CH630662A5 - Composition containing a stabilised enzyme, process for preparing it and its use - Google Patents
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Classifications
-
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Description
La présente invention a pour objets une composition liquide stable contenant un enzyme moléculairement stabilisé, définie à la revendication 1, un procédé pour sa préparation, défini à la 25 revendication 12, et une utilisation de cette composition, définie à la revendication 20.
Il a récemment été établi que le 25 % de tous les tests diagnostiques in vitro effectués annuellement aux USA ne sont pas fiables. Des tests auxquels on ne peut pas se fier peuvent aboutir 30 à des traitements médicaux inutiles, à la suppression d'un traitement nécessaire et à des pertes de revenus. A cause de leur haute spécificité, l'utilisation de déterminations enzymatiques a augmenté de façon appréciable pendant ces dernières années et tout laisse penser que cet état de choses va continuer. Toutefois, 35 des mesures rigoureuses de contrôle de qualité sont nécessaires pour assurer l'exactitude et la fiabilité des résultats. Cette nécessité découle du fait que la nature exacte des enzymes et le mécanisme de leur action restent en grande partie onconnus. Actuellement, la plus grande limitation imposée au fabricant de réac-40 tifs enzymatiques réside, de loin, dans les caractéristiques d'instabilité de ses produits. Les techniques courantes nécessitent l'utilisation de nombreux ingrédients labiles et le nombre de ces ingrédients tend plutôt à augmenter qu'à diminuer.
Dans l'état commercial actuel de la technique utilisée pour 45 stabiliser la capacité réactive des enzymes, on enferme ceux-ci dans une matrice solide soit par lyophilisation soit par mélange à sec tel qu'utilisé pour la mise en tablettes de poudres sèches dans l'industrie pharmaceutique, dans l'industrie des produits diagnostiques et autres industries similaires, immobilisant ainsi 50 leur structure chimique. Contrairement à la sophistication que ces termes impliquent, ces façons de procéder ne sont ni pratiques ni désirables et en plus sont chères. Le fabricant est obligé d'enlever l'eau et de fournir un produit partiel, perdant ainsi une partie du cycle du contrôle de la qualité lors de la dilution et de 55 l'utilisation du produit final. Les laboratoires sont ni pratiques ni désirables et en plus sont chères. Le fabricant est obligé d'enlever l'eau et de fournir un produit partiel, perdant ainsi une partie du çycle du contrôle de la qualité lors de la dilution et de l'utilisation du produit final. Les laboratoires sont forcés de 60 payer le prix élevé de l'emballage, la perte de réactif, la lyophilisation et le mélange à sec, tandis que l'utilité du produit est en plus limité par les modes d'emballage et la taille de ces emballages.
De plus, une bonne uniformisation du produit est difficile à 65 obtenir. Ceci ressort d'ailleurs du fait que la plupart des sérums de contrôle lyophilisés du commerce (sérums de référence) affichent la variation acceptable de flacon à flacon des constituants enzymatiques à ± 10% de la moyenne.
3
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Selon un mode d'exécution du procédé selon l'invention, on stabilise des enzymes labiles en les traitant avec un solvant organique concentré, tel que 30% de propanediol aqueux, en présence d'une petite quantité d'un polymère, telle que 0,1 % de gélatine, puis en diluant avec de l'eau jusqu'à 1 % de solvant tout en maintenant la concentration en polymère à au moins 0,01 %. La composition diluée peut être stockée pendant de longues périodes sans perte appréciable de l'activité catalytique enzymatique. On peut améliorer la stabilité en incluant de 1 à 8% ou plus de sels et de 0,1 % d'agents bactériostatiques dans la composition diluée. Ainsi l'enzyme stabilité liquide peut être conditionné avec un substrat et des sels tampons.
Les enzymes labiles sont chimiquement modifiés de façon à leur conférer un état stable à long terme sans influencer la réactivité enzymatique.
Le procédé selon l'invention fournit des réactifs ou des compositions de réactifs dans lesquels le contrôle de la qualité est assuré tout au long de la fabrication, de l'emballage, du stockage et de l'utilisation. L'inconvénient de la grandeur fixe de l'emballage est ainsi éliminié comme d'ailleurs les frais élevés d'emballage, la lyophilisation et les pertes de réactif. Des systèmes liquides d'enzymes fournissent une flexibilité d'application et la séparation des ingrédients est facilement effectuée à peu de frais de fabrication réalisant la flexibilité de la mise en route de la réaction désirée lorsque toutes les autres réactions connexes se sont dissipées.
