CH645670A5

CH645670A5 - Diagnostisches mittel.

Info

Publication number: CH645670A5
Application number: CH150282A
Authority: CH
Inventors: Hans-Georg Prof Dr Blobel; Werner Dr Schaeg; Joerg Dr Brueckler
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1976-10-02
Filing date: 1977-09-29
Publication date: 1984-10-15
Also published as: SE7711028L; DE2644622C3; US4312942A; BR7706495A; FR2366359B1; JPS5344624A; GB1565908A; DE2644622B2; FR2366359A1; IT1085295B; CH646259A5; NL7710668A; AU516057B2; DE2644622A1; AT360645B; ATA699877A; CH637423A5; AU2928177A; CA1102237A

Description

Die Erfindung betrifft ein diagnostisches Mittel zum Nachweis von Fibrinogen und/oder Fibrinspaltprodukten.

Mikroorganismen enthalten bekanntlich eine Vielzahl von Substanzen, die zu unterschiedlichen Reaktionen Anlass geben können. Wegen der häufigen Überschneidung derartiger Reaktionen sind Einzelabläufe selten beobachtbar. Es besteht oft der Wunsch, differenzierte, durch Einzelbezirke bedingte Reaktionen zu beobachten, wozu unerwünschte Bestandteile entfernt werden müssen.

Es ist bekannt, dass eine Reihe von Staphylococcus aureus Stämmen sowohl mit Fibrinogen als auch mit den Abbauprodukten des Fibrins unter Verklumpung zu reagieren vermögen. Der für die Reaktion verantwortliche Faktor ist als Clumping-Faktor (CF) bekannt. Die Clumping-Faktor-Reaktion hat wegen der Einfachheit ihrer Durchführung zur Diagnose der erhöhten Fibrinolyse praktische Bedeutung erlangt. Zur Durchführung der Clumping-Faktor-Reaktion hat man bisher nur ausgewählte CF-positive Staphylokokken verwendet. Insbesondere ist es nicht erwünscht, dass die betreffenden Staphylokokken neben CF auch lösliche Koagulase bilden. Eine Reihe von Staphylococcus aureus Stämmen zeigt zudem die unerwünschte Eigenschaft einer Spontan-Ag-glutination, für die bestimmte, nicht charakterisierte Proteine verantwortlich gemacht werden.

Es besteht demnach ein Bedarf an Clumping-Faktor enthaltenden Staphylokokken, die weder lösliche Koagulase enthalten noch Spontan-Agglutination zeigen.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein diagnostisches Mittel zum Nachweis von Fibrinogen und/oder Fibrinspaltprodukten das dadurch gekennzeichnet ist, dass es als wesentlichen Bestandteil eine Suspension eines Clumping-Faktor positiven Mikroorganismus enthält, der weder lösliche Koagulase enthält noch Spontan-Agglutination zeigt, wobei die Suspension 3 bis 50% mindestens eines darin löslichen mehrwertigen Alkohols enthält.

Dieses Mittel kann hergestellt werden, indem man den Mikroorganismus, vorzugsweise einen Clumping-Faktor positiven Staphylococcus, insbesondere einen Staphylococcus aureus, mit einer 4- bis 8-molaren, vorzugsweise 6-molaren, wässrigen Lösung eines Guanidinsalzes behandelt, danach von diesem freiwäscht und die erforderliche Alkoholmenge zugibt. Gegebenenfalls kann danach lyophilisiert werden.

Zum Einsatz als CF-Reagens werden die Staphylokokken zweckmässig in einer Pufferlösung, die gewünschtenfalls einen Suspensionsstabilisator enthält, suspendiert. Als Pufferlösungen können hierfür die bei biochemischen Arbeiten üblichen Puffersysteme verwendet werden, beispielsweise Tris-

hydroxymethylaminomethan-Hydrochlorid, Imidazol-Koch-salzpuffer oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Sofern Suspensions-Stabilisatoren erwünscht sind, werden zweckmässig Proteine vom Albuminoidtyp, beispielsweise Serumal-sbumin, bevorzugt Rinder-Serumalbumin, verwendet. Deren Konzentration liegt im allgemeinen bei etwa 0,005 bis 0,1, vorzugsweise 0,01 %, Rinderserumalbumin.

