CH637423A5 - Verfahren zur extraktion von mikroorganismen und verwendung der mikroorganismen fuer ein diagnostisches mittel. - Google Patents

Verfahren zur extraktion von mikroorganismen und verwendung der mikroorganismen fuer ein diagnostisches mittel. Download PDF

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CH637423A5 CH1192777A CH1192777A CH637423A5 CH 637423 A5 CH637423 A5 CH 637423A5 CH 1192777 A CH1192777 A CH 1192777A CH 1192777 A CH1192777 A CH 1192777A CH 637423 A5 CH637423 A5 CH 637423A5
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von Mikroorganismen, insbesondere Staphylokokken, und die Verwendung der so extrahierten Mikroorganismen für diagnostische Mittel, die z.B. zum Nachweis von Fibrinogen oder Fibrin-Spaltprodukten oder zum Binden von Immunglobulin bzw. dessen Fc-Fragment und damit zur Bestimmung eines Antigens verwendet werden können.
Mikroorganismen enthalten bekanntlich eine Vielzahl von Substanzen, die zu unterschiedlichen Reaktionen Anlass geben können. Wegen der häufigen Überschneidung derartiger Reaktionen sind Einzelabläufe selten beobachtbar. Es besteht oft der Wunsch, differenzierte, durch Einzelbezirke bedingte Reaktionen zu beobachten, wozu unerwünschte Bestandteile entfernt werden müssen.
Es ist bekannt, dass eine Reihe von Staphylococcus aureus Stämmen sowohl mit Fibrinogen als auch mit den Abbauprodukten des Fibrins unter Verklumpung zu reagieren vermögen. Der für die Reaktion verantwortliche Faktor ist als Clumping-Faktor (CF) bekannt. Die CIumping-Faktor-Reaktion hat wegen der Einfachheit ihrer Durchführung zur Diagnose der erhöhten Fibrindyse praktische Bedeutung erlangt. Zur Durchführung der Clumping-Faktor-Reaktion hat man bisher nur ausgewählte CF-positive Staphylokokken verwendet. Insbesondere ist es nicht erwünscht, dass die betreffenden Staphylokokken neben CF auch lösliche ICoa-gulase bilden. Eine Reihe von Staphylococcus aureus Stämmen zeigt zudem die unerwünschte Eigenschaft einer Spontan-Agglutination, für die bestimmte, nicht charakterisierte Proteine verantwortlich gemacht werden.
Es besteht demnach ein Bedarf an Clumping-Faktor enthaltenden Staphylokokken, die weder lösliche Koagulase enthalten noch Spontan-Agglutination zeigen.
Es ist ferner bekannt, dass bestimmte Mikroorganismen ein Polypeptid besitzen, das den sog. Fc-Teil von Antikörpermolekülen zu binden vermag. Bei Staphylokokken wird dieses Polypeptid Protein A genannt. Fc-bindendes Polypeptid enthaltende Mikroorganismen werden, um störende Nebenreaktionen auszuschalten, zur Gewinnung des Polypeptids aufgearbeitet, wobei das Polypeptid in der Regel an einen festen Träger gebunden wird. Es besteht ein Bedarf an trägergebundenem Polypeptid zur Bindung des Fc-Teils von Antikörpermolekülen, welches eine störungsfreie Verwendung bei der Bestimmung von Antigenen gestattet.
Die Aufgaben werden erfindungsgemäss dadurch gelöst, dass Mikroorganismen, insbesondere Staphylokokken einem besonderen Extraktionsverfahren unterworfen werden.
Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Extraktionsverfahren zur Entfernung unerwünschter Bestandteile eines als Reagens verwendbaren Mikroorganismus, vorzugsweise Staphylococcus aureus, das dadurch gekennzeichnet ist, dass der Mikroorganismus mit einer 4-8 molaren, vorzugsweise 6 molaren wässrigen Lösung eines Guanidinsalzes behandelt, danach von diesem freigewaschen und gewonnen wird. Gegebenenfalls kann danach lyophilisiert werden.
