CH633584A5 - Verfahren zur herstellung von an traeger gebundenen gereinigten enzymen und verwendung derselben zur herstellung von xylose durch enzymatische hydrolyse von xylanen. - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur He_r-ellungvon an Träger gebundenen gereinigten Enzymen, die zur enzymatischen Hydrolyse von Xylanen geeignet sind,

sowie deren Verwendung zur Herstellung von Xylose durch enzymatische Hydrolyse von Xylanen.

Der Einsatz von nativen, löslichen Enzymen zur Verzuckerung von Holzzellwandpolysacchariden ist bekannt (vgl. H.H. Dietrichs: Enzymatischer Abbau von Holzpolysacchariden und wirtschaftliche Nutzungsmöglichkeiten. Mitt Bundesforschungsanstalt für Forst- und Holzwirtschaft Nr. 93,1973, 153-169). Andererseits ist es bekannt, die Immobilisierung von Enzymen an unlöslichen Trägern vorzunehmen. Immobilisierte Enzyme sind stabiler und lassen sich leichter handhaben als lösliche Enzyme. Es ist bisher jedoch nicht bekannt, immobilisierte Enzyme zur Verzuckerung von löslichen Zellwandpolysaccha-riden einzusetzen.

Zur Hydrolyse von Pflanzenzellwandpolysacchariden eignen sich Enzyme besonders aus Kulturfiltraten von Mikroorganismen (Sinner, M.: Mitteilungen der Bundesforschungsanstalt für Forst- und Holzwirtschaft Reinbek-Hamburg Nr. 104, Januar 1975, Claeyssens, M. et al. FEBS Lett. 11,1970,336-338. Reese, E.T. et al. Can J. Microbiol. 19,1973,1065-1074).

Diese Mikroorganismen produzieren eine Vielzahl von Proteinen, u.a. von Hemizellulose-spaltenden Enzymen. Diese freien, nicht gebundenen Enzyme sind jedoch unter ihren optimalen Reaktionsbedingungen nur relativ kurze Zeit aktiv, maximal einige Tage. Für eine Verwendung in technischem Massstab sind sie deshalb ungeeignet. Wenn man versucht die Enzyme aus den Kulturfiltraten von Mikroorganismen, d.h. ungereinigte «Rohenzyme» an Träger anzulagern, würden im wesentlichen alle im Rohenzym vorhandenen Proteine, d.h. auch die jeweils unerwünschten Enzyme an den Träger gebunden werden. Wenn man versucht mit derartigen trägergebundenen Enzympräparaten Xylane, z.B. Laubholzxylane durch enzymatische Hydrolyse in Xylose zu überführen, würden ausserordentlich grosse Mengen derartiger trägergebundener Enzyme erforderlich sein, weil ein grosser Teil der nicht benötigten Enzyme nutzlos die Oberfläche des Trägers einnimmt, während nur ein kleiner Teil der angelagerten Enzyme, nämlich die xylanolytischen Enzyme, ihre katalytische Wirkung entfalten.

Es sind Verfahren bekannt, um aus einem Gemisch von Enzymen gewisse gewünschte Enzyme in gereinigter Form zu gewinnen, wobei die unterschiedliche elektrische Ladung, Molekülgrösse oder Affinität der Enzyme zu einem Affektor ausgenutzt werden (Sinner, M. u. H.H. Dietrichs, Holzforschung 29,1975,168-177, Robinson, P.J. et aL, Biotechnol. Bioeng. 16,1974,1103-1112).

Es ist weiterhin bekannt, dass am Abbau von pflanzlichen wasserlöslichen Zellwandpolysacchariden zu monomeren Zuk-kern mindestens zwei Enzymgruppen beteiligt sind, und zwar Glycanasen, die die Bindungen innerhalb eines Polysaccharids wahllos mit Ausnahme der Bindungen am Kettenende spalten, und Glycosidasen, die die von den Glycanasen freigesetzten Oligosaccharide in monomere Zucker zerlegen. So sind im Falle des Xylanabbaus ß-l,4-Xylanasen sowie ß-Xylosidasen erforderlich. Sofern Xylane vorliegen, die als Seitengruppen 4-O-Methylglucuronsäure enthalten, ist zusätzlich ein bisher nicht bekanntes Uronsäure-abspaltendes Enzym erforderlich. Die einzelnen Enzyme Hessen sich u.U. auch vorteilhaft aus verschiedenen Quellen gewinnen.

Es ist bekannt, dass sich beide Enzymgruppen hinsichtlich ihres Molekulargewichts und hinsichtlich der Bedingungen unterscheiden, bei denen sie ihre optimale Aktivität entwickeln (vgl. Ahlgren, E. et al. Acta Chem. Scandinavia 21,1967, 937-944).

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von an Träger gebundenen gereinigten Enzymen zu finden, die zur Herstellung von Xylose durch enzymatische Hydrolyse von Xylanen geeignet sind.

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Weiterhin liegt der Erfindung die Aufgabenstellung zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Xylose durch enzymatische Hydrolyse von Xylanen zu finden, das in einfacher Weise mit hoher Wirksamkeit bzw. hoher Ausbeute durchführbar ist,

