CH633043A5 - Process for preparing aminosugar derivatives - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung neuer 35 Aminozucker-Derivate, die sich in der Medizin zur Kontrolle des Kohlenhydratstoffwechsels von Menschen und Tieren durch Hemmung von Glycosidhydrolasen eignen, wie beispielsweise zur Behandlung von Diabetes, Fettsucht und Hyperlipä-mie.

40 Es ist bekannt, dass eine Reihe von Mikroorganismen der Ordnung Actinomycetales Inhibitoren für Glycosidhydrolasen bilden, wobei man je nach den Züchtungsbedingungen Inhibitoren mit überwiegender Amylase oder Saccharase-Hemmwir-kung erhält (s. hierzu die US-Patentschriften 3 876 766,

45 3 855 066 und 3 879 546).

Gefunden wurden nun die neuen Aminozucker-Derivate der Formel I

h-

cha oh

)-^L^-0

\ \ I vjn un nP ✓ \ d ch,0h h

— 0

cha oh

—r-J

çh2oh in der ni für eine Ziffer von 1 bis 8 und m für eine Ziffer von 0 bis 8 steht, die Summe von m + m jedoch stets einen Wert von n = 1 bis 8 besitzt, mit der Massgabe, dass im Falle von m + m = 1 oder 2, n2 stets gleich 0 ist.

Je nach dem Wert der Summe von m + m besitzen diese

Aminozucker-Derivate überwiegend amylase- bzw. saccharase-65 hemmende Wirkung. So sind Aminozucker-Derivate, die gezielt zur Hemmung der Amylase eingesetzt werden können, solche mit ni + m = 4 bis 8, insbesondere mit m + m = 4 und 5. Aminozucker-Derivate, die gezielt zur Hemmung der Saccha-

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rase eingesetzt werden können, sind solche mit m + m = 1 bis 3, bevorzugt mit m + m = 2 bis 3, insbesondere bevorzugt mit nt = 2.

Es wurde weiterhin gefunden, dass überraschenderweise Aminozucker-Derivate mit m + m = 1 bis 3, insbesondere mit 5 m = 2, in vivo eine starke Hemmung des Stärkeabbaus zeigen.

Die Herstellung der obigen, neuen Aminozucker-Derivate erfolgt erfindungsgemäss durch Züchtung von Stämmen der Ordnung Actinomycetales, insbesondere der Familie Actino-planaceae, in an sich bekannter Weise und durch anschlies- 10 sende Auftrennung und Isolierung der einzelnen Verbindungen in ebenfalls an sich bekannter Weise.

Aminozucker-Derivate mit Werten der Summe von m + m von 1 bis 4 können weiterhin durch chemische oder enzymati-sche Hydrolyse erhaltenes höhermolekularer Aminozuckerde- 15 rivate erhalten werden.

Als zur Herstellung der neuen Aminozucker-Derivate in Frage kommende Stämme der Ordnung Actinomycetales seien beispielsweise genannt SE 50 (CBS 961.70), SB 18 (CBS 957.70) und SE 82 (CBS 615.71), sowie Mutanten oder Varianten dieser 20 Stämme. Besonders gut geeignet erwiesen sich dabei im Hinblick auf die Ausbeute an erhaltenen Aminozucker-Derivaten die Stämme SE 50/13 (CBS 614.71) und SE 50/110 (CBS 674.73). Beide Stämme entsprechen in ihrer Beschreibung weitgehend dem Elternstamm SE50(CBS971.60), aus dem diese Stämme 25 durch natürliche Selektion ohne Anwendung von Mutagenen gewonnen werden.

Zur Züchtung der Mikroorganismen kann man feste oder flüssige, insbesondere flüssige, wässrige Nährböden verwenden, die die an sich bekannten Ausgangsstoffe für Kohlenstoff 20 und Stickstoff, Salze und Antischaummittel in den üblichen Konzentrationen enthalten.

Als Ausgangsstoffe für Kohlenstoff dienen vorwiegend Kohlenhydrate, insbesondere Stärke, Maltose, Glucose sowie komplexe Stoffgemische wie beispielsweise handelsüblicher 35 Malzextrakt.

Als Ausgangsstoffe für Stickstoff kommen die an sich bekannten komplexen Stoffgemische wie beispielsweise Kaseinhydrolysat, Hefeextrakt, Pepton, Fischmehl, Maisquellwasser, Fleischextrakt sowie Mischungen dieser Ausgangs- -to stoffe in Frage, ebenso wie einzelne Aminosäuren und/oder Ammoniumsalze als Stickstoffquellen verwendet werden können.

Die Züchtung der Mikroorganismen erfolgt aerob, zweckmässig in belüfteten Schüttelkulturen oder in den üblichen « Behälterkulturen.

Art und Konzentration der für Kohlenstoff eingesetzten Ausgangsstoffe beeinflusst in Verbindung mit dem jeweiligen zur Fermentation verwendeten Stamm die Art des überwiegend gebildeten Endproduktes. so

So werden beispielsweise in Nährlösungen, die Stärke über 2 Gew.-% enthalten, vor allem Verbindungen der Formel I mit m + m = 4 bis 8 gebildet. Für die Herstellung dieser Aminozuk-ker-Derivate mit m + m = 4 bis 8 ist der Stamm SE 50/13 (CBS 614.71 ) besonders gut geeignet. 55

Enthält die Nährlösung hinreichend Glucose (ca. 3,5 Gew.-%) so reichen jedoch bereits 0,1 bis 3 Gew.-% Stärke, um überwiegend Gemische von Aminozucker-Derivaten mit m + m = 4 bis 8 zu erhalten. Sämtliche dieser so erhaltenen Aminozucker-Derivate können als Ausgangsverbindungen für die 6o Herstellung der niederen Homologen auf dem Wege der chemischen oder enzymatischen Hydrolyse verwendet werden.

Aminozucker-Derivate der Formel I mit m + m = 1 bis 4 werden in überwiegendem Masse erhalten, wenn man in stärke- 65 freien Nährlösungen arbeitet. Besonders günstig wirkt sich hierbei die Zugabe von Maltose zur Nährlösung aus. So erhält man beispielsweise bei Zugabe von Maltose und unter Verwendung des Stammes SE 50 (CBS 961.70) Gemische von Aminozucker-Derivaten (I), mit überwiegend m + nz = 2 bis 3. Die Bildung eines Aminozuckers mit m = 1 wird insbesondere dadurch erreicht, dass man als Ausgangsmaterial für Kohlenstoff nur Glucose verwendet. Zu beachten ist hier jedoch, dass bei einem Überschuss an Glucose bei längerer Fermentationsdauer auch die höhermolekularen Aminozuckerderivate gebildet werden.

Verwendet man Nährlösungen, die keine Glucose enthalten und gibt als alleinigen Ausgangsstoff für Kohlenstoff Maltose hinzu, so erhält man überwiegend den Aminozucker der Formel I mit m + m = 2. In einer technisch vorteilhaften Ausführungsform kann man dabei die reine Maltose durch ein billigeres Produkt ersetzen, wie z. B. Maitzin, einen natürlichen handelsüblichen Malzextrakt.

Als besonders geeignet für die Herstellung von Aminozuk-ker-Derivaten, die überwiegend solche Derivate (I) mit m + m = 1 bis 3 enthalten, erwies sich der Stamm SE 50/110 (CBS 674.73).

Dieser Stamm ergibt Ausbeuten an niedermolekularen Aminozucker-Derivaten, die etwa zweimal so gross sind, wie die mit dem Stamm SE 50/13 (CBS 614.71) erhaltenen.

Die Züchtung der Mikroorganismen erfolgt im allgemeinen bei Bebrütungstemperaturen zwischen 15 bis 45 °C, vorzugsweise zwischen 24 bis 32 °C. So erhält man bei Verwendung der Stämme SE 50 (CBS 961.70) oder SE 50/13 (CBS 614.71) Aminozucker-Derivate (I) mit m + n2 = 4 bis 8 bei einer höheren Temperatur, z. B. 28 °C, während bei niedrigen Temperaturen z. B. 24 °C, beispielsweise die Stämme SE 50 (CBS 961.70) und SE 50/110 (CBS 674.73) in überwiegendem Masse Aminozuckerderivate (I) mit m + n2 = 1 bis 3 bilden.

Die Kulturdauer beträgt im allgemeinen 1 bis 8 Tage, vorzugsweise 2 bis 6 Tage. Eine längere Kulturdauer, insbesondere in Verbindung mit Kohlenhydratüberschuss im Nährmedium, begünstigt die Bildung von Aminozucker-Derivaten (I) mit höheren Werten von m + m.

Der pH-Wert des Kulturmediums variiert im allgemeinen zwischen 5,0 bis 8,5, wobei pH-Werte von 6,0 bis 7,0 bevorzugt werden.

Der Endpunkt der Fermentation erfolgt im allgemeinen durch Bestimmung des Gehaltes an Hemmaktivität im enzymatischen Hemmtest sowie durch dünnschichtchromatografische Bestimmung der Zusammensetzung des Fermentationsmediums.

Im Falle der chemischen Hydrolyse höhermolekularer Aminozucker-Derivate zur Herstellung von niedermolekularen wie bereits vorstehend erwähnt, geht man im allgemeinen in der Weise vor, dass man die höhermolekularen Aminozucker-Deri-vate mit 1 bis 5 normalen wässrigen Mineralsäuren bei Temperaturen von 50 bis 100 °C, insbesondere von 90 bis 100 °C 10 bis 180 Minuten behandelt. Die ebenfalls mögliche enzymatische Hydrolyse erfolgt im allgemeinen durch Inkubation mit Enzymen (Hydrolasen), insbesondere mit ß-Amylasen oder nicht hemmbaren a-Amylasen oder Amyloglucosidasen mikrobiellen Ursprungs, wie beispielsweise a-Amylasen aus B. subtilis, oder durch Inkubation mit Mikroorganismen, die in Nährlösungen, welche die höhermolekularen Aminozucker-Derivate in Gehalten von 1 bis 10%, vorzugsweise 2 bis 5% als vorzugsweise alleinige Kohlenstoffquelle enthalten, zu wachsen vermögen, beispielsweise Aspergillus niger (ATTC11.394).

Die Auftrennung und Isolierung der einzelnen erfindungsgemäss erhaltenen Aminozuckerderivate geht aus entweder von den mikrobiologischen Kulturbrühen oder von den Hydro-lysaten bzw. Inkubationsgemischen, in denen der enzymatische und/oder mikrobiologische Abbau der höhermolekularen Aminozucker-Derivate durchgeführt wurde.

Je nach den Werten für m + m erfolgt die Aufarbeitung in unterschiedlicher Weise. So geht man zur Reindarstellung der

5

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Aminozucker-Derivate von m + n2 = 1 bis 4 im allgemeinen in der Weise vor, dass man, gegebenenfalls nach vorheriger Abtrennung des Mycels, die betreffende Kulturbrühe oder das Hydrolysat mit Aktivkohle bei neutralem pH behandelt, anschliessend die so an die Aktivkohle gebundenen Aminozuk-ker-Derivate durch Behandlung der Aktivkohle mit wässrigen Alkoholen oder Aceton, vorzugsweise 50- bis 80%igem Aceton, desorbiert. Besonders vollständig gelingt dabei die Desorption bei sauren pH-Werten im Bereich von pH 1,5 bis 4, vorzugsweise von pH 2 bis 3.

Falls die aufzutrennenden Kulturbrühen bzw. Hydrolysate sehr dunkel gefärbt sind, hat es sich als vorteilhaft erwiesen, sie vor der vorstehend beschriebenen Behandlung mit Aktivkohle bei saurem pH zunächst mit Aktivkohle oder Absorbtionshar-zen wie dem handelsüblichen Lewapol Ca 9221 (0,35 mm Körnung, Bayer AG) bei pH-Werten von pH 2 bis 6, vorzugsweise 2 bis 3 zu behandeln und so eine Entfärbung zu erreichen. Die Aktivkohle bindet dabei im sauren Bereich bevorzugt nur die Farbstoffe, nicht jedoch die Aminozucker-Derivate.

Die Auftrennung der einzelnen erfindungsgemäss erhaltenen Aminozucker-Derivate aus dem wie vorstehend beschrieben erhaltenen Aktivkohle-Desorbat erfolgt dann im allgemeinen in der Weise, dass man dieses Desorbat über an sich bekannte stark saure Kationenaustauscher wie z. B. Dowex 50 W (Fa. Dow Chemicals) leitet (pH 1 bis 8, vorzugsweise pH 2 bis 4; bei niedriger Ionenstärke, entsprechend einer Leitfähigkeit < 10mS-cm-*, vorzugsweise < 2mS*cm_1)-Die einzelnen Aminozucker-Derivate werden dabei an den Kationenaustauscher gebunden. Besonders vorteilhaft lassen sich dabei die Aminozucker-Derivate aus acetonischer Lösung (50 bis 80% Aceton, pH 1 bis 5, vorzugsweise pH 2 bis 4) an solche Kationenaustauscher binden.

Die selektive Desorption der erfindungsgemäss hergestellten Aminozucker-Derivate von diesen Kationenaustauschern erfolgt dann im allgemeinen unter Verwendung von wässrigen Säuren oder Basen als Elutionsmittel, wobei man vorzugsweise Ammoniak oder Salzsäure in Konzentrationen von 0,01 bis 1 Val/Liter verwendet.

Aus den einzelnen Desorbaten wird dann das betreffende Aminozucker-Derivat nach Neutralisierung des Desorbats mit einem schwach sauren bzw. basischen Austauscher oder nach Entfernen der Base bzw. Säure durch Abziehen im Vakuum im Falle von flüchtigen Basen oder Säuren nach Einengen der Lösung durch Lyophilisation oder Fällung mit organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise mit Aceton erhalten.

Weiterhin ist es möglich, niedermolekulare Aminozucker-Derivate von inerten Sacchariden durch Chromatographie an Austauschern auf Cellulosebasis, vorzugsweise Phosphor-Cel-lulose (Fa. Serva, Heidelberg), abzutrennen. Als Laufmittel werden dabei Puffer, vorzugsweise Phosphatpuffer, von geringer Ionenstärke, vorzugsweise 2 bis 100 mM, insbesondere 5 bis 10 mM, im pH-Bereich von 2,5 bis 8, vorzugsweise 5 bis 6, verwendet. Voraussetzung für eine effektive Fraktionierung sind dabei möglichst geringe Salzgehalte in den zu fraktionierenden Präparationen, deren Farbstoffe weniger stören.

Zur Reindarstellung der einzelnen Aminozucker-Derivate chromatographiert man dann die vorgereinigten Präparate, über ein geeignetes Molekularsieb, z. B. Bio-Gel P-2 (Fa. Bio-Rad, München) und untersucht die Fraktionen des Eluates dünnschichtchromatographisch. Fraktionen, welche die erfin-dungsgemässen Verbindungen rein enthalten, werden vereinigt, rechromatographiert und schliesslich nach Einengen lyophilisiert oder mittels organischer Lösungsmittel, wie oben beschrieben, gefällt.