Die Keimkonzentration der Staphylokokken in der betreffenden Pufferlösung, die vorteilhaft auf einen pH-Wert io um den Neutralpunkt eingestellt wird, beispielsweise auf einen pH-Wert zwischen 7,0 und 7,5, beträgt im allgemeinen etwa 0,1 bis 10%. Besonders vorteilhaft ist eine Konzentration von um 0,15 bis 0,3 %.

Die Bestimmung wird zweckmässig im Titrierverfahren 15 vorgenommen. Günstig ist hierbei ein Mikro-Titrierverfah-ren, bei dem jeweils zu etwa 20 (il der gepufferten Keimsuspension von etwa 0,15 bis 0,3 % etwa 50 jal einer fortlaufenden • Verdünnungsreihe der zu bestimmenden Lösung, beispielsweise Blutplasma oder Blutserum, insbesondere Human-20 plasma oder Humanserum, zugesetzt werden.

Überraschenderweise wurde bei der nachfolgenden Inkubation des Gemisches gefunden, dass die Empfindlichkeit hinsichtlich der Nachweismöglichkeit von Fibrin-Spaltprodukten wesentlich erhöht werden kann, wenn die Reaktions-25 gemische intensiv geschüttelt werden.

Eine zeitliche Begrenzung der Schütteldauer bis zur Ablesung des Endpunktes der Reaktion hat sich als vorteilhaft erwiesen. Beim Mikro-Titrierverfahren werden dabei im allgemeinen etwa 3 bis 10 Minuten eingehalten.

30 In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung wurde gefunden, dass die Verklumpungsreaktion der Mikroorganismen besonders deutlich ablesbar wird, wenn die Mikroorganismen, insbesondere die Staphylokokken, mit einem geeigneten Farbstoff eingefärbt werden. Geeignete Farbstoffe im 35 Sinne der Erfindung sind im allgemeinen solche, die eine ausreichende Affinität zu Proteinen zeigen, direkt aufziehen, Oxydations- und Alkalibeständigkeit besitzen und infolge Fehlens reaktiver Gruppen nicht zur Agglutination der Mikroorganismen beitragen. Besonders günstig hat es sich er-40 wiesen, die Mikroorganismen mit Farbstoffen der Colour Index Bezeichnung (CI) Basic Red 23, Basic Blue 45 oder Basic Orange 3 0 einzufarben.

Zur Färbung können die extrahierten Mikroorganismen in einer wässrigen Lösung suspendiert, mit einer verdünnten 45 Lösung des betreffenden Farbstoffes versetzt und nach einer experimentell als günstig ermittelten Einwirkdauer von der Farbstofflösung getrennt werden. Zweckmässig werden die Keime zur Abtrennung der Farbstofflösung hochtourig zen-trifugiert, beispielsweise bei etwa 10 000 bis 20 000 x g. In ei-50 nem der oben beschriebenen Puffer suspendiert und mit einem Suspensions-Stabilisator versetzt, sind die gefärbten Mikroorganismen besonders geeignete Reagenzien-Bestandteile für den Nachweis von Fibrin-Spaltprodukten. Gewünschtenfalls können die gefärbten Mikroorganismen in gefrierge-55 trockneter Form aufbewahrt und unmittelbar vor dem Gebrauch resuspendiert werden.

Die Einfärbung der Mikroorganismen führt zu besonders günstiger Ablesung der Reaktion, da die gefärbten Partikel zur Erhöhung des Kontrastes gegenüber der Umgebung be-6o deutend beitragen. Vorteilhaft wirkt sich weiterhin die Möglichkeit aus, die Konzentration der Mikroorganismen im Testsystem herabsetzen zu können. Die Empfindlichkeit kann gesteigert werden, die Endpunkte der Reaktion werden schärfer.

