DD145280A5 - Verfahren zur herstellung von androst-4-en-3,17-dion - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
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-
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Description
Vertreter: Patentanwaltsbüro Berlin
Verfahren zur Herstellung von Androst- -4~en-3,17-dion
^nv/e_naunp;sp;ebiet der,"Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Mutanten zur Verwendung in einem neuen mikrobiologischen Verfahren zur selektiven Umwandlung von Steroiden mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis 10 C-Atomen zu.Androst~4-en~3,17-dion (AD) als im wesentlichen einzigem Produkt. AD stellt ein wertvolles Zwischenprodukt bei der Herstellung wichtiger Steroide dar.
CjTtarakteristik
Die Umwandlung von Steroiden durch Mikroorganismen ist weitgehend erforscht und dokumentiert. Die wohl früheste Arbeit auf diesem Gebiet geht auf Mamoli und Vercellone in Ber. _20, 470 und Ber. JO, 2079, 1937 zurück. Sie entdeckten die Reduktion von 17-Ketosteroiden zu 17ß-Hydroxysteroiden durch Fermentation mit. Hefe. Später entdeckten Peterson und Murray die 11 ^C-Hydroxylierung von Progesteron mit dem Pilz Rhizogus nigricans (siehe U -PS .2 602 7.59f 1952). Kraychy et al. beschreiben in der US-PS 3 634 657 (1972) den selektiven mikrobiologischen Abbau von steroiden 17-Alkylen durch Fermenta-
tion eines in der Ί 7-Alkyl seitenkette mindestens 8 C-Atome enthaltenden Steroids mit Mycobaeter ium sp. NRRL B-3683 zu Androst-1,4-en~3j17-dion (At)), Androst-1,4-dien-3,17-dion (ADD) und 20 &-Hydroxymethyl-pregnä-1,4-dien-3~on. Marsheck et al. beschreiben in der US-PS 3 759 791 (1973) die selektive mikrobiologische Herstellung von Androst~4~en~3,17r~ dion durch Fermentation eines Steroids der Cholestan- oder Stigmastanreihe mit mindestens 8 C-Atomen in der 17-Alkylseitenkette mit Hilfe von Mjj^obj^Jberium spo NRRL B~3805f das Mycobacterium vaccaj? benannt wurde.
In der DE-PS 2 746 383 s veröffentlicht am 27. April 1978, wird ein Verfahren zur vorzugsweisen Herstellung von AD unter Zuhilfenahme des Mikroorganismus M. fortuitum NRRL B-11045 beschrieben. Geringe Mengen von ADD werden bei diesem Verfahren ebenfalls erhalten. Diese Methode wird eis die beste gemäß dem Stand der Technik zur Herstellung von AD betrachtet.
Mit der Erfindung soll das Verfahren zur Herstellung von AD verbessert werden. Dazu wird ein Mutant eines Mikroorganismus verwendet, der aus einem adaptiven Mutanten des im besten Verfahren gemäß dem Stand der Technik eingesetzten Mikroorganismus ausgewählt wurde. Der erfindungsgemäße Mutant Myc oba c t ejr ium_ fρrtu.itum NRRL B-11359, wird aus M. foxjbuitum, NRRL B-11358, erhalten, der einen adaptiven Mutanten von Mxpjob3j3j_ejpjh^^ NRRL B-11045 darstellt. Der letztere ist in der D12-PS 2 746 383 beschriebene
Darlegung de s We sens
M0 .fortuitum NRRL B-11359 ist gekennzeichnet durch seine Fähigkeit, Steroide mit 17~Alkylseitenketten mit 2 bis C-Atomen selektiv umzuformen und AD als im wesentlichen einziges Produkt in der Fermentationsbrühe anzureichern.
• - 3 - β
Im besten Verfahren gemäß dem Stand der Technik zur Herstellung von AD wird ungefähr 4 mal soviel ADD in der Fermentationslösung angesammelt wie im erfindungsgemäßen Verfahren., Eine geringere Menge an ADD in der Fermentationsbrühe erleichtert die Isolierung des gewünschten AD.