In bevorzugten Ausführungsformen werden im Hinblick auf ihre Verwendung entweder Clumping-Faktor positive Mikroorganismen, insbesondere Clumping-Faktor positive Staphylokokken, oder Fc-Teil bindendes Peptid enthaltende Mikroorganismen, insbesondere Protein A enthaltende Staphylokokken, verwendet.
Zum Einsatz als CF-Reagens werden die Staphylokokken zweckmässig in einer Pufferlösung, die gewünschtenfalls einen Suspensionsstabilisator enthält, suspendiert. Als Pufferlösungen können hierfür die bei biochemischen Arbeiten üblichen Puffersysteme verwendet werden, beispielsweise Trishydroxymethylaminomethan-Hydrochlorid, Imidazol-Kochsalzpuffer oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Sofern Suspensions-Stabilisatoren erwünscht sind, werden zweckmässig Proteine vom Albuminoidtyp, beispielsweise Serumalbumin, bevorzugt Rinder-Serumalbumin, verwendet. Deren Konzentration liegt im allgemeinen bei etwa 0,005 bis 0,1, vorzugsweise 0,01% Rinderserumalbumin.
Die Keimkonzentration der Staphylokokken in der betreffenden Pufferlösung, die vorteilhaft auf einen pH-Wert um den Neutralpunkt eingestellt wird, beispielsweise auf einen
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pH-Wert zwischen 7,0 und 7,5, beträgt im allgemeinen etwa 0,1 bis 10%. Besonders vorteilhaft ist eine Konzentration von um 0,15-0,3%.
Als Suspensionsstabilisator und als Stabilisator zur Konservierung der Aktivität des gefriergetrockneten Produktes haben sich mehrwertige Alkohole als besonders geeignet erwiesen. Die Konzentration des mehrwertigen Alkohols in der für die Suspension der Staphylokokken verwendeten wässrigen Pufferlösung vom bevorzugten pH-Wert 7,0 bis 7,7 liegt vorzugsweise bei 3 bis 50%. Die besonders geeigneten polyhydrischen Alkohole umfassen einen Molekulargewichtsbereich von 62 bis 500 000. Beispielsweise handelt es sich um folgende Substanzen: Glyzerin, Glukose,Mannit, Polyäthylenglykol, Dextran und «Ficoll». Bei den letztgenannten haben sich jene als besonders geeignet erwiesen, die ein Molekulargewicht von 70 000 bis 400 000 besitzen. Während beispielsweise für Glyzerin es besonders vorteilhaft ist, 50% in die Suspension einzubringen, kann mit Mannit, Plyät-hylenglykol, Dextran und «Ficoll» bereits mit 3% eine hervorragende Stabilisierung der Suspension und der Lagerungsbeständigkeit der extrahierten Staphylokokken erreicht werden.
Die Bestimmung wird zweckmässig im Titrierverfahren vorgenommen. Günstig ist hierbei ein Mikro-Titrierver-fahren, bei dem jeweils zu etwa 20 jj.1 der gepufferten Keimsuspension von etwa 0,15 bis 0,3% etwa 50 jxl einer fortlaufenden Verrdünnungsreihe der zu bestimmenden Lösung, beispielsweise Blutplasma oder Blutserum, insbesondere Humanplasma oder Humanserum, zugesetzt werden.
Überraschenderweise wurde bei der nachfolgenden Inkubation des Gemisches gefunden, dass die Empfindlichkeit hinsichtlich der Nachweismöglichkeit von Fibrin-Spaltprodukten wesentlich erhöht werden kann, wenn die Reaktionsgemische intensiv geschüttelt werden.
