JPH07500190A

JPH07500190A - 免疫試験中の誤反応を防止する技術

Info

Publication number: JPH07500190A
Application number: JP5516856A
Authority: JP
Inventors: シンガー、ジャック
Original assignee: マントティフィオーレ、メディカル、センター
Priority date: 1992-03-26
Filing date: 1993-03-26
Publication date: 1995-01-05
Also published as: CA2110159A1; WO1993019369A1; AU3969393A; EP0586693A4; EP0586693A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】免疫試験中の誤反応を防止する技術発　明　の　背　景細菌やヴイールス等の病原によって生じるある種の疾病の診断は、体の免疫系の変化を検知することに一部もとずいて行われる。このような変化は、細菌、ヴイールス、寄生虫のタン白−糖タン白−多糖成分に反応して体が作る抗体を検知することによって示される。

誤った陽性の結果はすべての血清においてＣ１１合体の成分であるＣ１ｑが存在することによって生じることがある。また誤った陽性結果は多くの血清においてリウマトイド因子（ＲＦ）が存在することによっても生じる。

誤った陰性の結果は非解離Ｃ１１合体の存在によって生しることがある。

Ｃ１補体はＣ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓとして知られる３成分で構成されており、これら３成分はカルシウムに依存する複合体として複合している。グリシン緩衝液（ｐＨ８，２）で希釈した時および／またはＥＤＴＡ−Ｎａて処理した時Ｃ１は該３成分（Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１５）に解離する。従来技術において、Ｃ１ｑ成分は熱不安定な物質で５６℃、３０分の加熱によって失活すると考えられていた。本発明者は、血清試料を５６℃、３０分加熱することによって、Ｃ１とＣ１ｑは減衰はするが失活はしないことを発見した。

ヒト血清中のＣ１ｑは抗原抗体複合体やＩｇＧ、ＩｇＭ等の免疫グロブリンに結合することができる。Ｃ１ｑの通常の濃度は７０ｍｃｇ、／ｍｌである。またそれは集合したγグロブリンに結合し、γグロブリンを溶液および寒天系において沈殿させる。Ｃ１ｑは細菌、細菌のリポ多糖、デキストラン、ヘパリン、ポリイノシン酸、カラギーナン、ＤＮＡ、Ｃ反応タン白、フィブロネクチン、ミトコンドリア、血小板、リンパ球、単球、ヌル細胞、尿酸モノナトリウム結晶、細胞骨格フィラメント、ハイブリッドモノクローナルマウス抗体に結合する。

血清を５６℃で３０分加熱することはＣ１ｑを失活させる方法としては有効でないことが示された。本発明は、有機イオンまたは無機イオンの存在下で温度を５９〜６４℃に上昇し３〜３０分間加熱した時にのみＣ１とＣ１ｑは失活することを発見した。温度が高いほど必要な加熱時間は少くてすむ。

また５６℃、３０分の加熱は補体を可逆的に減衰させるが、血清試料を５９〜６４℃で約３〜３０分加熱することは免疫検定法における補体の干渉を防止することが判った。

Ｃ１ｑの干渉から生じる実際上の問題点は、抗体の存在が妨げられまたは抗原もしくは抗体反応の定量化における増減が検定の感度または正確さに変化を生じる時に誤った陰性の結果を生じることである。

従前Ｃ１ｑ−ＩｇＧ反応またはＣ１−１ｇＭ反応の阻害剤として知られていた無機塩等の化合物が、ラテックス測光法を使用することによりＣ１ｑを露出させることによるＣ１のアクチベータであることが判ったことは驚くべきことであり意外なことであった。

リウマトイド因子は、ラテックス、羊細胞、ベントナイト、木炭粉等の特定の担体を使用するすべての免疫検定法において干渉するものと認識されている。ＲＦは誤って免疫複合体の形成を増進させる。補体は大きな不溶格子体の形成を妨げることによって抗原抗体複合体を可溶としたり、免疫複合体の形を増進することがあることが知られている。Ｃ１ｑはヒトおよび動物のすべての血清中に存在している。これらの双方が相互に競合し、これらの双方がすべての免疫検定法において誤った陽性反応を生じる。

よって、本発明の主たる目的は、補体系Ｃ１およびＣ１ｑの−またはそれ以上の成分によって生じる誤った陽性または陰性の結果を除去する改善された方法を提供することにある。

本発明の主たる目的は、また、免疫検定法においてテストされる体液中のＣ１ｑおよびＲＦの双方を除去するための新規な技術を提供することにある。

本発明のこれらの目的および他の目的は添付クレームを読むことによって明白となるであろう。

発　明　の　概　要本発明は、体液中のＣ１ｑの干渉効果を防止する方法を提供する。

もっとも広い意味において、本発明は、免疫検定法において体液から０１とＣ１ｑの干渉効果を防止する方法を含む。該方法は次の工程を含んでいる。

（ａ）体液の希釈試料に対し有効量の化合物を添加する工程であって、該化合物は、該体液と該化合物の混合物が５９〜６４℃の温度まで充分な時間加熱された時、該体液中の抗原または抗体の反応性に影響することなく免疫検定法において該体液中の０１またはＣ１ｑの干渉を防止することができるものである工程（ｂ）該化合物と該体液を含む該希釈試料を約５９℃ないし約６４℃の温度まで免疫検定法において０１またはＣＩＱの干渉を除去するために充分な時間加熱する工程。

体液中の特定の試料中のＣ１ｑおよびＲＦを失活させたい時は、以下の工程は好ましい方法を含む。

（ａ）体液の希釈試料に対し有効量の化合物および有効量の式Ｒ−３Ｈの化合物を添加する工程であって、該化合物は、該体液と該化合物の混合物が５９〜６４ ℃の温度までＣ１またはＣ１ｑを失活させるために充分な時間加熱された時、該体液中の抗原の反応性に影響することなくＣＩまたはＣ１ｑを失活させるものであり、該化合物においてＲは、式Ｒ−５Ｈの化合物がＲＦを失活させるために充分な時間温度５９〜６２℃まで加熱された時該混合物に対する体液中の抗原の反応性に影響を与えない有機分である工程（ｂ）工程（ａ）の産生物を５９〜６２℃の温度までＣ１ｑおよびＲＦが失活するために充分な時間加熱する工程。