Der Mutant kann unter Einsatz der hier beschriebenen oder auch anderer Mutationsmethoden erhalten werden. Der erfindungsgemäße adaptive Mutant wird durch Züchten von M. _fortujLtum in einem entsprechenden 9 Oi-OH AD enthaltenden Medium erhalten. Ausgewählt wird eine als adaptiver Mutant identifizierte schnellwachsende Kolonie. Dieser adaptive Mutant, M ♦..,fortuijrum NRRL B-11358, wird dann einer Nitrosoguanidin-Mutagenese (NTG) unterworfen. Der erfindungsgemäße Mutant wird danach unter Verwendung eines 90^-OH AD-Mediums (wie oben) auf Agarplatten selektioniert. Der gewünschte Mutant, M. _.JTortu1turn NRRL B-11359, wächst nicht in einem Medium, das AD oder 9&-0H AD als einzige Kohlenstoffquelle enthältr
Mycpbacterium fortuitum, NRRL B~11359> findet bei der selektiven Umwandlung von Steroiden mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis 10 C-Atomen in AD'Verwendung. Als Beispiele verwendbarer Steroidsubstrate seien genannt: Sitosterole, Cholesterol, Stigmasterol, Campesterol und ähnliche Steroide mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis 10 C-Atomen.- Diese Steroidsubstrate können entweder in reiner oder roher Form vorliegen.
Der erfindungsgemäße Mutant zeichnet sich durch seine Fähigkeit aus, Steroide mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis 10 C-Atomen selektiv umzuwandeln und AD als im wesentlichen einziges Produkt in der Fermentationsbrühe anzureichern, Dieser Mutant v/ird durch Mutation eines aus dem bekannten AD liefernden M. fortuitum NRRL B-I1045 hergestellten adap- :tiven*Mutanten erhalten. Der adaptive Mutant v/ird als
M, fortuitum NRRL B-11358 identifiziert, der Mutant, erhalten aus diesem adaptiven Mutanten, M. fortuitum NRRL B-11359, liefert AD wirksamer als M._, fortuitum NRRL B-11045. Die Ausbeute ist größer, da M. fortuitum NRRL B-11359 überall ungefähr 75 bis 100 % weniger ADD als unerwünschtes Produkt in der Fermentationsbrühe liefert, als dies bei M. fortuitum NRRL B-11045 der Fall ist.
M. fortuitum NRRL B-11358, M._ fortuitum NRRL B-11359 und M..fortuitum NRRL B-11045 wurden in der ständigen Sammlung des Northern Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA, hinterlegt. Subkulturen dieser Mikroorganismen sind auf Anforderung bei dieser Hinterlegungsstelle erhältlich. ICs wird darauf hingewiesen, daß die Möglichkeit, diese Kulturen zu erhalten, nicht eine Genehmigung darstellt, vorliegende Erfindung unter Verletzung der durch die Regierung erteilten Patentrechte in der Praxis anzuwenden.
M. fortuitum NRRL B-11359 unterscheidet sich von Mi_JT£rtui~ tum NRRL B-11045 durch seine Fähigkeit, bei der Herstellung von AD weniger ADD in der Fermentationsbrühe zu liefern.
Mtj fortuitum NRRL B-11045 unterscheidet sich von den Mycobacterium-Arten NRRL B-3805, die in der erwähnten US-PS 3 759 791 beschrieben sind. NRRL B-3805 besitzt die allgemeinen Eigenschaften von MvcobactgrIum_.vaccae, das eine völlig andere Art ist als das erfindungsgemäße M._ fortuitum (s. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Aufl., The Williams and Wilkins Company, 1974, Seiten 695 und 696, zwecks Vergleich dieser Mikroorganismen).
Morphologie und Medikamentenempfindiichkeit von M. jfortuitum NRRL B-11358 und NRRL B-11359 unterscheiden sich von denen von M. , fortuitum, ATCC 6842 und M. fortuitum NRRL B-11045 nicht. M. fortuitum ist ein säurefester, nichtbe-
v/eglicher, keine Sporen bildender Bazillus der Familie Mycot)a_ci:eriaceae der Ordnung A_ct_inp_mycetales. Gemäß der Klassifikation nach Runyon, Runyon, Έ.Η. 1959 Med. Clin. North America 43 : 273? ist M. fortuitum ein Mycobacterium der nichtchromogenen Gruppe IV, d.h. es entwickelt sich rasch bei niedrigen Temperaturen und ergibt unpigmentierte Kolonien in verhältnismäßig einfachen Medien.
