CH634351A5

CH634351A5 - Verfahren zur herstellung eines gemisches neuer 7a-beta-methylhexahydro-1,(5)-indan(di)on-verbindungen.

Info

Publication number: CH634351A5
Application number: CH1441176A
Authority: CH
Inventors: John Costain Knight; Merle Gene Wovcha
Original assignee: Upjohn Co
Priority date: 1975-11-17
Filing date: 1976-11-16
Publication date: 1983-01-31
Also published as: DD128802A5; PL106350B1; GB1523970A; DE2652376C2; US4042459A; FR2344628A1; IL50893A0; JPS584552B2; JPS5742316B2; IL50893A; IE44876L; DE2652376A1; DE2660011C2; NL169502C; IE44876B1; JPS56131382A; NL7612754A; JPS56131396A; FR2344628B1; JPS5910792B2

Description

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird insbesondere ein neuer Mikroorganismenmutant, nämlich Mycobacterium so fortuitum NRRL B-8128, zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschliesslich 10 Kohlenstoffatomen zu Gemischen von Verbindungen der Formeln I, II, III und IV benutzt. Geeignete Steroide sind Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin und dergleichen 55 mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschliesslich 10 Kohlenstoffatomen und Androst4-en-3,17-dion, Androsta-l,4-dien-3,17-dion, Dehydroepiandrosteron und Testosteron. Diese Steroid-substrate können entweder in reiner Form oder in Rohform zum Einsatz gelangen.

60 Wie bereits erwähnt, erhält man durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden der beschriebenen Art gekennzeichnete und Verbindungen der Formeln I, II, III und IV in der Gärbrühe anhäufende Mutanten durch Mutation von sterinabbauenden Mikroorganismen der Gattungen Arthro-65 bacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces.

Mycobacterium fortuitum, ATCC 6842 ist seit dem 9. April 1937 bei der American Type Culture Collection, 12301 Park-

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lawn Drive, Rockville, Maryland 20852 USA hinterlegt und Die Kultur wird in einem Nährmedium mit einem Kohlenstoffkann dort seit dem genannten Datum auf Verlangen von jeder- lieferanten, beispielsweise einem assimilierbaren Kohlenmann frei bezogen werden. hydrat, und einem Stickstofflieferanten, beispielsweise einer Für den Erfindungszweck wurde in der später beschriebe- assimilierbaren Stickstoffverbindung oder einem eiweissarti-nen Weise die Art Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 zu 5 gen Material, wachsen gelassen bzw. gezüchtet. Bevorzugte einem neuen Labor-Mikroorganismusmutanten mutiert. Der Kohlenstofflieferanten sind Glucose, brauner Zucker, Rohrzuk-ATCC-Katalog von 1974 erläutert neben der Auflistung von ker, Glyzerin, Stärke, Maisstärke, Lactose, Dextrin, Melasse ATCC 6842 folgendes: «J.C. Cruz 2. Cold abscess. Acta Med. und dergleichen. Bevorzugte Stickstofflieferanten sind Mais-Rio de Janeiro 1:1,1936, Medium 90 37C». M. fortuitum ATCC einweichflüssigkeit, Hefe, autolysierte Brauhefe mit Milchfest-6842 baut Sterine nicht selektiv zu niedrigmolekularen Verbin- io Stoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Maismehl, Milchdungen, beispielsweise CO2 + H2O, ab. Somit eignet sich dieser feststoffe, Pankreas-Verdauungsprodukte von Casein, Fisch-Mikroorganismus nicht zum selektiven Steroidabbau. mehl, Brennereirückstände, Tierpeptonflüssigkeiten, Fleisch-

Bei der Mutation von M. fortuitum ATCC 6842 mittels und Knochenabfälle, Ammoniumsalze und dergleichen. In vor-