本発明の実施のために有益な方法においては、免疫検定法においてテストすべき試料０．２５ｍ　ｌは、ｐＨ７，８〜Ｂ、２、イオン強度０．０２５〜（１，（１１２５のグリシン緩衝液で希釈される。次に中性塩溶液（２Ｍ　ＮａＣ１または２ＭＫＣｌまたはＱ、１Ｍ　ＥＤＴＡ−Ｎａ）２０ｕ　ｌを希釈体液に添加し６３℃で１３分間保温する。試料をＲＦのために検定する場合は、好ましい温度は６０℃で３０分間である。

本発明はまた、体液の試料すなわち血清、滑液、肋膜液または腹水がＣ１ｑまたはＲＦを含んでいるかどうかを決定するスクリーニング法を含む。この方法はＣ１ｑおよびＲＦのラテックス粒子に対する反応性および本明細書で規定するＣ１ｑを失活させるために適当な化合物の存在下で熱を使用することにもとずく一連の工程を使用する。またオフタロニー法によってＣ１ｑの存在を証明するスクリーニング法も考案された。

本発明は、さらに、ラテックステストをＲＦに対し特異的にしてＣ１ｑによる干渉を防止するために用いられる適当な化合物と熱の使用によるヒト血清および体液中のＲＦの検出および準定量法を含む。

またラテックス粒子を用いて精製Ｃ１ｑの量を決定する技術が考案された。

本発明は、また、Ｃ１ｑまたはＲＦからの干渉なしにラテックス凝集テストを自動的に行うための新規な装置図面の簡単な説明図１は測光器のＸ−Ｙ記録器からのプロットを示すグラフで、陰性の比濁法テストのベースライン（陰性曲線）と陽性の比濁法テストの陽性曲線（スロープ〉０）の双方を示す。「最大値に対する接線」と記された破線は、「最大スロープの測定」と記された右側の重畳する３角形によって示される最大スロープを測定するため接線計によって引かれた線である。

図２は体液がＲＦ陽性であるかＣ１ｑを含んでいるかを決定するための本発明のスクリーニング法の一連の工程を示すフローチャートである。

図３は本発明による装置の概略図である。

図４は実施例１２Ｂの結果を示すグラフである。

発明の詳細な説明「体液」という用語は脳を髄液、滑液、腹水、肋膜液、血液または類似物、尿および血清を含む。体液をテストする時、免疫検定法において０１とＣ１ｑの干渉効果は本明細書において述べる方法によって防止することができる。好ましい検出方法は測光法によるラテックス凝集技術である。

ラテッスス凝集に使用される測光器は血液凝集測定に使われるモデル５００　（Ｃｈｒｏｎｏ−１ｏｇ　Ｃｏｒｐ、）である。コノ器具は温度制御装置が設けられており、加熱器ブロックは３７℃まで制御される。またこの器具は攪拌速度１２００ｒｐｍの攪拌モータを備えている。

ラテックス抗原と抗体混合物間の反応は公知の方法を使って単一チューブ内で行われた。曲線が作成され、この曲線において時間に対する伝達％の変化は綿状固まりの間の粒子サイズの変化度の測定量である。伝達における増加は、ＡｇＡｇ反応の間衝突して直径５〜６μまでのより大きくかつより少数のラテックス粒子を形成する０、８μサイズのラテックス粒子によるものである。それが最大サイズに達する時Ｓ字状の綿状固まりの曲線は漸近的となる、粒子サイズがもっとも急速に変化する時の綿状固まりの点は伝達９６曲線のスロープによって示される。このスロープはラテックス懸濁液が添加された後数分以内に接線針て測定される。抗原抗体反応が生じない陰性の液体を使用する場合は、伝達対時間は直線となる。

最大スロープ値は３分以内に検出される。定量的情報を得るため、血清は希釈され、各アリコツトは測光器にかけられる。異る希釈液の血清試料についての一連の曲線が次に得られ、スロープが計算される。ある量の抗原または抗体を含む種々の希釈液の最大スロープレスポンスをプロットすることにより標準曲線が作られる。未知の試料についての曲線はこの標準曲線と比較され、定量的評価がこの比較にもとすいてなされる。

図１において、実質的に直線である凸型的なベースラインまたは陰性曲線が水平破線によって示され、また陽性の「曲線」が示される。破線はＸ−Ｙプロッターによって記録されるスロープが最大であるＳ字状曲線の点における接線である。

最大スロープは綿状固まりの粒子サイズの変化率が最大である区域である。

未知の体液をいくつかの希釈液としてテストしなくても、標準曲線から体液の希釈液のいずれかについての結果を予測することは可能である。

本発明の実施上用いられる好ましい化合物はホフマイスター順列の中性塩、有機塩またはジアミノ化合物を含む。これらの化合物のいずれも、ｐＨ７，０〜ｇ、５、ｐＨ８，２、イオン強度０．０１２５〜０．０２５　ｕ、濃度４０　ｍ　Ｍ　〜２００ｍＭのグリシン緩衝液中での体液試料の１：１０希釈液に添加され、かつ該試料が５９〜６４℃の温度まで充分な時間たとえば３〜３０分間加熱され、体液中の抗原または抗体の反応性に影響することなくＣＩまたはＣ１ｑの干渉を防止することができるものであれば、本発明の実施において使用することができる。

以下はラテックス凝集テストの促進剤であることが示された塩のリストである。

Ｃ１ｑを露呈する以外に、これらの塩はＣ１ｑの荷電基を中和し、Ｃ１ｑ複合体を免疫グロブリンとＡｇＡｇ複合体から解離することに役立つ。

臭化ナトリウム塩化ナトリウム沃化ナトリウムクエン酸ナトリウムシアン酸ナトリウム過塩酸ナトリウム酢酸ナトリウム有機イオンエチレンジアミンナトリウムエチレンジアミンテトラ酢酸テトラナトリウムプロピオン酸ナトリウムブチル酸ナトリウム他のホフマイスター順列の中性塩も５９〜６４℃の温度で充分な時間加熱される時ｃ１またはＣ１ｑを失活させるものであれば使用することができる。