Eine zeitliche Begrenzung der Schütteldauer bis zur Ablesung des Endpunktes der Reaktion hat sich als vorteilhaft erwiesen. Beim Mikro-Titrierverfahren werden dabei im allgemeinen 3-10 Minuten eingehalten.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung wurde gefunden, dass die Verklumpungsreaktion der Mikroorganismen besonders deutlich ablesbar wird, wenn die Mikroorganismen, insbesondere die Staphylokokken, mit einem geeigneten Farbstoff eingefärbt werden. Geeignete Farbstoffe im Sinne der Erfindung sind im allgemeinen solche, die eine ausreichende Affinität zu Proteinen zeigen, direkt aufziehen, Oxydations- und Alkalibeständigkeit besitzen und infolge Fehlens reaktiver Gruppen nicht zur Agglutination der Mikroorganismen beitragen. Besonders günstig hat es sich erwiesen, die Mikroorganismen, mit Farbstoffen der Colour Index Bezeichnung (CI) Basic Red 23, Basic Blue 45 oder Basic Orange 30 einzufärben.
Zur Färbung werden die erfindungsgemäss extrahierten Mikroorganismen in der Regel in einer wässrigen Lösung suspendiert, mit einer verdünnten Lösung des betreffenden Farbstoffes versetzt und nach einer experimentell als günstig ermittelten Einwirkdauer von der Farbstofflösung getrennt. Zweckmässig werden die Keime zur Abtrennung der Farbstofflösung hochtourig zentrifugiert, beispielsweise bei etwa 10 000 bis 20 000 x g. In einem der oben beschriebenen Puffer suspendiert und mit einem Suspensions-Stabilisator versetzt sind die gefärbten Mikroorganismen besonders geeignete Reagenzien-Bestandteile für den Nachweis von Fibrin-Spalt-produkten. Gewünschtenfalls können die gefärbten Mikroorganismen in gefriergetrockneter Form aufbewahrt und unmittelbar vor dem Gebrauch resuspendiert .werden.
Die Einfärbung der Mikroorganismen führt zu besonders günstiger Ablesung der Reaktion, da die gefärbten Partikel zur Erhöhung des Kontrastes gegenüber der Umgebung bedeutend beitragen. Vorteilhaft wirkt sich weiterhin die Möglichkeit aus, die Konzentration der Mikroorganismen im Testsystem herabsetzen zu können. Die Empfindlichkeit kann gesteigert werden, die Endpunkte der Reaktion werden s schärfer.
Clumping-Faktor-positive Mikroorganismen sind aus der Literatur bekannt. Durch Hitze inaktivierte Clumping-Faktor-positive Mikroorganismen können zur Bestimmung von Fibrinspaltprodukten verwendet werden. Mit all diesen io Literatur-bekannten Stämmen von Mikroorganismen ist das erfindungsgemässe Verfahren durchführbar. Es können aus ihnen Reagenzien mit verminderter Störanfälligkeit hergestellt werden. Besonders günstige Ergebnisse hinsichtlich der Empfindlichkeit und einer geringen Störanfälligkeit des Verls fahrens zum Nachweis von Fibrinogen und Fibrin-Spaltprodukten liefert ein Staphylococcus aureus mit der Bezeichnung K 807 (ATCC-Nr. 31243) dessen Charakteristica in folgender Weise beschrieben werden:
Der Stamm wurde von einer an Mastitis erkrankten Kuh 20 isoliert. In flüssigem Nährmedium wächst er diffus. Er ist grampositiv. Weitere charakteristische Eigenschaften:
Kristallviolett: Typ A Clumping Faktor 25 Koagulase Protein A
Pan ton Valentine Leukozidin (PVL) PVL R (Rind)
Hämolysine a 30 Hämolysine ß Hämolysine 5 Saure Phosphatase Alkalische Phosphatase Fibrinolysin 35 Eigelbfaktor Penicillinase Nuclease
+ + + + + + + + +
Wachstum auf festen Medien:
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Staphylococcus Medium 110 (Baltimore Biological Lab.): gutes Wachstum, weisslich-graue Kolonien mit einem Durchmesser von 1 -2 mm.
Pferdeblutagar: gutes Wachstum, weisslich-graue Kolo-45 nien, kaum hämolytisch.