Nitrosoguanidin erhält man einen neuen Mutanten, der selektiv teilhafter Weise können Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Steroide des beschriebenen Typs zu Gemischen von Verbin- 15 Stickstofflieferanten zum Einsatz gelangen. Den Gär- bzw. Fer-dungen der Formeln 1,11, III und IV abzubauen vermag. Diesem mentationsmedien brauchen keine Spurenmetalle, z.B. Zink, Mikroorganismenmutanten von M. fortuitum wurde durch das Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergleichen, zugesetzt Northern Regional Research Laboratory, U.S.-Department of zu werden, da vor der Sterilisation des Mediums vorzugsweise Agriculture, Peoria, Illinois, USA (der Mikroorganismenmutant Leitungswasser und ungereinigte Bestandteile als Komponen-wurde an dieser Hinterlegungsstelle in der Dauersammlung 20 ten des Mediums zum Einsatz gelangen.

hinterlegt), die Nummer NRRL B-8128 zugeteilt. Eine Subkul- Das Umwandlungsverfahren dauert normalerweise etwa tur dieses Mikroorganismus ist auf Anfrage von dieser Hinter- 72 h bis 15 Tage. Die Inkubationstemperatur während des Iegungsstelle frei erhältlich. Es sei jedoch darauf hingewiesen, Umwandlungsverfahrens reicht im allgemeinen von etwa 25° dass die Verfügbarkeit bzw. Aushändigung der Kultur keine bis etwa 37 °C und beträgt vorzugsweise 30 °C. Der Inhalt des Lizenz an einem etwa auf die vorliegende Erfindung erteilten 25 Umwandlungsgefässes wird mit sterilisierter Luft belüftet und Patent begründet. zum leichteren Wachstum des Mikroorganismus normaler-

Die Morphologie und die Chemikalien- bzw. Drogenemp- weise bewegt. Auf diese Weise lässt sich der Wirkungsgrad des findlichkeit von M. fortuitum NRRL B-8128 sind von den ent- Umwandlungsverfahrens erhöhen.

sprechenden Eigenschaften der Ausgangsart M. fortuitum Nach beendeter Umwandlung, ermittelt durch Dünn-

ATCC 6842 nicht zu unterscheiden. Beide M. fortuitum-Kultu- 30 schichtchromatographie unter Verwendung von handelsübli-ren stellen säurefeste, unbewegliche, nicht-sporenbildende chen Silikagelplatten und eines Lösungsmittelsystems aus 2 Bacilli aus der Familie Mycobacteriaceae der Ordnung Actino- Volumina Àthylacetat und 3 Volumina Cyclohexan, kann das mycetales dar. Nach der Runyon's Klassifizierung (vgl. E.H. umgewandelte Steroid in üblicher bekannter Weise isoliert Runyon «Med. Clin. North America», 43,273 [1959]) handelt es werden. So kann beispielsweise das Gär- bzw. Fermentations-sich um ein nicht-chromogenes, der Gruppe IV angehörendes 35 oder Umwandlungsgemisch einschliesslich der Gärbrühe und Mycobacterium, d.h. es wächst rasch bei niedriger Temperatur der Mikroorganismenzellen mit einem mit Wasser nicht mischunter Bildung nicht-pigmentierter Kolonien auf relativ einfach baren organischen Lösungsmittel für Steroide extrahiert wer-zusammengesetzten Medien. den. Geeignete Lösungsmittel sind Chloroform, Tetrachlorkoh-

M. fortuitum ATCC 6842 und M. fortuitum NRRL B-8128 lenstoff, Äthylenchloid, Trichloräthylen, Äther, Amylacetat, lassen sich hinsichtlich ihrer Wirkung auf Steroidmoleküle ein- 40 Benzol und dergleichen, vorzugsweise Methylenchlorid.

deutig voneinander unterscheiden. Wie bereits ausgeführt, Andererseits können die Gär- bzw. Fermentationsbrühe kommt es beim Einsatz von M. fortuitum ATCC 6842 zu einem und die Zellen zunächst in üblicher bekannter Weise, beispiels-nicht-selektiven Abbau von Steroiden, bei Einsatz von M. for- weise durch Filtrieren oder Znetrifugieren voneinander tuitum NRRL B-8128 erfolgt dagegen ein selektiver Steroidab- getrennt und dann getrennt mit geeigneten Lösungsmitteln bau. Diese Eigenschaft von M. fortuitum NRRL B-8128 stellt 45 extrahiert werden. Die Zellen können entweder mit einem mit eine in hohem Masse wertvolle Eigenschaft dar. Wasser mischbaren oder mit einem mit Wasser nicht mischba-