中性塩はイオン強度源として役に立つ強い電解質である。中性塩の電荷は、電荷内または電荷間の吸引または反撥反応を弱めることによって巨大分子コンフォメーションに影響する。したがって、荷電基との反応、ペプチド結合、アミノ−カルボキシル、ヒドロキシル、第１および第３アミド等の双極基との反応によって、それは巨大分子の折畳み形（会合）および開裂形（解Ｍ）の間の自由エネルギーの相違を変化させ、中性塩は会合平衡および解離平衡に著るしい影響を及はす。ここではＥＤＴＡ　Ｎ　ａ　４は中性塩としての作用のために使用されるのであって、そのキレート剤ないし錯体形成特性のために使用されるのではないことに注意すべきである。

反応の正確な機構は未知であるが、本発明において使用されるこれらの中性塩がＣ１複合体および血清中のＣ１ｑ成分を露出（ｕｎｍａｓｋ）　Ｌ、解放するアクチベータとして機能するものと考えられる。同じ中性塩はＩｇＧ、ＩｇＭとの複合体およびＡｇＡｇ複合体がらＣ１ｑを解離させるために使用され、また加熱してＣ１ｑ成分を失活させるために使用される。

無機塩および有機塩はタン白質に構造上の変動をもたらす。これらは巨大分子の環境を修正し、したがって温度、ｐＨ，競合水素結合、疎水結合エフェクターを介してその水溶液中の動作の仕方に影響する。中性塩は、溶液のｐＨに主たる電荷を付与することなく水に著るしく可溶な強い電解質として定義される。

血清を５３℃以上で加熱するとγグロブリンが凝集することが認められている。

本発明は、免疫グロブリンの形状に変化をもたらし、Ｃ］、　ｑを不可逆的に凝集免疫グロブリンに対して結合させる程度の凝集を生じることなくＣ１ｑを結合させるための加熱と無機または有機陰イオンの使用にもとずく新規な方法を提供する。

これによって、免疫検定法におけるＣ１ｑによる誤った陽性（非特異的）結果を防止することができる。

ラテックス固定テストはリウマチ患者の７０〜８０％について陽性であり、他の病気の患者についても０〜２５％について陽性である。ＲＡを有する血清正の患者の約２５％は１　：１６０〜１：６４０の力価を持つ。シンガーとブロッツは、に８０以上の力価は陽性と考えられるべきであると示唆している。ＲＦについての熟練テスト中で述べられているように、伝染病センターによれば、多くの研究所はに８０以上の力価を有意として報告している。誤った陽性のテストは血清中の０１またはＣ１ｑの存在の故ではないかと考えられた。これがＲＦ血清について低い力価が規定できない誤った陽性の結果に対する理由であり、また多分ＲＡ患者の８０％のみが陽性のテスト結果を有する理由であろう。

Ｃ１ｑ干渉の防止は、治療症候学と相関するＲＦテストに対して意味のある力価を付与することを可能とする。

ラテックス測光技術においてリウマトイド因子の検出と定量化のために、上記の化合物を希釈体液に添加することによって試料を用意し、６０℃で約３０分加熱することが好ましい。もっともより高い温度すなわち６３℃でより短い時間すなわち３分間としてもよい。その後作られた試料をコートしたまたはコートしていないラテックス粒子と接触させることによってＲＦの存在について試料をテストする。

ラテックス粒子の凝集は、目視によりまたは分光光度計によって迅速に検出することができる。試料の吸光度は試料中のＲＦの員に正比例して増加する。ＲＦの標準試料を使って分光光度計を標準化した後、試料は分光光度計に入れられ、３分以内に綿状固まり曲線が観測されたら、試料はＲＦについて陽性である。この方法は、医者に対して、誤った陽性結果を生じることがあるＣ１またはＣ１ｑを除去すべく処理された試料から得られる迅速で高感度で再現可能なテスト結果を与える利点がある。

その上、Ｃ１またはＣ１ｑによる干渉が防止されたという事実は、自動分光光度計をマイクロプロセッサによって制御された加熱器とともに使用することを可能とし、それはスライドまたはチューブによるテストを主観的に読むことによって生じる誤りを防止しまた恒久的な印刷された記録を提供する。これは行政当局に対し品質上の保証と熟練テスト用の記録を提供する。ｃ１成分とＲＦはＩｇＧの同一部位に結合するから、ｃ１成分を失活させることは極めて重要なことであることを理解すべきである。これは凝集１ｇＧを形成するためＲＦが結合しなければならぬ部位に０１が結合することによって生じる誤った陰性の結果の可能性を除去するものである。この可能性はテストの感度を減少させる。

量的なテストデータが必要な場合は、それまで質的に取扱われて来た試料を順次希釈する。測光器中の一連の標準曲線は公知の量の精製ＲＦまたはＣ１ｑが存在しない標準化したりウマトイド因子血清およびコートしたラテックス粒子を使用して調製することができる。試料中に存在するＲＦの量を決定するためテスト試料についての曲線が標準曲線と比較される。

体液がこれらの化合物の存在下で５９〜６２℃で３０分間加熱された時γグロブリンの凝集が防止された。同時に小量の有効量のＲ−５Ｈ化合物を添加することによりＣ１ｑとＲＦの双方が変性し、かくしてＣ１ｑとＲＦの双方が失活した。

血清その他の体液（脳を髄液、肋膜液、滑液）中のＲＦおよびＣ１ｑを失活させるため次の技術が推せんされる。

体液を低イオン強度グリシン緩衝液０．０２μ（イオン強度）ｐＨ８，２で１／１０に希釈する。０．２５ｍ　ｌ血清希釈液にＥＤＴＡ−テトラＮａ０．１Ｍ溶液１０μｍ〜２０μｌおよび新たに調製した５Ｍメルカプトエタノール溶液２μ ｌを添加した後直ちに体液を６０℃で３０分加熱する。

これらの方法は体液中の抗原をテストすることに限定されている。抗体のテストは示唆されていない。この方法の他の限界は、検出し定量すべき抗原はＳＳ結合を含んでいてはならないということである。ウィルスの莢膜抗原はメルカプトエタノールの変性効果に対して敏感であるいくつかの事例においてはそれはテストすべきではない。