Alle Aminozucker-Derivate sind dadurch gekennzeichnet, dass bei saurer Totalhydrolyse «Komponente I» [C13H21O7N] sowie Glucose gebildet werden. Für «Komponente I» wurde nachstehende Strukturformel hergeleitet:

oh ho

0h h-c-oh t

«Komponente I»

Das Anfangsglied der Aminozucker-Derivate der vorliegenden Erfindung besitzt eine Glucoseeinheit. Diese Verbindung ist eine farblose, amorphe Sustanz mit guter Löslichkeit in Wasser, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Methanol und heissem Äthanol. Bei Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Essigester, Methanol und Wasser in einem Verhältnis von 10:6:4 zeigte die Verbindung einen RpWert von 0,46 (Maltose = 0,50 und Glucose = 0,65) auf F1500 Kieselgelfolien [Schleicher & Schüll] und von 0,47 (Maltose = 0,54 und Glucose = 0,66) auf F 254 Kieselgelplatten [Merck, Darmstadt].

Bei Anwendung eines Silbernitrat/Natriumhydroxid-Sprüh-reagens erhält man eine braun-schwarze Anfärbung bei Raumtemperatur oder nach geringfügigem Erwärmen.

Die Verbindung wurde zusammen mit D-Glucose oder Saccharose als Standards in einem Gemisch aus Pyridin (1), Trime-thylchlorsilan (0,5) und N-Methyl-trimethyl-silyltrifluoraceta-mid (1) silyliert und anschliessend der Gaschromatographie in einer 1,8 m Glassäule, gefüllt mit 3% SE 30 Silikon-Elastomer [Packard] auf Chromosorb WAW, unterzogen.

Die Einspritz- und Detektortemperatur lag bei 300 °C. Die Ofentemperatur betrug 220 °C, isotherm bis zur Elution der a-und ß-D-Glucose-Standards. Anschliessend wurde die Temperatur bei einer Geschwindigkeit von 15 "C/Minute bis auf 300 °C erhöht.

Ein Flammenionisationsdetektor wurde verwendet, wobei Stickstoff als Trägergas bei 40 ml/Minute, Luft als Verbrennungsgas bei 80 ml/Minute und Wasserstoff bei 20 ml/Minute eingeführt wurden. Die Verbindung wies eine Retentionszeit von 16-17 Minuten auf; (a-D-glucose = 3 Minuten, ß-D-Glucose = 4 Minuten und Saccharose =12-13 Minuten.

Eine durch Einengen einer methanolischen Lösung gewonnene, nicht kristalline Probe der Verbindung wurde in Wasser gelöst und die spezifische optische Drehung zu [a]o = +134,3° bestimmt.

Das NMR-spektrum in CD3OD bei 220 MHz zeigt Figur 1 (Abszisse = ô ppm).

Vorherrschende Merkmale des NMR-Spektrums zeigt die folgende Tabelle 1:

Tabelle 1

8 in ppm Multiplizität relative Intensität

1,3

Dublett; J = 6,5 Hz

3 H

2,3

«Triplett», ]i und J2 8-10 Hz

IH

3,15

«Triplett»; Ji und J2 7-9 Hz

IH

3,3-3,9

Signale sind nicht einzeln

12 H

zuzuordnen!

4,13

AB-System; J = 12 Hz

2 H

4,48

Dublett; J = 7 Hz

1 H

5,1

Dublett; J = 2,5 Hz

4,9

Singlett

11 H

Deuterium ausgetauschte Protonen

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

633043

Ô in ppm Multiplizität relative Intensität

5,0

Dublett; J =

2-3 Hz (schlecht

1 H

aufgelöst)

5,8

Dublett; J =

3-4 Hz (schlecht

1 H

aufgelöst)

33 H

Wenn man diese Verbindung in einem 1:1-Gemisch aus Acetanhydrid und Pyridin bei Raumtemperatur umsetzt, erhält man ein Dekaacetylderivat (Molgewicht: 903). Das NMR-Spek-trum des Dekaacetylderivats zeigt Fig. 2.

Wird die Reaktion in Eisessig/Acetanhydrid 1:1 mit katalyti-schen Mengen H2SO4 durchgeführt, so lässt sich neben dem Dekaacetylderivat auch die Bildung eines Undekaacetylderi-vats (Molgewicht: 945) massenspektroskopisch nachweisen.

Das Massenspektrum des Dekaacetylderivats zeigt einen Molekelpeak bei 903 (2,5% rei. Intensität) und einen Basepeak bei 843. Wichtige Fragmentpeaks im oberen Massenbereich sind 844 (55% r.I.), 784 (36% r.I.) 783 (34% r.I.), 759 (34% r.I.), 556 (36% r.I.), 496 (37% r.I.) und 436 (29% r.I.).

Die Methylierung mit CH3J / NaH in Dimethylsulfoxid nach Hakomori ergibt als Hauptprodukt das Dekamethylderivat, in geringer Menge auch das Undekamethylderivat.

Das Massenspektrum zeigt einen Molekelpeak bei 623 5 (6,1% rei. Intensität) und einen Basepeak bei 535. Ein zweiter Molekelpeak wird bei 637 (0,2% rei. Intensität) beobachtet.

Spektroskopische Daten und chemische Eigenschaften ergeben die folgende Struktur für diese Verbindung ii a

15 ch2oh h 0'

Insbesondere zeigt das NMR-Spektrum, dass dieser Verbindung IIa die Struktur einer 0-14,6-Bisdesoxy4-[lS-(l,4,6/5)4,5,6-20 trihydroxy-3-hydroxymethylcyclohex-2-en-l-ylamino]-a-D-glu-copyranosylH 1 -*4)-D-glucopyranose der konformativen Formel

HOCH

IIB

CH20H

zukommt.

Das nächste Glied der Reihe (m + m = 2) besitzt die allgemeine Zusammensetzung C25H43O18N und ist ein gut wasserlös- 45 liches amorphes Produkt. Bei der Dünnschichtchromatographie zeigt es einen RrWert von 0,35 auf F1500 Kieselgelfolien und 0,33 auf F 254 Kieselgelplatten unter Anwendung des oben beschriebenen Systems.

Die optische Rotation in Wasser [a]d ist + 167,0°.

Das NMR-Spektrum in D2O bei 220 MHZ zeigt Fig. 3 und das 13C-NMR-Spektrum die Fig. 4.

Die Methylierung, wie oben beschrieben, liefert eine 13fach methylierte Verbindung, in geringer Menge auch ein 14fach methyliertes Produkt.

Das Massenspektrum des Methylierungsproduktes zeigt einen Molekelpeak bei 827 (1,5% v.l.) und entspricht einer Summenformel C38H69NO18.

50

55

Mit 0,1% r.I. ist bei 841 ein zweiter Molekelpeak vorhanden. Die wichtigsten Fragmentpeaks sind:

739 (27% r.I.)

592( 3,7%r.I.)

535 (30% r.I.)

388( 9%r.I.)

386 (13% r.I.)

284 (13% r.I.)

187 (12% r.I.)

171 (40% r.I.)

101 (34% r.I.)

88 (25% r.I.)

75 Base peak

Aus den chemischen und spektroskopischen Eigenschaften ergibt sich folgende Struktur für diese Verbindung:

ch20h

CHoOl

IIIA

7

633043

wobei diesem zweiten Glied der Reihe der neuen Aminozuk- D-glycopyranosylH 1 —4)-0-a-D-glucopyranosyl-( 1 —4)-D-gluco-ker-Derivate (I) die Struktur einer 0-f4,6-Bisdesoxy-4-[lS-(l,4,6/ pyranose der konformativen Formel zukommt: 5>4,5,6-trihydroxy-3-hydroxymethylcyclohex-2-en-l-ylamino]-a-

Das nächsthöhere Glied der Reihe (m + m = 3) erhält man 30 Das in kleineren Mengen vorhandene Produkt ist die Vérin zwei isomeren Formen, wobei eine der beiden isomeren For- bindung 0-(4,6-Bisdesoxy-4-[l S-( 1,4,6/S)-4,5,6-trihydroxy-3-men überwiegend gebildet wird. hydroxymethylcyclohexy-2-en-l -ylamino]-a-D-glucopyranosyIl-

Bei saurer Teilhydrolyse lassen sich beide isomeren Verbin- (1 -*4)-Ó-a-D-glucopyranosyl-(l —4>0-a-D-glucopyranosyl-dungen in das erste Glied der Reihe (m + m = 1) und Glucose (1 —4>D-glycopyranose der konformativen Formel im Molverhältnis 1:2 spalten. 35

633043 8

Das in grösseren M engen vorhandene isomere Produkt ist 1 -ylamino]-a-D-glycopyranosylH 1 —4)-0-a-D-glucopyranosyl-die Verbindung CM4,6-Bisdesoxy-4-[l S-( 1,4,6/5)4,5,6-trihydroxy- ( 1 —4)-D-glucopyranose der konformativen Formel 3-hydroxymethyl-4-0-a-D-glucopyranosyl-( 1 —4>cyclohex-2-en-

CH20H

hchs>i—0

noJk '\

HOCH. a-0H

HO—^N.

CH20H

CH20H

Diese Isomere zeigen auf F-1500-Platten unter Verwendung von n-Butanol, Äthanol und Wasser im Verhältnis von 50:30:20 Rducose-Werte von 0,41 bis 0,46. Die Anwesenheit des Isomeren mit der in Formel V gezeigten Struktur lässt sich nachweisen, indem man die Produkte aus dem hydrierenden Abbau (Palla- to dium/Aktivkohle) analysiert. Es gehören zu diesen Abbauprodukten:

3-Hydroxymethyl4,5,6-trihydroxy-[4-0-a-D-glucopyranosyl-( 1 »cyclo-hexan, 0-(4-amino4,6-bisdexoxy-a-D-glucopyrano-

sylHl —-4)-0-a-D-glucopyranosyl-(l —<4)-D-glucopyranose und Glucose.

Da bei diesem Abbau die C-N-Bindung in Alkylstellung gespalten und die Hydrierung hydriert wird, ist es klar, dass diese Verbindung, die gegenüber der Verbindung der Formel IV isomer ist, mit der Verbindung der Formel III A oder III B strukturell verwandt ist; sie ist jedoch durch die Anwesenheit einer weiteren Glucopyranosylgruppe in 4-Stellung des Cyclo-hexenringes gekennzeichnet.

CH.0H CHS 0H N 0 0 OH

OH OH OH OH OH 0H

Pd/C/H« t

CH* OH CHa OH

H3

HO OH

CHS

CHa0H CHÄ0H

- 0 + 0

OH OH

OH OH

CHa0H

>- 0 -O-OH + IHO-^^-OH

OH OH OH OH \ OH OH

Die Anwesenheit des Isomeren mit der in Formel IV gezeigten Struktur wird durch die Bildung von Validatol und

0-<4-Amino4,6-bisdesoxy-a-D-glucopyranosylH 1 —4)-0-a-D-

9 633043

glucopyranosyKl -*>0-a-D-gIucopyranosyl-(l -*4)-D-glucopy-ranose bewiesen.

cha oh i chj cha oh cha oh cha0h oh 0h| oh oh oh oh oh oh oh oh cha0h chs cha0h cha oh

+ han-?^- 0 0 0

0 oh óh0h oh oh oh oh oh oh

-oh

In weiteren Untersuchungen wurden die Isomeren mit m + m = 3 nach bekannten Methoden methyliert, hydrolysiert, mit Natriumborhydrid reduziert, acetyliert und gaschromatogra-phisch analysiert. Während die Verbindung der Formel IV nur 1,4,5-Trio-0-acetyl-2,3,6-tri-0-methyl-D-glucitol ergibt, liefert die Verbindung der Formel V l,4,5-Tri-0-acetyI-2,3,6-tri-0-me-thyl-D-O-glucitol und l,5-Di-0-acetyl-2,3,4,6-tetra-0-methyI-D-glucitol im Molverhältnis von 2:1. Die Isomeren mit m + m = 3 der Formeln IV und V werden durch ß-Amylase nicht degradiert.

Die isomeren Verbindungen mit den Formeln IV und V wurden chromatographisch an einem sauren Austauschharz mit 0,025 n Salzsäure als Elutionsmittel getrennt.

Das Produkt mit m + n2 = 4 wurde am Pd/C-Kontakt hydriert. Die nicht basischen Hydrogenolyseprodukte wurden über saure Ionenaustauscher abgetrennt und durch präparative Dünnschichtchromatographie aufgetrennt. Nach Acetylierung wurden die beiden folgenden Pseudotrisaccharide massenspek-trometrisch als Hauptabbauprodukte identifiziert:

ch2oh ch2oh ce2oh.

HO OH OH OH OH OH (als Dekaacetat mit dem Molekelpeak bei m/e = 906)

Diese Struktur folgt auch als Ergebnis des Abbaus mit ß-Amylase, bei dem der überwiegende Teil der Komponente mit m + m = 4 zu der Verbindung der Formel III B und Maltose degradiert wird.

30 Die Komponente mit m + m = 5 verhält sich beim Abbau durch ß-Amylase wie folgt:

Etwa 90% werden zu einer Verbindung der Formel V und einer entsprechenden Menge an Maltose degradiert, daraus folgt, dass das Isomere mit einer glykosidisch an den Cyclitolrest 35 gebundenen Maltotrioseeinheit Hauptbestandteil des Produktes ist; ca. 10% werden von ß-Amylase nicht degradiert.

Die höheren Qlieder der Reihe, die 4 bis 8 Glucoseeinheiten mit Molgewichten von 969 bis 1617 enthalten, vermögen Sac-charase weniger zu hemmen. 40 Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von n-Butanol, Äthanol, Wasser im Verhältnis von 50:30:20 auf F 1500 Kieselgelplatten ergibt RGiUcose-Werte von 0,30-0,34 4 Glucoseeinheiten 0,21-0,23 5 Glucoseeinheiten 45 0,14-0,16 6 Glucoseeinheiten 0,09-0,11 7 Glucoseeinheiten

Wie bei den niederen Gliedern dieser Reihe ergibt die totale saure Hydrolyse «Komponente I» und Glucose in diskreten Molverhältnissen, nämlich 1:4,1:5,1:6,1:7 und 1:8 (wobei so die Glucoseprozentsätze 74,4%, 79,7%, 83,3%, 86,5% bzw. 89,1% sind).

Bei der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von F-1500-Kieselgelplatten mit n-Butanol, Äthanol, Wasser im Verhältnis von 45:35:20 als Lösungsmittel werden folgende Rr 55 Werte bei der dreifachen Entwicklung beobachtet:

ch2oh ch.