Zur Herstellung von M. fortuitum NRRL B-11359 wird die Mutation von M. fortuitum NRRL B-11358 unter Verwendung von Nitrosoguanidin durchgeführt. Die Einzelheiten des Verfahrens werden im folgenden beschrieben. -
Die erfindungsgemäße selektive Umwandlung kann man in einer Kultur von M* fortuitum NRRL B-11359 entweder durch Zusatz eines ausgewählten Steroidsubstrats zur Kultur während der Inkubation oder aber durch Zusatz zum Nährmedium vor der Inokulation durchführen. Das Steroid kann man allein oder zusammen mit anderen Steroiden zugeben« Der bevorzugte, aber den Umfang der Erfindung nicht einschränkende Konzentrationsbereich des Steroids in der Kultur beträgt ca. 0,1 bis ca. 100 g/l. Die Kultur wächst in einem Nährmedium, welches eine Kohlenstoffquelle, z.B. ein assimilierbares Kohlehydrat, und eine Stickstoffquelle, z.B. eine N-Verbindung oder eiweißartiges Material enthält. Zu den bevorzugten Kohlenstoffquellen gehören: Glukose, brauner Zucker, Saccharose, Glycerin, Stärke, Maisstärke, Lactose, Dextrin, Melasse u.a. Bevorzugte Stickstoffquellen sind; Maisquellflüssigkeit, Hefe, autolysierte Brauhefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, Pankreasverdauungsprodukt von Kasein, Fischmehl, feste Destillationsrückstände, tierische Peptonflüssigkei- · ten, Fleisch- und Knochenstückchen, Ammoniumsalze u.a. Bevorzugt verwendet man diese Kohlenstoff- und Stickstoffquellen in Kombination miteinander» Spurenmetalle, z.B. Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen u.a. braucht man
den Fermentationsmedien nicht hinzuzufügen, da als Mediumkomponenten vor der Sterilisierung des letzteren Leitungswasser und nicht gereinigte Ingredientien verwendet v/erden.
Die Dauer des Umwandlungsvorgangs kann ca. 72 Stunden bis 15 Tage oder langer sein. Die Inkubationstemperatur kann ca. 250C bis ca. 37°C betragen, wobei für NRRL B-11359 300C bevorzugt werden. Die enthaltenen Komponenten werden mit sterilisierter Luft belüftet und zur Erleichterung des Wachstums des Mikroorganismus gerührt, wodurch die Wirkung des Umwandlungsprozesses verbessert wird.
Nach Beendigung des Umwandlungsprozesses, was man durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silikagelplatten (E. Merck, Darmstadt) und eines aus Äthylacetat-Cyclohexan (2:3 Vol~Teile) bestehenden Lösungsmittelsystems feststellt, wird das gewünschte umgewandelte Steroid auf allgemein bekannte Weise isoliert. So kann man z.B. die Fermentations-· (Umwandlungs-)Reakt.ionsmischung, einschließlich Fermentationsflüssigkeit und Zellen, mit einem sich mit Wasser nicht mischenden organischen Lösungsmittel für Steroide extrahieren, Entsprechende Lösungsmittel sind Dichlormethan (bevorzugt), Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlormethan, Äthylenchlorid, Trichloräthylen, Äther, Amylacetat, Benzol u.a.
Man kann aber auch zuerst die Fermentationsflüssigkeit und die Zellen auf gewöhnliche Weise, z.B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren, abtrennen und danach einzeln mit Hilfe von entsprechenden Lösungsmitteln extrahieren. Die Zellen können entweder mit mit Wasser mischbaren oder nicht mischbaren Lösungsmitteln extrahiert werden. Die zellfreie Fermentationsflüssigkeit kann mit mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln extrahiert werden.
Die Extrakte kann man durch Diatomeenerde filtrieren und das Filtrat bis zur Trockne im Vakuum eindampfen. Den erhaltenen Rückstand, der das gewünschte 'umgewandelte Steroid enthält, kann man in einer minimalen Menge an Äthylacetat-Cyclohexan
(20:80) lösen. Diese Lösung kann man dann an Silikagel chroraatographieren. AD kann man aus Silikagel durch "Eluieren mit einem Lösungsmittelsystem Äthylacetat-Chloroform (15:85) abtrennen. Die Verbindung kann man darauf als Ganzes durch "Eindampfen des Lösungsmittels und Umkristallisieren aus Hexan isolieren.
Das gewünschte Produkt des erfindungsgemäßen Umwandlungsverfahrens ist das bekannte Steroid-Zwischenprodukt AD.