この方法によって、ＡｇＡｇ複合体を解離することによってＣ１ｑとＲＦの影響を除去し、抗原がＡｇＡｇ１合体に捕えられていたらそれも解放することができる。

抗体は変性して露出した抗原を解放することができる。

この方法はＳＳ結合を含まない細菌、ウィルス、寄生虫の検出のためのすべてのテストに利用することができる。

本発明の実施上使用する好ましい化合物はホフマイスター順列の中性塩、有機酸塩またはジアミノ化合物を含む。もしこれらの化合物のいずれかがｐＨ８，２、濃度４（１ｍＭ〜２００ｍＭのグリシン緩衝液の１／８希釈体液試料に添加され、この試料が５９〜６２℃の温度で充分な時間たとえば３０分間加熱され、体液中の抗原または抗体の反応性に影響を与えることなくＣ１またはＣ１ｑを失活させるならば、本発明の実施上使用することができる。

ＲＦを失活させる場合は、メルカプトエタノール、シスチン、ジチオエリスリトルチオグリコール酸、チオアルコール、低級アルキル（Ｃ）メルカプタン等を含む式Ｒ−５Ｈの特定の化合物を使う必要がある。

本明細書記載の方法を使ってＲＦを失活させる他の適当な化合物も使用することができるＲ−ＳＨ化合物の量は臨界的なものではなく、２５ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは約３０ｍＭ（最終希釈液において）を使用することができる。試料は約５９〜６２℃の温度でＣ１ｑとＲＦを失活させるために充分な時間加熱する。通常３０分が有効である。

好ましい実施例の説明本発明を説明するため以下の実施例が示される。これらは添付クレームの範囲を限定するものと解すべきてはない。

以下詳述する実施例１〜１２において、次の２つの技術が本発明の適用をさらに示すための実験データを生じるために使用される。

Ａ、特定の免疫検定技術の代表としてのラテックス測光率反応。

Ｂ、沈殿技術による抗原抗体の反応を検出するためのオフタロニー分析。

免疫沈殿は研究所において抗原抗体反応を示すもっとも簡単でもっとも直接的な方法であって、その他のすべての免疫検定法に適用することができる。

本発明はラテックス測光法を用いて発展したから、この方法をまず記載する。

試薬ニゲリシン生理食塩水緩衝液。

０．１Ｍグリシン９７５ｍ１にＩＮ　ＮａＯＨ２，５ｍｌを加え、蒸留水で１０００ｍ　ｌとしｐＨを８，２に調整する。

次に各１０００ｍ　ｌ緩衝液に塩化ナトリウム１０ｇを添加する。

グリシン緩衝液Ｎｏ、２グリシン生理食塩水緩衝液１００　ｍ　ｌを蒸留水７００ｍ１て希釈し、緩衝液の１：８希釈液を作る。

２、ラテックス粒子：インディアナ州インディアナポリス、バングラボラトリーズ、セラゲンダイアグノスチノクス、ポリスチレンラテックス１０％固体粒子、サイズ０．７７７μ径。

３、グリシン生理食塩水緩衝液Ｎｏ、１中ヒトγグロブ’）　ンＰ［ＥＮＴＥＸ　０．５ｇ％溶液。

４、グリシン緩衝液Ｎｏ、１１０ｍ１中にラテックス１０９６粒子サイズ０．７７７μ直径２５μｍを添加することによりラテックス粒子懸濁液を調製する。

５、ラテックスヒトγグロブリン懸濁液。

グリシン生理食塩水緩衝液Ｎｏ、１１０ｍ１にラテックス１０％２５μｌとヒト γグロブリン５０μｌを添加する。

６、ＥＤＴＡテトラナトリウム０．１Ｍ本発明の一般的方法において、テストすべき血清または体液はグリシン緩衝液Ｎｏ、２で１＝１０に希釈される。

希釈血清０．２５ｍ　ｌに０．１Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａテトラナトリウム２水塩１０μｌを添加し、温度を制御された浴中で５９〜６４℃で３〜３０分間保温する。次いで、ＩｇＧでコートしたかまたはコートされていないラテックス粒子を添加し、ラテックス粒子の綿状固まりまたは凝集の存在この実施例は、体液の試料がＲＦ陽性かまたはそれがＣ１ｑを含んでいるかを決定するためのスクリーニング法を記述する。

血清をグリシン緩衝液ＮＯ１２で１：１０希釈液に希釈する。希釈した試料をＣｈｒｏｎｏｌｏｇ測光器に入れ連続して攪拌する。この試料にコートしていないラテックス粒子懸濁液０．２５ｍ　ｌを添加する。測光器の記録Ｊ１が直線を示せば、それは検出可能なＣ１ｑまたはＲＦが存在しないことを示す。Ｓ字状曲線が得られれば、それは試料がＣ１ｑかリウマトイド因子を含んでいることを示す。

ラテックス粒子で処理した試料中に３分後にまだ直線が観〃１されたならば、血清とラテックスの混合物に中性塩（２Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃ１１０μｌ）を添加する。

次に測光器に綿状固まりの曲線が得られたら、これはマスクされたＣ１ｑまたはＲＦまたはＣ１ｑとＲＦの混合物の存在を示す。綿状固まりの曲線が得られなければ、上記のとおり血清、緩衝液および２ＭＮａＣ１のアリコツトを調製する。

この混合物を５６℃で３０分間加熱し、コートされていないラテックスを添加する。綿状固まりの曲線が観測されるはずであり、それはＣ１ｑおよびＲＦの存在を示す。

綿状固まりの曲線が得られる時はいっても、血清、緩衝液、２ＭＮａＣ１の新しいアリコツトを調製し、６３℃で３分間加熱する。そしてコートされていないラテックスを添加する。綿状固まりの曲線が観測される時は、それはＲＦの存在を確認する。綿状固まりの曲線が観δＦ１されない時は、それは血清がＲＦについて負であり、推論により試料はＣ１ｑを含んでいたとする。

この実施例は体液中にＲＦが存在する場合のＲＦ検出のスクリーニング法を示すものであり、この方法はまた免疫検定法において使用する試料中でＣ１ｑによって生じる干渉が防止されたことを確認するために使用するここの実施例はＣ１中のＣ１ｑ成分が血清を凝集させ、塩の存在下で６３℃で３分間加熱することによって失活することを示す。