çh2oh

-£KK}

ho oh oh oh oh oh

(als Nonaacetat mit dem Molekelpeak bei m/e = 848)

Bei weitem überwiegender Hauptbestandteil von Kompo- 65 nente 5 ist daher das Isomere der konformativen Formel VI, 4:1 mit einer glykosidisch an den Cyclitolrest gebundenen Maltoseeinheit. 5:1

Verhältnis

Glucose:Komponente I

Standard

RrWert

Glucose

Maltose

Maltotriose

Maltotetraose

Maltopentaose

Maltohexaose

0,77 0,65 0,51 0,39 0,27 0,25 0,21 0,18

633043

10

Verhältnis Standard RpWert

Glucose:Komponente I

Maltoheptaose 0,15

6:1 0,13

Maltooctaose 0,11

7:1 0,09

8:1 0,07

Ebenfalls zeigt die oben beschriebene katalytische Hydrierung, dass einige aber nicht alle Glucoseeinheiten dieser höheren Glieder in 4-Stellung der Cyclohexengruppe gebunden sind.

Da diese Verbindungen lineare Oligoglucosidketten mit 1 —4-Bindungen enthalten, können sie als Substrate für gewisse kohlenhydrat-abbauende Enzyme Verwendung finden. Der Bereich der Enzyme ist offenbar auf solche beschränkt, die nicht wesentlich durch die Verbindungen gehemmt werden.

Bakterielle und pilzartige a-Amylasen können zum Abbau jeder Oligoglucosidkette verwendet werden, die 3 oder mehr Glucoseeinheiten enthalten und niedermolekulare Verbindungen und inerte Saccharidfragmente wie z. B. Maltose und Mal-totriose ergeben. Dieses Abbauverfahren ist auf die Verbindungen mit m + m ^ 3 anwendbar und stellt einen weiteren Beweis für die a, 1—4-Bindung dar. Erfindungsgemässe Verbindungen mit 4-bis 7-Glucoseeinheiten sind auch teilweise durch ß-Amylase abbaubar. Da ß-Amylase-Maltoseeinheiten von dem nicht-reduzierenden Ende einer Glucosekette mit a, 1 -»4-Bindungen abspaltet, liefert sorgfältige Analyse der ß-Amylaseabbaupro-dukte wertvolle Information über jeden an der 4-Stellung des Cyclohexenrings gebundenen Oligoglucosidsubstituenten, insbesondere über seine Kettenlänge, und die Zahl der Glucosen in der an der Bisdesoxyglucose gebundenen Kette, d. h. in dem reduzierenden Ende der Verbindung. Die 4,5,6,7- oder 8-Gluco-seeinheiten enthaltenden Verbindungen sind jedoch nicht völlig abbaubar durch ß-Amylase. Der Resistenz eines Teils der Verbindungen ist offensichtlich unzureichenden Strukturbedingungen für den ß-Amylaseangriff zuzuschreiben.

Die Ergebnisse des ß-Amylaseabbaus können folgender-massen zusammengefasst werden.

Zahl der Glucoseeinheiten

Zahl der Glucoseeinheiten entfernte im Ausgangsmaterial in Abbauprodukten

Maltoseeinheiten

4

4

0

2

1

5

5

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3

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6

6

0

4

1

2

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7

7

0

5

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3

2

8

8

0

6

1

4

2

2

3

Gegebenenfalls wird ein Teil des Ausgangsmaterials wiedergewonnen.

Bezüglich des ß-amylolytischen Abbaus soll nochmals betont werden, dass ß-Amylase nur Maltoseeinheiten zu entfernen vermag und diese auch nur von dem nicht-reduzierten Ende eines Oligosaccharids. Es soll vermieden werden, dass irgendeine Theorie zu einer Einschänkung führt. Obwohl die genaue Struktur dieser höheren Verbindungen nicht völlig geklärt ist, ist nach obigen Befunden zu folgern, dass zu den Verbindungen mit 4,5,6,7- und 8-Glucoseeinheiten Derivate der niederen Verbindung mit der Formel III A gehören, welche Ketten mit 2,3,4,5- und 6-Glucoseeinheiten enthalten, die a, 1 —4 miteinander verbunden sind, wobei die Oligosaccharidkette in a-Konformation mit der 4-Stellung des Cyclohexenringes verbunden ist.

Methylierung der Verbindungen mit Methyljodid/Natrium-hydrid in Dimethylsulfoxid, totale Hydrolyse, Derivatisierung und anschliessende gaschromatographische Analyse ergibt das 2,3,6-Trimethylglucosederivat, so dass die Glucoseeinheiten notwendigerweise 1—4 in einer ausschliesslich linearen Struktur verbunden sind.

Ein zweites Methylierungsprodukt, welches in Abhängigkeit von der methylierten Verbindung in verschiedenem Masse oder unter Umständen gar nicht vorhanden ist, ist das 2,3,4,6-Tetramethylderivat. Das Vorkommen dieses Derivats und sein Molverhältnis zu dem Trimethylderivat ist abhängig von dem an dem Cyclohexenring gebundenen Substituenten.

Es ist bekannt, dass bei Tieren und Menschen nach Aufnahme von kohlenhydrathaltigen Nahrungsmitteln und Getränken (z. B. Getreide-, Kartoffelstärke, Obst, Fruchtsaft, Bier, Schokolade) Hyperglykämien auftreten, die infolge eines raschen Abbaus der Kohlenhydrate durch Glykosidhydrolasen (z. B. Speichel- und Pankreasamylasen, Maltasen, Saccharasen) nach folgendem Schema

Amylase Maltase

Stärke bzw. Glykogen *■ Maltose »'Glucose

Saccharase

Saccharose ** Glucose + Fruktose bewirkt werden. Diese Hyperglykämien sind bei Diabetikern besonders stark und anhaltend ausgeprägt. Bei Adipösen bewirkt die alimentäre Hyperglykämie oftmals eine besonders starke Sekretion von Insulin, das seinerseits zu vermehrtem Fettaufbau und vermindertem Fettabbau führt. Im Anschluss an derartige Hyperglykämien tritt bei stoffwechselgesunden und adipösen Personen infolge der Insulinsekretion häufig eine Hypoglykämie auf. Bekannt ist, dass sowohl Hypoglykämien als auch im Magen verweilender Speisebrei die Produktion von Magensaft fördern, der seinerseits die Entstehung einer Gastritis, eines Ulcus ventriculi oder duodeni auslöst oder begünstigt.

Es wurde nun gefunden, dass die erfindungsgemäss erhaltenen Aminozuckerderivate die alimentäre Hyperglykämie, Hyperinsulinämie und Hypoglykämie, besonders auch die reaktive postprandiale Hypoglykämie, erheblich vermindern.

Ferner ist bekannt, dass in der Mundhöhle Kohlenhydrate, besonders Saccharose, durch Mikroorganismen gespalten werden und dadurch die Kariesbildung gefördert wird.

Die erfindungsgemäss hergestellten Aminozuckerderivate können zur Verhinderung bzw. Verminderung einer solchen Kariesbildung eingesetzt werden.

In-vitro-Amylasetest

Eine Amylase-Inhibitor-Einheit (1 AIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Amylaseeinheiten zu 50% inhibiert. Eine Amylaseeinheit (AE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 p. Äquivalent glucosidischer Bindungen in der Stärke spaltet. Die |j.Val gespaltenen Bindungen werden als n-Val gebildeter reduzierender Zucker mit Dinitrosalicylsäure kolorimetrisch bestimmt und mit Hilfe einer Maltoseeichkurve als (iVal-Malto-seäquivalente angegeben. Zur Durchführung des Testes werden 0,1 ml Amylaselösung (20-22 AE/ml) mit 0-10 ng Inhibitor oder 0-20 jj.1 der zu testenden Lösung in 0,4 ml 0,02m Natrium-glycerophosphatpuffer/0,001m CaCh pH 6,9 versetzt und etwa 10-20 Minuten in einem Wasserbad von 35 °C äquilibriert.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

11

633043

Dann wird 5 Minuten mit 0,5 ml einer auf 35 °C vorgewärmten 1% Stärkelösung (Stärke, löslich, der Firma Merck, Darmstadt, Nr. 1252) bei 35 °C inkubiert und anschliessend mit 1 ml Dini-trosalicylsäure-Reagens (nach P. Bernfeld in Colowick-Kaplan, Meth. Enzymol., Band 1, Seite 149) versetzt. Zur Farbentwicklung wird der Ansatz 5 Minuten auf dem siedenden Wasserbad erhitzt, dann abgekühlt und mit 10 ml destilliertem Wasser versetzt. Die Extinktion bei 540 nm wird gegen einen entsprechend angesetzten Leerwert ohne Amylase gemessen. Zur Auswertung wird aus einer vorher aufgenommenen Amylaseeich-kurve die nach Inhibitorzusatz noch wirksame Amylaseaktivi-tät abgelesen und daraus die prozentuale Hemmung der eingesetzten Amylase errechnet. Die prozentuale Hemmung wird als Funktion des Quotienten

[ig Inhibitor*

AE**

* bezogen auf Trockensubstanz

** AE im nicht inhibierten Ansatz der gleichen Serie aufgetragen, der 50% Hemmungspunkt aus der Kurve abgelesen und auf EIE/mg Inhibitor umgerechnet.

In -vitro-Saccharasetest

Eine Saccharase-Inhibitor-Einheit (SIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Saccharaseeinheiten zu 50% inhibiert. Eine Saccharaseeinheit(SE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 n.Mol Saccharose in Glucose und Fructose spaltet. Die p.Mol gebildete Glucose werden mit Hilfe der Glucoseoxidasereak-tion quantitativ bestimmt unter Bedingungen, bei denen eine weitere Saccharosespaltung durch die Saccharase nicht mehr stattfindet. Zur Durchführung des Testes werden 0,05 ml einer auf 0,12 SE eingestellten Saccharaselösung [Solubilisierte Saccharase aus Schweinedünndarmmucosa nach B. Borgström, A. Dahlquist, Acta Chem. Scand. 12 (1958), Seite 1997. Mit 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 auf entsprechenden SE-Gehalt verdünnt.] mit 0-20 \ig Inhibitor oder 0-20 p.1 der zu testenden Lösung versetzt und mit 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 auf 0,1 ml aufgefüllt. Es wird 10 Minuten bei 35 °C äquilibriert und dann mit 0,1 ml einer auf 35 °C vorgewärmten 0,05 m Saccharoselösung in 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 versetzt. Man inkubiert 20 Minuten bei 35 °C und stoppt die Saccharase-reaktion durch Zugabe von 1 ml Glucoseoxidasereagens [Das Glucoseoxidasereagens wird durch Lösen von 2 mg Glucoseo-xidase (Fa. Boehringer, Reinheitsgrad I) in 100 ml 0,565 m Tris-HCl-Puffer pH 7,0 und anschliessenden Zusatz von 1 ml Deter-genslösung (2 g Triton X 100 + 8 g 95% Äthanol p.a.), 1 ml Dia-nisidinlösung (260 mg o-Dianisidin • 2 HCl in 20 ml H2O) und 0,5 ml 0,l%iger wässriger Peroxidaselösung (Fa. Boehringer; Lyophilisat, Reinheitsgrad II) hergestellt.] ab und inkubiert weitere 30 Minuten bei 35 °C. Danach wird 1 ml 50% H2SO4 zugesetzt und bei 545 nm gegen einen entsprechenden Leerwert gemessen. Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzten Saccharase berechnet und aus dem 50% Hemmpunkt mit Hilfe einer Glucoseeichkurve auf SIE/g bzw. SIE/Liter umgerechnet.

Maltasetest

Eine Maltase-Inhibitor-Einheit (MIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Maltaseeinheiten zu 50% inhibiert. Eine Maltaseeinheit (ME) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unen angegebenen Testbedingungen 1 pMol Maltose in 2 jiMol Glucose spaltet. Die |iMol gebildete Glucose werden mit Hilfe der Glucoseoxidasereaktion quantitativ bestimmt unter Bedingungen, bei denen eine weitere Maltosespaltung durch die Maltase nicht mehr stattfindet. Zur Durchführung des Testes werden 0,05 ml einer auf 0,060-0,070 ME eingestellten Maltaselösung [Solubilisierte Maltase aus Schweinedünndarmmucosa nach B. Borgström, A. Dahlquist, Acta Chem. Scand. 12,(1958), Seite 1997.MitO,l m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 auf entsprechenden ME-Gehalt verdünnt.] mit 0-20 jxg Inhibitor oder 0-20 |il der zu testenden Lösung versetzt und mit 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 auf 0,1 ml aufgefüllt. Es wird 10 Minuten bei 35 °C äquilibriert und dann mit 0,1 ml einer auf 35 °C vorgewärmten 0,05 m Maltoselösung in 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 versetzt. Man inkubiert 20 Minuten bei 35 °C und stoppt die Maltasereaktion durch Zugabe von 1 ml Glucoseoxidasereagens [Bereitung des Glucoseoxidasereagens: wie beim Saccharasetest, S. 30, Fussnote 2), beschrieben.] ab und inkubiert weitere 30 Minuten bei 35 °C. Danach wird 1 ml 50% H2SO4 zugesetzt und bei 545 nm gegen einen entsprechenden Leerwert gemessen.

Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzten Maltase berechnet und aus dem 50% Hemmpunkt mit Hilfe einer Glucoseeichkurve auf MIE/g bzw. MIE/Liter umgerechnet.

Die Ergebnisse der In-vitro-Enzymhemmtests für einzelne der erfindungsgemässen Aminozuckerderivate sind in nachstehender Tabelle II zusammengefasst:

Tabelle II

For

Zahl der a-Amylase

Saccharase

Maltase-Inhi-

mel

Glucoseeinhei

Inhibition inhibition bition

ten

AIE/g

SIE/g

MIE/g

IIB

1

300000

30000

5 000

HIB

2

300000

68 000

15 000

V

3

1 400 000

21000

5 000

4-6

17 500000

8500

-

5-7

30000000

2 000

-

Wie aus der Tabelle ersichtlich, steigt die spez. In-vitro-Hemmaktivität gegenüber Pankreas-a-Amylase mit zunehmendem Molekulargewicht der Reihe stark an; so zeigen die Verbindungen mit 5-7 Glucoseeinheiten eine lOOfach stärkere Enzymhemmung in vitro als die Verbindung mit 1 oder 2 Einheiten. Die Saccharaseinhibition ist bei dem Derivat mit 2 Einheiten am stärksten ausgeprägt, das Derivat mit 1 Glucoseein-heit hemmt nur noch halb so stark, und das höhere Glied zeigt eine weiter abfallende spezifische Aktivität der Saccharase-hemmung.

In vivo läuft die Wirksamkeit in der Saccharasehemmung der in vitro gefundenen spez. Hemmaktivität in etwa parallel. Dagegen wurde überraschenderweise beim Stärkebelastungstest in vivo für die Verbindungen mit 1,2 oder 3 Glucoseeinheiten eine im Vergleich zur Amylasehemmung in vitro 10-40fach gesteigerte Wirksamkeit gefunden.