Die Mutation von M. fortuitum ATCC 6842 zu M. fortuitum ren Lösungsmittel extrahiert werden. Die zellenfreie Gär- oder NRRL B-8128 erfolgt mit Hilfe von Nitrosoguanidin. Die Ein- Fermentationsbrühe lässt sich mit mit Wasser nicht mischba-zelheiten der Mutationsmassnahmen werden im folgenden ren Lösungsmitteln extrahieren.

noch näher erläutert werden. Obwohl Mutationsverfahren all- 50 Die Extrakte können durch Diatomeenerde filtriert wer-gemein bekannt sind, gibt es auf dem einschlägigen Fachgebiet den, worauf das Filtrat im Vakuum zur Trockene destilliert keine Lehren oder sogar Vermutungen bezüglich der wird. Der die gewünschten umgewandelten Steroide enthal-

möglicherweise bei Durchführung der im vorliegenden Falle tende Destillationsrückstand kann in einem 10% Chloroform eingehaltenen Mutationsmassnahmen erhältlichen Arten von enthaltenden handelsüblichen Hexanisomerengemisch gelöst Mutanten. Die im folgenden näher erläuterten Mutations- und 55 und auf Silikagel chromatographiert werden, wobei als Ent-Umwandlungs- bzw. Transformationsmassnahmen werden wickler das handelsübliche Hexanisomerengemisch einerseits zwar im einzelnen für ein Mycobacterium beschrieben, es ist und Mischungen desselben mit zunehmenden Mengen Äthyl-jedoch ohne weiteres möglich, ähnliche oder äquivalente Mass- acetats verwendet werden. Bei diesen Massnahmen lassen sich nahmen bei Mikroorganismen der anderen genannten Gattun- die Verbindungen I, II und III eluieren. Die Verbindung IV lässt gen anzuwenden. 60 sich beispielsweise mit 5% Methanol enthaltendem Äthylacetat

Die selektive Umwandlung lässt sich in einer wachsenden eluieren. Kristalline Produkte erhält man mit Hilfe eines Kultur von M. fortuitum NRRL B-8128 entweder durch Zugabe Lösungsmittels, beispielsweise Äthylacetat. Die gewünschten des jeweiligen Steroidsubstrats zu der Kultur während der umgewandelten Steroide erhält man auch aus der überstehen-

Inkubationsdauer oder durch Zusatz des jeweiligen Steroidsub- den Flüssigkeit nach dem Verdampfen des in der überstehen-strats zu dem Nährmedium vor dem Beimpfen bewerkstelligen. 65 den Flüssigkeit enthaltenen Lösungsmittels.

Das Steroid kann entweder alleine oder in Kombination mit Die aus dem erfindungsgemäss hergestellten Gemisch auf-

einem anderen Steroid zugesetzt werden. Der bevorzugte, getrennten Verbindungen der Formeln I, II, III und IV eignen jedoch nicht zwingend erforderliche Konzentrationsbereich sich als Zwischenprodukte bei der chemischen Synthese wertfür das Steroid in der Kultur beträgt etwa 0,1 bis etwa 100 g/1. voller Steroide. So lassen sich beispielsweise die aufgetrennten

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Verbindungen in bei dem aus der US-PS 3 880 884 bekannten Verfahren zur Totalsynthese wertvoller 19-Norsteroide verwendeten Ausgangssubstanzen überführen. Diese Umwandlung zu den genannten Ausgangssubstanzen lässt sich in üblicher bekannter Weise durchführen, beispielsweise durch Oxi-dation mit Chromsäure in Essigsäure und anschliessender Nachbehandlung mit Essigsäureanhydrid und Natriumacetat (vgl. «Biochem.» 2,1238 bis 1243 und «I.A.C.S.» 85,2135 bis 2137).

Die folgenden Beispiele sollen das Verfahren gemäss der Erfindung näher veranschaulichen. Sofern nichts anderes angegeben, bedeuten sämtliche Prozentangaben «Gewichtsprozente». Ferner bedeuten sämtliche Mengenangaben bei Lösungsmittelgemischen, sofern nichts anderes angegeben, «Volumina».