Ｃ１ｑ失損ヒト血清の市販の調製物が測光器中でラテックスＩｇＧ調製物とともにテストされる。ラテックス粒子懸濁液に対しグリシン緩衝液Ｎｏ、２、ｐＨ８，２で１．１０に希釈した血清０．２５ｍ　ｌを添加した時ラテックス粒子の凝集は生じない。Ｃ］、　ｑ失損血清０．２５ｍ　ｌを精製した市販のＣ］Ｑ調製物と組合せた時血清は強い正のラテックス凝集を示す。次に希釈血清を２ＭＮａＣ１１５μｍの存在下で６３℃で３分間加熱した。ＩｇＧでコートしたラテックスでテストした時凝集は検出されこの比較例は、試料が５９〜６４℃で充分な時間処理されなかった時、Ｃ１または負の血清を添加した場合ＩｇＧが種々の精製した補体成分およびリウマトイド因子と凝集することを示している。

１、Ｃ１、グリシン緩衝液Ｎｏ、２０．２５　ｍ　ｌ中２０μ２、Ｃ１＋ＥＤＴＡ−Ｎａ、０．１Ｍ　ＥＤＴＡ−Ｎａ１０μｌ添加３、Ｃ１ｑ、１０μ！４、Ｃ１ｒ、１０μｍ５、Ｃ１ｓ、１０μｍ６．０１阻害剤、１０μｍ７、精製ＲＦ、１０μｍ８、精製ＲＦ＋Ｃ１１０μｍ９、精製ＲＦ陰性の血清２５μＩＣＩ　Ｄｉａｍｅｄｊｘ　０．０４ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌ、Ｃ１ｑ　Ｓｉｇａ＋ａ　Ｏ，５ｍｇ／ｍｌ、Ｃ１ｒ　ヒト２５０　ｕ　ｇ　１Ｃａｌｂｉｏｃｈｅａ＋、　Ｃ１ｓ　Ｃａ１ｂｉｏｃｈｅａ＋　５００μｇ／ｍｌ、ＲＦ精製１ｍｇ／ｍｌ、Ｃ阻害剤０．５／　ｍ　ｇ　Ｃａ１ｂｌｏｃｈｅｓこの表はＣＩ（１）　、Ｃ１ｒ（４）　、Ｃ１５（５）およびＣ１阻害剤はラテックスＩｇＧ粒子を凝集させないことを示す。Ｃ１をＥＤＴＡ−Ｎａと処理するとそれはＣ１ｑ成分を解放し、これはラテックスＩｇＧ粒子を凝集させる。精製ＲＦ調製物（７）はラテックスＩｇＧを凝集させるが、Ｃ１を精製ＲＦ　（８）に添加すると、それはｃｌを含む負の血清のＲＦ耐凝集阻害する。

実　施　例　３この実施例はＨｇＧでコートしたまたはコートしないラテックス粒子がＣ１ｑの存在の検出に使用されることを示す。

コートしないラテックス粒子またはヒトγグロブリンでコートしたラテックス粒子をＤｌａａｅｄｌｘ　ＣｏｒｐＳＳｉｇｍａｌ、ａｂ　、Ｂｅｈｒｌｎｇ、　Ａｔ１ａｎｔｉｃ　Ｌａｂからの精製Ｃ１ｑ　（各濃度０．５ｍｇ　ＣＩＱ／ｍｌ）に添加した。これら調製物のすべてはγグロブリンをコートしたまたはコートされないラテックス粒子を凝集させた。

Ｃ１ｑの希釈液をＣｙｔｏｔｅｃｈ製のＣ１ｑから調製した。

これらの希釈液はコートされないラテックス粒子を用い、上記の技術により定量した。その結果は次のとおりである。

０．５　１．２０．０２５　０．［ｌＯＯ，（１１２５０，３００，００６２５０・１８０．００３１２５　０．０９０．００＋５６２５　０．０４５０．０００７Ｂ１２　０．０２７０．０００３９０Ｂ　０．０１４実　施　例　４この実施例は、６０℃で３０分加熱した通常の血清に対する中性塩の種々の濃度の影響を示す。

陰性の血清０．２５ｍ　ｌに対しＥＤＴＡテトラナトリウム溶液の種々の量を添加し、ラテックスＩｇＧを使用して１１光法によりテストした。

０．１Ｍ　スロープ　スロープＥＤＴＡテトラＮａ μｌ添加　加熱せず　６０℃で加熱０　０．０８　０１０　０．９５８　０２０　１．１２　０３０　０．８１５　０４０　０．７８８　０５０　０．１１ｉ４７　０６０　０．６４７　０７０　０．６６０　０８０　０．６６０　０ｔｏｏ　ｏ、ｅｅｏ　。

中性塩（ＥＤＴＡ−テトラＮａ）の存在下で６０℃で３０分加熱した通常の血清は、ラテックスＩｇＧを使って測光法でテストした時は正の反応を示したのに対し、陰性の反応を示す。

通常の血清と同一濃度のＥＤＴＡテトラＮａを使い、コートしないラテックスを使い、６３℃±１℃で３分加熱したその後のテストは各濃度についてゼロスロープをこの実施例はラテックス測光法による１００通常の供与者血清のテストについて報告している。

加熱　加熱　加熱　加　熱　加熱せず本５６℃　５６℃　６０　℃　６３＠　±１℃％　３０分　３０分　３０　分　３分塩添加　塩無添加　塩添加　塩添加％　％　％　％非特異　２０　１００　１００凝集なし８０　１００　１００＊対照　″ 健康に見える血液供与者から得た血清１００試料を最初スライド法（Ｒｈｅｕｍａｔｅ＋ｃ　、ニューシャーシ−Ｈクランベリー、ｗａｍｐｏｌｃラボラトリーズおよびシンガーとプロッツの標準ラテックス固定テスト管法、＾ｍ、　Ｊ、　Ｍｅｄ２１　：８８８−８９２頁（１９５６年））によりリウマトイド因子の存在についてテストした。テストはすべての血清について陰性であった。

各血清をグリシン緩衝液Ｎｏ、２で１：１０に希釈し次のとおり処理した。

１、加熱せず、塩魚添加２．５６℃、３０分加熱、０．１Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａナトリウム１５μｌ添加３．６０℃、３０分加熱、塩魚添加４．６０℃、３０分加熱、０．１Ｍ　ＥＤＴＡ−１−トＩＪ’７ム１５μｌ添加５．６３℃±１℃で加熱、０．１Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａナトリウム１５μｍ添加表は、Ｃ１ｑについて、この方法により、加熱しない血清の８０％は負であるが、塩を添加しまたは添加しないで５６℃、３０分加熱する時血清緘ｃ１ｑについて正となることを示す。前回５６℃でラテックス粒子を凝集した通常の血清からのＣ１ｑは塩の存在下で加熱した時にのみ６０℃、３０分または６３℃±１℃、３分間で失活した。