Zur Erzeugung einer alimentären Hyperglykämie und Hyperinsulinämie erhielten Gruppen mit jeweils 6 nüchternen Ratten a) 2,5 Saccharose,

b) 2,5 g Maltose oder c) 1 g gekochte Stärke p.os in wässriger Lösung oder als Suspension appliziert. 6 andere Ratten erhalten die genannten Kohlenhydrate in der gleichen Menge und zusätzlich einen Glucosidhydrolaseinhibi-tor in der angegebenen Dosierung.

Weiterhin erhalten 6 andere Ratten eine entsprechende Menge Salzlösung.

Blutglucose und Seruminsulin wurden in kurzen zeitlichen Abständen im Blut aus dem retroorbitalen Venenplexus gemessen. Die Blutglucosebestimmungen werden im Auto-Analyzer [Technicon® nach Hoffman: ]. biol. Chem. 120,51 (1937) oder

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

633043 12

enzymatisch mit Glucoseoxydase und o-Dianisidinhydrochlo- Die Ergebnisse der In-vivo-Saccharaseinhibition (Saccharo-

rid), die Seruminsulinbestimmungen nach der Methode von severabreichung) in der nüchternen Ratte gibt die folgende

Haies und Rändle: Biochem. J. 88,137 (1963)] ausgeführt. Tabelle III:

Tabelle III

Blutglucose in mg % (Mittelwert + Abw.)

Formel n Dosis (SIE) 15 Min. 30 Min. 45 Min. 60 Min

Salzlösung

69±5,2

84 ±3,9

91 ±5,9

-

Saccharose (Kontrolle)

117+11

135±8,1

152± 18

-

Saccharose+50 SIE

105 ±11

123 ±5,2*

128± 11*

-

Saccharose+100 SIE

89±6,5***

111 ±4,1***

116±3,9***

-

Saccharose+200 SIE

72±4,6***

95+9,1***

104±9,6***

-

Salzlösung

55 ±4,5

92±8,5

95 ±6,4

-

Saccharose (Kontrolle)

113±9,9

126±20

127±14

-

Saccarose+25 SIE

71 ±3,7***

100±7,3*

107 ±2,4**

-

Saccarose+100 SIE

58±5,9***

92 ±4,0**

98±5,0***

-

Salzlösung

66 ±4,6

73±4,3

76±3,9

-

Saccarose (Kontrolle)

122 ±6,6

125+16,0

128±14,8

-

Saccarose+25 SIE

88± 11,4**

101 ±12,0*

104±7,4**

Saccharose+50 SIE

91 ±9,4**

106 ±7,0*

94±9,0***

-

Saccharose +100 SIE

81 ±7,2**

90±8,0***

97±1,6***

-

Salzlösung

58 ±2,9

49 ±3,3

54±4,8

63±5,0

Saccharose (Kontrolle)

107 ±11

121 ±6,0

132± 16

132 ±6,7

Saccharose+25 SIE

109 ±6,4

105±10**

112±9,1*

108±8,1

Saccharose+50 SIE

103±4,1

107 ± 15

102±7,7**

101 ±9,2'

Saccharose+100 SIE

85±8,1**

94±9,9***

95±8,5***

85 ±6,4

Salzlösung

58 ±2,9

49 ±3,3

54 ±4,8

63 ±5,0

Saccharose (Kontrolle)

107 ±11

121 ±6,0

132+16

132+6,7

Saccharose+75 SIE

102 ±11

108 ±9,6*

109±7,5**

101 ±7,9'

Saccharose+150SIE

92±7,0*

100±8,3***

109±3,7**

102 ±6,3'

Saccharose+300 SIE

95±8,1*

84 ±8,7***

93±9,0***

91 ±4,5'

* Wahrscheinlichkeit gegen Kontrolle mit Saccharose = <0,05

** Wahrscheinlichkeit gegen Kontrolle mit Saccharose = <0,01

*** Wahrscheinlichkeit gegen Kontrolle mit Saccharose = <0,001

Wie aus obigen Daten ersichtlich läuft die In-Vivo-Aktivität in der Saccharase-Inhibition der in vitro gefundenen Hemmaktivität parallel. So steigt die EDso, während die Saccharaseinhi-bitionseinheiten pro mg abnehmen. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle IV zusammengefasst:

Tabelle IV

Formel Glucoseein- Saccharaseinhibition heiten in vitro in vivo

SIE/mg (EDso mg/kg)

IIB (1) 30 3,00

HIB (2) 68 0,21

45 V (3) 21 2,65

(4-6) 8,5 -15,30

(5-7) 2,5 -52,00

50

Überraschenderweise ist die In-vivo-Inhibition des Stärkeabbaus durch die Verbindungen der Formel IIB, IIIB und V viel höher, als man anhand der in vitro gefundenen Daten für die Amylasehemmung erwartet hätte und entspricht also nicht dem erwarteten Muster. Die folgende Tabelle V gibt die wie oben ermittelten In-vivo-Daten für die nüchterne Ratte nach Verabreichung der Stärke wieder:

Tabelle V

For- Gluco-Dosis (AIE) Blutglucose in mg % (Mittelwert ± Abw.)

mei seein-heiten

5 Min. 10 Min. 15 Min. 20 Min. 30 Min. 45 Min.

IIB 1 Salzlösung 74±6,2 74±3,0

Stärke (Kontrolle) 101 ±8,8 135±13

Stärke+75 AIE 102±2,9 130±6,9

Stärke-I-150 AIE 98±8,7 116±9,0*

Stärke+300 AIE 87±13 106±1,8**

82 ±9,4 146±4,8 128±5,4*** 128±5,8*** 110±8,9***

71 ± 11 151 ±9,5 143± 11 127±4,8*** 111 ±2,1 ***

76±5,4 148± 18 125±11* 115±5,2** 108±5,3*

90±9,2 156± 19 132±18* 137±5,2** 121±7,2*

13

633043

For- Gluco-Dosis(AIE) Blutglucose in mg % (Mittelwert ± Abw.)

mei seein-heiten

5 Min. 10 Min. 15 Min. 20 Min. 30 Min. 45 Min.

IIIB 2

Salzlösung

61 ±3,7

68 ±3,9

83+5,3

75±8,7

91 ±5,2

84±1,5

Stärke (Kontrolle)

85±7,9

120±7,7

132 ±11

140± 12

135 ±5,0

128± 14

Stärke+150 AIE

82 ±7,5

105±4,2**

120 ±6,0*

124 ±7,0*

134±6,1

125 ±5,2

Stärke+300 AIE

79±8,2

97±2,7***

105±10**

118±6,7**

119±9,9**

130±5,9

Stärke+600 AIE

70±4,6**

80±8,8***

94±6,9***

91 ±16***

103±9,2***

102±4,2***

Stärke+1200 AIE

70±7,0**

84±7,7***

88±7,4***

97 ±5,2***

97±5,0***

100±4,3***

V 3

Salzlösung

52±2,3

75±7,9

57 ±3,7

78±9,6

82+6,5

70±6,9

Stärke (Kontrolle)

93 ±7,3

133± 12

127 ±9,3

152± 15

156± 15

124 ±7,7

Stärke+750 AIE

86 ±8,5

107±5,0***

117 ±8,7*

121 ± 12**

126± 11 ***

114±3,6***

Stärke+1500 AIE

77 ± 14*

92±9,6***

94±9,5***

113±9,7***

112±8,8***

111 ±4,2**

Stärke+3000 AIE

65±5,6***

101+3,3***

82± 11 ***

112±4,5***

109±6,4***

104±2,5***

4-6

Salzlösung

-

55±4,8

63 ±5,9

67 ±5,8

72±4,7

66 ±5,0

Stärke (Kontrolle)

-

103± 11

117 ±8,6

118±8,5

128 ±8,9

109 ±11

Stärke+6000 AIE

-

99 ±4,5

118±5,8

104±8,1*

123± 11

107 ±7,3

Stärke+12000 AIE

-

90±5,2*

98±8,2**

99±4,1***

117±6,7*

104±8,2

Stärke+24000 AIE

-

74±5,5***

82±2,9***

83±3,7***

96±6,6***

85±6,4**

5-7

Salzlösung

-

55±4,8

63 ±5,9

67 ±5,8

72±4,7

66 ±5,0

Stärke (Kontrolle)

-

103± 11

117 ± 8,6

118±8,5

128 ±8,9

109±11

Stärke+6000 AIE

-

95 ±4,3

107±3,3*

102+5,5**

111 ±3,0**

102 ±6,7

Stärke+12000 AIE

-

87 ±8,6*

94±8,8**

89±8,5***

98±8,3***

91 ±4,3**

Stärke+24000 AIE

-

74±8,9***

84±7,2***

84±6,9***

85+6,5***

85±4,9**

* Wahrscheinlichkeit gegen Kontrolle mit Stärke = <0,05 ** Wahrscheinlichkeit gegen Kontrolle mit Stärke = <0,01 *** Wahrscheinlichkeit gegen Kontrolle mit Stärke = <0,001

Aus obigen Daten ist ersichtlich, dass, während sich der Grad der Saccharaseinhibition sowohl in vitro als auch in vivo als eine deutliche Funktion des Molekulargewichtes erweist, die Amylaseinhibition nur in vitro abhängig vom Molekulargewicht ist, während in vivo die Inhibition des Stärkeabbaus mit dem fallenden Molekulargewicht nicht abnimmt, sondern überraschenderweise konstant bleibt.

Obwohl also die In-vivo-Amylasehemmaktivität mit dem Molgewicht abnimmt, sind die EDso-Werte der Stärkeverdauungshemmung für alle erfindungsgemässen Verbindungen im wesentlichen gleich. Dies ist in der folgenden Tabelle VI zusam-mengefasst:

Tabelle VI

Tabelle VII

Dosis

Blutglucose in mg % (Mittelwert ± Abw.) 15 Min. 30 Min. 45 Min.

72+4,6 78+1,3 142± 12 142 ±12

Salzlösung Glucose 35 (Kontrolle)

Glucose+30 135±13 128±5,5 mg

Glucose+60 125± 13* 118±2,9* mg

87 ±6,8 158± 19

132 ±7,3

130±9,0***

a-Amylaseinhibition

Stärkeverdauungsinhibi

tion

For

Glucoseein in vitro in vivo mel heiten

AIE/mg

(EDso mg/kg)

IIB

(1)

300

0,76

IIIB

(2)

300

1,60

V

(3)

1400

1,61

-

(4-6)

17500

1,42

-

(5-7)

30000

1,00

* Wahrscheinlichkeit gegen Kontrolle mit Glucose = 0,05 ** Wahrscheinlichkeit gegen Kontrolle mit Glucose = 0,01

Reinigung des Gemisches der höheren Glieder dieser 45 Reihe und Anwendung in reiner Form führt unerwarteterweise zu noch höherer Aktivität und Spezifität. Dies lässt sich durch einen Vergleich der in Tabelle II angegebenen a-Amylase- und Saccharase-In-vitro-Hemmdaten mit den in folgender Tabelle VIII angegebenen Daten für die reinen Verbindungen belegen:

50

Tabelle VIII

Es ist also überraschenderweise möglich, mit den Verbindungen IIB, HIB und V eine Hemmung der Saccharose- und Stärkeverdauung gleichzeitig zu erreichen, und zwar bei einer präzisen, vorhersehbaren und charakteristischen Dosis.

Die Verbindungen besitzen darüber hinaus eine vorteilhafte Wirkung im Hinblick auf Glucoseabsorption. Dies ist ersichtlich aus den folgenden Daten in Tabelle VII (Experimente mit hungernden Ratten) für die Verbindung der Formel HIB (m = 2).

60

Zahl der a-Amylase-Inhibition

Saccharase-Inhibition

Glucoseeinheiten

AIE/g

SIE/g

4

67 000000

7000

5

57 000 000

3500

6

42 000000

1200

7

24 000000

60

8

5 000000

10

Die vorhergehenden Ergebnisse zeigen die hohe Aktivität der Verbindung mit 4 Glucoseeinheiten in der Rolle eines a-Amylaseinhibitors. Auch die Verbindungen mit 5 und 6 Ein-65 heiten zeigen wesentlich höhere spezifische Inhibitoraktivität als bei bisher bekannten Präparaten gefunden wurde. Eine Abnahme der Inhibitoraktivität tritt mit zunehmendem Molekulargewicht auf, wie bei den Verbindungen mit 7 und 8 Gluco-

633043 14

seeinheiten zu sehen ist, obgleich diese noch erhebliche Hemm- Die Anfertigung der Tabletten erfolgt zum Beispiel durch aktivität zeigen. In-vitro-Saccharaseinhibition scheint in Herstellung einer Pulvermischung, grob oder feinkörnig, und umgekehrter Abhängigkeit von dem Molekulargewicht zu ste- Hinzufügung eines Gleitmittels und Desintegrators. Aus dieser hen. Die Verbindung mit 4 Glucoseeinheiten weist etwa '/io der Mischung formt man Tabletten. Eine Pulvermischung bereitet spezifischen Aktivität auf, die die Verbindung mit 2 Glucoseein- 5 man vor durch Mischung der Substanz, welche in geeigneter heiten aufweist, wohingegen die Hemmaktivität der Verbin- Weise zerkleinert wurde und ergänzt ein Verdünnungsmittel dung mit 8 Glucoseeinheiten nur geringfügig ist. oder eine andere Trägersubstanz wie oben beschrieben. Gege-

Die Verbindungen können ohne Verdünnung, z. B. als Pul- benenfalls fügt man ein Bindemittel hinzu: z. B. Carboxymethyl-

ver oder in einer Gelatinehülle oder in Kombination mit einem cellulose, Alginate, Gelatine oder Polyvinylpyrrolidone, einen

Trägerstoff in einer pharmazeutischen Zusammensetzung 10 Lösungsverzögerer, wie z. B. Paraffin, einen Resorptionsbe-

appliziert werden. schleuniger, wie z. B. ein quarternäres Salz und/oder ein

Pharmazeutische Zubereitungen können eine grössere Adsorptionsmittel, wie z. B. Bentonit, Kaolin oder Dicalcium-

oder kleinere Menge des Inhibitors enthalten, z. B. 0,1 % bis phosphat. Die Pulvermischung kann granuliert werden zusam-

99,5%, in Kombination mit einem pharmazeutisch verträgli- men mit einem Bindemittel, wie z. B. Sirup, Stärkepaste, Aka-

chen nichttoxischen, inerten Trägerstoff, wobei der Trägerstoff is zienschleim, oder Lösungen aus Zellulose- oder Polymeren-

eine oder mehrere feste, halbfeste oder flüssige Verdünnungs- materialien. Danach presst man das Produkt durch ein grobes mittel, Füllstoffe und/oder nichttoxisches, inertes und pharma- Sieb. Als Alternative hierzu kann man die Pulvermischung zeutisch-verträgliches Formulierungshilfsmittel enthalten durch eine Tablettenmaschine laufen lassen und die sich erge-

kann. Solche pharmazeutischen Zubereitungen liegen Vorzugs- benden ungleichmässig geformten Stücke bis auf Korngrösse weise in Form von Dosierungseinheiten vor, d. h. physikalisch- 20 zerkleinern. Damit die entstandenen Körner nicht in den diskrete, eine bestimmte Menge des Inhibitors enthaltenden tablettbildenden Düsen stecken bleiben, kann man sie mit