Beispiel 1

Herstellung des Mutanten M. fortuitum NRRL B-8128 aus M. fortuitum ATCC 6842:

a) Nitrosoguanidin-Mutagenese:

Zellen von M. fortuitum ATCC 6842 werden bei einer Temperatur von 28 °C in einem sterilen Saatmedium der folgenden Zusammensetzung wachsen gelassen:

Nährbrühe (Difco) 8 g/1

Hefeextrakt 1 g/1

Natriumpropionat 0,5 g/1

mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 11

Der pH-Wert des Mediums wird mit ln-NaOH vor einer 20minütigen Sterilisation bei 121 °C auf 7,0 eingestellt.

Die Zellen werden bis zu einer Dicke von etwa 5x 108/ml wachsen gelassen, durch Zentrifugieren in Kügelchen überführt und dann mit einem gleichen Volumen sterilen 0,1m-Natriumcitrat eines pH-Werts von 5,6 gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden in demselben Volumen Citratpuffer resuspendiert, worauf ein aliquoter Teil zur Titerfeststellung (d.h. zur Zellenzählung) abgetrennt wird. Schliesslich wird Nitrosoguanidin bis zu einer Endkonzentration von 50 ja. g/ml zugesetzt. Die Zellensuspension wird in einem Wasserbad 30 min lang bei einer Temperatur von 37 °C inkubiert, worauf erneut ein aliquoter Teil zur Titerfeststellung abgetrennt wird. Der Rest wird abzentrifugiert und mit einem gleichen Volumen sterilen O,lm-Kaliumphosphats eines pH-Werts von 7,0 gewaschen. Schliesslich werden die Zellen in einem sterilen Minimalsalzmedium ohne Kohlenstofflieferant der folgenden Zusammensetzung:

NH4NO3 1,0 g/1

K2HPO4 0,25 g/1

MgS04-7H20 0,25 g/1

NaCI 0,005 g/1

FeSCWHzO 0,001 g/1

mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 11

resuspendiert. Der pH-Wert dieses Mediums wird vor einem 20minütigen Sterilisieren bei 121 °C mit ln-HCl auf 7,0 eingestellt. Endlich werden die Zellen zur Auswahl der Mutanten ausgebreitet.

b) Auswahl und Isolierung des Mutanten M. fortuitum NRRL B-8128:

Die in der geschilderten Weise mutagenisierten Zellen werden verdünnt und auf Platten verstrichen, die ein Medium der folgenden Zusammensetzung enthalten (modifiziert nach Fraser und Jerrel, 1963 «J. Biol. Chem.», 205,291 bis 295):

Glyzerin 10,0 g/1

Na2HP04 8,4 g/1

KH2PO4 4,5 g/1

NH4CI 2,0 g/1

MgS04-7H20 0,3 g/1

FeCh • 6H2O 0,05 g/1

mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 11

Nach Zugabe von 15 g/1 Agar wird das Medium 30 min lang in einem Autoklaven auf eine Temperatur von 121 °C erhitzt und dann in sterile Petrischalen gegossen. Das Wachsen bzw. die Züchtung auf diesem Medium eliminiert die meisten durch das Mutageneseverfahren gebildeten Nährauxotrophe. So wer-5 den beispielsweise Kulturen, die zum Wachsen auf chemisch definierten Medien Vitamine, Wachstumsfakoren und dergleichen erfordern, eliminiert. Nach etwa 7tägiger Inkubation bei einer Temperatur von 28 °C werden die gebildeten Kolonien auf zur Auswahl von Mutanten geeignete Testplatten und dann 10 zurück auf das auf Glyzerin basierende Medium enthaltende Kontrollblatt repliziert. Die Testplatten werden entsprechend der Veröffentlichung von G.E. Peterson, H.L. Lewis und J.R. Davis «Préparation of uniform dispersions of cholesterol and other water-insoluble carbon sources in agar media», J.Lipid 15 Research 3,275 bis 276 (1962) hergestellt. Das Minimalsalzmedium auf diesen Platten ist unter (a) von Beispiel 1 beschrieben. Nach Zugabe von 15 g/1 Agar und 1,0 g/1 eines geeigneten Kohlenstofflieferanten werden Steroide, wie Sitosterin oder Andro-stendion (AD), zugesetzt, worauf die erhaltene Suspension 30 20 min lang bei 121 °C im Autoklaven erhitzt wird. Das sterile, heisse Gemisch wird hierauf in ein steriles Mischgefäss gegossen, mehrere min lang durchgemischt und schliesslich in sterile Petrischalen gegossen. Bei diesen Massnahmen kann es infolge Schaumbildung zu Schwierigkeiten kommen, diese lassen sich 25 jedoch durch Durchmischen des heissen Gemischs und durch Abflammen der Oberfläche der geschmolzenen Agarplatten verringern. Auf diese Wise erhält man gleichmässige Dispersionen wasserunlöslicher Kohlenstofflieferanten, wodurch die Herstellung sehr homogener, jedoch opaker Agarplatten 30 erleichtert wird.