wobei hochwirksame an Träger gebundene Enzyme verwendet werden. Es wurde überraschenderweise gefunden, dass in überaus einfacher Weise aus einem Rohenzym durch Reinigung und Bindung an Träger derartige Enzymsysteme hergestellt werden können. Es wurde weiterhin gefunden, dass die zweite Aufgabenstellung in einfacher Weise gelöst werden kann, wenn man auf die Xylanlösung verschiedene an Träger gebundene Enzymsysteme mit unterschiedlicher Wirkung einwirken lässt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demgemäss ein Verfahren zur Herstellung von an Träger gebundenen gereinigten Enzymen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein Xylanase und ß-Xylosidase enthaltendes Rohenzym durch Ultrafiltration trennt in eine Fraktion, die im wesentlichen nur Xylanase enthält, und eine Fraktion, die im wesentlichen nur ß-Xylosidase enthält, und diese beiden Fraktionen getrennt an Träger bindet. Wenn man ein Rohenzym verwendet, das ausserdem Uronsäure-abspaltendes Enzym enthält, so ist das Uronsäure-abspaltende Enzym in derjenigen Fraktion enthalten, die die ß-Xylosidase enthält.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin die Verwendung der so hergestellten, an Träger gebundenen gerei- 25 nigten Enzyme zur Herstellung von Xylose durch enzymatische Hydrolyse von Xylanen oder Xylanbruchstücken, die dadurch gekennzeichnet ist, dass man auf eine wässrige Lösung von Xylanen oder Xylanbruchstücken einwirken lässt a) einen Träger, der von den xylanolytischen Enzymen im wesentlichen nur Xylanase gebunden enthält,

b) einen Träger, der von den xylanolytischen Enzymen im wesentlichen nur ß-Xylosidase gebunden enthält.

Der Träger b) kann ausserdem auch Uronsäure-abspaltendes Enzym gebunden enthalten.

Es gibt Uronsäure-haltige Xylane und Xylane, die keine Uronsäure enthalten. Xylane, die Uronsäure enthalten, können enzymatisch gespalten werden, wenn der unter b) genannte Träger auch Uronsäure-abspaltendes Enzym gebunden enthält. Wenn die Xylane keine Uronsäure enthalten, ist ein Gehalt an Uronsäure-abspaltendem Enzym nicht erforderlich.

Die Erfindung eröffnet einen ausserordentlich einfachen und wirksamen Weg, um in hoher Ausbeute aus den in grossen Mengen vorhandenen aus pflanzlichen Rohstoffen stammenden Xylanen das Monosaccharid Xylose herzustellen. Die Xylose ist ein wertvoller Zucker, der als solcher verwendet oder gegebenenfalls zu Xylit reduziert werden kann, der wiederum ein wertvoller bisher nur verhältnismässig schwer in grossen Mengen zugänglicher Stoff ist

Als Rohenzyme werden im erfindungsgemässen Verfahren vorzugsweise Kulturfiltrate von Mikroorganismen verwendet, die diese Enzyme produzieren. Derartige Mikroorganismen sind in grosser Zahl bekannt z.B. Trichoderma viride, Bacillus pumilus, verschiedene Aspergillus-Arten und Penicillium-Arten. Aus Mikroorganismen erhaltene Rohenzympräparate sind bereits vielerorts als Handelsprodukte erhältlich, und diese können im Verfahren gemäss der Erfindung verwendet werden. Besonders bevorzugt sind naturgemäss solche Präparate, die eine besonders starke xylanolytische Wirkung besitzen. Beispiele hierfür sind Celluzyme 450 000 (Nagase), Cellulase 20 000 60 und 9 x (Miles Lab, Elkard, Indiana), Cellulase Onozuka P 500 und SS (All Japan Biochem. Co, Japan), Hemicellulase NBC (Nutritional Biochem. Co, Cleveland, Ohio).

Nachfolgend wird eine Aufstellung von Mikroorganismen gegeben, die besonders viel Enzym mit xylanolytischer Wirkung produzieren. Weiterhin sind Literaturstellen genannt,

worin derartige Mikroorganismen und ihre optimalen Kulturbedingungen angegeben sind.

Aspergillus niger QM 877 für ß-Xylosidase Pénicillium wortmanni QM 7322 Reese et al., Can. J.

Microbiol. 19,1973, 1065-1074

Trichoderma viride QM 6 a für Xylanase

Reese u. Handels, Appi. Microbiol. 7,1959, 378-387

Culture Collection der US Natick Laboratories, Natick, Massachusetts 01760, USA

Fusarium roseum QM 388 für Xylanase

Philadelphia QM Depot

Trichoderma viride CMI45553 für Xylanase

Gascoigne u. Gascoigne, J. Gen. Microbiol. 22, 1960,242-248 Commonwealth Mycological Institute, Kew

Fusarium moniliforme CMI 45499 für Xylanase Bacillus pumilus PRL B12 für ß-Xylosidase

Simpson, F.J, Canadian J. Microbiol. 2,1956, 28-38

Prairie Regional Laboratory Saskatoon, Saskatchewan,

Canada

Coniophora cerebella für Xylanase

King, Füller, Biochem. J. 108,1968,571-576 F.P.F.L. culture no. 11 E Forest Products Research Laboratory Princess Risborough, Buck.

35 Bacillus No. C-59-2 für Xylanase äusserst thermostabil breites pH-Optimum 2-Tage-Kultur Institute of Physical and Chemical Research Wako-shi, Saitama 351

40 K. Horikoshi u. Y. Atsukawa,

Agr.Biol.Chem.37,1973, 2097-2103

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Weitere Angaben über Mikroorganismen mit starken xylanolytischen Enzymen können aus den nachfolgenden Literaturstellen entnommen werden:

ß-Xylosidasen Aspergillus niger Botryodiplodia sp. Pénicillium wortmanni Chaetomium trilaterale

55 Bacillus pumilus

ß-1 —4-Xylanasen Trichoderma viride

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A. batatae

Reese, E.T. et al, Can. J. microbiol. 19,1973,1065-1074

Kawaminami, Lu. H. Izuka, J. Ferment. Technol. 48,1970, 169-176

Simpson, F.J, Can. J. Microbiol. 2,1956,28-38

Reese, F.T. u. M. Mandels, Appi. Microbiol. 7,1959, 378-387

Nomura, K. et al, J. Ferment Technol. 46,1968,634-640 Takeniski, S. et al, J. Biochem. (Tokyo) 73,1973,335-343 Fukui, S. u. M. Sato, Bull, agric. ehem. Soc. Japan 21,1957, 392-393