Nähr-Agar: weisslich-graue Kolonien, zuweilen unregelmässig ausgebildet.
Mac Concey-Agar Nr. 3 (Oxoid): kein Wachstum so Antibiogramm:
Chloramphenicol Erythromycin Sulphafurazol 55 Methicillin Penicillin Ampicillin Streptomycin Tetracyclin empfindlich empfindlich resistent empfindlich empfindlich empfindlich empfindlich empfindlich
Der Stamm Staphylococcus aureus K 807 zeigt folgende Stoffwechselleistungen:
Vergärung von: 65 Dextrose Lactose Saccharose Maltose nach 6 Tagen nach 6 Tagen nach 6 Tagen nach 6 Tagen bei37°C bei 37°C bei 37°C bei 37°C
+ + + + + + + +
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Mannit nach 6 Tagen bei 37°C
+ +
Salizin nach 13 Tagen bei37°C
-
Inulin nach 13 Tagen bei 37°C
-
Äskulin nach 13 Tagen bei 37°C
—
Wachstum in Gegenwart von NaCl:
4% +
5% +
6% +
7% +
8% +
Im besonderen ist demnach Gegenstand der Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäss erhaltenen Mikroorganismus als Nachweismittel für Fibrinogen und/oder Fibrin-Spaltprodukte, das als wesentlichen Bestandteil eine vorzugsweise 0,l-10°/oige Suspension, vorzugsweise homogen verteilter, erfindungsgemäss extrahierter Clumping-Faktor-positiver Mikroorganismen, vorzugsweie eines Clumping-Faktor-positiven Staphylococcus aureus, insbesondere den Staphylococcus aureus K 807 (ATCC-Nr. 31243), enthält, der gegebenenfalls mit einem geeigneten Farbstoff eingefärbt ist.
Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der genannten Mikroorganismen-Suspension für die Bestimmung von Fibrinogen und/oder Fibrin-Spaltprodukten, insbesondere in Körperflüssigkeiten, vorzugsweise in Plasma oder Serum, nach bekannten Verfahren. Nach Inkubation je eines Anteils der Reagenziensuspension mit je einem Anteil der zu bestimmenden Lösung in steigernder Verdünnung werden die Ansätze vorteilhaft wenige Minuten geschüttelt und diejenige höchste Verdünnung der Körperflüssigkeit registriert, die noch eine positive Verklumpung der Keime aufweist. Wird dieser Wert mit einem durch Verdünnung von Serum gesunder Personen erhaltenen Wert in Beziehung gesetzt, kann danach das Resultat als Abweichung vom Normalwert festgestellt werden.
Gegenstand der Erfindung ist weiter die in den Patentansprüchen 8 bis 15 angegebene Verwendung des erfindungsgemäss erhaltenen Mikroorganismus.
Zur Bestimmung von Antigenen sowohl in Lösung wie auch an der Oberfläche von feinen Teilchen, wie Bakterien oder Viren, können Mikroorganismen, die den Fc-Teil von Immunglobulinen zu binden vermögen, nach dem oben beschriebenen Verfahren extrahiert werden. Über die anti-genbindenden Teile der Immunglobuline entsteht eine wirksame Bindung mit den zu bestimmenden Antigenen. Die Agglutination der mit dem Immunglobulin beladenen Mikroorganismen kann leicht beobachtet und registriert werden. Ein besonders geeigneter Mikroorganismus mit einem Fcbin-denden Polypeptid ist, wie erwähnt, Staphylococcus aureus. Ausserdem seien noch einige Stämme des Staphylococcus pyogenes als Polypeptid-Träger genannt, die mit dem Fc-Teil von Immunglobulinen zu reagieren vermögen.
Diese Mikroorganismen lassen sich nach erfindungsge-mässer Extraktion zur Diagnostik von physiologisch oder pathologischen Zuständen an denen ein Antigen beteiligt ist, einsetzen und zwar sowohl bei Tieren als auch bei Menschen. Dabei wird eine Probe, die das Antigen enthält, mit spezifischen Antikörpern in Kontakt gebracht, die an die Oberfläche der Mikroorganismen gebunden sind. Es erfolgt eine Agglutination, wenn die Probe ein entsprechendes Antigen enthält.