Die auf den Kontrollplatten gewachsenen Kolonien, jedoch nicht die auf den AD als einzigen Kohlenstofflieferanten enthaltenden Testplatten gewachsenen Kolonien, werden durch Ausstreichen auf Nähragarplatten gereinigt. Nach dem 35 Wachsen bei einer Temperatur von 28 °C werden mit Hilfe steriler Zahnstocher Einzelklonen von den Nähragarplatten gepflückt und durch Beimpfen netzartig gemusterter Platten mit AD als Kohlenstofflieferanten erneut getestet. Gereinigte Isolate, die noch einen von der Mutterkultur unterschiedlichen 4o Phenotypus aufweisen, weden dann in Schüttelflaschen ausgewertet.

c) Schüttelflaschenauswertung:

Es werden 500 ml fassende Schüttelflaschen mit 100 ml eines Biotransformationsmittels der folgenden Zusammensetzung 45 verwendet:

Glyzerin 10,0 g/1

Na2HP04 8,4 g/1

KH2PO4 4,5 g/1

NH4CI 2,0 g/I

soMgS04-7H20 0,3 g/1

FeCh • 6H2O 0,05 g/1

mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 11

Hierauf werden in das Medium 1 g/1 Sojamehl und dann 10 g/1 Sitosterin eingemischt. Nach 20minütigem Erhitzen der Fla-55 sehen in einem Autoklaven auf 121 °C werden sie auf 28 °C abgekühlt und dann mit 10 ml eines wie folgt hergestellten Saatguts beimpft:

Die gereinigten Isolate aus Stufe (b) werden bei einer Temperatur von 28 °C auf geneigtem Agar wachsen gelassen. Zum 60 Beimpfen einer 500 ml fassenden Flasche mit 100 ml eines sterilen Saatmediums der folgenden Zusammensetzung:

Nährbrühe (Difco) 8 g/1

Hefeextrakt 1 g/1

Glyzerin 5 g/1

65 mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 11

wird eine von einem geneigten Agar entnommene Öse voll Zellen verwendet.

Der pH-Wert des Saatmediums wird vor dem 20minütigen Erhitzen der Flaschen auf 121 °C in einem Autoklaven mit

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ln-NaOH auf 7,0 eingestellt. Die Saatflaschen werden 72 h lang bei einer Temperatur von 28 °C inkubiert.

Wie bereits erwähnt, werden 10 ml gewachsene Saat zum Beimpfen sämtlicher 500-ml-Flaschen mit jeweils 100 ml sterilen Transformationsmediums verwendet. Hierauf werden die s Flaschen bei einer Temperatur von 28° bis 30 °C auf einem Drehrüttler inkubiert, wobei von Zeit zu Zeit aliquote Proben entnommen werden. Diese Proben umfassen jeweils 10 ml und werden nach dem Austragen durch Schütteln mit 3 Volumina Methylenchlorid extrahiert. Teile der Extrakte werden durch i o Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silikagel und des beschriebenen Lösungsmittelsystems, d.h. 2 Volumina Äthylacetat und 3 Volumina Cyclohexan, sowie durch Gas/ Flüssig-Chromatographie analysiert. Ein Nachweis der Anwesenheit der Verbindungen der Formeln I, II, III und IV bestätigt i5 den selektiven Abbau von Sitosterin durch den neuen Mutanten aus dem Muttermycobacterium M. fortuitum ATCC 6842.