65 Clumping-Faktor-positive Mikroorganismen sind aus der Literatur bekannt. Durch Hitze inaktivierte CIumping-Fak-tor-positive Mikroorganismen können zur Bestimmung von Fibrin-Spaltprodukten verwendet werden. All diese literatur

bekannten Stämme von Mikroorganismen sind für bestim-mungsgemässe Verwendung geeignet. Es können aus ihnen Reagenzien mit verminderter Störanfälligkeit hergestellt werden. Besonders günstige Ergebnisse hinsichtlich der Empfindlichkeit und einer geringen Störanfälligkeit des Verfahrens zum Nachweis von Fibrinogen und/oder Fibrin-Spaltpro-dukten liefert eine Staphylococcus aureus mit der Bezeichnung K 807 (ATCC-Nr. 31 243), dessen Charakteristika in folgender Weise beschrieben werden:

Der Stamm wurde von einer an Mastitis erkrankten Kuh isoliert. Der Stamm K 807 wurde am 19. August 1976 bei ATCC deponiert unter der Bezeichnung ATCC 31 243. In flüssigem Nährmedium wächst er diffus. Er ist gram-positiv. Weitere charakteristische Eigenschaften:

Kristallviolett: Typ A

dumping Faktor Koagulase Protein A

Panton Valentine Leukozidin (PVL)

PVL R (Rind)

Hämolysine a

Hämolysine ß

Hämolysine 5

Saure Phosphatase

Alkalische Phosphatase

Fibrinolysin

Eigelbfaktor

Penicillinase

Nuclease

+ + + + + + + + +

Wachstum auffesten Medien:

Staphylococcus Medium 110 (Baltimore Biological Lab.): gutes Wachstum, weisslich-graue Kolonien mit einem Durchmesser von 1 bis 2 mm.

Pferdeblutagar: gutes Wachstum, weisslich-graue Kolonien, kaum hämolytisch.

Nähr-Agar: weisslich-graue Kolonien, zuweilen unregelmässig ausgebildet.

Mac Concey-Agar Nr. 3 (Oxoid): kein Wachstum.

Antibiogramm:

Chloramphenicol

Erythromycin

Sulphafurazol

Methicillin

Penicillin

Ampicillin

Streptomycin

Tetracyclin empfindlich empfindlich resistent empfindlich empfindlich empfindlich empfindlich empfindlich

Der Stamm Staphylococcus aureus K 807 zeigt folgende

Stoffwechselleistungen:

Vergärung von:

Dextrose nach 6 Tagen bei 37 °C

+ +

Lactose nach 6 Tagen bei 37 °C

+ +

Saccharose nach 6Tagen bei 37 °C

+ +

Maltose nach 6 Tagen bei 37 °C

+ +

Mannit nach 6 Tagen bei 37 °C

+ +

Salizin nach 13 Tagen bei 37 °C

-

Inulin nach 13 Tagen bei 37 °C

-

Aeskulin nach 13 Tagen bei 37 °C

-

3 645 670

Wachstum in Gegenwart von NaCl:

4% +

5% +

6% +

5 7% +

8% +

Eine besondere Ausführungsform des erfindungsgemäs-sen diagnostischen Mittels enthält als wesentlichen Bestand-io teil eine 0,1- bis 10%ige Suspension homogen verteilter, extrahierter Clumping-Faktor-positiver Mikroorganismen, vorzugsweise eines Clumping-Faktor-positiven Staphylococcus aureus, insbesondere des Staphylococcus aureus K 807 (ATCC-Nr. 31 243), der gegebenenfalls mit einem geeigneten 15 Farbstoff eingefärbt ist.

Das erfindungsgemässe diagnostische Mittel kann für die Bestimmung von Fibrinogen und/oder Fibrin-Spaltprodukten in Körperflüssigkeiten, vorzugsweise in Plasma oder Serum, nach bekannten Verfahren eingesetzt werden. Nach In-20 kubation je eines Anteils der Reagenziensuspension mit je einem Anteil der zu bestimmenden Lösung in steigender Verdünnung werden die Ansätze vorteilhaft wenige Minuten ge-• schüttelt und diejenige höchste Verdünnung der Körperflüs-

sigkeit registriert, die noch eine positive Verklumpung der 25 Keime aufweist. Wird dieser Wert mit einem durch Verdünnung von Serum gesunder Person erhaltenen Wert in Beziehung gesetzt, kann danach das Resultat als Abweichung vom Normalwert festgestellt werden.