Diese Verbindung dient als Zwischenstufe bei der Synthese geeigneter Steroidhormone. AD kann z.B. Verwendung finden bei der Herstellung von Testosteron gemäß US-PS 2 143 453, 2 253 793, 2 264 888 und 2 356 154.
Die nachfolgenden Beispiele beschreiben das erfindungsgemäße Verfahren und Produkt, sind jedoch nicht als Einschränkung zu interpretieren. Wenn nichts anderes angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht und das Verhältnis der Lösungsmittelgemische auf das Volumen.
Aus_fjihrun/ysb_e_i_spi_ele_:_
Beispiel 1 - Herstellung des Mutanten M^.jrorjbuitum NRRL B-11359 aus M. fortuitum NRRL B-11358
M..fortuitum NRRL B-11358 wird gewonnen durch Aufstreichen von M.^ fortuitum NRRL B-11045 auf das Medium einer Agarplatte, bestehend aus:
| NH4NO3 | 1*0 g/l |
| K2HPO4 | . 0,25 g/l |
| MgSO4.7H2O | 0,25 g/l |
| NaCl | 0,005 g/l |
| FeSO4.7H2O | 0,001 g/l |
| Destill. Wasser, q.s. | 1 1 |
Der pH-Wert wird mit 1 N HCl auf 7,0 eingestellt. Agar (15 g/l) und 9 AC-Hydroxyandrostendion (0,25 g/l) werden hinzugefügt, das Medium wird 30 min bei 1210C autoklaviert. Das heiße Medium wird dann in ein steriles Mischgefäß gegossen, einige Minuten lang gemischt und danach auf sterile Petri-Platten gegeben. Diese v/erden bei 28 C etwa 7 Tage lang inkubiert. Von den Platten wird M. fortuitum NRRL B-11358 selektiert; dies zeigt das schnelle Wachstum auf den Platten. M. fortuitum NRRL B-11358 wird dann zur Gewinnung von M. f _f qrtuitum NRRL B-11359 dem Mutationsverfahren unterworfen.
(a) NjJbjrjDsjD£^^
M,, fortuitum NRRL B-11358-Zellen v/erden bei 28°C in folgendem sterilen Impfmedium gezüchtet?
Nährbrühe (Difco) 8 g/l
Hefebrühe 1 g/l
Glycerin 5 g/l
TWEEN 80 1 g/l
destill. Wasser, q.s. 11.
Der pH-Wert wird mit 1 N NaOH auf 7,0 eingestellt, wonach
man 20 min bei 1210C sterilisiert.
Die Zellen züchtet man bis zu einer Dichte von ca. 5 x Ί0 pro ml, formt sie durch Zentrifugieren und wäscht dann mit dem gleichen Volumen an sterilem 0,1 M Natriumzitrat bei pH 5,6. Die gewaschenen Zellen werden in demselben Volumen Zitratpuffer resuspendiert, wonach man eine Probe zwecks Titration (Zellzählung) entnimmt und Nitrosoguanidin bis zu einer Konzentration von schließlich 50 nikg/ml hinzufügt. Die Zellsuspension wird im Wasserbad 30 min bei 37°C inkubiert, wonach man erneut eine Probe davon titriert; der Rückstand wird zentrifugiert und mit einem gleichen Volumen an sterilem 0?1 M Kaliumphosphat bei pH 7»0 gereinigt. Schließlich werden die Zellen in einem sterilen Medium mit minimalem Salzgehalt ohne Kohlenstoffquelle bei
folgender Zusammensetzung resuspendiertί
1,0 g/l 0,25 g/l
MgSO477H2O 0,25 g/l
NaCl · 0,005 g/l
FeSO4,7H2O 0,001 g/l
destill. Wasser, q.s. 1 1.
Der pH-Wert wird mit 1 N HCl auf 7}0 eingestellt, wonach man 20 min bei 1210C sterilisiert. Hiernach werden die Zc len zur Selektion der Mutanten auf Platten ausgebracht.
(b) Selektion und Isollerun/y
Hergestellt wird, das unter (a) bei Beispiel 1 beschrie-
e· ·
bene Medium mit minimalem Salzgehalt, ergänzt durch Glycerin (10 g/l) als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle. Hinzugefügt werden dann 15 g/l Agar, wonach das Medium bei 1210C 30 min autoklav!ert wird, worauf das Ausgießen auf sterile Petri-Platten erfolgt.