Les enzymes stabilisés ainsi ont été évalués au cours d'études lors desquelles on compare des réactifs enzymatiques liquides avec des réactifs frais. Ces études montrent une corrélation de 1 à 1 entre des réactifs liquides et des réactifs frais avec une sensibilité et une précision comparables. La fourniture de réactifs enzymatiques sous forme liquide améliore l'application colorimétrique des méthodes couplées NAD/NADH2 actuelles, principalement du fait que la séparation des ingrédients est facilement accomplie. Des réactifs liquides sont spécialement avantageux lorsque la consommation du NADH2 est la base de la mesure et que le réactif coloré doit être séparé du NADH2 et de la réaction principale. Dans le mode ultraviolet, le système liquide d'enzymes assure une meilleures homogénéité et un meilleur amballage du réactif, ainsi qu'une meilleure flexibilité à l'usage, contrairement aux préparations lyophilisées ou les préparations en milieu sec.
En enzymologie diagnostique, la stabilisation de réactifs enzymatiques sous la forme de liquides prêts à l'emploi est une conception nouvelle et intéressante pour satisfaire les besoins des laboratoires cliniques et les exigences de fiabilité des autorités de réglementation. La flexibilité des systèmes liquides d'enzymes implique leur application à l'instrumentation automatique tout en facilitant les tests manuels.
La stabilisation des enzymes labiles est accomplie suivant un mode d'exécution du procédé selon l'invention en dissolvant des enzymes secs, lyophilisés, dans une base enzymatique aqueuse comprenant au moins 0,05 % d'un polymère et au moins 20% V/V d'un solvant organique. On maintient la solution en-dessous du point de dénaturation, convenablement en-dessous de 60 °C et dans la plupart des cas en-dessous de 40 °C, pendant au moins 30 minutes, d'habitude 2 à 3 jours. On dilue alors la solution avec de l'eau, pour produire une dilution de l'ordre d'au moins 20 fois, généralement à une dilution de 30 fois, tout en rajoutant davantage de polymère pour y maintenir un niveau de diltuion d'au moins 0,05 en poids %. La solution diluée convenablement à une concentration en enzymes de 100 à 10 000 U.I. par litre peut alors être emballée dans des récipients séparés et scellés et est stockée sous réfrigération à une température de 30 °C ou moins.
La solution diluée peut également renfermer un substrat tamponné, un agent bactériostatique et d'autres composés si cela était nécessaire. Si ces autres ingrédients sont rajoutés, la solution diluée est mélangée pour obtenir une solution de substrat homogénéisée avant d'être répartie en flacons individuels, scellée et stockée.
Les substrats sont des produits chimiques organiques de 5 structure connue dont les réactions ou les interactions sont catalysées par des enzymes, produisant un changement de la structure du composé, de sa composition atomique ou de sa rotation stéréochimique, par exemple l'acide lactique, le L-aspartate ou l'alphacétoglutarate, la L-alanine ou d'autres produits analo-10 gues.
En général, les substrats sont susceptibles d'être attaqués par dégradation microbienne car ils servent de nourriture pour des bactéries, des champignons ou autres micro-organismes. Autrement, ces composés restent stables en milieux aqueux à un 15 pH neutre ou proche de la neutralité, normalement de 4 à 10. Ainsi, si on ajoute le substrat à une composition enzymatique, le milieu de stabilisation devrait contenir également un tampon pour contrôler le pH de la réaction, par exemple un phosphate acide d'un métal alcalin et des agents bactéricides et/ou fongi-20 cides qui ne réagissent pas chimiquement avec le substrat ou qui n'inhibent pas la réaction enzymatique du substrat. Des exemples typiques sont l'azide de sodium, l'acide benzolique, le phénol, le thymol ou le pentachlorophénol, tous à 0,1 %.
On pense que le solvant organique choisi stabilise l'enzyme 25 en milieu liquide en protégeant le site du groupement fonctionnel, c'est-à-dire la partie de la molécule où la réaction avec le substrat s'effectue effectivement ou est catalysée et en protégeant l'enzyme contre une contamination microbienne et la dégradation qui s'ensuivrait. Il se produit évidemment une cer-30 taine réaction physique ou chimique dans le milieu concentré en solvant puisque l'enzyme n'a aucune activité catalytique sur le substrat à cette concentration en solvant. Toutefois lors de la dilution, l'enzyme récupère sa plein activité et maintient cette réactivité pleinement à des hauts niveaux pendant de longues 35 périodes de stockage allant de quelques mois à plusieurs années. La structure chimique interne de la molécule d'enzyme n'a pas besoin d'être préservée. Aussi longtemps que le site réactif est préservé, l'activité catalytique de l'enzyme rest intact.