Beispiel 2

Umwandlung von Sitosterin zu einem Gemisch der Verbin- 20 düngen der Formeln I, II, III und IV und anschliessende Auftrennung in die einzelnen Verbindungen:

Das verwendete Medium entspricht dem Medium von Beispiel 1 (c). Dieses Medium wird durch 30minütiges Erhitzen auf 121 °C sterilisiert, dann auf 30 °C abgekühlt und schliesslich mit 25

10 Teilen einer Saatkultur des Mutanten-Mycobacterium M. fortuitum NRRL B-8128, die entsprechend Beispiel 1 (c) hergestellt worden war, beimpft. Das beimpfte Gemisch wird unter Bewegung 336 h lang bei einer Temperatur von 30 °C zur Begünstigung eines submersen Wachstums inkubiert. Nach der 30 Inkubation wird das Gemisch mit Methylenchlorid extrahiert. Der Extrakt wird durch Diatomeenerde filtriert, worauf das Filtrat im Vakuum zur Trockene destilliert wird. Der hierbei angefallene Destillationsrückstand wird mit einem handelsüblichen,

10% Chloroform enthaltenden Hexanisomerengemisch aufge- 35 nommen und auf Silikagel chromatographiert, wobei als Entwickler das handelsübliche Hexanisomerengemisch und Mischungen desselben mit zunehmenden Mengen an Äthylacetat verwendet werden. Hierbei lassen sich die Verbindungen I,

11 und III eluieren. Die Verbindung IV lässt sich aus der Säule 40 mit 5% Methanol enthaltendem Äthylacetat eluieren. Die Reihenfolge des Eluierens der betreffenden Verbindungen ist I —

II — III — IV. Die RrWerte dieser Verbindungen auf einem Dünnschichtchromatogramm unter Verwendung eines 3:2-Cyclohexan/Äthylacetat-Gemischs sind: I = 0,37, II = 0,28, 45

III = 0,16, IV = 0,05.

Auf dünnschichtchromatographischem Wege ermittelte geeignete Fraktionen werden gesammelt und zur Trockene eingedampft, wobei die Verbindungen I, II, III und IV in guter Ausbeute erhalten werden. 50

Beim Umkristallisieren aus Äthylacetat erhält man die Verbindung I in Form eines 1:1-Epimerengemischs eines Fp. von 100° bis 112 °C; die Verbindung II stellt ein Öl dar; die Verbindung III besitzt einen Fp. von 122° bis 124 °C und die Verbindung IV besitzt einen Fp. von 148° bis 150 °C.

Beispiel 3

Beim Ersatz des im Beispiel 2 verwendeten Sitosterins durch Cholesterin erhält man ebenfalls die Verbindungen I, II, III und IV.

Beispiel 4

Beim Ersatz des im Beispiel 2 verwendeten Sitosterins durch Stigmasterin erhält man ebenfalls die Verbindungen I, II, III und IV.

Beispiel 5

Beim Ersatz des im Beispiel 2 verwendeten Sitosterins

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durch Campesterin erhält man ebenfalls die Verbindungen I, II, III und IV.

Beispiel 6

Durch Zusatz einer Kombination aus beliebigen Steroiden der Beispiele 2 bis 5 zu dem Sitosterin in Beispiel 2 oder durch Verwendung einer beliebigen Kombination der Steroide der Beispiele 2 bis 5 anstelle des Sitosterins in Beispiel 2 erhält man ebenfalls die Verbindungen der Formeln I, II, III und IV.

Beispiel 7

Bei Ersatz von Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 in Beispiel 1 durch einen Mikroorganismus der Gattung Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces erhält man Mikroorganismenmutanten, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschliesslich 10 Kohlenstoffatomen und zur Bildung von Verbindungen der Formeln I, II, III und IV in der Gärbrühe auszeichnen.