Die oben beschriebenen mutagenisierten Zellen werden verdünnt und auf die Platten ausgebracht. Das Wachstum in diesem Medium eliminiert die meisten der durch das Verfahren der Mutagenese entstandenen Nährstoffauxotrophen, wie z.B. Kulturen, die Vitamine, Wachstumsfaktoren usv/. benötigen, um in einem chemisch definierten Medium v/achsen zu können. Nach 7-tägiger Inkubation bei 280C bringt man die gewonnenen Kolonien noch einmal auf zur Selektion von Mutanten geeignete Testplatten und dann zurück auf die Kontrollplatten, die das Medium auf Glyceringrundlage enthalten. Die Testplatten werden nach Peterson, G.E., H. L.-.Lewis und J. R. Davis, 1962 "Preparation of uniform dispersions of cholesterol and other water-insoluble carbon sources in agar media" in J. Lipid Research 3:275-276 bereitet. Das sterile Medium mit minima-
lern Salzgehalt in diesen Platten wurde oben unter Beispiel 1 (a) beschrieben. 15 g/l Agar und 9<X~0H AD (0,25 g/l) werden hinzugefügt und die gewonnene Suspension 30 min bei 121°c autoklaviert. Das sterile, heiße Gemisch wird danach in ein Mischgefäß (steril) gegossen, einige Minuten gemischt und sodann auf sterile Petri-Platten gegeben. Bei diesem Verfahren stellt meist das Schäumen ein Problem dar; es kann jedoch verringert werden durch Mischen, solange das Gemisch noch heiß ist, und durch Abflammen der geschmolzenen Agarplatten. Auf diese Art erhält man gleichförmige Dispersionen von wasserunlöslichen Kohlenstoffquellen, wodurch die Herstellung von sehr homogenen, aber undurchsichtigen Agarplatten erleichtert wird. Solche Kolonien, die zwar auf den Kontrollplatten gewachsen sind, doch auf den Testplatten, die 90C-0H AD als einzige Kohlenstoffquelle enthalten, wenig, wenn überhaupt, Wachstum gezeigt haben, werden durch das Aufstreichen auf Agar-Nährplatten gereinigt, Nach dem V/achstum bei 28°C werden Einzelklone von den Ägar-Nährplatten mit sterilen Zahnstochern entnommen und durch Inokulieren von Gitterplatten, die als Kohlenstoffquelle 9Oi-OH AD enthalten, erneut getestet. Zeigen die gereinigten und isolierten Kulturen einen anderen Phänotyp als die Elternkulturen, werden sie in Schüttelkolben ausgewertet.
( c ) Au sw erb urifi i m Sp_hü t^b_eJUcj3JFqe_n
500 ml-Schütte!kolben enthalten 100 ml eines biologischen Umv/andlungsmediums, das folgende Bestandteile aufweist:
Cerelose 5.0 g/l
NH4Cl 3,0 g/l
KHpPO, 0,5 g/l
C.
3 3,0 g/l
Na3C6H5O7.2H2O 3,0 g/l
MgSO4.7H2O 2,0 g/l
Harnstoff . 0,5 g/l
TTOEN 8O+ .2,0 g/l
Ucon++ 8,0 g/l
Mit Wasserleitungswasser wird auf 1 1 aufgefüllt,der pH-Wert auf 7,0 mit 1 N NaOH eingestellt und dann autoklaviert.
+ Atlas refinery inc., Newark, New Jersey. Synthetisches Antischaum-Mittel der Firma Union Carbide Chem. Co., NY, NY.
In das Medium werden 1 g/l Sojamehl und 30 g/l Sitosterol gemischt. Die 30 min bei 1210C autoklavierten Kolben werden auf 28°C abgekühlt und mit 10 ml des folgenden Wachstumsmediums inokuliert.
Die unter (b) erwähnten isolierten und gereinigten Kulturen werden bei 280C auf Schrägagar gezüchtet. "Gin Zellstreifen wird von einer Schrägfläche entnommen und zur Inokulierung eines 500 ml-Kolbens eingesetzt, der 100 ml eines sterilen Impfmediums folgender Zusammensetzung enthält:
Nährflüssigkeit (Difco) 8 g/l
Hefoextrakt 1 g/l
Glycerin ' 5 g/l
TWIDTSN 80 1 g/l
destill. Wasser, q.s. 1 1«,
Der pH-Wert wird mit 1 N NaOH auf 7,0 eingestellt, wonach man die Kolben 20 min bei 1210C autoklaviert. Die Impfkolben werden 72 Stunden lang bei 280C inkubiert.