Guanidiniumchlorid-extrahierte unbekapselte Staphylokokken (S. aureus und S. epidermidis) aktivieren den Komplementfaktor C3 und adsorbieren ihn an ihrer Oberfläche. Das erfolgt nach Inkubation in frischem Menschen- und Meerschweinchenserum. Die mit aktiviertem C3 behafteten Staphylokokken bilden Rosetten mit B-Lymphozyten von
Menschen. Damit ermöglichen die guanidiniumchloridextra-hierten Staphylokokken die Erkennung und Isolierung von B-Lymphozyten. Ebenso können guanidiniumchloridextra-hierte Protein A positive Staphylokokken direkt dafür verwendet werden.
Die Bestimmung kann als quantitative Bestimmung nach üblichen Agglutinationsverfahren durchgeführt werden, beispielsweise, indem man eine Verdünnungsreihe von Proben testet und das Ergebnis mit einer Probe von bekannten Anti-genkonzentrationen vergleicht. Der Agglutinationstest wird im allgemeinen in einer wässrigen Lösung, beispielsweise in einer physiologisch gepufferten Salzlösung mit einem neutralen pH-Wert durchgeführt.
Die extrahierten Mikroorganismen, die einen Fc-Teil der Antikörper zu binden vermögen, können wie beschrieben gefärbt sein, um die Beobachtung der Agglutination zu erleichtern.
Gegenstand der Erfindung ist schliesslich die Verwendung eines erfindungsgemäss extrahierten Mikroorganismus als diagnostisches Mittel in seiner allgemeinsten Form und insbesondere zur Bestimmung eines Antigens nach an sich bekannten Verfahren, der Agglutination, des Radioimmuno-assay oder des enzymmarkierten Immunoassay, um nur einige beispielhaft zu nennen.
Die Erfindung soll am nachstehenden Beispiel näher erläutert werden:
Beispiel
Staphylococcus aureus K 807 (ATCC-Nr. 31243) wird in einem Medium folgender Zusammensetzung vermehrt:
Vorkultur: TSB (Tryptone Soya Broth, Oxoid) 100 ml in 1000 ml Erlenmeyer-Kolben
Hauptkultur: 141 TSB in 16-1-Fermenter unter Zusatz von 0,25% Liebig Fleischextrakt (B.B.L.B.); Beimpfung mit 6 Vor-kulturkolben.
Die Keime werden nach Zentrifugation bei 74 000 x g gewonnen, danach 2 mal in destilliertem Wasser gewaschen und gefriergetrocknet. Aus einem 161 Fermenter werden ca. 50 g Staphylokokken erhalten. Die Bakterien aus einem Fermenter werden mit 200 ml 6 M Guanidinhydrochloridlösung 18 Stunden stehengelassen. Danach werden die Keime von der Guanidinhydrochloridlösung abgetrennt und die Behandlung mit Guanidinhydrochlorid insgesamt 4 mal wiederholt. Schliesslich werden die Staphylokokken so lange gewaschen oder dialysiert, bis mit alkalischer 1,2 Naphtho-chinon-4-Sulfonsäure und Hydroxylamin nach Sullivan und Hess (1936) in Hoppe Seyler Thierfelder, Physiologie und Pathol. Chemische Analyse 10. Aufl. Band III, 2, S. 1091, Guanidinhydrochlorid nur noch in Spuren nachweisbar ist. Nach Resuspension der Staphylokokken in destilliertem Wasser werden die Keime lyophilisiert.