Einheiten, die einem Bruchteil oder einem Vielfachen der Dosis einem Gleitmittel versetzen, wie z. B. Stearinsäure, Stearatsalz,

entsprechen, die zur Herbeiführung der gewünschten Hemm- Talkum oder Mineralöl. Diese gleitfähig gemachte Mischung

Wirkung entsprechen. Die Dosierungseinheiten können 1,2,3,4 wird dann in Tablettenform gepresst. Die Wirkstoffe können oder mehr Einzeldosen oder 'A, 'A oder lU einer Einzeldosis ent- 25 auch mit freifliessenden inerten Trägerstoffen vereinigt wer-

halten. Eine Einzeldosis enthält vorzugsweise eine genügende den und direkt in Tablettenform gebracht werden unter Auslas-

Menge Wirkstoff, um bei einer Applikation gemäss eines vor- sung der Granulat- oder Zerstückelungsschritte. Man kann das her bestimmten Dosierungsschemas einer oder mehrerer Produkt mit einer klaren oder opaken Schutzhülle versehen,

Dosierungseinheiten die gewünschte Hemmwirkung zu erzie- z. B. einem Überzug aus Schellack, einem Überzug aus Zucker len, wobei eine ganze, eine halbe, oder ein Drittel oder ein Vier- 30 oder Polymersubstanzen und einer polierten Hülle aus Wachs,

tel der Tagesdosis gewöhnlich einmal, zweimal, dreimal oder Farbstoffe können diesen Überzügen beigefügt werden, damit viermal am Tage verabreicht wird. Andere therapeutische Mit- zwischen den verschiedenen Dosierungseinheiten unterschie-

tel können auch eingenommen werden. Obgleich die Dosie- den werden kann.

rung und das Dosierungsschema in jedem Fall sorgsam abge- Die oral zu verabreichenden Zubereitungsformen, wie z. B. wogen werden sollte, unter Anwendung gründlichen fachmän- 35 Lösungen, Sirup und Elixiere, lassen sich in Dosierungseinheinischen Urteils und unter Beachtung des Alters, des Gewichts ten herstellen, so dass eine bestimmte Menge Präparat eine und des Zustands des Patienten, der Art und der Schwere der bestimmte Menge Wirkstoff enthält. Sirup kann so hergestellt Erkrankung, wird die Dosierung gewöhnlich in einem Bereich werden, dass der Wirkstoff in einer wässrigen Lösung, welche zwischen etwa 30 bis etwa 3 x 105 AIE/kg und zwischen etwa 1 geeignete Geschmacksstoffe enthält, gelöst wird; Elixiere wer-bis etwa 1 x 104 SIE/kg des Körpergewichtes pro Tag liegen. In 40 den unter Verwendung nichttoxischer, alkoholischer Träger-manchen Fällen wird man dabei eine ausreichende therapeuti- stoffe erhalten. Suspensionen kann man durch Dispergieren sehe Wirkung mit einer geringeren Dosis erreichen, während in der Verbindung in einem nicht toxischen Trägerstoff darstel-anderen Fällen eine grössere Dosis erforderlich sein wird. len. Lösungsvermittler und Emulgiermittel, wie z. B. äthoxy-

Orale Applikation kann unter Verwendung fester und flüssi- lierte Isostearylalkohole und Polyoxyäthylensorbitester, Konger Dosierungseinheiten durchgeführt werden, wie z. B. Pulver, 45 servierungsmittel, geschmacksverbessernde Zusätze wie z. B. Tabletten, Dragées, Kapseln, Granulate, Suspensionen, Lösun- Pfefferminzöl oder Saccharin und dergleichen können auch gen und dergleichen. zugegeben werden.

Pulver wird durch Zerkleinerung der Substanz in einer ge- Dosierungsvorschriften können auf der Kapsel angegeben eigneten Grösse und Vermischen mit einem ebenfalls zerklei- werden. Überdies kann die Dosierung so abgesichert sein, dass nerten pharmazeutischen Trägerstoff hergestellt. Obgleich ein so der Wirkstoff verzögert abgegeben wird, z. B. durch Einhalten essbares Kohlenhydrat, wie z. B. Stärke, Lactose, Saccharose des Wirkstoffes in Polymerensubstanzen, Wachs oder derglei-

oder Glucose normalerweise zu diesem Zwecke Verwendung chen.

findet und auch hier benutzt werden kann, ist es wünschens- Die Toxizität dieser Verbindungen ist sehr gering. Auch wert, ein nicht metabolisierbares Kohlenhydrat, wie z. B. ein ohne Endreinigung wird beispielsweise das Rohprodukt aus

Cellulosederi vat zu benutzen. 55 dem Beispiel 8 mit einer Aktivität von 26 000 SIE/g ohne Auf-

Süssmittel, Geschmackszusätze, Konservierungsstoffe, Dis- treten von Nebenwirkungen vertragen, wenn 340 000 SIE/kg pergiermittel und Färbemittel können auch mitverwendet wer- Maus und Ratte p. os appliziert worden sind. Auch bei intrave-

den. nöser Injektion tolerieren Mäuse 10 000 SIE/kg ohne Neben-

Die Kapseln können durch Zubereitung der oben beschrie- Wirkungen.

benen Pulvermischung und durch Füllung bereits gebildeter 60 Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch

Gelatinehüllen hergestellt werden. Die Pulvermischung kann andere pharmazeutischwirksame Verbindungen enthalten, ins-

man vor dem Füllvorgang mit Gleitmitteln, wie z. B. Kieselgel, besondere andere orale Antidiabetica, wie z. B. ß-cytotrope Sul-

Talkum, Magnesiumstearat, Calciumstearat oder festem Poly- fonylharnstoffderivate und blutzuckerspiegelsenkende Bigua-

äthylenglykol versetzen. Die Mischung kann man ebenfalls mit nide.

einem Desintegrator oder Lösungsvermittler, wie z. B. Agar- 65 Zusätzlich zu den oben erwähnten pharmazeutischen

Agar, Calciumcarbonat oder Natriumcarbonat versetzen, um Zusammensetzungen lassen sich auch diese Wirkstoffe enthal-

bei Einnahme der Kapsel die Zugänglichkeit des Inhibitors zu tende Lebensmittel herstellen; beispielsweise Zucker, Brot,

verbessern. Kartoffelprodukte, Fruchtsaft, Bier, Schokolade und andere

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Konfektartikel, und Konserven, wie z. B. Marmelade, wobei zu diesen Produkten eine therapeutisch wirksame Menge mindestens eines der neuen Derivate als Inhibitoren gegeben wurde.

Erläuterung einiger verwendeter Reagentien und Hilfsmittel:

Als Ionenaustauscher können z. B. die im Handel befindlichen Produkte Amberlite IRA 410 Cl" (Anionenaustauscher); Amberlite IRC 120 (H+-Form) (stark saurer Kationenaustauscher); Amberlite (HCCh'-Form) (Anionenaustauscher); Amberlite IRA 410 OH" (stark basischer Anionenaustauscher); Amberlite IRC 50 H+ (schwach saurer Kationenaustauscher) [Warenzeichen der Firma Rohm and Haas Company] sowie Dowex 50 WX 4H+ (stark saurer Kationenaustauscher) [Warenzeichen der Firma Dow Chemical Co. Midland, Michigan, USA] verwendet werden.

Als Anionenaustauscher auf Cellulosebasis kann z. B. DEAE-Zellulose der Firma Schleicher und Schüll verwendet werden.

Als Polyacrylamid-Gel kann z. B. Bio-Gel-P-2 [Warenzeichen der Firma Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, USA] verwendet werden.

Maitzin ist ein natürliches Malzextrakt der Firma Diamalt AG, München (BRD).

Lewapol® ist ein unspezifisches Adsorptionsharz der Firma Bayer AG, Leverkusen (BRD).

Clarcel ist ein Filterhilfsmittel der Firma CECA, Velizy-Vil-lacoublay, Frankreich.

SE 30 ist ein Silicon-Elastomer der Firma Hewlett Packard.

Die im folgenden verwendeten Mikroorganismen sind bei American Type Culture Collection unter den folgenden Nummern hinterlegt worden:

Stamm ATCC-Nr.

SE 50(CBS 961.70) 31042

SE 18 (CBS 957.70) 31041

SE 82 (CBS 615.71) 31045

SE 50/13 (CBS 614.71) 31043

SE 50/110 (CBS 674.73) 31044

Beispiel 1

Man beimpft einen Glasfermenter mit 8 Liter Nährlösung der Zusammensetzung 5,0% Stärke, 1,0% Hefeextrakt, 0,2% K2HPO4 mit einem 3 Tage alten Schüttelkolben des Stammes SE 50/13 (CBS 614.71 ) und bebrütet unter intensiver Rührung und Belüftung 3 Tage bei 28 °C und erhält eine Kulturbrühe mit 105000 AIE/ml.

6 Liter dieser Fermentationsbrühe werden nach dem Abkühlen auf 20 °C mit halbkonzentrierter HNO3 auf pH 2,5 eingestellt, mit 30 g Carboraffin-Aktivkohle versetzt und 10 Minuten gerührt. Anschliessend wird 15 Minuten bei 10000 Upm zentrifugiert und der klare, hellgelbe Überstand nach Neutralisation mit NH3 auf 500 ml eingeengt. Die 500 ml Konzentrat wurden 45 Minuten mit 200 g Amberlite IRA 410 Cl" gerührt, abgenutscht und mit 4/s Vol. = 400 ml Methanol versetzt, um die Hauptmenge der höhermolekularen Stärkeabbauprodukte (zusammen mit noch vorhandenen Aktivkohleresten) auszufällen. Es wird 5 Minuten bei 5000 Upm zentrifugiert. Die 850 ml Überstand werden unter intensivem Rühren in 41 Trok-kensprit eingetropft. Die weise, flockige Fällung wird abgenutscht, 3 mal mit Trockensprit und 2 mal mit Äther gewaschen und im Vakuum bei 50 °C getrocknet. Ausbeute: 36 g eines weissen Pulvers mit lOx 106 AIE/g. In einigen der folgenden Beispiele wird diese Zubereitung verwendet.

Enzymhemmung auf Dünnschichtplatten

Zur Beurteilung des Endproduktes von Fermentationen und der Zusammensetzung von Präparaten mittels Dünnschichtchromatographie trägt man 1 (il der Fermentationsbrühen oder 1 p,g der Präparate auf Kieselgelfertigfolien (Fa. Schleicher und Schüll, Dassel, Typ F1500) auf und entwickelt 2 mal in n-Butanol/Äthanol/Wasser = 50/30/20.

Zur Saccharaseinhibitionsfärbung besprüht man die entwickelte und gut getrocknete Platte mit Enzymgel (20 ml/ 20x20 cm Platte) und lässt das Gel erstarren. Dann wird für 5' in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur vorinkubiert und anschliessend satt mit Substratgel besprüht. Nach dem Erstarren dieser zweiten Gelschicht bringt man die Platte in eine feuchte Kammer ein und inkubiert bei 40 °C. Die Inhibitionsfärbung (helle Flecken, rotbrauner Hintergrund) entwik-kelt sich in 60-90'. Zum Zeitpunkt der optimalen Farbentwicklung wird abgebrochen und die Platte mit den darauf befindlichen Agarschichten am Föhn mit Warmluft getrocknet.

Bereitung der Gele

Enzymgel: 1,5 g Agarose (L'Industrie Biologique Français) wird in 100 ml 0,2 m Na-Maleinatpuffer pH 6,0 suspendiert und anschliessend durch Aufkochen gelöst. Die klare Agaroselösung wird auf 50 °C abgekühlt und mit 250 jo.1 Triton X-100 Lösung (2 g Triton X-100 + 8 g Äthanol p.a.) und 0,5 ml Dianisi-dinlösung (20 mg Dianisidin/1 ml Aceton) unter Umschwenken versetzt. Direkt vor Gebrauch des Gels werden 1 ml GOD/ POD-Reagens (12,5 mg Glucoseoxidase, Reinheitsgrad I, Fa. Boehringer, und 2,5 mg Peroxidase, Reinheitsgrad II, Lyophilisat, Fa. Boehringer, gelöst in 5 ml Maleinatpuffer) und 4 bis 5 Einheiten Saccharase aus Schweinedünndarm zugesetzt. Das Gel muss bis zum Versprühen auf 50 °C gehalten werden, da es sonst beim Sprühvorgang in den Düsen erstarrt. Substratgel: 0,5 g Agarose wird in 100 ml Na-Maleinatpuffer pH 6,0 suspendiert und unter Kochen gelöst. Man kühlt anschliessend auf 50 °C ab, versetzt mit 100 jxl Triton (2 g Triton X-100 + 8 g Äthanol p.a.) und gibt 1 g Saccharose (Serva Nr. 35579) zu. Nach dem Lösen der Saccharose ist das Gel gebrauchsfertig.

Zur Amylaseinhibitionsfärbung besprüht man die entwik-kelte und getrocknete DC-Platte mit einem Amylasegel (20 ml/ 20x20-cm-Platte) und lässt erstarren. Nach 5' Vorinkubation bei Raumtemperatur bringt man die Platte mit der Gelschicht in eine 0,5%ige Stärkelösung (1 g Stärke, Merck Nr. 1252, in 200 ml 0,2 m Glycerophosphatpuffer 0,01m CaCh pH 6,9 unter Kochen gelöst) ein und belässt sie dort für 2' bei 40 °C unter Umschwenken der Lösung. Danach wird die Platte mit dest. Wasser gut abgespült und zur Anfärbung der nicht abgebauten Stärke in eine verdünnte J2-Lösung (4 ml JtStammlösung auf 500 ml H2O; J2-Stammlösung: 2,2 g J2 + 4,4 g K] in 100 ml H2O gelöst) eingetaucht. Nach ca. 1 Minute ist die Färbung optimal. Man photographiert sofort, da die blauen Flecken schnell verblassen.

Bereitung des Amylasegels

1 g Agarose wird in 100 ml 0,2 m Natriumglycerophosphat/ 0,01 m CaCh-Puffer pH 6,9 bei 100 °C gelöst, nach dem Abkühlen auf 50 °C werden 100 (xl Triton X-100 (2 g Triton X-100 + 8g Äthanol p.a.) zugesetzt. Direkt vor dem Besprühen setzt man 100 |xl einer Amylasekristallsuspension (10 mg Schweinepan-kreasamylase/ml ges. NH4-Sulfatlösung, Fa. Boehriner, zu.

