CH629535A5 - Stabilisierte urease. - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft eine gegen Aktivitätsverlust stabilisierte Urease und ein Reagenz zum Nachweis von Harnstoff. Das Enzym Urease spaltet Harnstoff unter Bildung von Kohlensäure und Ammoniak. Es ist in relativ niedrig gereinigter Form im Handel erhältlich. In rohem Zustand ist die Urease ausreichend lagerstabil, in gereinigtem Zustand nimmt die Stabilität stark ab und bereits bei einer spezifischen Aktivität von ca. 25 bis 100 U/mg wird die Stabilität unbefriedigend. Obwohl ein Bedarf an einem höher gereinigten Enzym besteht, insbesondere für die klinische Harnstoffbestimmung, konnte dies bisher infolge der ungenügenden Stabilität nicht als stabiles Handelspräparat herausgebracht werden. Handelsübliche Urease mit einer spezifischen Aktivität von ca. 100 U/mg verliert bei halbjähriger Lagerung im Kühlraum bereits ca. 50% ihrer Aktivität. Lagerung bei Zimmertemperatur oder in gelöster Form führt zu einem noch sehr viel rascheren Alctivitätsverlust.
Es wurde bereits versucht, die Stabilität des gereinigten Enzyms durch Variation des Puffer-pH-Wertes, der lonen-stärke und der Art des Puffers (Maleat, Citrat, EDTA, Phosphat) oder durch Zusatz von sulfhydrylgruppenhaltigen Verbindungen wie Cystein und Mercaptoäthanol zu erhöhen. Alle diese Versuche waren erfolglos. Lediglich mit 2-fach kristallisiertem Rinderplasmaalbumin konnte eine gewisse Verlängerung der Halbwertszeit des gereinigten Enzyms erzielt werden, die jedoch unzureichend war (vgl. K.R. Lynn, Biochim. Biophys. Acta, 146 (1967) 216).
Aufgabe der Erfindung ist es, diese Schwierigkeit zu beseitigen und eine stabilisierte Urease zu schaffen, die auch in hochgereinigter Form ausreichend lagerstabil, ist um handelsfähig zu sein.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäss durch eine stabiliserte Urease, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie als Stabilisierungsmittel ein Gemisch von Glutathion, Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Citrat enthält.
Überraschenderweise ist das Gemisch der genannten drei Substanzen in der Lage, auch hochgereinigte Urease sehr gut zu stabilisieren, obwohl es bekannt ist, dass die Einzelbestandteile dieses Gemisches keine Stabilisierungswirkung entfalten.
Vorzugsweise enthält erfindungsgemäss stabilisierte Urease die Bestandteile Urease, Glutathion, EDTA und Citrat im Gewichtsverhältnis 1:0,5-5:0,5-3:0,5-3. Präparate in diesem bevorzugten Zusammensetzungsbereich weisen insbesondere im bevorzugten Aktivitätsbereich von ca. 50 bis 300 U/mg hervorragende Stabilität auf und besitzen beispielsweise nach Lyophilisation und 12-wöchiger Lagerung bei 33°C noch 100% der Ausgangsaktivität vor Lyophilisie-rung. Ohne Stabilisierungsmittel tritt bereits bei der Lyophili-sierung ein Aktivitätsverlust zwischen 30 und 80% auf.
Auch mit erfindungsgemäss stabilisierten Ureasepräpa-raten ausserhalb des bevorzugten Bereichs lassen sich noch sehr gute Stabilisierungseffekte erzielen.
Vorzugsweise enthält das erfindungsgemäss stabilisierte Enzympräparat eine Urease, die zur Reinigung vor Zusatz der Stabilisatormischung mit einem Dextran behandelt wurde. Bei dieser Dextranbehandlung gelingt es, die Aktivität des Enzyms etwa zu verdoppeln. Gleichzeitig scheint eine instabilisierende Verunreinigung durch Dextranbehandlung entfernt zu werden, so dass Ureasepräparate, die der Dextranbehandlung zuvor unterworfen wurden, sich durch besonders hohe Stabilität nach Zusatz des Stabilisatorengemisches auszeichnen. Die Behandlung mit dem Dextran kann durch einfaches Einführen des Dextrans in eine Enzymlösung oder aber nach den Methoden der Säulenchromatographie erfolgen. Besonders günstig wird als Dextran ein ver-netztes Produkt mit Molekularsiebeigenschaften verwendet, da hier gleichzeitig eine Entsalzung der Urease neben der Anreicherung und Entfernung einer störenden Verunreinigung erreicht wird. Geeignete vernetzte oder unvernetzte Dextranpräparate sind handelsüblich.