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A.oryzae Fusarium roseum

P. janthinellum

Chaetomium trilaterale

Coniophora cerebella

Trametinae

Coriolinae

Lentineae

Tricholomateae

Coprinaceae

Fomitinae

Polyporinae

Bacillus No. C-59-2

Streptomyces xylophagus

Bacillus subtilis

Fukui, S., J. Gen. Appi. Microbiol. 4,1958,39-50 Gascoigne, J.A. u. M.M. Gascoigne. J. Gen. Microbiol. 22,1960,242-248 Takenishi, S. u. Y. Tsujisaka, J. Ferment.Technol.51,1973, 458-463

Iizuka, H.u. Kawaminami, Agr. Biol. Chem.33,1969,1257-1263 King, N.J., Biochem. J. 100, 1966,784-792 Kawai, M., Nippon, Nogei Kagaku Kaishi47,1973, 529-534

(aus einem ScreeningTest unter Basidiomyceten)

Horikoshi, K. u. Y. Atsukawa, Agr. Biol. Chem. 37,1973, 2097-2103

Iizuka, H. u. T. Kawaminami, Agr. Biol. Chem. 29,1956, 520-524

Lyr, H, Z. Allg. Mikrobiol. 12, 1972,135-142

Das an dem Träger gebundene gereinigte Enzym wird vorzugsweise dadurch hergestellt, dass man eine Rohenzym-Lösung von unlöslichen Bestandteilen, zweckmässig durch normale Filtration, befreit, die Lösung durch ein Ultrafilter mit dem Trennbereich von mindestens etwa MG 80 000 und höchstens etwa MG 120 000, vorzugsweise etwa MG 100 000 filtriert, den Überstand durch ein Ultrafilter mit dem Trennbereich von mindestens etwa MG 250 000 und höchstens etwa MG 350 000, vorzugsweise etwa MG 300 000, filtriert und das im wesentlichen ß-Xylosidase und gegebenenfalls Uronsäure-abspaltendes Enzym enthaltende Filtrat an einen Träger bindet, das Filtrat der Ultrafiltration mit dem zuerst genannten Trennbereich durch einen Ultrafilter mit dem Trennbereich von mindestens etwa MG 10 000 und höchstens etwa MG 50 000, vorzugsweise etwa MG 30 000, filtriert und das im wesentlichen Xylanase enthaltende Filtrat an einen Träger bindet. Zur Durchführung dieses Verfahrens wird das Rohenzym zweckmässig in der etwa 10- bis 30fachen, vorzugsweise der -etwa 20fachen, Menge Wasser gelöst.

Eine noch stärkere Reinigung der im wesentlichen Xylanase enthaltenden Fraktion kann dadurch ausgeführt werden, dass man das im wesentlichen Xylanase enthaltende Filtrat nach der Filtration durch einen Ultrafilter mit dem Bereich von etwa MG 10 000 bis 50 000 durch einen Ultrafilter mit dem Trennbereich von mindestens etwa MG 300 und höchstens etwa MG 700, vorzugsweise etwa MG 500, filtriert und den Überstand an den Träger bindet Durch diese zusätzliche Ultrafiltration wird die Xylanase konzentriert. Gleichzeitig wird die grösste Menge der Kohlenhydrate, die bis zu etwa 40% des Ausgangsmaterials betragen kann, im Ultrafiltrat abgeschieden. Wenn in dieser Patentschrift die Worte «im wesentlichen» in Zusammenhang mit den genannen Enzymen gebraucht werden, so wird darunter verstanden, dass die in der jeweiligen Fraktion enthaltenen Enzyme im Hinblick auf xylanolytische Wirkung im wesentlichen aus dem jeweils genannten Enzym bestehen bzw. dass die jeweilige Fraktion als Enzym in erster Linie das jeweils genannte Enzym enthält Nach Durchführung der Reinigungsoperation wird z.B. eine Xylanase-Fraktion erhalten, in der ein Gehalt an ß-Xylosidase praktisch nicht mehr nachweisbar ist Das Gleiche gilt in umgekehrtem Sinne für die ß-Xylosidase-Fraktion. Im Verfahren gemäss der Erfindung, insbesondere zur Durchführung der Herstellung von Xylose durch enzymatische Hydrolyse von Xylanen, können aber auch solche Träger verwendet werden, die nicht einen so 5 hohen Reinheitsgrad an dem jeweiligen Enzym aufweisen. Beispielsweise werden die vorteilhaften Ergebnisse gemäss der Erfindung auch dann erhalten, wenn unter dem Begriff «im wesentlichen» verstanden wird, dass das jeweilige Enzym mindestens etwa 80%, vorzugsweise mindestens etwa 90% und i° besonders bevorzugt mindestens etwa 95% der jeweiligen gewünschten Hauptaktivität ausmacht.

Es ist überraschend, dass durch diese einfache Ultrafiltration eine Auftrennung des Rohenzymes in die gewünschten Komponenten möglich ist, die auf diese Weise in hoher Rein-«5 heit erhalten werden. Besonders überraschend und vorteilhaft ist es, wenn in der Fraktion, die die ß-Xylosidase enthält, auch das Uronsäure-abspaltende Enzym enthalten ist. Xylanase und ß-Xylosidase allein sind nicht in der Lage, die durch das Einwirken der Xylanase auf die Xylan-Kette gegebenenfalls mitent-20 standenen sauren Xylanbruchstücke in der Abbaulösung weiter zur monomeren Xylose zu spalten. Die sauren Xylooligomeren müssen erst durch die katalytische Wirkung des Uronsäure-abspaltenden Enzymes vom Säurerest befreit werden, ehe sie weiter bis zur Xylose hydrolysiert werden. 25 Die Anlagerung der gereinigten Enzymfraktionen an Träger kann nach an sich bekannten Verfahren erfolgen. Es sind verschiedene Anlagerungsverfahren bekannt, die sich nach Art der Bindung (Adsorption, kovalente Bindung an der Trägeroberfläche, kovalente Quervernetzung, Einschluss u.a.) und 30 Schwierigkeitsgrad und Aufwand bei der Herstellung der Bindung unterscheiden. Bevorzugt sind solche Verfahren, die eine dauerhafte Bindung gewährleisten (kovalente Bindung), die auch bei höhermolekularen Substraten Diffusionsbehinderungen gering halten und die einfach durchzuführen sind. Für das 35 Verfahren gemäss der Erfindung haben sich als besonders vorteilhaft erwiesen: 1. Bindung über Glutaraldehyd (Weetall, H.H., Science 166,1969,615-617), 2. Bindung über Cyclohexyl-morpholinoäthyl-carbodiimidtoluolsulfonat (CMC) Line, W.F. et al., Biochem. Biophys. Acta 242,1971,194-202), 3. Bindung « über TiCU (Emery, A.N. et al, Chem. Eng. (London) 258,1972, 71-76).