Beispiel 2

Beimpft man 11 Erlenmeyerkolben mit 120 ml einer Nährlösung bestehend aus 4% Stärke, 2,4% Glucose, 0,9% Kaseinhy-drolysat und 0,9% Hefeextrakt, pH mit NaOH auf 7,6 eingestellt, mit 0,4% CaC03 versetzt und 30 min bei 121 °C sterilisiert, mit 3 ml einer Vorkultur des Stammes SE 82 (CBS 615.71 ), angewachsen in einer Nährlösung bestehend aus 2% Stärke, 1% Glu-

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cose, 0,5% Kaseinhydrolysat und 1% Hefeextrakt, pH mit NaOH auf 7,2 eingestellt, mit 0,4% CaC03 versetzt und 30 min bei 121 °C sterilisiert, und bebrütet 5 Tage bei 28 °C auf einer Rundschüttelmaschine, so erhält man eine Kulturlösung mit 122 000 AIE/ml. Zur Aufarbeitung trennt man das Mycel von den vereinigten Kulturlösungen durch Zentrifugation bei 12 000 Upm ab, bringt 300 ml des Kulturfiltrates mit halbkonz. HNO3 auf pH 2,5 und rührt für 10 min mit 2,5 g A-Kohle p.A. Nach Abtrennung der Kohle bei 12 000 Upm wird die mittels 10N KOH auf pH 6 neutralisierte Lösung mit 300 ml Methanol versetzt, kurz stehen gelassen und bei 12 000 Upm vom Niederschlag befreit. Tropft man nun den Überstand in 31 Äthanol, isoliert die Fällung nach kurzem Stehenlassen durch Zentrifugation bei 12 000 Upm, wäscht den Niederschlag zweimal mit abs. Äthanol und einmal mit Äther und trocknet im Vakuum, so erhält an 2,23 g eines Produktes mit 7,45 x 106 AIE/g, das zu über 95% Verbindungen mit m + m = 4 und mehr Glucoseeinheiten enthält.

Beispiel 3

Beimpft man 11 Erlenmeyerkolben mit 120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 3,5% Glucose, 2% Stärke, 0,5% Kaseinhydrolysat, 1,3% Hefeextrakt, 0,3% CaCCh und 0,3% K2HPO4 vor Sterilisation auf 7,8 eingestellt, Sterilisation 307121 °C, mit 6 ml einer Vorkultur des Stammes SE 50/110 in einer Nährlösung bestehend aus 3% Sojamehl, 3% Glycerin und 0,2% CaCCh und bebrütet 3-4 Tage auf einer Rundschüttelmaschine bei 24 °C, so erhält man eine Kulturlösung, die 153 000 AIE/ml und 12 200 SIE/1 enthält.

11 Kulturlösung wurde mit HNO3 auf pH 2,5 eingestellt, mit 5 g Aktivkohle 10' gerührt und anschliessend 30' bei 5000 Upm zentrifugiert. Anschliessend wurde durch Zusatz von 25 g Amberlite IRA 410 (OH~-Form) neutralisiert. Der neutrale Überstand wurde auf 100 ml einrotiert, mit 100 ml Methanol versetzt und filtriert. Das Filtrat wurde in 21 Trockensprit eingerührt, der ausfallende Niederschlag abgenutscht und nach 3x Waschen mit Aceton und Äther im Vakuum getrocknet

Ausbeute 14 g eines weissen Pulvers mit5x 106 AIE/g, das überwiegend Verbindungen mit mindestens m + m = 4 Glucoseeinheiten enthält.

Beispiel 4

Arbeitet man nach Beispiel 3, jedoch mit 0,5% Stärke so erhält man nach 4tägiger Fermentation eine Kulturbrühe mit 40 000 AIE und 184 SIE/ml. Die Kulturbrühe enthält eine Mischung der erfindungsgemässen Verbindungen, die mindestens eine Glucoseeinheit haben.

Beispiel 5

Beimpft man 11 Erlenmeyerkolben, die 120 ml Nährlösung der Zusammensetzung 3% Glucose, 0,6% Kaseinhydrolysat, 1,6% Hefeextrakt, 0,3% CaCCh, 0,3% K2HPO4, pH vor der Sterilisation mit KOH auf pH 7,8 eingestellt, mit einer Vorkultur des Stammes SE 50/110 (CBS 674.73) nach Beispiel 3 und bebrütet 4 Tage bei 24 °C auf einer Rundschüttelmaschine, so erhält man eine Kulturbrühe mit 10 800 SIE/1, die überwiegend die erfin-dungsgemässe Verbindung mit einer Glucoseeinheit enthält.

51 Kulturfiltrat, bei 13 000 UPM vom Mycel abgetrennt, wurden mit halbkonz. HNO3 auf pH 2,5 eingestellt und für 15 min mit 55 g Aktivkohle («Merck») und 200 g Clarcel gerührt. Nach dem Entfernen der Feststoffe durch Absaugen neutralisierte man mit konz. Ammoniak auf pH 7, engte die Lösung auf 1,51 ein und fällte mit der fünffachen Menge Äthanol. Der resultierende flockige Niederschlag wurde mittels eines Durchlaufrotors bei 12 000 Upm abgetrennt und der gelbliche Überstand auf 150 ml eingeengt und zur Abtrennung geringer Anteile ungelösten Materials niedertourig zentrifugiert. 50 ml dieser Lösung wurden auf eine mit Amberlite IR-120 (H+-Form)

gefüllte Säule (30x300 mm; 30 ml H2O pro Stunde) gegeben. Nachdem man insgesamt 300 ml Eluat aufgefangen hatte, welches inerte Saccharide sowie einen Anteil nicht adsorbierter hemmaktiver Komponenten enthält, überführte man den Austauscher mit ca. 400 ml H2O in ein Becherglas und fügte unter Rühren so lange konz. Ammoniak zu, bis der pH einen Wert von 11,5 erreicht hatte. Nach 30 min weiterem Rühren trennte man vom Austauscher ab, engte auf V20 des Volumens ein, filtrierte über eine Säule (20x 150 mm) mit Amberlite IRA-410 (HC03'-Form) und fing bei einer Fliessgeschwindigkeit von 30 ml/h ca. 500 ml Eluat auf, welches eingeengt wurde und nach Lyophilisation 1,3 g Rohprodukt ergab.

Zur weiteren Reinigung wurde das rohe Präparat an Bio-Gel P-2,100-200 mesh (Fa. Bio-Rad, München) fraktioniert. Dazu diente eine Säule von 50 mm 0 und 450 mm Länge, die mit H2O bei einer Fliessgeschwindigkeit von 40 ml/h betrieben wurde, wobei man Fraktionen von je 10 ml sammelte. Alle Fraktionen wurden mittels des Anthrontestes auf Kohlenhydrate sowie mittels des Saccharase-Hemmtestes auf inhibitorisch aktive Komponenten geprüft. Die Saccharase-Inhibitor enthaltenden Fraktionen wurden weiterhin dünnschichtchro-matographisch nach Beispiel 1 auf ihren Gehalt an individuellen Komponenten untersucht. Diejenigen Fraktionen, welche die Verbindung mit einer Glucoseeinheit enthielten, wurden vereinigt, eingeengt und lyophilisiert. Man erhielt 35 mg des Stoffes mit 0,3 x 106 AIE/g und 30 000 SIE/g.

Beispiel 6

Beimpft man 11 Erlenmeyerkolben mit je 120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 5% Stärke, 1% Hefeextrakt, 0,2% K2HPO4 mit je 2 ml einer Vorkultur nach Beispiel 3, so erhält man nach 3tägiger Bebrütung bei 28 °C Kulturlösungen mit folgender Ausbeute an Amylase-Inhibitor:

Stamm

AIE/ml

SE 50 (CBS 861.70)

37 000

SE 50/13 (CBS 614.71)

109 000

SE 50/110 (CBS 674.73)

53500

Die vorwiegend aus einer Mischung der Verbindungen mit 4 oder mehr Glucoseeinheiten bestehen.

Beispiel 7

Beimpft man 11 Erlenmeyerkolben mit je 120 ml Nährlösung der Zusammensetzung 1,3% Maltose, 3,5% Glucose, 0,5% Kaseinhydrolysat, 1,3% Hefeextrakt, 0,3% CaC03,0,3% K2HPO4 mit je 2 ml einer Vorkultur nach Beispiel 3, so erhält man nach 4tägiger Bebrütung auf Rundschüttelmaschinen bei 24 °C mit verschiedenen Stämmen folgende Ausbeuten:

Stamm

SIE/ml

AIE/ml

SE 50 (CBS 961.70)

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580

SE 50/13 (CBS 614.71)

14,8

1460

SE 50/110 (CBS 674.73)

57,9

755

Die vorwiegend aus einer Mischung der Verbindungen mit 4 oder weniger Glucoseeinheiten bestehen.

Beispiel 8

Beimpft man einen Fermenter mit 1001 Nährlösung der Zusammensetzung 3,5% Glucose, 2,5% Maitzin, 0,5% Kaseinhydrolysat, 1,3% Hefeextrakt, 0,3% CaCoî, 0,3% K2HPO4 und 0,1% Antischaummittel mit 51 einer Vorkultur nach Beispiel 3 und bebrütet unter Rührung und Belüftung 5 Tage bei 24 °C, so

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erhält man eine Kulturlösung mit 73 000 SIE/L, die vorwiegend die erfindungsgemässe Verbindung mit m + m = 2 enthält.

901 Fermentationsansatz wurden mit Mycel am pH-Meter mit konz. HNO3 auf pH 2,5 eingestellt und unter Rühren mit 900 g (= 1%) Aktivkohle (Merck) zur Adsorption der Hauptmenge der gebildeten Farbstoffe versetzt. Man rührte für 15 Min., trennte über eine Zentrifuge bei 3000 Upm vom Mycel und der Hauptmenge der Kohle ab und filtriert den Überstand schliesslich unter Zusatz von 3 kg Clarcel über eine Drucknut-sche. Man erhielt 611 gelbbraunen, klaren Filtrats mit einem SIE-Gehalt von 60 000 SIE/1.

Das Filtrat wurde mit konz. NH3 auf pH 7 eingestellt und zur Adsorption des Wirkstoffs mit 1300 g (2%) Aktivkohle (Merck) für 30' gerührt. Man filtriert über eine Drucknutsche und wusch das Aktivkohlesediment 3 x mit 101 destilliertem Wasser. Anschliessend wurde die Kohle gut trocken gedrückt und in 3x4150% Aceton bei pH 2,5 für jeweils 15' gerührt, um den Wirkstoff von der Kohle zu desorbieren. Die acetonischen Desorbate wurden - nach Abtrennen von der Kohle durch Filtration - vereinigt. Man engte das vereinigte Desorbat am Rotationsverdampfer auf 250 ml ein, versetzte mit einem gleichen Volumen (250 ml) Methanol und filtrierte durch ein Faltenfilter. Das Filtrat (480 ml) wurde in 51 Aceton unter kräftigem Rühren eingetropft. Der ausfallende Niederschlag wurde abgenutscht und 3x mit Aceton und Äther gewaschen. Anschliessend wurde im Vakuum bei 35 °C getrocknet. Ausbeute 230 g mit 8500 SIE/g.

25 g des obigen rohen Produkts wurden in 11H2O gelöst und mit 300 g Dowex® 50 WX 4 H+ (200-400 mesh) 30' gerührt. Man filtrierte das Harz ab und wusch 3x mit 210,001 n HCl nach. Das gewaschene Dowex wurde anschliessend in 500 ml H2O suspendiert und die Suspension am pH-Meter durch Zugabe von 25% NH3 auf pH 9,0 eingestellt. Anschliessend wurde noch 2 x mit je 500 ml 0,6% NH3 desorbiert, die Desorbate vereinigt und am Rotationsverdampfer auf 100 ml eingeengt. Zur Entfärbung dieses Konzentrats wurde es mit 2 g DEAE-Zellulose (Fa. Schleicher und Schüll Nr. 02035,0,6 mVal/g) für 5 min gerührt, dann zentrifugiert. Der hellgelbe Überstand wurde mit einem gleichen Volumen (100 ml) Methanol versetzt und dann in 21 Aceton unter intensivem Rühren eingetropft. Der Niederschlag wurde abgenutscht, mit Aceton und Äther gewaschen und im Vakuum bei 35 °C getrocknet. Ausbeute 4,2 g mit 26 000 SIE/g. Zur weiteren Feinreinigung wurden die 4,0 g Inhibitor in 0,5 g Portionen über Biogel P-2 gefiltert. Dazu wurden jeweils 0,5 g des Präparats in 10 ml H2O gelöst und auf eine Biogel-P-2-Säule (200-400 mesh, Fa. Bio-Rad) vom Durchmesser 5 cm und der Länge 95 cm aufgetragen. Man entwickelte in Wasser bei einer Fliessrate von 80 ml/h. Es wurden 12 ml Fraktionen gesammelt. Von allen Fraktionen wurde der Gesamtkohlenhydratgehalt (in Form des Anthrontest als Extinktion bei E620) sowie der Gehalt an Sac-charase-Inhibitor und Amylase-Inhibitor ermittelt. Ausserdem wurden die Fraktionen dünnschichtchromatographisch (Enzym-Inhibitionsfärbung nach Beispiel 1) geprüft.

Die Fraktionen, die die Verbindungen mit 4-6 Glucoseeinheiten enthalten, wurden vereinigt, im Vakuum auf 10 ml eingeengt und durch Eintropfen in 200 ml Trockenspritz gefällt. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert, mit Aceton und Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet; Ausbeute aus 4,0 g Rohinhibitor: 0,2 g der Verbindungen mit 4-6 Glucoseeinheiten mit 17,5x 106 AIE/g und 8500 SIE/g. Die die Verbindung mit 3 Einheiten enthaltenden Fraktionen wurden in gleicher Weise aufgearbeitet, wobei die Fällung mit 200 ml Aceton erfolgte; Ausbeute aus 4,0 g Rohinhibitor: 0,1 g der Verbindung mit ni + m = 3 mit l,4x 106 AIE/g und 21 000 SIE/g. Aus den die Verbindung mit m + n2 = 2 enthaltenden Fraktionen (Fällung mit Aceton) wurden 0,9 g der Verbindung mit m + m = 2 Einheiten mit 0,3 x 106 AIE/g und 68 000 SIE/g isoliert.