La dégradation microbienne peut aussi être contrôlée en 40 utilisant une forte concentration en sels, par exemple d'au moins 1 % en poids, typiquement de 2 à 8 % en poids, ou même davantage. Les molécules de sels peuvent également protéger les sites actifs en formant des liaisons électrostatiques protégeant la configuration spatiale de l'enzyme et des sites actifs. 45 La description qui va suivre permettra de mieux faire ressortir et de rendre plus clair les divers aspects et avantages de l'invention.
Les enzymes sont des molécules de protéines complexes à haut poids moléculaire, généralement de structure chimique in-50 connue. Ils sont, à présent, classifiés par leur activité catalytique et leur spécificité extrême envers un substrat. Les enzymes peuvent être redéfinis comme étant des catalyseurs biologiques, aptes à catalyser la réaction d'un seul substrat ou la réaction d'un groupe de substrats analogues.
55 Des enzymes typiques sont la LDH (déhydrogénase lactique), la MDH (déhydrogénase malique), la CPK (créatine Phosphokinase) et analogues. L'enzyme est présent dans la composition stabilisée diluée, typiquement en une quantité de 100 à 10 000 U.I. par litre.
60 Des substrats typiques sont la L-alanine, le pyruvate, le L-aspartate, l'alphacétoglutarate et analogues. Les substrats sont sous forme de sels et font partie de la concentration en sels utile pour améliorer la stabilité de l'enzyme. La stabilité enzymatique augmente avec la concentration en substrat. Toutefois, 65 à des concentrations élévées en substrat, au-dessus d'environ 8%, l'activité enzymatique est inhibée. Il y a donc lieu d'optimaliser la concentration en substrat, généralement autour des 2 à 4%.
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Le sel tampon fournit également une partie de la concentration en sels mentionnée ci-dessus. Le sel tampon est ajouté en une quantité suffisante pour maintenir le pH entre 4 et 10, typiquement entre 6 et 8. En général le tampon est un mélange de 0,1 à 1 % d'un hydroxyde de métal alcalin et de 0,5 à 3 % d'un phosphate ou d'un carbonate acide d'un métal alcalin. La quantité totale de la concentration en sel influence aussi la quantité de polymère nécessaire. Avec de plus fortes concentrations en sels, par exemple au-dessus de 4% en poids, il faut moins de polymère, ceci étant dû à la stabilisation électrostatique produite par le sel. Toutefois, avec de plus fortes concentrations en sel, le polymère peut obscurcir la solution ou même précipiter, nécessitant un chauffage de la solution pour assurer une redissolution.
Le polymère qu'on ajoute dans la solution stabilisée diluée est de préférence prévu jusqu'à une quantité qui reste en suspension homogène sous réfrigération sans précipiter. Le polymère est présent en une quantité allant de 0,01 à 0,5 %, de préférence entre 0,05 et 0,25%. Les polymères solubles dans l'eau qui sont utiles en tant qu'agents de stabilisation sont ceux qui n'inhibent pas l'activité enzymatique et qui sont aptes à piéger l'enzyme dans la matrice de polymère. Ce polymère peut être une matière organique synthétique telle que la polyvinyl-pyrrolidone ou le dextranne d'origine biologique, par exemple la gélatine qui est du collagène dénaturé.
Le solvant doit être miscible avec l'eau, d'un pH neutre ou alcalin, liquide à la température ambiante et au réfrigérateur et non réactif avec dégradation des sites réactifs de l'enzyme, sauf par formation de liaisons électrostatiques. Des solvant utiles sont en général des solvants polaires organiques tels que les éthers, les cétones, les sulfones, les sulfoxydes et les alcools, par exemple le méthanol, l'éthanol, le propanol, le butanol, l'acétone, le dioxane, le DMSO, la diméthylsulfone et le THF. Toutefois, pour l'opération de traitement on obtient une plus forte activité avec des concentrations plus faibles dans le cas de solvants liquides polyols comprenant de 2 à 4 groupes OH et contenant de 2 à 10 atomes de carbone tels que le glycérol, le propanediol, le butanediol, l'éthylène glycol et leurs analogues.