Erfindungsgemäss stabilisierte Urease eignet sich besonders zur Verwendung beim Nachweis von Harnstoff. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Reagenz zum Nachweis von Harnstoff, welches durch einen Gehalt einer erfindungsgemäss stabilisierten Urease zusammen mit einem System zum Nachweis von Ammoniak gekennzeichnet ist.
Es sind zahlreiche Systeme zum Nachweis von Ammoniak bekannt und diese können für das erfindungsgemässe Reagenz verwendet werden, soweit sie keine Bestandteile enthalten, welche die durch die Urease katalysierte Reaktion
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oder die Urease selbst stören. Ein derartiges System zum Nachweis von Ammoniak kann aus einer pH-Indikatorsub-stanz, wie z.B. Bromthymolblau, bestehen, die den bei der Ammoniakbildung ansteigenden pH-Wert durch Farbän— rung oder dergl. anzeigt. Ein derartiges System eignet sie;, beispielsweise für Testpapiere bzw. Testfilme zum Nachweis von Harnstoff im Blut oder Serum. Erfindungsgemäss stabilisierte Urease ist so beständig, dass sie sich zur Imprägnierung von Papier, Film oder ähnlichem Trägermaterial oder zur Herstellung von reaktionsfähigen Schichten zusammen mit einem Bindemittel auf derartigen Trägern eignet. Wenn ein derartiger Träger oder eine derartige Schicht zusätzlich den pH-Indikator enthält, so lässt sich durch einfachen Farbumschlag Harnstoff bestimmen.
Ein anderes bevorzugtes System zur Ammoniakbestimmung im Rahmen des erfindungsgemässen Reagenz besteht aus Glutamatdehydrogenase (G1DH), NADH und Puffer sowie gegebenenfalls Stabilisierungsmitteln für G1DH oder/und NADH. Beispiele für derartige Stabilisierungsmittel sind organische Sulfhydrylverbindungen bzw. ADP.
Ein anderes geeignetes Nachweissystem bedient sich der Indophenolreaktion nach Berthelot. Das System besteht aus Phenol oder Salicylsäure zusammen mit Nitroprussid-Natrium und Natriumhypochlorit.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter: Beispiel 1
Eine handelsübliche Urease mit einer spezifischen Aktivität von ca. 100 U/mg wurde in Wasser gelöst, über ver-netztes Dextrangel gegeben und anschliessend lyophilisiert. Das lyophilisierte Präparat wurde dann einem Stabilitätsversuch durch Lagerung bei 33°C unterworfen.
In einem zweiten Ansatz wurde der oben beschriebene Versuch wiederholt, dem mit dem vernetzten Dextran behandelten Enzym wurden jedoch Gluthation, Citrat und EDTA im Gewichtsverhältnis 1:1:1:1 zugesetzt. Dann wurde die Lyo-philisierung und Lagerung wie im ersten Versuch wiederholt.
Beim ersten Versuch ohne Stabilisierungsmittelzusatz betrug die Aktivitätsausbeute nach der Lyophilisation 20%. Nach 6wöchiger Lagerung bei 33°C betrug die gemessene Restaktivität weniger als 1%.
Im zweiten Versuch mit erfindungsgemässem Stabilisierungsmittel betrug die Aktivität nach der Lyophilisation 100%, nach 6wöchiger Lagerung bei 33°C immer noch 100%. Bei Fortsetzung der Lagerung unter den angegebenen Bedingungen auf 3 Monate wurden erneut 100% der Ausgangsaktivität vor der Lyophilisation gemessen.
Beispiel 2
Handelsübliche Urease mit einer spezifischen Aktivität von ca. 100 U/mg wurde in Wasser gelöst, mit Gluthation, Citrat und EDTA im Gewichtsverhältnis 1:1:1:1 versetzt und ohne Dextranbehandlung lyophilisiert. Im Lyophilisat wurden Ì 00% der Ausgangsaktivität gefunden.
Das Lyophilisat wurde dann einer Lagerung bei 33°C unterzogen. Nach 6wöchiger Lagerung betrug die Aktivität noch 95% des Ausgangswertes.
Beispiel 3
Aus handelsüblicher käuflicher Urease wurde durch mehrfache Kristallisation und Behandlung mit Dextran eine Urease mit einer spezifischen Aktivität von ca. 1500 U/mg gewonnen. Das erhaltene Präparat wurde mit GSH, Citrat und EDTA im Gewichtsverhältnis 1:3:3:3 versetzt. Die Beständigkeit bei der Lagerung bei 33°C entsprach der der Urease von 100 U/mg.