Beispiel 9

Beimpft man 3 Kleinfermenter mit je 81 der Nährlösung 7,5% Maitzin, 0,3% Kaseinhydrolysat, 0,7% Hefeextrakt, 0,3% CaC03,0,3% K2HPO4 mit 5% einer Vorkultur des Stammes SE 50/110 (CBS 674.73) (gewonnen nach Beispiel 3), so erhält man nach 5tägiger Bebrütung bei 24 °C eine Kulturbrühe mit 73 SIE/ml, die vorwiegend die Verbindung mit m + m = 2 enthalten. Nach Zentrifugation (30', 3000 Upm) zur Abtrennung des Mycels erhielt man 20,51 einer tiefbraunen Kulturlösung mit 67 000 SIE/1. Man stellte mit HNO3 auf pH 3,5 ein und setzte zur Entfärbung 60 g Lewapol (Ca 9221,0,35 mm Körnung, Fa. Bayer)/L = 1,23 kg Lewapol zu. Nach 20' Rühren wurde über ein Seitz-K3-Filter abgenutscht. Die entfärbte Kulturlösung wurde mit NH3 neutralisiert (18,5 L, 67 000 SIE/1). Man rührte anschliessend zur Adsorption des Wirkstoffs 20 g Aktiv-Kohle/1 = 370 g ein und Hess 30' rühren. Anschliessend wurde über ein Seitz-K3-Filter, das mit einer Schicht aus dem Filterhilfsmittel Clarcel beschickt war, abfiltriert. Das Filtrat (17,51,3600 SIE/1) wurde verworfen. Der Kohlerückstand wurde 3 x mit 21 dest. H2O gewaschen. Zur Desorption des Wirkstoffs von der Kohle wurde diese 3x nacheinander mit jeweils 1180%ig. Aceton für 15' gerührt, wobei das pH mit konz. HCl auf pH 2,5 eingestellt wurde. Die Desorbate wurden vereinigt (2,41,371 000 SIE/1). In dieses Desorbat wurden 20 g Dowex H+/l (Dowex 50 WX 4, H+-Form, Fa. Serva, Heidelberg) = 46 g Dowex eingetragen und 20' gerührt. Anschliessend wurde das Harz abfiltriert (Dowexfraktion I) und mit etwas 75%igem Aceton nachgewaschen. Das Filtrat und Waschflüssigkeit (31 = 215 000 SIE/1) wurden mit 60 g Amberlite IRA 410 (OH"-Form) (Firma Serva Heidelberg)/1 gerührt, bis pH 7 erreicht war. Anschliessend wurde abfiltriert und das Filtrat (2,8 L, 219 000 SIE/1) mit 72 g Dowex H+ versetzt und 20' gerührt. Das pH wurde dabei durch Einhängen eines mit Amberlite IRA 410 OH" gefüllten porösen Nylonbeutels auf 3,0 gehalten. Anschliessend wurde vom Dowex abfiltriert (Dowexfraktion II), das Filtrat (2,61,27 000 SIE/L) wurde verworfen.

Dowexfraktion I und II wurden jede für sich 3x mit 75% Aceton bei pH 3,5 gewaschen und anschliessend je 3x mit je 100 ml (Dowexfraktion I) bzw. 150 m (Dowexfraktion II) 0,6% NH3 desorbiert. Bei der 1. Desorption, bei der die Ammoniakmenge zur Neutralisation des Dowex-Harzes nicht ausreichte, wurde durch Zugabe von konz. NH3 am pH-Meter auf pH 9 eingestellt. Die 3 Desorbate von Dowex-Fraktion I und II wurden für sich vereinigt, am Rotationsverdampfer fast zur Trockne eingeengt, in 50 ml H2O aufgenommen, am pH-Meter mit HCl auf pH 3-4 eingestellt und mit 50 ml Methanol versetzt. Die Lösungen wurden in 1,51 absolutes Aceton unter Rühren eingetropft, der fallende Niederschlag abgenutscht und 3x mit Aceton sowie 1 x mit Äther gewaschen. Man trocknete im Vakuum. Ausbeute: Frakton I 6,5 g 25 000 SIE/g Fraktion II 12,3 g 36 000 SIE/g

Fraktion I und II enthalten als hemmaktive Bestandteile hauptsächlich die erfindungsgemässe Verbindung mit m + m = 2 neben geringen Anteilen der Verbindung mit m + m = 3.

Die folgende Tabelle gibt die Saccharase-Hemmaktivitäten des Präparats in aufeinanderfolgenden Stufen wieder:

Ausbeute

Volumen

(1)

SIE/1

SIE gesamt

SIE-Aus-

beute

(%)

1) Kulturlösung

20,5

67000

1373500

100

2) nach Lewapol

19,5

67000

1306500

95

Entfärbung

3) nach

18,5

3600

66600

(4,8

Aktivkohleadsorption

verwor

fen)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

633 043

18

Volu

SIE/1

SIE gesamt

S IE-Aus

men

beute

(1)

(%)

4) 1. Desorbat

0,7

742000

519400

37,8

5) 2. Desorbat

0,9

329000

296100

21,6

6) 3. Desorbat

0,8

85000

68000 883500

5,0 64,4

7) Mischdesorbat

2,4

371000

890400

64,8

(4-6)

8) nach 1.

3,0

215000

645000

Dowexadsorption

9) nach Neutralisat.

2,8

219000

613200

mit IRA OH"

10) nach 2.

2,5

27000

67500

(4,9

Dowexadsorption

verworfen)

11) vereinigte NH3

0,29

682000

197780

14,4

Desorbate von

Dowexfraktion I

12) Desorbate von

0,45

1419000

638550

46,5

Dowexfraktion II

60,9

13) Fällung Fraktion 1

: 6,5 g

25000/g

162500

11,8

Fällung Fraktion II

12,3 g 36000/g

442800

32,2

44,0

Beispiel 10

200 g einer Zubereitung wie in Beispiel 1 beschrieben wurden in 940 ml destilliertem Wasser und 60 ml konz. H2SO4 gelöst und 4 Stunden unter Rückfluss erwärmt (Innentemperatur: 98-100 °C; Ölbadtemperatur: 140 °C). Die abgekühlte, schwarzbraune Lösung wurde mit 10 g Aktivkohle (Merck Art. 2186) versetzt und 1 Stunde gerührt. Danach wurde die Aktivkohle abgesaugt, mit Wasser gewaschen und das Filtrat mit ca. 250 ml 10 n KOH auf pH = 7 bis 8 eingestellt. Die Lösung wurde 1 Stunde mit 50 g Aktivkohle ausgerührt. Die Kohle wurde abgesaugt, mit 21 Wasser gewaschen und das Filtrat verworfen. Zur Desorption wurde die Kohle über Nacht mit 21 30%igem Alkohol digeriert. Schliesslich saugte man die Kohle ab und engte die alkoholische Lösung am Rotationsverdampfer ein. Rückstand: 6,2 g. Dieses Rohprodukt (6,2 g) wurde in 500 ml Wasser gelöst und mit 30 g Amberlite IR 120 (H®-Formel) 1 Stunde vorsichtig gerührt. Man saugte den Austauscher ab und wusch mit destilliertem Wasser, bis das Filtrat neutral und frei von Glucose war. Der Austauscher wurde dann mit 15 ml 25%igem NH3 in 1000 ml H2O über Nacht ausgerührt, abgetrennt und verworfen. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer eingeengt. Rückstand: 3,7 g.

Zur weiteren Reinigung wurde eine Chromatographie an Cellulose durchgeführt. 4,5 g des vom Austauscher desorbier-ten Materials wurden auf eine 1 m lange und 2,5 cm weite mit Cellulose gefüllte Säule aufgetragen. Als Fliessmittel wurde zunächst Àthanol/HîO 5:1, zum Eluieren der erfindungsgemäs-sen Verbindung mit m = 1 wurde zunächst Âthanol/HîO 3:1, verwendet. Bei einer Tropfgeschwindigkeit von 20 Tropfen pro Minute wurden Fraktionen von jeweils 14 ml abgenommen. Die einzelnen Fraktionen wurden dünnschichtchromatogra-phisch geprüft. Die Fraktionen 47-85 lieferten nach dem Einengen 1,6 g einer schwach bräunlich verfärbten erfindungsgemäs-sen Verbindung mit einer Glucoseeinheit. Die färbenden Verunreinigungen spielen mengenmässig keine Rolle. Als farbloses Harz erhält man die Verbindung mit m + m = 1, wenn man den Reinigungsschritt mit stark saurem Ionenaustauscher nicht im Batch-Verfahren, sondern auf einer Säule durchführt.

Beispiel 11

200 g einer Zubereitung wie in Beispiel 1 beschrieben wurden in 940 ml destilliertem Wasser und 60 ml konz. H2SO4 gelöst und 14 Stunde unter Rückfluss erwärmt (Innentemperatur: 98-100 °C; Ölbadtemperatur: 140 °C). Die abgekühlte, schwarzbraune Lösung wurde mit 10 g Aktivkohle (Merck, Art. 5 2186) versetzt und 1 Stunde gerührt. Danach wurde die Aktivkohle abgesaugt, mit Wasser gewaschen und das Filtrat mit ca. 250 ml 10 n KOH auf pH = 7 bis 8 eingestellt. Die Lösung wurde 1 Stunde mit 50 g Aktivkohle ausgerührt. Die Kohle wurde abgesaugt, mit 21 Wasser gewaschen und das Filtrat ver-10 worfen. Zur Desorption wurde die Kohle über Nacht mit 21 30%igem Alkohol digeriert. Schliesslich saugte man die Kohle ab und engte die alkoholische Lösung am Rotationsdampfer ein. Rückstand: 8,0 g.

Der Rückstand wurde in 15 ml H2O aufgenommen und auf 15 eine mit 50 g Amberlite IR 120 (H+-Form) gefüllte Säule (Höhe: 20 cm, 0 2,4 cm) aufgetragen. Man liess mit 3 Tropfen/Minute einziehen und wusch mit Wasser nach (12 Tropfen/Minute), bis alle nicht basischen Bestandteile entfernt waren. Dann wurden die basischen Produkte mit 0,5%igem NH3 von der Säule eluiert 20 (12 Tropfen/Minute) und die wässrige Lösung am Rotationsverdampfer zur Trockne gebracht. Rückstand: 4,1 g.

2 g dieses Rückstandes wurden in wenig Wasser gelöst und auf eine mit Sephadex G-15 gefüllte Säule (Höhe: 200 cm; 0:3,0 cm) aufgetragen. Es wurde mit Wasser eluiert. Bei einer Fliess-25 geschwindigkeit von 8 ml/Stunde wurden Fraktionen von jeweils 2 ml abgenommen. Die einzelnen Fraktionen wurden dünnschichtchromatographisch geprüft. Die Fraktionen 85-94 lieferten 280 mg der Verbindung mit m + m = 2 mit einer spez. Aktivität von 50 000 SIE/g.

30

Beispiel 12

Inkubiert man 2 g einer Zubereitung wie in Beispiel 1 beschrieben in 60 ml 20 mM Natriumglycerophosphatpuffer, pH 6,9 und 1 mM an CaCL, mit 1 g a-Amylase aus Aspergillus 35 spec. (Serva Nr. 13418) unter stetigem Rühren für 120 h bei 37 °C, erhitzt schliesslich für 5 min auf 100 °C und zentrifugiert bei 4000 Upm vom Ungelösten ab, so erhält man nach Lyophilisation der Lösung 1,9 g eines Produktes mit 3500 SIE/g und 2x 106 AIE/g. Prüft man dieses Produkt mittels Dünnschicht-40 Chromatographie und Saccharase-Inhibitionsfärbung wie in Beispiel 1 beschrieben, so zeigt sich, dass es an hemmaktiven Verbindungen im wesentlichen die erfindungsgemässe Verbindungen mit m + m = 1,2 und 3 erhält.

45 Beispiel 13

Inkubiert man 2 g einer Zubereitung wie in Beispiel 1 beschrieben in 30 ml 20 mM Acetatpuffer vom pH 4,8 mit 1,25 mg ß-Amylase aus sweet potato (Boehringer) unter stetigem Rühren für 120 h bei 37 °C, erhitzt schliesslich für 5 min auf so 100 °C und zentrifugiert bei 4000 Upm vom Ungelösten ab, so erhält man nach Lyophilisation der Lösung 1,5 g eines Produktes mit 1800 SIE/g und 3,8 x 106 AIE/g. Prüft man dieses Produkt mittels Dünnschichtchromatographie und Saccharase-Inhibitionsfärbung wie in Beispiel 1 beschrieben, so zeigt sich, dass es 55 an hemmaktiven Verbindungen im wesentlichen die erfin-dungsgemässen Verbindungen mit m + m = 2 und 3 erhält.

Beispiel 14

60 Beimpft man einen 200 ml Erlenmeyerkolben, der 25 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 0,1% K2HPO, 0,2% (NH4)2S04,0,05% MgS04,0,05% KCl, 0,01% FeS04,2% einer Zubereitung wie in Beispiel 1 beschrieben mit einer Sporensuspension des Stammes Asp. niger ATCC11394 und bebrütet bei

65 28 °C auf einer Rundschüttelmaschine, so sinkt nach 6 Tagen der AIE-Titer von 210 000 AIE/ml auf 53 000 AIE/ml und nach 10 Tagen auf 21 300 AIE/ml. Gleichzeitig nimmt der SIE/ml Gehalt von 7,0 auf 72 SIE/ml zu.

19

633043

20 ml einer 10 Tage mit der Sporensuspension inkubierten Lösung wurden zur Abtrennung des Mycels 30' bei 3000 Upm zentrifugiert. Die 15 ml Überstand (72 000 SIE/1) wurden durch 30minütiges Rühren mit 2 g Amberlite IRC 50 H+ und 1 g Amberlite IRA 410 OH" entsalzt (Leitfähigkeit kleiner als 2 mS • cm-1). Man filtrierte ab und liess das Filtrat mit 5 ml/h durch eine mit Dowex H+ in 0,001 n HCl äquilibrierte Säule (0 1 cmx 10 cm) laufen. Anschliessend wurde mit 200 ml 0,001 n HCl nachgewaschen. Zur Desorption wurde 0,6% NH3-Lösung durch die Säule gepumpt (10 ml/h) und 5 ml Fraktionen aufgefangen. Die die saccharaseinhibitorische Aktivität enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, auf 2 ml am Rotationsver-dampfer einrotiert und mit 2 ml Methanol versetzt. Man stellte diese Lösung auf pH 3-4 ein und brachte sie durch Eintropfen in 100 ml Aceton zur Fällung. Der Niederschlag wurde abgenutscht, mit Aceton und Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 26 mg mit 28 000 SIE/g, bestehend aus Verbindungen mit m + m = 2 und 3. Die Gewinnung der reinen Verbindung mit m + m = 2 aus diesem Produkt erfolgt wie in Beispiel 8 beschrieben durch Gelfiltration über eine Säule mit Bio-Gel P-2. Man erhält 7 mg der Verbindung mit m + m = 2 von 60 000 SIE/g.

Beispiel 15

21 Kulturfiltrat, welches man aus einem Fermentationsansatz wie in Beispiel 5 beschrieben durch Abschleudern des Mycels bei 13 000 Upm gewinnt und welches eine Aktivität von 13 000 SIE/g aufweist, wurden zur Reduktion des Salzgehaltes (Leitfähigkeit des Kulturfiltrates: ca. 10 mS • cm"1) mit 500 g eines Gemisches aus 2,5 Teilen Amberlite IRC-50 (H+-Form) und 1 Teil Amberlite IRA-410(OH'-Form)für 1 h gerührt. Der Austauscher wurde abgetrennt, die Lösung auf etwas unter 100 ml eingeengt und zur Entfernung ungelöster Bestandteile bei 20 000 UPm für 15 min centrifugiert. Der Überstand wurde auf 100 ml aufgefüllt; er wies nunmehr eine Leitfähigkeit von 3,5 mS* cm-' auf und wurde zur weiteren Reinigung auf eine Säule (55x400 nm) mit P-Celluiose (Serva Nr. 45130; nach bekannten Methoden vorbereitet und in 5 mM Ammoniumphosphat-Puf-fer; pH 5,5; äquilibriert) aufgetragen. Als Laufmittel diente genannter Phosphatpuffer; die Fliessgeschwindigkeit betrug 90 ml/h und Fraktionen von 18 ml Volumen wurden gesammelt.