Als Träger können für das Verfahren gemäss der Erfindung alle auf diesem technischen Gebiet üblichen Träger eingesetzt werden, wie Stahlstaub, Titanoxid, Feldspat und andere Mine-45 ralien, Seesand, Kieselgur, poröses Glas und Kieselgel. Die verwendbaren Träger sind jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt. Als poröses Glas kann z.B. das Handelsprodukt CPG-550, Corning Glass Works, Corning N.Y. eingesetzt werden und als Kieselgel das Handelsprodukt Merckogel SI-1000, so Merck AG, Darmstadt Zur Herstellung der Träger-Enzymbin-dung nach Methode 1 und 2 ist es günstig, die Träger über Nacht im Rückfluss mit etwa 5 bis 12%, vorzugsweise etwa 10%, y-Aminopropyltriäthoxysilan in Toluol zu erhitzen. Durch diesen Schritt wird das jeweilige Trägermaterial mit einer primä-55 ren Aminogruppe ausgestattet Bei Methode Nr. 3 ist dieser Schritt nicht notwendig.

Nach intensiver Waschung mit geeigneten Lösungsmitteln wie Toluol und Aceton folgt in der Regel die Aktivierung der Träger. Dieser Schritt besteht bei Methode 1 darin, dass der 60 jeweilige Träger in etwa 3- bis 7%ige, vorzugsweise etwa 5%ige Glutaraldehyd-Lösung des Anlagerungspuffers gerührt wird. Ein Puffer-pH von 6,5 hat sich als günstiger erwiesen als ein Puffer -pH von pH 4. Je höher der Anlagerungs-pH, desto mehr • Protein wird gebunden. Da die Enzyme aber im schwach sau-65 ren Bereich stabil sind, kommt für die Anlagerung ein pH von 6-7,5, vorzugsweise von 6,5, in Frage.

Nach 60 Minuten Inkubation, teilweise unter Vakuum, hat es sich als günstig erwiesen, die überschüssige Glutaraldehyd-

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Lösung abzusaugen. Das Trägermaterial wird zweckmässig Ein Verfahren zur Herstellung dieser Xylanlösungen ist im noch einmal gründlich gewaschen, ehe es mit der Enzymlösung einzelnen beschrieben in der österreichischen Patentschrift Nr. inkubiert wird. 361 506 mit dem Titel «Verfahren zur Gewinnung von Xylan

Bei Methode 2 wird der Alkylaminträger zweckmässig erst und Faserstoffen aus xylanhaltigen pflanzlichen Rohstoffen», mit dem zu kuppelnden Enzym 5 Minuten gut verrührt, ehe das 5 Die sonstigen Bedingungen bei der Xylanhydrolyse mit die Kupplung startende Reagenz CMC zugegeben wird. Die Hilfe trägergebundener Enzyme unterscheiden sich gegenüber zugegebene Menge an CMC ist kritisch. Bei zu geringer der Hydrolyse mit freien Enzymen im wesentlichen dadurch,

Zugabe an CMC wird nur wenig Enzym gebunden. Bei zu hoher dass aufgrund der höheren Stabilität der gebundenen Enzyme Gabe an CMC besteht Gefahr der Quervernetzung mit Aktivi- höhere Temperaturen gewählt werden können, wodurch die tätsverlust für das Enzym. Auf 1 g Träger und 150 mg Enzym io Reaktion beschleunigt wird. Temperaturen im Bereich von hat sich eine Menge von etwa 350 bis 450 mg, vorzugsweise 30-60 °C, vorzugsweise im Bereich von 40-45 °C, ergeben in von etwa 400 mg, CMC als günstig erwiesen. Der pH-Wert wird der Regel optimale Ergebnisse.

während der ersten 30 Minuten der Inkubation zweckmässig Es ist weiterhin von Vorteil, dass im Gegensatz zu den mit 0,1 n-HCl auf pH 3 bis 5, vorzugsweise etwa 4,0, gehalten. freien Enzymen, die einen relativ engen Optimal-pH-Bereich Dieser pH-Wert hat sich als günstiger erwiesen als ein 15 aufweisen, mit den gebundenen Enzymen in einem erheblich pH-Wert von 6,5. CMC-Methode und TiCU-Methode eignen weiteren Bereich gearbeitet werden kann. Die jeweiligen obe-sich besonders für Enzyme, die im sauren Bereich stabil sind. ren und unteren Grenzwerte hängen von den jeweiligen kon-Die höchsten Proteinmengen werden im sauren Bereich gebun- kreten Enzymen ab. Im allgemeinen kann man sagen, dass den. zweckmässig im Bereich von pH 3 bis 8, vorzugsweise 4 bis 5,

Bei Methode 3 kann die Aktivierung des Trägers darin 20 gearbeitet werden kann, um optimale Hydrolyse zu erzielen, bestehen, dass der unbehandelte Träger in etwa 6 bis 15%ige, Damit erübrigt sich in der Regel der Zusatz von Puffer zur Ein-vorzugsweise etwa 12,5%ige, wässrige TiCU-Lösung gerührt, Stellung genauer pH-Werte.