Beispiel 8

Durch Ersatz des Mutanten M. fortuitum NRRL B-8128 in den Beispielen 2 bis 6 durch die gemäss Beispiel 7 hergestellten Mutanten erhält man ebenfalls die Verbindungen der Formeln I, II, III und IV.

Beispiel 9

Durch Ersatz des M. fortuitum ATCC 6842 in Beispiel 1 durch einen sterinabbauenden Mikroorganismus der Gruppe Mycobacterium phlei, M. smegmatis, M. rhodochrous, M. mucosum und M. butyricum erhält man Mikroorganismenmutanten, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschliesslich 10 Kohlenstoffatomen und zur Bildung bzw. Anhäufung von Verbindungen der Formeln I, II, III und IV in der Gärbrühe auszeichnen.

Beispiel 10

Durch Ersatz des Mutanten M. fortuitum NRRL B-8128 in den Beispielen 2 bis 6 durch die gemäss Beispiel 9 hergestellten Mutanten erhält man ebenfalls Verbindungen der Formeln I, II, III und IV.

Beispiel 11

Durch Ersatz des Sitosterins im Beispiel 2 durch Androst-4-en-3,17-dion, Androsta-l,4-dien-3,l 7-dion, Dehydroepiandroste-ron oder Testosteron erhält man ebenfalls die Verbindungen der Formeln I, II, III und IV.

Beispiel 12

Durch Ersatz des Sitosterins im Beispiel 2 durch eine Kombination aus zwei oder mehreren Sterinen, bestehend aus Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Androst-4-en-3,l 7-dion, Androsta-l,4-dien-3,l 7-dion, Dehydroepiandrosteron und Testosteron, erhält man ebenfalls die Verbindungen der Formeln I, II, III und IV.

Beispiel 13

Durch Ersatz des Mutanten M. fortuitum NRRL B-8128 in den Beispielen 11 und 12 durch die gemäss Beispiel 7 hergestellten Mutanten erhält man ebenfalls die Verbindungen der Formeln I, II, III und IV.

Beispiel 14

Durch Ersatz des Mutanten M. fortuitum NRRL B-8128 in den Beispielen 11 und 12 durch die gemäss Beispiel 9 hergestellten Mutanten erhält man ebenfalls die Verbindungen der Formeln I, II, III und IV.

G*

Claims

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PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung eines Gemisches der neuen Verbindungen der Formeln I bis IV,

(lì

L1Ù

dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismenmutanten aus der Gruppe Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobac-ter, Serratia und Streptomyces, welche sich durch ihre Fähigkeiten zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-AIkylseitenkette mit 2 bis einschliesslich 10 Kohlenstoffatomen und zur Bildung bzw. Ansammlung von 3aa-H-4a-[3'-Pro-panol]-7-aß-methylhexahydro-l ,5-indan-dion-hemiketal; 3aa-H-4<x-[3 ' -Propanal]-5a-hydroxy-7 aß-methylhexahydro-1 -indanon-hemiacetal ; 3aa-H-4a-[3 ' -Propionsäure]-5a-hydroxy-7 aß-me-thylhexahydro-l-indanon- 8-lacton und 3aa-H-4a-[3'-Propanol]-5a-hydroxy-7aß-methylhexahydro-l-indanon in der Gärbrühe auszeichnen, in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines einzigen Steroids mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschliesslich 10 Kohlenstoffatomen oder in Gegenwart eines Gemischs aus zwei oder mehreren Steroiden ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Androst-4-en-3,17-dion, Androsta-l,4-dien-3,17-dion, Dehydroepiandroste-ron und Testosteron züchtet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Mycobacterium fortuitum NRRL N-8128 züchtet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die hergestellten Verbindungen anschliessend in die einzelnen Verbindungen auftrennt.

4. Mittel zur Durchführung des Verfahrens gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Mycobacterium fortuitum NRRL B-8128 einsetzt.