血清は塩を添加せずに６３℃±１℃の温度で処理すべきてはない。なぜならば、試料が高レベルのγグロブリンすなわち１８ｍｇ／ｍｌを超えるγグロブリンを有していると、この高レベルのγグロブリンが凝集を起すことがあるからである。

実　施　例　にの実施例はＲＦ含有血清における塩と加熱の影響を示す。

リウマトイド血清５ｏをグリシン緩衝液Ｎｏ、１で１：１０に希釈し、加熱せず、５６℃、３０分加熱およびＥＤＴＡ−Ｎａ　１５μ＋添加、および６０”Ｃ１３０分加熱およびＥＤＴＡ−Ｎａ添加でテストした。これら血清はスライド法およびラテックスＩｇＧチューブ法ではすべて陽性であった。

これら血清（緩衝液で１・１ｏに希釈）の５０％はラテックスＩ　ｇ　Ｇ　７１ＦＩ光法では陰性であった。この抑止は補体の０１成分にょるＲＦの阻害によるものであった。熱と塩の使用により、ｃ１補体成分は解離し、ＲＦは解放されてラテックスＩｇＧと反応する。０．１Ｍ　ＥＤＴＡ−Ｎａ　１５μｌを添加して６０℃、３０分加熱すると、Ｃ１成分１；！　Ｃ１ｑ　、　Ｃ１ｒ　ＳＣ１ｓ　ｌ：解離し、ｃｌｑのラテックス粒子との凝集を防止することができる。結果は次のとおりてあった。

加熱せず　加熱５６″　加熱６０″ ＲＦに対する陽陰　陰性　陽性　陽性６３℃±１℃、３分間はＩｇＧでコートしたラテックス粒子に対するＲＦの欲求を減退させるかもしれないので、ラテックスＩｇＧ粒子におけるＣ１ｑの凝集を防止するため６０℃、３０分の温度を使用すべきである。

実　施　例　７本発明は、また、体液試料中のＣ１またはＣ１ｑを失活させることが望ましい免疫検定法を自動的に実施する新規な装置を含む。

この装置は次のものに使用することがてきる。

１、Ｃ１ｑが失活したことを確認するためのスクリーニング法２、体液中のＣ１ｑの検出のためのスクリーニング法３、体液試料中のＲＦの存在を確認するためのスクリーニング法４、メルカブトエクールで処理後体液中にＲＦが不存在であることを示す方法５、ＲＦの検出のためのスクリーニング法６、体液中のＲＦ力価のスクリーニング法７、体液中のＲＦ（ＩｇＭ）８度を定量する方法８、体液試料から０１とＣ１ｑを除去する装置中でラテックス凝集を用いて細菌、かび、寄生虫、リヶチア、ウィルス性の疾病を検出する方法図３は本発明の装置の概略図である。本発明の基本的構成は光源１を備える照射ユニット、フィルターまたはプリズム２、体液の試料を保持するための試料セル３、セル４近傍においてテスト試料管を保持するようになされた電子的に制御された可変電気加熱器ブロック４を含む。加熱器ブロック４の電子的制御は試料セル３中の試料を３分ないし３０分またはそれ以上の時間約５９〜６４℃の温度に加熱する温度を提供する。試料セル３はいくつかの関連する試薬供給ライン６．７．８を有し、これらは自動計測弁を備え、これらの弁は電子的に制御されて所要の量の分散したラテックス粒子、化学溶液、および／または抗原もしくは抗体溶液および／またはメルカプトエタノール溶液を供給する。図３に示すように、ライン６は分散ラテックス粒子を供給するために設けられ、ライン７は２ＭＮａＣ１等の中性塩溶液を供給するために設けられ、ライン８は体液試料からＲＦを除去することが望まれる免疫検定法のためにメルカプトエタノール溶液を供給するために設けられている。光源ＩＡを備えた基準セル３Ａは補償のための対照試料を保持するために設けられている。加熱器４Ａとライン６Ａ１７Ａ、８Ａは並行制御を行うことが望まれる場合のために設けられている。光電池１２．１４はセル３および３Ａを通って透過される光を感知するように配置されている。

光電池１２−１４からの信号を増幅するため増幅器１６が使用される。信号はインタフェイス１８に送られコンピュータ処理されて図３に示されていないＣＲＴおよび／またはプリンタ上に表示される。セル３および３Ａは好ましくは公知の磁力攪拌機が装備され、この攪拌機はテストセル中の成分を懸濁状態に保持するために使用される。

本発明のこの新規な装置は次のように動作する。血清（グリシン緩衝液Ｎｏ、２で１：１０に希釈）等の被分析物をｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏ「ｏｒｓａｎｓについてテストする場合被分析物をセル３に置き、ＫＣＩ　２Ｍ水溶液１０μｌをライン６を介してセル３に計量して入れる。加熱器ブロック４を動作させセルの温度を６３℃に上げ３分間加熱しＣ１とＣ１ｑを失活させる。

その後ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｒｏｒ＊ａｎｓ抗体をコートした分散ラテックス粒子１５μｌをライン６によりセル３に計量して入れ、その間磁力攪拌機を１０００　ｒｐ■で回転する。吸光度の変化をセル３Ａで行われている対照と比較し綿状固まりが生じたかどうかを確認する。綿状固まりの検出はＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｒｏｒａａｎｓ抗原の存在を示す陽性結果として読み取れる。

本発明の装置は、光学的凝集テストを行うためＣｈｒｏｎ。

ｌｏｇモデル５７０ＶＳ等の公知の測光器の基本構成を備えていてもよい。この装置はまた可変加熱器ブロック手段および関連するタイマ一手段および上述の試薬供給手段を含むように変更してもよい。本発明を具現するために修正しうる適当な測光器は参照文献として本明細書に含まれる米国特許第４．１１８，１９２号に記載されているか、またはＥｉｋｅｎ　Ｃｈｅｓｌｃａｌ　Ｃｏ、製造にかかるＬＡ−２０００等市販の測光器でもよい。