das überschüssige Wasser abgedampft und das Reaktionspro- Die Konzentration der Xylane in der Lösung kann in ver-

dukt bei 45 °C im Vakuumtrockenschrank getrocknet wird. hältnismässig weiten Grenzen schwanken. Die obere Grenze Anschliessend wird es zweckmässig intensiv mit dem Anlage- 25 wird bestimmt durch die Viskosität der Lösungen und diese rungspuffer gewaschen, ehe es mit der anzulagernden Enzym- wiederum durch den DP (Durchschnittspolymerisationsgrad) lösung inkubiert wird. der Xylane; im Mittel kann mit einer oberen Grenze von etwa

Die Inkubation des aktivierten Trägers mit der Enzymlö- 8%, in manchen Fällen etwa 6% gerechnet werden.

sung ist in der Regel nach mehreren Stunden, z.B. über Nacht, Die untere Grenze ist im wesentlichen dadurch gegeben,

beendet. Der Zeitraum der Inkubation ist nicht besonders kri- 30 dass ein Arbeiten in zu verdünnten Lösungen unwirtschaftlich tisch. Die Inkubation wird zweckmässig bei Normaltemperatur werden kann. Es ist besonders vorteilhaft, die nach der oben durchgeführt. erwähnten österreichischen Patentschrift erhaltenen Xylan-

Die trägergebundenen Enzympräparate werden nach dem Lösungen ohne weitere Verdünnung einzusetzen. Anlagerungsvorgang zweckmässig über eine Fritte mit 1 M Die enzymatische Hydrolyse wird in der Regel so lange

NaCl in 0,02 M Phosphatpuffer pH 4 und anschliessend mit 0,02 35 durchgeführt, bis im wesentlichen die gesamtn Xylane zu M Phosphatpuffer pH 5 gewaschen, bis kein Enzym mehr im Xylose abgebaut wurden, was durch Analyse der Lösung leicht Waschwasser nachgewiesen werden kann. festgestellt werden kann. Es wird dazu auf den Vergleichsver-

Gemäss dem Verfahren der Erfindung wird eine ausseror- such verwiesen. Im Chargenverfahren kann ein vollständiger dentlich weitgehende Reinigung der Enzyme durchgeführt, die Abbau zu Xylose nach etwa 4 Stunden erreicht werden.

für den Abbau der Xylane benötigt werden. Man erhält somit 40 Das Verfahren gemäss der Erfindung kann aber auch in Träger mit einer ausserordentlich hohen spezifischen katalyti- kontinuierlicher Weise dadurch ausgeführt werden, dass die sehen Aktivität, und die enzymatische Hydrolyse von Xylanen Xylan-Lösung durch eine Säule geleitet wird, die mit den lässt sich vorteilhaft ausführen. Besonders überraschend ist, gemäss der Erfindung verwendeten Enzympräparaten gefüllt wie der nachfolgend beschriebene Vergleichsversuch zeigt, ist. Im Säulenbetrieb lässt sich die Inkubationszeit leicht durch dass die Ausbeute an Xylose gemäss dem Verfahren ganz 45 Säulenabmessungen und die Durchflussgeschwindigkeit beträchtlich grösser ist als dann, wenn man Xylanase, ß-Xylosi- steuern.

dase und Uronsäure-abspaltendes Enzym gemeinsam an einen In der Beschreibung und in den Beispielen handelt es sich Träger bindet und versucht, die enzymatische Hydrolyse von bei % um Gewichts-%, soweit nichts anderes angegeben ist. Die Xylanen dadurch auszuführen, dass man auf eine wässrige Gewinnung bzw. Isolierung und Reinigung der gewünschten in

Xylanlösung diesen alle drei Enzyme enthaltenden Träger ein- 50 Lösung vorliegenden Stoffe erfolgt, soweit sie zweckmässig ist, wirken lässt. nach den auf dem Gebiet der Zuckerchemie üblichen Verfah-

Die als Ausgangsprodukt eingesetzten Xylane bzw. Xylan- ren, z.B. durch Einengen der Löschungen, Versetzen mit Flüs-bruchstücke sind bekanntlich Hemizellulosen, die aus pflanzli- sigkeiten, in denen die gewünschten Produkte nicht oder chen Rohstoffen verschiedener Art gewonnen werden können, schwer löslich sind, Umkristallisation usw. «Atro» bedeutet Beispiele für solche pflanzlichen Rohstoffe sind Laubhölzer, 55 «absolut trocken».

Stroh, Bagasse, Getreidespelzen, Maiskolbenreste, Maisstroh usw. Wenn als pflanzliche Rohstoffe solche verwendet werden, Beispiel 1 : Trennung und Konzentrierung von Xylanase und die als Hemizellulosen in erster Linie Xylane enthalten, z.B. ß-Xylosidase aus einem Enzym-Handelspräparat einen Xylangehalt von über etwa 15 Gew.-%, vorzugsweise 220 g des im Handel erhältlichen Rohenzym-Präparates

über etwa 25 Gew.-%, aufweisen, können die beim Auslaugen in 60 «Celluzyme» der Firma Nagase wurden in 4,810,02 M AmAc die wässrige Phase übergehenden Xylane und Xylanbruch- Puffer (Ammoniumacetat-Puffer) pH 5 gelöst. Der unlösliche stücke in vorteilhafter Weise für das Verfahren gemäss der Rückstand wurde teilweise yber eine Fritte entfernt. Anschlies-Erfindung eingesetzt werden. Die Xylanlösung wird dabei send wurde die Enzymlösung über einen Teflonfilter (Chem-

zweckmässig dadurch erhalten, dass man die xylanhaltigen wäre 90 CMM Coarse) klarfiltriert. Es folgte die Ultrafiltration pflanzlichen Rohstoffe einer Dampf-Druckbehandlung mit 65 der Enzymlösung am Ultrafiltrationsgerät TCF-10 der Firma Sattdampf bei Temperaturen von etwa 160-230 °C während Amincon (Lexington, Massachusetts).