3o 2 602 769) berichten Peterson und Murray über die 1 la-Hydro-xylierung von Progesteron mit Hilfe des Pilzes Rhizopus nigricans. 1972 (vgl. US-PS 3 684 657) berichten Kraychy und Mitarbeiter über den selektiven mikrobiologischen Abbau von steroidischen 17-Alkylresten durch Vergären von Steroiden mit 35 mindestens 8 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette mit Mycobacterium sp. NRRL B-3683 unter Bildung von Androst-4-en-3,17-dion, Androst-l,4-dien-3,17-dion und 20a-Hydroxyme-thylpregna-l,4-dien-3-on. 1973 (vgl. US-PS 3 759 791) berichten Marsheck und Mitarbeiter über die selektive mikrobiologische 40 Darstellung von Androst-4-en-3,l 7-dion durch Vergären eines Steroids der Cholestan- oder Stigmastanreihe mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette mit Mycobacterium sp. NRRL B-3805.

Die Verbindung III gemäss der Erfindung wird von Wang 45 und Sih in «Biochem.» 2,1238 bis 1243 (1963) als Zwischenprodukt beim Abbau von Androst-4-en-17ßol-3-on durch Nocardia restrictus beschrieben. Die offene Ringform der Verbindung I, nämlich 7a-Methylperhydroindandion-(l,5)-[ß-propylalkohol-(4)], wird von Schubert und Mitarbeitern in «Steroids», 4,581 so bis 586 (1964) als Zwischenprodukt beim Abbau von Progesteron durch Mycobacterium smegmatis beschrieben.

Mutanten, die durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschliesslich 10 Kohlenstoffatomen gekennzeichnet sind und in 55 der Gärbrühe Verbindungen der folgenden Formeln:

3aa-H-4a-[3'-Propanol]-7aß-methylhexahydro-l,5-indan-dion, Hemiketal:

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Die Umwandlung von Steroiden durch Mikroorganismen wurde bereits recht weitgehend untersucht und in der Literatur veröffentlicht. Die früheste einschlägige Arbeit stammt offensichtlich von Mamoli und Vercellone aus dem Jahre 1937, «Berichte» 70,470 und «Berichte» 70,2079. AaO wird über die Reduktion von 17-Ketosteroiden zu 17ß-Hydroxysteroiden mit Hilfe von Gärhefe berichtet. Im Jahre 1952 (vgl. US-PS

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(I)

3aa-H-4a-[3 ' -Propanal]-5ct-hydroxy-7 aß-methylhexahydro-1 -indanon, Hemiacetal:
3

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3aa-H-4a-[3 ' -Propanol]-5a-hydroxy-7 aß-methylhexahydro-1 -indanon:

(II)

3aa-H4a-[3' -Propionsäure]-5a-hydroxy-7 aß-methylhexahydro-1 -indanon- 8-lacton :

(IV)

(m)

anhäufen, erhält man nach den im folgenden näher erläuterten 15 Mutationsmassnahmen oder anderen Mutationsmassnahmen aus sterinabbauenden Mikroorganismen der Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces, vorzugsweise Mycobacterium. Beispiele für 20 Arten dieser Gattung sind M. phlei, M. smegmatis, M. rhodo-chrous, M. muscosum, M. fortuitum und M. butyricum.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung eines Gemisches der neuen Verbindungen der Formeln I bis IV

(Ii

LH)

ist dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismenmutanten aus der Gruppe Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces, welche sich durch ihre Fähigkeiten zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschliesslich 10 Kohlenstoffatomen und zur Bildung bzw. Ansammlung von 3aa-H-4a-[3'-Propanol]-7-aß-methylhexahydro-l,5-indandion-hemiketal, 3aa-H-4a-[3 ' -Propanal]-5a-hydroxy-7 aß-methylhexahydro-1 -indanon-hemiacetaI;3aa-H4a-[3'-Propionsäure]-5a-hydroxy-7aß-methylhexahydro-l-indanon- 8-lacton und 3aa-H-4a-[3'-Propanol]-5a-hydroxy-7aß-methylhexahydro-l-indanon in der Gärbrühe auszeichnen, in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines einzigen Steroids mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschliesslich 10 Kohlenstoffatomen oder in Gegenwart eines Gemischs aus zwei oder mehreren Steroiden ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Campeste-rin, Androst-4-en-3,l 7-dion, Androsta-l,4-dien-3,l 7-dion, Dehy-droepiandrosteron und Testosteron züchtet.