実　施　例　８この実験は温度のＣｌｑ分子に与える影響を示すもので、この分子は精製した形では５６℃、３０分で熱不安定であるが、Ｃ１ｑと複合した時その温度で熱安定でありまたは血清であって１０〜３０分加熱した時は熱安定実　験　例　抗Ｃ１ｑ　抗Ｃ１ｎ１＊　通常血清、加熱せず２５μ＋　ｐｐｔ　ｐｐｔ２零　通常血清、５６℃、３０分加熱、ｐｐｔ　ｐｐｔ２Ｍ　ＮａＣ１１５μ！添加、２５μｍ３　通常血清、６３℃、３分加熱　ｐｐｔなし　非常に弱い２Ｍ　ＮａＣ１１５μＩ添加、２５μＩ　ｐｐＬＨＣ１ｑ１５ｍｇ／ｍ　ｌ　ｆｏμｌ　ｐｐｔ　１）ｌｌｔなし５４　ｃｔｑ　５Ｂ℃、３０分加熱　ｌＯμ＋　ｐｐｔなし　ｐｐｔなし８＊　Ｃ１ｎ　ＩＯμｌ　ｐｐｔなし　ｐｐｔ７ＩＩＣＩＱ　１ＯｕＩ　＋Ｃ１ｎ　ｌＯμｌ　ｐｐｔ　ｐｐｔ８＊　ｃｔｑ　ＩＯμｌ　＋ＣＩｎ　１０μＩ　、　ｐｐｌ　ｐｐｔ５６℃、１０分加熱９＊　Ｃ１ｑ　ｌＯμｌ　＋Ｃ１ｎ　１ＯｕＩ、　ｐｐｔ　ｐｐｔ５６℃、２０分加熱１０＊　ＣＩＱ　１ＯｕＩ　＋ＣＩｎ　ｌｏμＩ、　ｐｐｔ　ｐｐｔ５６℃、３０分加熱１１＊　Ｃ１ｑ　ｌＯｕ　Ｉ　＋ｃｔｎ　ｔｏμＩ　、　ｐｐｔなし　ｐｐｔ＊対　照Ｃ１ｒ阻害剤は１０国際単位（Ｃａｌｂｌｏｃｈｅｓ）であった。

実験例Ｎｏ、３に示す本発明は中性塩の存在下で血清中のＣ１ｑは６３℃、３分の温度で熱不安定であるが、中性塩の存在下で５６℃、３０分の温度では熱不安定でないことを示している。

を（ＣＡ　Ｌ　Ａ　Ｓ　）　Ｍｅｒｉｄｉａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｉｎｃ、のラテックス凝集テストによってテストした。これらのキットのラテックス粒子は抗クリプトコツカルグロブリンでコートされている。血清の一つはＲＦ陰性であり他の血清はシンガーおよびブロックのラテックスγグロブリンテストにおいてＲＦについて１・６０の力価を有していた。このキットにおいて用いた技術はテストされる液から非特異的な凝集因子であるＲＦの存在を除去するはずである。

血清試料２００ｕ　１に対しＰｒｏｎａｓｅ溶液（ＭｅｒｉｄｉａｎカタログＮｏ、１４００５０）　２００　Ｉｔ　Ｉを添加し、血清Ｐｒｏｎａｓｅ試薬を５６℃で１５分保温し、ある溶液は酵素消化を終了させるため５分間煮沸した。これらの血清は、抗クリプトコツカルグロブリンでコートしたラテックス粒子を用いるチューブ法によって１：２５６および１：５１２の凝集力価を示した。

上記の技術は、Ｃ１ｑおよびＲＦの試料からの除去を含めて本発明の技術と比較された。それはまた２つの対照を含む。一つの対照は１ｍｇ　Ｃ１ｑ　（精製Ｃ１ｑ）２５μｌであって、これをグリシン緩衝液０．２５μｌに添加する。第２の対照は活性リウマチ性関節炎患者から得たＲＦ血清の１＝５０希釈液である。

血清の１：１０希釈液０．２５ｍ　ｌおよび２つの対照にＥＤＴＡテトラナトリウム０．１Ｍ溶液１０μｌおよび５Ｍメルカプトエタノール溶液２μｍを添加する。血清と対照を６０℃、３０分加熱する。

血清を０、１　Ｍグリシン緩衝液ｐＨ８，２で順次希釈しクリプトｍｌ　ッカル抗体（Ｍｅｒｉｄｉａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｉｎｃ、のラテックスキット）でテストした。血清、対照の双方とも同一の試薬でテストした。両方の血清は凝集力１ｉ１ｆｌ：２５６および１　：　５１２を示した。この力価はＭｅｒｉｄｉａｎ　ＤｌａｇｎＯ８ｔｌｅｓの当初の方法によって得られたものと類似するものであった。対照はいずれも陰性を示し、本発明の技術を用いることによってこの血清からＣ１ｑとＲＦが除去されることを示した。

憇血清型８と同定された。患者の血清はＷｅ　Ｉ　ｃｏ■ｅ　Ｄｉａｇｎ。

５ｔｊｃのｖｅ＋ｃｏｇｅｎ抗原検出キットでテストした時陽性のラテックス粒子を示した。このキットにおいては、ラテックス粒子はＳ、ｐｎｅｕ＋ｇｏｎｉａｅウサギ抗体でコートしである。

テスト前に血清試料に０．１Ｍ　ＥＤＴＡナトリウム（ｐＨ７，４）を血清１容量に対し３容量添加した後席とう水中で５分加熱した。試料は室温で冷却し、テスト前に遠心分離により清澄化した。クロットからの上澄みを使用し、両方の血清について陽性であることが判った。

肺炎患者から得た２つの血清はシンガーおよびブロッツノラテックス凝集テストＡｓ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　２１　＋　８０．１９５６年によって検出したところＲＦの存在についても陽性であった。

蒸留水で１：８に希釈したグリシン緩衝液で患者の血清を１．１０に希釈した。

希釈血清０．２５ｍ　ｌに対し、および２つの０．２５ｍ　ｌ対照に対しＥＤＴＡ　Ｏ，１Ｍ溶液１０μｌおよび５Ｍメルカプトエタノール溶液２ラムダを添加し、血清は６０℃で３０分加熱した。対照はＲＡ患者の血清から得たＲＦ含有血清の１１５０希釈液およびＣ１ｑ精製品（Ｓ！ｇｇａ　Ｃｏ、）　１　ｍ　ｇを含むグリシン緩衝液（ｐ　Ｈ８，２）であった。