Zur Färbung werden die lyophilisierten, extrahierten Keime in einer Konzentration von 1,5 mg/ml in 0,14 M NaCl suspendiert und pro ml mit 0,3 ml einer 0, l%igen Lösung von Astrazonrot BBL® (eingetragenes Warenzeichen der Farbenfabriken Bayer AG, Leverkusen) = CI Basic Red 23, in 0,14M Kochsalzlösung versetzt und 5 Minuten gerührt. Danach werden die Staphylokokken bei 14 600 xg abzentri-fugiert und die Keime in dem ursprünglichen Volumen 0,14M phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 6,4 suspendiert. Der Puffer enthält 0,05% Rinderserumalbumin.
Für die Clumping-Faktor Reaktion im Röhrchentest werden die Staphylokokken in einer l%igen Suspension, beispielsweise in 0,05 M Tris-hydroxymethyl-aminomethan-Puffer pH 7,4 mit einem Zusatz von 0,01% Rinderserumalbumin eingesetzt.
Im Mikrotitrationsverfahren nach Leavelle: (Amer. J. Clin. Path., Vol. 55, S. 452-457 (1971) werden die Staphylokokken
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in 0,3%iger Suspension in 0,017 M Imidazon-NaCl-Puffer pH 7,4 eingesetzt. Für die Mischung des Reaktionsansatzes hat sich besonders vorteilhaft ein Plattenschüttler (Mikro-Shaker AM 69 der Flow Laboratories, Bonn) erwiesen.
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Für Nachweisverfahren von Antigenen haben sich extrahierte, Protein A enthaltende Staphylokokken, besonders der Staphylococcus aureus Stamm COWANI (NCTT 8 530), bewährt. Er wird in der gleichen Weise wie K 807 extrahiert.
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Claims (15)

637 423 PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Extraktion von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, dass Mikroorganismen mit einer 4-bis 8-molaren wässrigen Lösung eines Guanidinsalzes behandelt, danach von diesem freigewaschen und gewonnen werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus ein Staphylococcus verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus ein Clumping-Faktor positiver Mikroorganismus verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass Staphylococcus aureus K 807, ATCC 31243, als Mikroorganismus verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus ein Mikroorganismus verwendet wird, der ein den Fc-Teil von Antikörpern bindendes Peptid enthält.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus Staphylococcus aureus Cowan I verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die gewonnenen Mikroorganismen anschliessend zu ihrer Stabilisierung in einer wässrigen Suspension mit 3 bis 50% mindestens eines darin löslichen mehrwertigen Alkohols versetzt werden.
8. Verwendung der nach einem der Ansprüche 1 bis 7 erhaltenen Mikroorganismus für ein diagnostisches Mittel.
9. Verwendung nach Anspruch 8 als Nachweismittel für Fibrinogen und/oder Fibrinspaltprodukte, enthaltend als wesentlichen Bestandteil eine Suspension eines gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7 behandelten Mikroorganismus.
10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Suspension Staphylococcus aureus K 807 eingefärbt mit CI Basic Red 23 enthält.
11. Verwendung nach Anspruch 8 für ein Bestimmungsmittel für ein Antigen, enthaltend als wesentlichen Bestandteil eine Suspension eines nach einem der Ansprüche 1,5 und 6 behandelten, gegebenenfalls mit einem Antikörper bela-denen, Mikroorganismus.
12. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel als wesentlichen Bestandteil eine Suspension eines nach einem der Ansprüche 1 bis 6 behandelten Mikroorganismus enthält, welcher mit einem Farbstoff eingefärbt ist.
13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus mit Basic Red 23 gemäss Color Index eingefärbt ist.
14. Verwendung nach Anspruch 8 für ein Charakterisierungsmittel von Rezeptor tragenden Lymphozyten, enthaltend als wesentlichen Bestandteil eine Supension eines nach einem der Ansprüche 1 oder 2 erhältlichen Mikroorganismus.
15. Verwendung nach einem der Ansprüche 9,11,12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Suspension 3 bis 50% an mindestens einem darin löslichen mehrwertigen Alkohol enthält.
CH1192777A 1976-10-02 1977-09-29 Verfahren zur extraktion von mikroorganismen und verwendung der mikroorganismen fuer ein diagnostisches mittel. CH637423A5 (de)

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