Beispiel 4
Testfilm zum Nachweis von Harnstoff im Blut bzw. Serum Bestandteil:
Polyvinylacetatpropionatdispersion (Propiofan 70 D) 45,0 g 1,93 %ige Lösung von Natriumalginat in Wasser 10.0 g Dioctylnatriumsulfosuccinat 0,5 g
Stabilisierte Urease + gelöst in 10 ml Wasser 10 000 U
Bromthymolblau, gelöst in 5 ml Methanol + 5 ml Wasser
Dinatriumhydrogenphosphat 0,9 g
+ stabilisiert mit GSH, Citrat u. EDTA 1:1:1:1
Die Bestandteile werden gut gemischt und mit 1 n HCl auf pH 6,0 eingestellt. Die Masse wird in einer Schichtdicke von 250 jj. auf PVC-Folie ausgestrichen und 60 min bei 60°C getrocknet. Auftropfen von harnstoffhaltigem Blut bzw. Serum und Abwischen desselben nach 90 sec. liefert folgende Reaktionsfarben:
20 mg% Harnstoff - gelb 60 mg% Harnstoff - gelbgrün 100 mg% Harnstoff - grün 200 mg% Harnstoff - dunkelgrün
Nach 3tägiger Belastung bei 60° reagiert dieser Testfilm praktisch unverändert.
Ein Testfilm gleicher Zusammensetzung und Herstellung, der aber anstelle der erfindungsgemäss stabilisierten Urease eine unstabilisierte Urease gleicher Aktivität enthält, zeigt anfänglich praktisch die gleichen Reaktionsfarben, reagiert jedoch nach 3tägiger Belastung bei 60°C nicht mehr ausreichend.
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- 629535PATENTANSPRÜCHE1. Stabilisierte Urease, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Stabilisierungsmittel ein Gemisch von Glutathion, Äthy-lendiamintetraessigsäure und Citrat enthält.
- 2. Urease nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie ürease, Glutathion, Äthylendiamintetraessigsäure und CiûTxî im Gewichtsverhältnis 1:0,5 bis 5:0,5 bis 3:0,5 bis 3 enthält.
- 3. Urease nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet. dass sie Dextran enthält.nach einem der Ansprüche 1 bis 3 als lyophilisiertes Präparat oder Lösung in Glycerin/Wasser-Gemisch.
- 5. Reagenz zum Nachweis von Harnstoff, dadurch gekennzeichnet, dass es stabilisierte Urease nach Anspruch 1 und ein System zum Nachweis von Ammoniak enthält.
- 6. Reagenz nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es stabilisierte Uerase nach den Ansprüchen 2 bis 3 enthält.
- 7. Reagenz nach den Ansprüchen 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass es Bindemittel, Träger, Puffersub-stanzen oder/und Stabilisator für das Ammoniaknachweis-■system enthält.
- 8. Reagenz nach den Ansprüchen 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es aus einem Trägerpapier oder Trägerfilm besteht, welcher mit der stabilisierten Urease und dem System zum Nachweis von Ammoniak imprägniert oder in Form einer Bindemittel enthaltenden Schicht überzogen ist.
- 9. Reagenz nach den Ansprüchen 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das System zur Bestimmung von Harnstoff aus einem oder mehreren pH-Indikatoren besteht und gegebenenfalls Netzmittel und Puffer enthält.
- 10. Reagenz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das System zur Bestimmung von Harnstoff aus einem oder mehreren pH-Indikatoren besteht und gegebenenfalls Netzmittel und Puffer enthält.
- 11. Reagenz nach den Ansprüchen 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das System zur Bestimmung von Ammoniak aus Glutaminsäuredehydrogenase, Alphaketo-glutarat, NADH, ADPund Puffer besteht.
- 12. Reagenz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das System zur Bestimmung von Ammoniak aus Glutaminsäuredehydrogenase, Alphaketoglutarat, NADH, ADP und Puffer besteht.
- 13. Reagenz nach den Ansprüchen 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das System zur Bestimmung von Ammoniak aus Phenol oder Salicylsäure, Nitroprussidna-trium und Natriumhypochlorit besteht.
- 14. Reaganz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das System zur Bestimmung von Ammoniak aus Phenol oder Salicylsäure, Nitroprussidnatrium und Natriumhypochlorit besteht.
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