Wie oben erwähnt, werden 10 ml des Wachstumsmediums zur Inokulierung .jedes 500 ml-Kolbens eingesetzt, der jeweils 100 ml des sterilen Umwandlungsmediums enthält. Die Kolben werden danach bei 28 bis 30 C in einem Rotationsschüttler inkubiert, wobei man in verschiedenen Abständen 10 ml-Proben entnimmt. Diese werden durch Schütteln mit dem 3~fachen Volumen Methylenchlorid extrahiert. Teile der Extrakte wer™.
den unter Verwendung von Silikagel und des oben erwähnten Lösungsmittel sy st ems, d.h. unter Verv/endung von 2:3 (Vol.) Äthylacetat/Cyclohexan dünnschichtchromatographisch und durch Gas-Flüssigkeits-Chromatographie analysiert. Die Anwesenheit von AD bestätigt den selektiven Abbau von Sitosterol durch den aus M. fortuitum NRRL. B-11358 erzeugten Mutanten.
Beispie1.2 - Umwandlung von Sitosterol in AD
Das Umwandlungsmedium ist dasselbe wie in Beispiel 1 (c). Das Medium wird durch Autoklavieren 30 min bei 1210C sterilisiert und anschließend auf 300C abgekühlt, wonach mit 10 Teilen einer Impfkultur des Mutanten M_._ f ojrtuitum NRRL B-11359 (hergestellt wie in Beispiel 1 (c)) inokuliert wird* Das inokulierte Gemisch wird 336 Stunden lang bei 300C inkubiert und dabei umgerührt, um das submerse Wachstum zu fördern. Nach der Inkubation wird das Gemisch mit Dichlormethan extrahiert; Der Extrakt wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel durch Vakuumdestillation entfernt» Der sich ergebende Rückstand wird in einer geringen Menge von Äthylacetat/Cyclohexan (20:80) gelöst. Diese Lösung wird-auf Silikagel chromatographiert. Die Anwesenheit von Androst-4-en-3,17~dion und einer sehr kleinen Menge Androst-1,4-dien-3,17-dion zeigt die Dünnschichtchromatographie. Diese Verbindungen v/erden aus dem Silikagel durch dilution mit dem Lösungsmittelsystem Äthylacetat/Chloroform (15:85) entfernt. Danach v/erden die Verbindungen durch Abdampfen des Lösungsmittels und Umkristallisieren aus Hexan isoliert.
BeiS1PjLel 3 ..·"''
Ersetzt man in Beispiel 2 Sitosterol durch Cholesterol, so gewinnt man AD als im wesentlichen einziges Umwandlungsprodukt .
Λ "Jf ^^ CS? * W
Ersetzt man Sitosterol durch Stigmasterol (Beispiel 2), so gewinnt man AD als im wesentlichen einziges Umwandlungsprodukt.
Ersetzt man in Beispiel 2 Sitosterol durch Campesterol, so erhält man AT) als im wesentlichen einziges Umwandlungsprodukt .
Durch Hinzugäbe einer Kombination der in den Beispielen 2 bis 5 genannten Steroide zusätzlich zu oder anstelle von Sitosterol gemäß Beispiel 2 gewinnt man AD als im wesentlichen einziges Umwandlungsprodukt.
Claims (6)
12 507
Λ?"
Erfindungsanspruch ·
1, Verfahren zur Herstellung von Androst-4-en-3,17-dion> gekennzeichnet dadurch, daß man Mycobacterium fortuitum NRRL B-11359 in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines oder mehrerei Steroide mit einer 17-Alkylseitenkette mit 2 bis 10 C-Atomen züchtet.
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man als Steroid oder eines der Steroide Sitosterol verwendet.
3β Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man als Steroid oder eines der Steroide Cholesterol verwendet*
4. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man als Steroid oder, eines der Steroide Stigmasterol verwendet.
5. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man als Steroid oder eines der Steroide Campesterol verwendet.
6. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß Mycobacterium fortuitum NRRL B-11359 durch Mutation des Mikroorganismus Mycobacterium fortuitum NRRL B-11358 erhalten wird.
7. Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß der Mikroorganismus Mycobacterium fortuitum NRRL B-11358 durch adaptive Mutation von Mycobacterium fortuitum NRRL B--11O4-5 erhalten wird»
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