reaktorfüllung Aktivitätshalb-

wertzeit(h)

vernetzte Isomerasekristallmasse 120

an DEAE-Zellulose gebundene Isomerase 36

Aus den Ergebnissen geht hervor, daß vernetzte Kristalle ausgezeichnet ihre enzymatische Aktivität behalten.

Beispiele 79 bis 81

Vergleich der vernetzten Kristalle und immobilisierten Isomerasen, die dem Stand der Technik entsprechen, in Säulenverfahren Proben von typischen industriell angewendeten Isomerasen und den vernetzten erfindungsgemäßen Kristallen wurden in senkrechte Laborsäulen gefüllt. Das Vernetzen der Kristalle wurde so durchgeführt, wie in Beispiel 51 beschrieben ist. Der Innendurchmesser der zylindrischen Säulen betrug 2,7cm, die Höhe 50cm. Die Säulen hatten einen auf 6O⁰C thermostatisierten Wassermantel. Das untere Ende der Säulen war mit einem Sieb versehen, um die Enzymkörner in der Säule zu halten und die Zuckerlösung durchströmen zu lassen. 20g Trockensubstanz eines jeden Enzyms wurden in die einzelnen Säulen gegossen. Glucosesubstrat mit der Zusammensetzung von Beispiel 71 wurde mit einer verstellbaren Laberpumpe durch die Säulen gepumpt. Jede Säule hatte eine einzelne Pumpe. Die Temperatur des Substrats wurde auf 6O⁰C eingestellt. Das durch die Säule kommende Produkt wurde auf Fructose und Glucose analysiert. Es wurde beobachtet, daß jedes verschiedene Enzympräparat einen unterschiedlichen Fru,ctosegehalt ergab, wenn der Substratdurchsatz ähnlich war. Der Durchsatz einer jeden Säule wurde individuell im Probierverfahren eingestellt, bis der Fructosegehalt eines jeden Produkts 45% des Gesamtzuckers (Glucose plus Fructose) betrug. Die folgende Tabelle listet die Enzyme und entsprechenden Durchsatzwerte zur Herstellung von 45% Fructose auf.

Tabelle Xl

Beispiel Enzym 20 g Trockensubstanz Substratdurchsatz

(ml/h)

Vergl. SPEZYMEIGI, Handelsprodukt 179

Vergl. SWEETZYME T, Handelsprodukt 197

Vergl. TAKASWEET, Handelsprodukt 94

79 vernetzte Isomerasekristalle mit

100-200 Mikrometer Durchmesser 1364

80 vernetzte Isomerasekristalle mit 500-600 Mikrometer Durchmesser 1121

81 vernetzte Isomerasekristalle mit 900-1100 Mikrometer Durchmesser 1098

Die Durchsätze der die handelsüblichen Enzyme enthaltenden Säulen stellen sehr typisch das dar, was in der gegenwärtigen industriellen Praxis beobachtet wird. Die Durchsätze der vernetzte Isomerasekristalle enthaltenden Säulen waren wesentlich höher. In der industriellen Praxis führt die hohe Aktivität von vernetzten Kristallen zu wesentlich kleineren Enzymsäulen, was zu Einsparungen bei den Investitions- und Verarbeitungskosten führen wird.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen, vernetzten kristallinen Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß

a) ein Diaidehyd zu einer kristallinen Isomerasesuspension hinzugegeben wird, wobei vor der Zugabe von Diaidehyd oder während der Vernetzungsreaktion eines mindestens eine Aminogruppe enthaltende Verbindung wie Ammoniumsalz, Amin oder Aminosäure

. hinzugegeben wird, und

b) die vernetzten Kristalle zur Entfernung von Reagenzrückständen mit Wasser oder einer anderen Flüssigkeit gewaschen werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Glucoseisomerase ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Diaidehyd Glutaraldehyd ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge Glutaraldehyd 0,4 bis 8 Ma.-% beträgt.

5. Verfahren zur Isomerisierung eines Substrats, dadurch gekennzeichnet, daß eine vernetzte kristalline Isomerase zur Katalysierung der Umwandlung des Substrats in sein Isomer verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat Glucose, Fructose oder Xylose ist und die Isomerase Glucoseisomerase ist.

7. Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung von Fructose, dadurch gekennzeichnet, daß man eine glucosehaltige Lösung durch einen Reaktor fließen läßt, der eine wasserunlösliche vernetzte kristalline Glucoseisomerase enthält.

8. Reaktor, derfür die kontinuierliche Herstellung von Fructose geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, daß er wasserunlösliche, im wesentlichen reine, vernetzte kristalline Giucoseisomerase enthält.