Le solvant doit être présent en une quantité d'au moins 20% pendant l'opération de traitement, typiquement de 25 à 50%. Certains solvants nécessitent des concentrations aussi élevées que 70% afin de maintenir une activité stabilisée au-dessus de 60% de réactivité enzymatique.
Des modes d'exécution seront maintenant donnés:
4
Exemple 1
Quantités 0,1%P/P 30% V/V 70% V/V
On dissout une suspension de sulfate d'ammonium (2,2M) et de l'enzyme LDH (déhydrogénase lactique) sec lyophilisé, en io une quantité équivalente à 22 500 U.I./litre, dans la base enzymatique et on maintient le tout entre 4 et 30 °C pendant 2 à 3 jours.
Réactif de substrat
15 Matières Quantités
L-alanine 22 g/1 Acide alpha-cétoglutarique 1,6
KH2P04 14
NaOH 5
20 NaN2 1
Gélatine 1
On dilue la base enzymatique trente fois par addition à la suspension du réactif de substrat et on mélange en rajoutant de la gélatine de manière à obtenir une suspension homogène. La 25 suspension est stockée sous réfrigération. On estime la vie en rayon sous réfrigération, à 3 ans avec une activité restante de 50 à 90%
Dans le domaine des diagnostics cliniques, l'application commerciale de ces compositions d'enzymes stabilisés est repré-30 sentée par (sans y être limitée) les réactifs diagnostiques utilisés pour déterminer et quantifier les constituants suivants qu'on trouve dans des fluides biologiques (sans toutefois être limitée à ces réactifs):
1. Transaminase glutamique-oxalacétique (SGOT) 35 2. Transaminase glutamique-pyruvique (SGPT)
3. Déhydrogénase lactique (LDH)
4. Créatine phosphokinase (CPK)
5. Déhydrogénase a-hydroxybutyrique (a-HBD)
6. Glucose (par hexokinase-G-6-PDH)
40 Ces réactifs réagissent de manière analogue, contiennent des ingrédients labiles communs, et certaines des réactions qui se produisent sont communes. Le schéma de réaction chimique suivant est présenté comme un modèle pour illustrer la nature générale des réactions impliquées.
45
Base enzymatique
Matières Gélatine 51,2-propanediol Eau
(1) Substrat(s) —Enzyme 1 ^ pro(juit(s)
^ pH
(2) Produit/substrat + NAD-NADH2 Enzyme 2 ^ NADH2-NAD + produit
PH
(3) NADH2 + Chromogène Catalyseur ^ Chromogène + NAD
Toutes les réactions enzymatiques indiquées ci-dessus suivront ce schéma général, dans lequel la réaction (2) est généralement nommée la réaction de couplage, les réactions (2) et (3) sont les réactions de mesure et la réaction (1) peut être caractérisée comme étant la réaction primaire. Il doit être entendu,
toutefois, que ces trois réactions ne seront pas toutes nécessaires 65 lors d'une mesure ; en fait, elle peuvent être limitées à deux ou à une seule. Dans le cas de la mesure en ultraviolet de l'activité de la déhydrogénase lactique (LDH), seule la réaction (2) est concernée, comme suit:
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Schéma de réaction 2. - LDH LDH
Pyruvate + NADH2 ^ ^ NAD + Lactate
A l'inverse, le nombre de réactions requises peut être supérieur aux trois réactions indiquées, comme dans le cas de la mesure de la phosphokinase creatine (CPK):
Schéma de réaction 3. - CPK CPK^
(1) CP + ADP ATP+ Créatine
HK
(2) ATP + Glucose ^1 Glucose-6-phosphate + ADP
G-6-PDH„
(3) Glucose-6-phosphate + NAD ^ NADH2
PMS^
(4) NADH2 + INT^ INT + NAD
(ox.) (réd.)
= Phosphate de créatine = Adénosine-5'-diphosphate = Adénosine-triphosphate = Hexokinase
= Dinucléotide nicotamide-adénine = Dinucléotide-nicotamide-adénine réduit = Déhydrogénase glucose-6-phosphate = Sel de tétrazolium = Méthosulfate de phénazine
Dans ce cas, les réactions (2) et (3) peuvent être considérées comme les réactions de couplage, les réactions (3) ou (4) comme étant les réactions de mesure, et la réaction (1) sera la réaction 15 primaire.