etwa 2 bis 60 Minuten aussetzt und die so aufgeschlossenen Folgende Amincon-Ultrafilter wurden verwendet (in der pflanzlichen Rohstoffe mit einer wässrigen Lösung auslaugt. Reihenfolge der Anwendung):

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XM 100 A (Trennbereich MG 100 000) XM300 (Trennbereich MG 300 000) PM30 (Trennbereich MG 30 000) DM5 (Trennbereich MG 500)

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Die gereinigte Rohenzym-Lösung wurde also zunächst mittels des Filters mit dem Trennbereich MG 100 000 filtriert. Dan : befand sich die Xylanase überwiegend im Ultrafiltrat. Die p-Xylosidase und ein bisher unbekanntes Enzym, das für die Abspaltung der 4-O-Methylglucuronsäure von sauren Xylooli- io gomeren verantwortlich ist, befanden sich überwiegend im Überstand.

Der Überstand dieser Ultrafiltration wurde nun durch den Ultrafilter mit dem Trennbereich MG 300 000 filtriert. Am Ende dieser Behandlung war die ß-Xylosidase zusammen mit is der Uronsäure-abspaltenden Enzymaktivität nur in der klaren Lösung des Ultrafiltrats nachweisbar, während der dickflüssige dunkelbraune Überstand keine ß-Xylosidaseaktivität und keine Uronsäure-abspaltende Aktivität enthielt.

Das bei der ersten Ultrafiltration erhaltene Filtrat wurde 20 auf folgende Weise aufgearbeitet:

Ultrafiltration an PM 30: Die Xylanase befand sich nach diesem Schritt wiederum im Ultrafiltrat. Nicht Xylanase-aktive Substanzen wurden im Überstand abgeschieden.

Ultrafiltration an DM 5: Die Xylanase befand sich im Über- 25 stand; sie wurde durch diesen Schritt konzentriert. Gleichzeitig wurde die grösste Menge der Kohlenhydrate (im Ausgangsmaterial: 39%) im Ultrafiltrat abgeschieden.

In der nachfolgenden Tabelle sind die Aktivitäten an Xylanase, ß-Xylosidase und Uronsäure-abspaltenden Enzym ange- 30 geben. Bei den angegebenen Werten handelt es sich um «units». 1 Unit ist die Enzymmenge, die den Zuckergehalt der Abbaulösung (1% Buchenholzxylan für Xylanase, 2 mMol p-Nitrophenylxylopyranosid für ß-Xylosidase, 0,2 jig/p.1 4-O-MethylglucuronosyIxyIotriose für das Säure-abspaltende 35 Enzym) bei 37 °C um 1 jiMol Xylose für Xylanase und ß-Xylosi-dase und 1 jiMol 4-O-Methylglucuronsäure für das Säureabspaltende Enzym erhöht.

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Xylose umgerechnet. Als Substrat des Uronsäure-abspaltenden Enzyms diente 4-O-Methylglucuronosylxylotriose. Die Abbaulösungen wurden säulenchromatografisch an Durrum DA X-4 analysiert (Sinner, M, M.H. Simatupang u. H.H. Dietrichs, Wood Sei. Technol. 9,1975,307-322). Die freigesetzte Menge an 4-O-Methylglucuronsäure wurde n |iMol/Min. berechnet.

Beispiel 2: Anlagerung der Enzyme an Träger

Als Enzymträger wurde poröses Glas (CPG-550, Corning Glass Works, Corning N.Y.) gewählt. Die xylanolytischen Enzyme wurden über Glutaraldehyd (Weetall, H.H., Science 166,1969,615-617) an den Enzymträger gebunden.

1 g des als Träger verwendeten porösen Glases wurden über Nacht mit 10% •y-AminopropyltriäthoxysHan in Toluol am Rückfluss erhitzt. Dadurch wurde der Träger mit einer primären Aminogruppe ausgestattet. Anschliessend wurde intensiv mit Toluol und Aceton nacheinander gewaschen. Danach wurde der Träger mit 20 ml einer 5%igen Glutaraldehydlösung in einem 0,02 Phosphat-Puffer bei pH 6,5 gerührt. Zunächst wurde 15 Min. unter Vakuum (300 torr) gerührt, dann wurde 45 Min. unter Normaldruck weiter inkubiert. Danach wurde abgesaugt und das Trägermaterial wurde gründlich mit 200 ml Puffer gewaschen.

Unter Verwendung dieses aktivierten Trägermaterials wurden zwei trägergebundene Enzympräparate hergestellt:

a) 1 g des aktivierten Trägers wurde mit 5 ml der nach Beispiel 1 erhaltenen 657 units Xylanase-Enzymlösung über Nacht gerührt. Danach wurde über eine Fritte mit 1 m NaCI in 0,02 M Phosphatpuffer pH 4 und anschliessend mit 0,02 m Phosphatpuffer pH 5 gewaschen, bis kein Enzym mehr im Waschwasser nachweisbar war.

Das so erhaltene Präparat 1 enthält pro g 64 units wirksamer Xylanase gebunden.

b) Es wird wie unter a) verfahren, wobei jedoch 5 ml der gemäss Beispiel 1 erhaltenen Lösung verwendet werden, die 33 units ß-Xylosidase und 60 units Uronsäure-abspaltende Enzyme enthält. Das erhaltene Präparat 2 enthält pro g etwa 33 units ß-Xylosidase und 60 units Uronsäure-abspaltende Enzyme gebunden.