処理後血清と対照をＶｅｌｃｏｇｅｎＳＷｅｌｃｏｍｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃキットを使ってＳ、ｐｎＯＵ＋ｗＯｎｌａｅの存在についてテストした。

２つの血清はＳ、ｐｎｅｕａ＋ｏｎｌａｅについて陽性であり２つの対照について陰性であった。

この実施例は、Ｃ１，ｑとＲＦがＳ、ｐｎｅｕｍｏｎｌａｅ含有血清から除去された時Ｓ、ｐｎｅｕｎｏｎｌａｅ抗原について血清は陽性と出ることを示す。

本発明は免疫検定法の実施用のキットを含む。

本発明のキットはいずれの公知のキットの構成要素を含んでいてもよく、さらに　（ａ）体液の試料に添加された時、体液と化合物の混合物が５９〜６２℃の温度にまで体液中の抗原または抗体の反応性に影響することなくｃｌとＣ１ｑを失活させるに充分な時間加熱された時体液中の０１またはＣ１ｑを失活させることができる化合物、および（ｂ）Ｃ１ｑを含む溶液を含む。

本発明のキットはいずれの公知のキットの構成要素を含んでいてもよく、さらに　（ａ）体液の試料に添加された時、体液と化合物の混合物が５９〜６４℃の温度まで体液中の抗原または抗体の反応性に影響を与えることなくＣ１とＣ１ｑを失活させるに充分な時間加熱された時体液中の０１またはＣ１ｑを失活させることができる化合物と　（ｂ）Ｃ１ｑを含む溶液を含む。

これらのキットの例は次のとおりである。

１、液または血清中のＣ１のＣ１ｑ補体成分の干渉を除去するための試薬（ｃ）　抗原用対照（ｄ）　抗体用対照（ｅ）　中性塩（好ましくは２Ｍ　ＮａＣ１）、および（ｒ）　抗原抗体反応用緩衝液２、インビトロ診断用として、キットは各免疫検定法において用いられる試薬を含む。

（ａ）ラテックス抗原または抗体エマルジョン（ｂ）　ラテックス抗原対照（Ｃ）　ラテックスリウマトイド因子対照（ｄ）　ラテックス抗体対照、および（ｅ）　中性塩（好ましくは２Ｍ　ＮａＣ１）３、ＲＦ同定およびＣ１ｑスクリーニング技術（ａ）　ラテックス粒子溶液　０．７０〜０．９０ミクロン径（ｂ）　ＨｇＧ　２％（ｃ）　グリシン緩衝液ｐＨ８，２μｙ　ｏ、ｔ（ｄ）ＲＦ精製タン白（ｅ）ＲＦ標準血清（ｒ）　オフタロニー板（選択的）（ｇ）　精製Ｃ１ｑ（ｈ）　中性塩２Ｍ　ＮａＣ１または２Ｍ　ＫＣＩ、および（ｉ）　５Ｍメルカプトエタノール水溶液４、Ｃ１ｑの干渉除去用およびＲＦ干渉除去用（ａ）　０．１Ｍグリシン緩衝液生理食塩水　ｐＨ８，２（ｂ）　Ｏ，１Ｍ　ＥＤＴＡ　Ｎａ溶液（ｃ）　５Ｍメルカプトエタノール濃溶液（ｄ）ＲＦ血清ヒト血清（ＨＩ　Ｖについてテストしたもの）の１：５０希釈液（ＲＦについての対照として）、または精製ＲＦ調製物（ｅ）Ｃ１ｑ補体成分希釈液（ＣＩＱの対照として１ｍｇｃ１ｑ精製タン自調製物２５μｌをグリシン生理食塩水緩衝液（ｐ　Ｈ８，２）０．２５ｍ　ｌに添加したもの）、および（「）保存剤として０．１％アジ化ナトリウムを含む緩衝液Ｚｖ≧Ｊ第２図ＦＩＧ、３ｏ　Ｏの　Ｑ　嘘　へシＯｏ　ｃ：ｓ　ｏ　ｏ　。

）χ憧手続補正書動式）

Claims

【特許請求の範囲】請求項１免疫検定法におけるＣｌとＣｌｑの干渉を除去するたため体液からＣｌとＣｌｑの影響を除去する方法であって、次の工程を含む方法（ａ）体液の希釈試料に対し有効量の化合物を添加する工程であって、該化合物は、該体液と該化合物の混合物が５９〜６４℃の温度まで充分な時間加熱された時、該体液中の抗原または抗体の反応性に影響することなく免疫検定法において該体液中のＣｌまたはＣｌｑの干渉を防止することができるものである工程（ｂ）該化合物と該体液を含む該希釈試料を約５９℃ないし約６４℃の温度まで免疫検定法においてＣｌまたはＣｌｑの干渉を除去するために充分な時間加熱する工程。請求項２免疫検定法キットにおいて以下の構成を含む改良（ａ）請求項ｌ記載の化合物（ｂ）Ｃｌｑ成分を含む溶液請求項３以下の構成を含む凝集検知用測光装置（ａ）光源（ｂ）体液の試料を保持する試料セル（ｃ）該セル近傍に設けられた制御された可変加熱器ブロック（ｄ）試薬の測定された量を該試料セルに測って入れるための試薬供給手段および弁手段（ｅ）該試料セルを介して伝達される光を検知する光電池手段（ｆ）該光電池手段からの信号を増幅する増幅器手段（ｇ）該信号を処理しかつ該弁手段を制御するマイクロプロセサ、および（ｈ）凝集の検知結果を記録する表示手段。請求項４精製Ｃｌｑの定量化方法であって次の工程を含む方法（ａ）Ｃｌｑの試料を順次希釈する工程（ｂ）該順次希釈した（ａ）工程からの試料をラテックス粒子と接触させる工程（ｃ）測光器中の各希釈試料中の綿状固まりの量を決定する工程（ｄ）各試料の最大スロープを決定する工程（ｅ）試料の該最大スロープを標準値と比較する工程。