Si l'on se réfère au Schéma de réaction 1. - Modèle général, il est clair et bien connu que l'utilisation de la séquence de réactions permet l'analyse quantitative soit de la réaction substrat/produits, soit des enzymes catalyseurs.
20 L'analyse quantitative de ces constituants dans les fluides biologiques est un outil diagnostique bien accepté et largement utilisé pour le diagnostic et le traitement des états pathologiques chez les humains et les animaux.
Symboles CP ADP ATP sHK NAD NADH2 G-6-PDH INT io PMS
C
Claims (15)
1. Composition liquide stable contenant un enzyme molécu-lairement stabilisé, caractérisée en ce qu'elle comprend un véhicule aqueux contenant au moins 100 U.I. par litre d'enzyme stabilisé, qui autrement serait labile et instable en milieux aqueux, jusqu'à 5 % d'un solvant organique non réactif, miscible à l'eau, qui est liquide au moins à température ambiante, et au moins 0,01 % d'un polymère soluble dans l'eau.
2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend, en plus, lorsqu'elle est susceptible d'être en présence d'un agent de dégradation bactérien, au moins 0,01 % d'agent bactéricide afin de préserver la stabilité de la composition.
2
REVENDICATIONS
3. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le solvant est choisi parmi les cétones, les éthers, les sulfones, les sulfoxydes et les alcools.
4. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que le solvant est le 1,2-propanediol.
5 que, le L-aspartate, l'alphacétoglutarate, la L-alanine et le pyru-vate, en une quantité comprise entre 2 et 4%.
19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 18, caractérisé en ce que l'enzyme est la déhydrogénase malique ou la déhydrogénase lactique.
io 20. Utilisation de la composition liquide stable selon la revendication 1, pour des déterminations médicales des fonctions humaines et animales.
21. Utilisation selon la revendication 20 de la composition selon l'une quelconque des revendications 2 à 10.
5. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le solvant est présent en une quantité comprise entre 0,05 et 5 %.
6. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le polymère est présent en une quantité comprise entre 0,05 et 0,5 %.
7. Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce que le polymère est de la gélatine.
8. Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce que le pH est de 4 à 10.
9. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle comprend de 1 à 8% de sels, y compris un substrat, et de 0,01 à 0,3% d'un agent bactéricide.
10. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce que les sels comprennent un substrat choisi parmi l'acide lactique, le L-aspartate, l'alphacétoglutarate, la L-alanine et le pyru-vate, en une quantité comprise entre 2 et 4%.
11. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que l'enzyme est la déhydrogénase malique ou la déhydrogénase lactique.
12. Procédé de préparation d'une composition liquide stable contenant un enzyme moléculairement stabilisé, selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on forme une solution de la molécule d'enzyme dans un milieu aqueux contenant au moins 20% d'un solvant organique non réactiv, miscible à l'eau, qui est liquide au moins à température ambiante, et au moins 0,05 % en poids d'un polymère soluble dans l'eau, l'on maintient l'enzyme dans la solution pendant un temps suffisant pour stabiliser ses sites réactifs, et l'on dilue alors la solution avec un milieux aqueux de façon à arriver à avoir une teneur en enzyme d'au moins 100 U.I. par litre et une teneur en solvant jusqu'à 5 %, tout en maintenant la teneur en polymère soluble dans l'eau à au moins 0,01%.
13. Procédé de préparation selon la revendication 12 d'une composition stable selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'or, dilue la solution avec un milieu aqueux contenant un agent bactéricide.
14. Procédé selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que le solvant est choisi parmi les cétones, les éthers, les sulfones, les sulfoxydes et les alcools.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le solvant est le 1,2-propanediol, lequel est présent en une quantité comprise entre 20 et 40% avant dilution.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à
15, caractérisé en ce que le polymère est de la gélatine, laquelle est présente en une quantité comprise entre 0,05 et 0,5 % avant dilution.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à
16, caractérisé en ce que l'on dilue la solution avec un milieu aqueux contenant de 1 à 8% de sels, y compris un substrat, et de 0,01 à 0,3 % d'un agent bactéricide.
18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que le milieu aqueux comprend un substrat choisi parmi l'acide lacti-
15 22. Utilisation selon la revendication 20 de la composition selon la revendication 11 pour la détermination des transami-nases glutamique-oxal-acétique (SGOT) et glutamique-pyruvi-que (SGPT).
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PL | Patent ceased | ||
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