Die Erfindung soll am nachstehenden Beispiel näher er-30 läutert werden.

Beispiel

Staphylococcus aureus K 807 (ATCC-Nr. 31 243) wird in einem Medium folgender Zusammensetzung vermehrt: 35 Vorkultur: TSB (Tryptone Soya Broth, Oxoid) 100 ml in 1000 ml Erlenmeyer-Kolben

Hauptkultur: 141 TSB in 16-1-Fermenter unter Zusatz von 0,25% Liebig Fleischextrakt (B.B.L.B.); Beimpfungmit

6 Vorkulturkolben.

40 Die Keime werden nach Zentrifugation bei 74 000 x g gewonnen, danach zweimal in destilliertem Wasser gewaschen und gefriergetrocknet. Aus einem 161 Fermenter werden ca. 50 g Staphylokokken erhalten. Die Bakterien aus einem Fermenter werden mit 200 ml 6 M Guanidinhydrochlo-45 ridlösung 18 Stunden stehengelassen. Danach werden die Keime von der Guanidinhydrochloridlösung abgetrennt und die Behandlung mit Guanidinhydrochlorid insgesamt viermal wiederholt. Schliesslich werden die Staphylokokken so lange gewaschen oder dialysiert, bis mit alkalischer 1,2-Naphtho-50 chinon-4-sulfonsäure und Hydroxylamin nach Sullivan und Hess (1936) in Hoppe Seyler Thierfelder, Physiologie und Pathol. Chemische Analyse, 10. Auflage, Band III, 2, S. 1091., Guanidinhydrochlorid nur noch in Spuren nachweisbar ist. Nach Resuspension der Staphylokokken in destillier-55 tem Wasser werden die Keime lyophilisiert.

Zur Färbung werden die lyophilisierten, extrahierten Keime in einer Konzentration von 1,5 mg/ml in 0,14 M NaCl suspendiert und pro ml mit 0,3 ml einer 0,1 %igen Lösung von Astrazonrot BBL®.(eingetragenes Warenzeichen der Farben-60 fabriken Bayer AG, Leverkusen) = CI Basic Red 23, in 0,14 M Kochsalzlösung versetzt und 5 Minuten gerührt. Danach werden die Staphylokokken bei 14 600 x g abzentrifu-giert und die Keime in dem ursprünglichen Volumen 0,14 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 6,4 suspendiert. Der 65 Puffer enthält 0,05% Rinderserumalbumin.

Für die Clumping-Faktor Reaktion im Röhrchentest werden die Staphylokokken in einer l%igen Suspension, beispielsweise in 0,05 M Tris-hydroxymethyl-aminomethan-Puf-

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fer pH 7,4, mit einem Zusatz von 0,01 % Rinderserumalbumin eingesetzt.

Im Mikrotitrationsverfahren nach Leavelle: (Amer. J. Clin. Path., Vol. 55 (1971) S. 452-457) werden die Staphylokokken in 0,3%iger Suspension in 0,017 M Imidazol-NaCl-

Puffer pH 7,4 eingesetzt. Für die Mischung des Reaktionsansatzes hat sich besonders vorteilhaft ein Plattenschüttler (Mikro-Shaker AM 69 der Flow Laboratories, Bonn) erwiesen.

-4

C

Claims

645 670 PATENTANSPRÜCHE

1. Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Fibrinogen und/oder Fibrinspaltprodukten, dadurch gekennzeichnet, dass es als wesentlichen Bestandteil eine Suspension eines Clumping-Faktor positiven Mikroorganismus enthält, der weder lösliche Koagulase enthält noch Spontan-Agglutination zeigt, wobei die Suspension 3 bis 50% mindestens eines darin löslichen mehrwertigen Alkohols enthält.

2. Diagnostisches Mittel nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus ein Staphylococ-cus ist.

3. Diagnostisches Mittel nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Staphy-lococcus aureus K 807, ATCC 31 243 ist.

4. Diagnostisches Mittel nach einem der Patentansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus mit einem Farbstoff, vorzugsweise Basic Red 23 gemäss Co-lour Index, eingefärbt ist.