Nachdem man die Fraktionen des Eluates auf ihren Gehalt an Kohlenhydraten (mittels Anthrontest) und an saccharase-inhibierenden Komponenten (mittels Saccharase-Inhibitions-test) geprüft hatte, vereinigte man diejenigen Fraktionen, welche sich im Anthrontest als nahezu frei von Kohlenhydraten und zugleich im Saccharase-Hemmtest als besonders wirksam erwiesen hatten (Fraktionen 60-170), engte auf 1501 ein und filtrierte über eine Säule (50 x 300 mm) mit Amberlite IRA-410 (HCOî'-Form). Zur besseren Kontrolle der Entionisie-rung wurde das Eluat in Fraktionen aufgefangen (10 ml pro Fraktion in 20 min) und auf Kohlenhydrat (mittels Anthrontest: durchweg nahezu negativ), auf Phosphat (mittels Ascorbin-säure-Molybdat-Reagenz: durchweg negativ) und auf Saccha-rase-Inhibition (mittels Enzymhemmtest) geprüft. Die hemmaktiven Fraktionen (3-30) wurden vereinigt, eingeengt und lyophilisiert, erneut aufgelöst und lyophilisiert, um 280 mg Rohinhibitor zu erhalten.

Zur weiteren Reinigung wurde der Rohinhibitor an Bio-Gel P-2 fraktioniert wie in Beispiel 6 beschrieben. Aus den Fraktionen, welche die reine Verbindung mit m + m = 1 enthielten, wurden nach Lyophilisation 30 mg eines Produktes isoliert mit 0,3x 106 AIE/g und 35 000 SIE/g.

Dazu wurden 30 g der Zubereitung nach Beispiel 1 in 250 ml h2o gelöst. Die Leitfähigkeit dieser Lösung beträgt 10 mS • cm-1, das pH 5,5. Zur Entsalzung wurde die Lösung mit 60 g Amberlite IRC 50 H+ (schwach saurer Kationenaustauscher, 5 der die Aminozuckerderivate aus wässriger Lösung nur spurenweise bindet) und 20 g Amberlite IRA 410 OH" versetzt und 20' gerührt. Das Filtrat (Leitfähigkeit 0,5 mS* cnr1, pH 3,5) wurde mit 1 n HCl auf pH 3,0 eingestellt (Leitfähigkeit 0,6 mS • cmr1). Diese Lösung wurde mit 42 ml/h durch eine mit Dowex 50 W 10 (H+) gefüllte Säule (0 2,5 cm, Höhe 40 cm, äquilibriert in 0,001 n HCl) gepumpt und anschliessend mit 210,001 n HCl nachgewaschen. Nach dem Waschen der Säule eluierte man mit 1,2% wässrigem Ammoniak und sammelte 10 ml Fraktionen. Die inhibitorisch aktiven Fraktionen wurden vereinigt, das Ammo-15 niak im Vakuum abgezogen und die Lösung anschliessend im Vakuum auf 30 ml eingeengt. Man fällte durch Eintropfen in 600 ml Trockensprit, nutschte den Niederschlag ab und trocknete im Vakuum nach Waschen mit Alkohol und Äther. Ausbeute 4,4 g mit 26,5 x 106 AIE/g.

20 Jeweils 0,5 g wurden zur Feinreinigung auf eine präparative Biogel-P-2- Säule, wie in Beispiel 8 beschrieben, aufgetragen und entwickelt. Die Fraktionen, die nach DC<Amylaseinhibi-tionsfärbung)-Verbindungen mit m + m = 5-7 enthalten, wurden vereinigt, im Vakuum eingeengt und wie oben beschrieben 25 mit Trockensprit gefällt. Ausbeute aus 0,5 g Rohprodukt: 0,2 g Aminozuckerderivat émit m + m = 5-7 mit 30x 106 AIE/g und 2500 SIE/g.

Beispiel 17

30 Dieses Beispiel zeigt, wie die erfindungsgemässen Verbindungen aus dem Kationenaustauscher unter sauren Bedingungen eluiert werden können.

Man füllt eine Säule vom Durchmesser 1,5 cm mit 30 g (Feuchtgewicht) Dowex® 50 Wx 4, (H+) 200-400 mesh in 0,001 35 n HCl. Anschliessend pumpt man 500 ml Mischdesorbat (400 000 SIE/1, pH 2,5,60% Aceton), erhalten nach Beispiel 9 (Tabelle, laufende Nr. 7) in ca. 1 Stunde durch die Säule und wäscht anschliessend mit 500 ml 0,001 n HCl nach. Unter diesen Bedingungen wird nur spurenweise Aktivität eluiert. Daran 40 anschliessend wurde mit 0,0125 n HCl desorbiert, wobei die Leitfähigkeit oder das Brechungsindex des Säuleneluats registriert wurde. Ausserdem wurde der SIE-Gehalt des Eluats getestet. Die aktiven Fraktionen 74-100 wurden vereinigt und durch Zugabe von Amberlite IRA 410 OH" neutralisiert, dann 45 eingeengt auf 5 ml, mit 5 ml Methanol reagiert und durch Eintropfen in 200 ml Aceton gefällt. Nach Waschen mit Aceton und Äther wurde im Vakuum getrocknet.

Ausbeute 1 g der Verbindung mit ni + m = 2 mit 65 000 SIE/g.

50 Aus den aktiven Vorfraktionen können die Verbindungen mit ni + n2 = 3 und 4 Glucoseeinheiten gewonnen werden.

Dieses Verfahren der sauren Desorption ermöglicht also im Gegensatz zur alkalischen Desorption eine Fraktionierung der einzelnen Aminozuckerderivate dieser Reihe.

55 Wenn man dem wie oben beschriebenen zubereiteten Stoff mit 4 bis 8 Glucoseeinheiten diesem Verfahren unterwirft, wobei die neutralisierten Eluat elediglich lyophilisiert werden, erhält man die folgenden einzelnen höheren Fraktionen: m + m = 4 = 67 000 AIE/mg 60 m + m = 5 = 57 000 AIE/mg m + m = 6 = 42 000 AIE/mg m + m = 7 = 24 000 AIE/mg m + n2 = 8 = 5 000 AIE/mg

Beispiel 16 65

Zur Gewinnung der Aminozuckerderivate mit 5-7 Glucose- Beispiel 18 einheiten geht man z. B. von einer Zubereitung, wie sie in Bei- Das oben beschriebene ß-Amylase-Abbauverfahren wird spiel 1 beschrieben wurde, aus. folgendermassen durchgeführt.

633043 20

100 mg Verbindung wurden in 1,9 ml 20 mM Natriumacetat- Beispiel 20 puffer (pH 4,75) gelöst und mit 0,1 ml ß-Amylase aus sweet Gereinigte Präparationen der Verbindungen mit m + m =

potato (Boehringer; 5 mg/ml; 500 E/mg) versetzt. Die Mischung können durch Kreislauf-Gelpermeationschromatographie wurde 48 Stunden bei 37 °C gehalten und für 5 Minuten auf (recycling gel permeation chromatography) nach folgendem

100 °C erhitzt und anschliessend bei 4500 Upm zentrifugiert, 5 Beispiel erhalten werden:

um ausgefälltes Eiweiss und andere Verunreinigungen zu ent- 6,0 g der gemäss Beispiel 8 oder 17 erhaltenen rohen Präparafernen. Die ganze Mischung wurde dann auf eine Säule mit tion von Verbindungen mit m + m = 4 und 5 werden durch Bio-Gel P 2 (Durchmesser 22 mm; 100 cm lang; bei 65 °C ther- Lösen des Materials in 1 nM Ammoniak und Aufbringen dieser mostatisiert) aufgetragen und mit Wasser bei einer Fliessge- Lösung auf eine Kolonne (Durchmesser 50 ml; Länge 100 cm) schwindigkeit von 25 ml/h eluiert. Das Eluat wird durch ein io gefüllt mit Sephadex G-10® von Salzbeimengungen befreit. Die Konduktometer und ein hochempfindliches Refraktometer mit Säule wird mit 1 nM Ammoniak eluiert und das Eluat mit Hilfe Durchflussküvetten geleitet. Fraktionen von jeweils 2,5 ml wur- eines Durchflussrefraktometers und eines Konduktometers mit den aufgefangen. Die Fraktionen können auf Amylase- oder einer Durchflusszelle überwacht. Das Eluat kann auch dünn-Saccharasehemmaktivität oder mittels des Anthrontests auf schichtchromatographisch an Silikage-Platten (n-Buta-Kohlenhydratgehalt geprüft werden. Die aus dem Puffer stam- is noI:Äthanol:Wasser = 45:35:20) überprüft werden. Fraktionen, menden Elektrolyten und das Enzympräparat werden mit dem die das zu reinigende Material enthalten, werden gesammelt Ausschlussvolumen und die Abbauprodukte nach abnehmen- und lyophilisiert (Ausbeute: 4,4 g).

dem Molekulargewicht eluiert. Vollständige Abtrennung der 2,0 g dieses Materials wird zur weiteren Trennung auf eine

Verbindungen, deren Molekulargewichte sich wenig unter- Säule (Durchmesser 50 mm; Länge 100 cm), gefüllt mit Bio-Gel scheiden, wird durch recycling chromatography unter den 20 P-2®, 200 bis 400 mesh, aufgebracht. Die Säule wird bei 65 °C oben beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Fraktionen, thermostatisiert und mit Wasser bei einer Fliessgeschwindig-die zu isolierende Produkte enthalten, werden vereinigt und keit von 80 ml/h eluiert.

lyophilisiert Die unbrauchbaren Fraktionen und solche Fraktionen, die

Salz enthalten, die nach der Sephadex-Chromatographie noch Beispiel 19 25 vorhanden sein können, werden verworfen. Das System, beste-

Zur Trennung der isomeren Verbindungen mit drei Gluco- hend aus Säule, Förderpumpe, Durchfluss-Refraktometer und seeinheiten wurden 10g einer in Wasser gelösten Isomerenmi- -konduktometer wird geschlossen und die Lösung wird im schung auf eine mit Dowex® 50 Wx4 (H+) gefüllte Säule aufge- Kreislauf durch das Gel geführt. Der Fortschritt der Trennung tragen. Die Säule wurde zuerst mit Wasser gewaschen, bis das wird durch ständiges Überwachen des Brechungsindex und der Eluat neutral war, und dann mit 0,025 n Salzsäure eluiert. Frak- 30 Leitfähigkeit überprüft. Eine ausreichende Trennung ist nach 5 tionen von jeweils 3 ml wurden aufgefangen und dünn- Umläufen erreicht. Danach wird die Säule wieder an das schichtchromatographisch geprüft. Dünnschichtchromatogra- Lösungsmittelreservoir angeschlossen und die Kolonne eluiert, phie wurde auf silanisierten Kieselgelplatten (Merck, Deutsch- wobei jeweils Fraktionen mit einem Volumen von 16 ml aufge-land) mit 100:60:40:2 Äthylacetat+Methanol+Wassern-25% fangen werden. Die Fraktionen werden durch Dünnschicht-Ammoniak mit dreifacher Entwicklung durchgeführt. Die Ver- 35 Chromatographie wie oben beschrieben getestet und die Frak-bindung der Formel IV läuft eine grössere Distanz vom Start- tionen, welche die reinen Verbindungen enthalten, und Zwi-punkt als die Verbindung der Formel V. Die 6 g Isomeres mit schenfraktionen werden gesammelt und lyophilisiert. Aus-der Formel V enthaltenden Fraktionen 215 bis 272 und die 600 beute: 600 mg der Verbindung mit m + m = 4; 420 mg der Ver-mg Isomeres mit Formel IV enthaltenden Fraktionen 288 bis bindung mit m + m = 5 und 100 mg wenig aufgetrenntes Mate-294 wurden vereinigt, mit Amberlite IRA-410 (OH-) neutrali- 40 rial aus den Zwischenfraktionen.

siert und eingeengt

Die In-vitro-Saccharase-Hemmaktivität des durch dieses Verfahren isolierten Isomeren der Formel IV ist 19 000 SIE/g.

G

4 Blatt Zeichnungen

Claims (8)

1. 633043
2. 2 chaoh h ch2oh oh in der m für eine Ziffer von 1 bis 8 und m für eine Ziffer von 0 2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von 0-(4,6-

   bis 8 steht und die Summe von m und m jedoch immer einen 20 Bisdesoxy4[lS-{l,4,6/5)4,5,6-trihydroxy-3-hydroxymethylcyclo-

   Wert von 1 bis 8 besitzt, wobei im Falle von m + m = 1 oder 2, hex-2-en-l-ylamino>a-D-glucopyranosyU-(l —4)-D-glucopyra-

   m stets gleich Null ist, durch aerobe Züchtung eines Mikroor- nose der konformativen Formel ganismus der Ordnung Actinomycetales in einem Nährmedium.

   hoch ho-'

   n ch0oh

   (IIB)

   2

   PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel

   CHjuOH \

   H-

   n h n0 / x
3. 3 633043

   3. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von 0-14,6- 45 copyranosyKl — 4>D-glucopyranose der konformativen For-Bisdesoxy-4-[l S-{ 1,4,6/5)4.5,6-trihydroxy-3-hydroxymethylcy- mei clohex-2-en-l-ylamino]-a-D-glycopyranosyl}-(l—4)-0-a-D-glu-

   (IIIB)

   0

   ch. oh
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von 0-{4,6- pyranosyll-(l —4)-0-a-D-glucopyranosyl)-(l —■4)-D-glucopyra-Bisdesoxy-4-[lS-(l,4,6/5)-4,5,6-trihydroxy-3-hydroxymethyl-4-0- nose der konformativen Formel a-D-glucopyranosyl-(l—4>cyclohex-2-en-l-ylamino)-a-D-glyco-

   ch20h j^ t «

   ch2oh

   ^vQH
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von Verbindungen der Formel I, worin m + m = 4 ist.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von Verbindungen der Formel I, worin m + m = 5 ist.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von Verbindungen der Formel I, worin m + m = 6 ist.
8. 8. Verfahren zur Herstellung von niedermolekularen Verbindungen der Formel I, worin m + m den Wert von 1 bis 4 hat, dadurch gekennzeichnet, dass man das Verfahren gemäss Anspruch 1 ausführt und die gebildete Kulturbrühe vor Isolierung der Fermentationsprodukte oder aber die isolierten Fermentationsprodukte einer chemischen oder enzymatischen Hydrolyse unterwirft.