Xylanase

ß-Xylosidase

Glucuronsäure-

abspaltende

Aktivität

Celluzyme

34 560 U

1541 U

2568 U

gelöst

XM 100 A

7 968 U

1290 U

1996 U

Überstand

XM 100 A

24 480 U

13 U

524 U

Ultrafiltrat

XM 300

-

1011 U

1817 U

Ultrafiltrat

PM 30

21 173U

Ultrafiltrat

DM5

19 730

Überstand

Die Nachweise der Aktivitäten erfolgte nach den nachfolgend beschriebenen Verfahren:

Der Nachweis der Xylanase mit Buchenholzxylan als Substrat erfolgte reduktometrisch (Sumner, vgl. Hostettler, F, E. Borei u. H. Deuel, Helv. Chim. Acta 34,1951,2132-2139). Zur Messung der ß-Xylosidase-Aktivität wurde die auf 1,5 ml verdünnte p-Nitrophenylxylosid-Lösung mit 2 ml 0,1 M Boratpuffer pH 9,8 versetzt Die Extinktion des freigewordenen p-Nitro-phenols wurde direkt bei 420 nm bestimmt Die Menge an p-Nitrophenol wurde über eine Eichkurve abgelesen und in

Herstellung der Xylanlösung A. Aufschlussprozess

400 g Rotbuchenholz in Form von Hackschnitzeln, lufttrok-45 ken, wurden im Asplund-Defibrator mit Dampf für 6 bis 7 Minuten bei 185-190 °C, entsprechend einem Druck von etwa 12 at, behandelt und etwa 40 Sekunden defibriert. Der so erhaltene feuchte Faserstoff wurde mit insgesamt 41 Wasser aus dem Defibrator herausgespült und auf einem Sieb gewaschen. Die so Ausbeute an Faserstoff betrug 83%, bezogen auf das eingesetzte Holz (atro).

Der gewaschene und abgepresste Faserstoff wurde anschliessend in 51 l%iger wässriger NaOH bei Raumtemperatur suspendiert und nach 30 Minuten durch Filtration und 55 Abpressen vom alkalischen Auszug abgetrennt. Nach Waschen mit Wasser, verdünnter Säure und wiederum Wasser betrug die Ausbeute an Faserstoff 66%, bezogen auf das eingesetzte Holz (atro).

In entsprechender Weise wurden andere Holzarten, auch in 60 Form grober Sägespäne, sowie Stroh in gehäckselter Form behandelt Die Mittelwerte der Ausbeuten an Faserstoffen, bezogen auf die Ausgangsmaterialien (atro) betrugen:

65

Ausgangsmaterial Faserstoffrückstände (%)

nach Waschen nach Behandlung mit H2O mit NaOH

Rotbuche

83

66

Pappel

87

71

Birke

86

68

Eiche

82

66

Eukalyptus

85

71

Weizenstroh

90

67

Gerstenstroh

82

65

Haferstroh

88

68

B. Kohlenhydratzusammensetzung der wässrigen und alkalischen Auszüge

Aliquote Anteile der unter A gewonnenen wässrigen und alkalischen Auszüge wurden einer Totalhydrolyse unterworfen. Die quantitative Bestimmung des Einzel- und Gesamtzuk-ker erfolgte mit Hilfe des Biotronic-Autoanalyzers (vgl. M. Sinner, M.H. Simatupang und H.H. Dietrichs, Wood Science and Technology 9 (1975), S. 307-322). Im Autoanalyzer wurde ausserdem der Totalhydrolyse unterworfenes Holz untersucht. Figur 1 zeigt die erhaltenen Diagramme für Rotbuche.

Auszug Gelöste Kohlenhydrate

Gesamt (%, bezogen Anteile (%, bezogen Ausgangsmaterial atro) Auszug)

Xylose Glucose

Rotbuche, H2O

13,5

69

13

NaOH

7,0

83

3

Eiche, H2O

13,2

65

11

NaOH

6,8

81

5

Birke, H2O

11,2

77

8

NaOH

7,3

84

3

Pappel, H2O

8,2

76

6

NaOH

6,5

83

3

Eukalyptus, H2O

9,5

71

8

NaOH

5,0

80

3

Weizen, H2O

7,0

53

21

NaOH

8,3

88

3

Gerste, H2O

6,1

41

25

NaOH

9,5

88

3

Hafer, H2O

5,1

44

20

NaOH

4,4

88

3

Beispiel 3: Hydrolyse von Buchenholzxylan

2 ml der gemäss A. durch Waschen mit Wasser erhaltenen Xylanlösung aus dem Aufschluss von Buchenholz (die Lösung enthält 1,3% Xylan) wurden mit 60 mg des Präparates 1 und 60 mg des Präparates 2, die gemäss Beispiel 2 erhalten wurden, bei

633 58^

40 °C im Schüttelwasserbad inkubiert. Die Hydrolyse des Xylans wurde analytisch säulenchromatografisch unter Verwendung eines Ionenaustauscherharzes (Handelsprodukt Durrum DA X-4 der Firma Durrum) verfolgt (Sinner, M, M.H. Simatupang und H.H. Dietrichs, Wood Sei. Technol. 9,1975, 307-322). Nach vier Stunden war das Buchenholzxylan in seine monomeren Bestandteile Xylose und 4-O-Methylglucuronsäure hydrolysiert. Figur 2 zeigt das Chromatogramm nach vierstündigem Inkubieren. Es ist daraus ersichtlich, dass in der Lösung ein vollständiger Abbau des Xylans zu Xylose erfolgte. Die Lösung enthält keine Xylobiose.

Vergleichsversuch 1

Es wurde wie in Beispiel 3 gearbeitet, wobei jedoch ein Enzympräparat verwendet wurde, das wie im Beispiel 2 beschrieben hergestellt worden war, wobei jedoch die Enzymlösungen, die die Xylanase sowie die ß-Xylosidase und das Uronsäue-abspaltende Enzym enthielten, gemeinsam im Gemisch an den Träger gebunden wurden. Es wurden zwei ml der im Beispiel 3 verwendeten Xylanlösung mit 60 mg des Präparates bei 40 °C inkubiert, das gemeinsam Xylanase, ß-Xylosidase und das Uronsäure-abspaltene Enzym enthielt.

Ausserdem wurde in einem weiteren Vergleichsversuch in gleicher Weise verfahren, wobei lediglich 60 mg des gemäss Beispiel 2 hergestellten Präparates 1 verwendet wurden (trägergebundene Xylanase).

Der Xylanabbau der drei Lösungen wurde wie in Beispiel 3 beschrieben über drei Stunden säulenchromatografisch verfolgt. Xylobiose- und Xylosegehalt der Lösungen sind in Figur 3 aufgetragen. In dieser Figur sind ebenfalls aufgetragen die Gehalte an Xylobiose und Xylose der Lösung von Beispiel 3 (Xylanase und ß-Xylosidase sowie Uronsäure-abspaltendes Enzym getrennt immobilisiert, gemeinsam inkubiert). Aus der Fig. 3 ist folgendes ersichtlich:

Die gemeinsam immobilisierten Enzyme hatten zwar nach 1 h schon einen grossen Teil des vorhandenen Xylans (13 mg/ml) zu Xylobiose hydrolysiert; die Konzentration des gewünschten Endabbauprodukts Xylose stieg jedoch mit steigender Inkubationszeit nicht weiter an.

Die trägergebundene Xylanase hat schon nach 30 Minuten den grössten Teil des vorliegenden Xylans zu oligomeren Zuk-kern abgebaut. Der Gehalt an Xylose stieg naturgemäss nicht weiter an, denn das Endabbauprodukt der Xylanase ist im wesentlichen Xylobiose.

Die nach Beispiel 3, d.h. gemäss der Erfindung getrennt immobilisierten, aber gemeinsam inkubierten Enzyme, hatten die Xylanlösung nach 30 Minuten zu Xylobiose und Xylose und sauren Zuckern abgebaut Mit steigender Inkubationszeit stieg durch das Einwirken der ß-Xylosidase die Xylosekonzentration, dementsprechend nahm der Xylobiosegehalt der Abbaulösung ab. Nach 4 h war Totalhydrolyse zu Xylose und 4-O-Methylglu-curonsäure erreicht, wie aus der Figur 2 (vgl. Beispiel 5) ersichtlich ist.

7

5

to

15

20

25

30

35

40

45

50

G

3 Blatt Zeichnunge:

Claims (10)

1. Ì3584

   2

   PATENTANSPRÜCHE

   1. Verfahren zur Herstellung von an Träger gebundenen :reinigten Enzymen, dadurch gekennzeichnet, dass man ein ylanase und ß-Xylosidase enthaltendes Rohenzym durch Itrafiltration trennt in eine Fraktion, die im wesentlichen nur ylanase enthält, und eine Fraktion, die im wesentlichen nur Xylosidase enthält, und diese beiden Fraktionen getrennt an räger bindet.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, iss man ein Rohenzym verwendet, das ausserdem Uronsäure-jspaltendes Enzym enthält.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, iss man das Rohenzym durch Ultrafiltration trennt in eine raktion, die im wesentlichen nur Xylanase enthält, und eine ■aktion, die im wesentlichen nur ß-Xylosidase und Uronsäure-jspaltendes Enzym enthält.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ^kennzeichnet, dass man das Rohenzym in einer Pufferlösung it einem pH-Wert von 4 bis 6, vorzugsweise 5, löst und von llöslichen Bestandteilen befreit, die Lösung durch ein Ultrafil-r mit dem Trennbereich von mindestens MG 80 000 und Lehstens MG 120 000, vorzugsweise etwa MG 100 000, filiert, den Überstand durch ein Ultrafilter mit dem Trennbeiich von mindestens MG 250 000 und höchstens MG 350 000, jrzugsweise MG 300 000, filtriert und das im wesentlichen Xylosidase und gegebenenfalls Uronsäure-abspaltendes tizym enthaltende Filtrat an einen Träger bindet, das Filtrat tr ersten Ultrafiltration durch ein Ultrafilter mit dem Trenn-:reich von mindestens MG 10 000 und höchstens MG 50 000, jrzugsweise etwa MG 30 000, filtriert und das im wesentli-ten Xylanase enthaltende Filtrat an einen Träger bindet.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, iss man das im wesentlichen Xylanase enthaltende Filtrat ischliessend durch ein Ultrafilter mit dem Trennbereich von indestens MG 300 und höchstens MG 700, vorzugsweise wa MG 500, filtriert und den Überstand an den Träger bindet.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeich-;t, dass man die Träger mit Glutaraldehyd, Cyclohexylmor-lolinoäthyl-carbodiimid-toluolsulfonat oderTiCU aktiviert.
7. 7. Verwendung von gemäss dem Verfahren nach Anspruch hergestellten, an Träger gebundenen gereinigten Enzymen ir Herstellung von Xylose durch enzymatische Hydrolyse von ylanen oder Xylanbruchstücken, dadurch gekennzeichnet iss man auf eine wässrige Lösung von Xylanen oder Xylan-ruchstücken einwirken lässt.

   a) einen Träger, der von den xylanolytischen Enzymen im esentlichen nur Xylanase gebunden enthält, und b) einen Träger, der von den xylanolytischen Enzymen im esentlichen nur ß-Xylosidase gebunden enthält.
8. 8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, iss der Träger b) ausserdem Uronsäure-abspaltendes Enzym sbunden enthält.
9. 9. Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekenn-ïichnet, dass man xylanhaltige pflanzliche Rohstoffe durch ampf-Druckbehandlung mit Sattdampf bei Temperaturen Dn 160 bis 230 °C während 2 bis 60 Minuten aufschliesst und Vibriert, die so aufgeschlossenen pflanzlichen Rohstoffe mit ner wässrigen Lösung auslaugt und auf diese Lösung die nzyme einwirken lässt.
10. 10. Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 9 von îmâss dem Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6 her-sstellt, an Träger gebundenen gereinigten Enzymen.