CH637825A5 - Vehicule compose d'un phospholipide et d'un lipide non miscible, destine a liberer une substance xenobiotique dans l'organisme d'un mammifere. - Google Patents

Description

La présente invention concerne l'apport à l'organisme d'un 25 mammifère, et la libération dans l'organisme d'un mammifère, de substances xénobiotiques. L'invention a plus particulièrement trait à des véhicules de transport de substances xénobiotiques sous la forme de microréservoirs transportables, à un procédé de formation des microréservoirs.

30 Dans beaucoup de cas différents et dans de nombreuses circonstances variées, il est désirable d'introduire dans l'organisme d'un mammifère des substances douées d'activité pharmacologique qui sont étrangères à l'hôte, ces substances étant qualifiées ci-après de substances xénobiotiques. Ces substances xénobiotiques compren-35 nent, à titre non limitatif, des médicaments, des agents diagnostiques, des substituts du sang, des composés biologiques d'origine endogène, des hormones, des adjuvants immunologiques, etc.

Dans l'administration de toute substance xénobiotique, un certain degré de spécificité doit être atteint, et la spécificité nécessite 4o que la substance xénobiotique atteigne son but de façon sélective et influençable. L'absence de spécificité liée à l'utilisation de nombreuses substances xénobiotiques peut donc priver ces substances d'une part appréciable, sinon essentiellement de la totalité, de leur efficacité potentielle en ce qui concerne l'obtention des résultats que l'on 45 attend de leur utilisation. Par exemple, un médicament chimiothérapeutique qui ne peut pas être retenu par le plasma sanguin pendant une période suffisante pour qu'une quantité notable de ce médicament atteigne le tissu visé ou bien un médicament administré par voie orale qui est destiné au courant sanguin, mais qui ne peut pas 5o traverser le tractus gastro-intestinal, ne possède pas le degré de spécificité qui pourrait le rendre très efficace. Ainsi, en l'absence de la spécificité désirée, un agent xénobiotique ne peut essentiellement pas, ou ne peut qu'à un degré limité, exercer les activités pharmaco-dynamiques nécessaires à l'exercice de son potentiel total. Parmi ces 55 activités pharmacodynamiques, on peut indiquer la cinétique du plasma, la distribution dans les tissus, le degré de toxicité, les taux de substances thérapeutiques in vivo, la solubilité d'agents xénobiotiques normalement incompatibles avec d'autres formulations pharmaceutiques et l'activation métabolique des agents xénobiotiques. «i On s'est aperçu dans le passé qu'il était désirable de modifier et de limiter, dans un sens bénéfique, la spécificité ou la pharmacodynamique de nombreuses substances xénobiotiques dont on a reconnu les propriétés désirables. Une approche connue pour limiter la spécificité de médicaments implique l'utilisation de dispositifs f>5 d'implantation mis en place, normalement par une intervention chirurgicale, dans l'organe ou à proximité de l'organe auquel le médicament doit être délivré. Habituellement, ces implants sont formés d'une matrice covalente renfermant le médicament à délivrer. Les

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matrices utilisées peuvent être hydrosolubles (par exemple la car-boxyméthylcellulose ou l'alcool polyvinylique), elles peuvent gonfler à l'eau (par exemple des hydrogels ou la gélatine), il peut s'agir de polymères hydrolytiques (par exemple des acides polylactiques, des acides polyglycoliques ou des acides poly-a-aminés) ou bien il peut s'agir de polymères non hydrolytiques (par exemple un caoutchouc du type organopolysiloxane). Généralement, bien que ces implants puissent limiter la vitesse à laquelle le médicament qu'ils contiennent peut être délivré par diffusion ou hydrolyse, l'influence qu'ils peuvent exercer sur la pharmacodynamique du médicament libéré est faible, voire même nulle.

L'une des approches les plus récentes qui aient été suggérées pour modifier et limiter l'activité pharmacodynamique d'agents xénobiotiques est l'utilisation d'un véhicule capable de délivrer et de libérer de façon réglable des agents xénobiotiques sur le site d'action dans l'organisme de l'hôte auquel ils sont administrés. L'utilisation de liposomes comme véhicules a été proposée à cette fin [voir G. Gregoriadis, «The Carrier Potential of Liposomes in Biology and Medicines», in «The New England Journal of Medicine», vol. 295, N° 13, pp. 704-710 (23 septembre 1976) et N° 14, pp. 765-769 (30 septembre 1976)]. Ces liposomes connus sont formés de phos-pholipides et en particulier de phosphatidylcholine en association avec d'autres lipides tels que le cholestérol, le phosphate de dicétyle, la stéarylamine et d'autres phospholipides tels que la phosphatidyl-sérine à laquelle la phosphatidylcholine est aisément miscible. Les liposomes sont caractérisés par la miscibilité des composants du véhicule, ce qui signifie que la séparation des phases ne peut être que faible ou nulle entre ces composants. En outre, ces véhicules sont dépourvus d'un haut degré de stabilité, ce qui est dû principalement à l'oxydation des composants phospholipidiques et/ou à leur instabilité thermique, notamment lorsqu'ils sont divisés par les ultrasons en petites particules, d'un diamètre d'environ 250 Â, par exemple. De plus, parmi les liposomes, ceux qui portent une charge négative due à la présence de phosphate de dicétyle, de phosphatidylsérine ou d'autres composants chargés négativement, s'agglomèrent en présence de cations divalents. Enfin, lorsque des liposomes sont injectés par voie intraveineuse, ils se concentrent préférentiellement dans le foie et la rate, ce qui est dû au moins en partie à leur grand diamètre. Par conséquent, bien que les liposomes connus utilisés comme véhicules soient compatibles avec un certain nombre de médicaments et soient en compatibilité biologique avec l'organisme d'un mammifère, leur instabilité naturelle, leur tendance à s'agglomérer notablement et leur diamètre relativement grand atténuent leur aptitude à être utilisés comme moyens acceptables de délivrance d'un médicament.

Par suite du rôle toujours croissant joué par les agents xénobiotiques dans le traitement du cancer, du diabète, de l'arthrite, des troubles métaboliques héréditaires, des maladies liées à l'emmagasinage des métaux, etc., le besoin de véhicules perfectionnés va croissant dans l'étude préventive des maladies telles que l'anaplasmose et des infections à virus et dans l'étude des mécanismes biologiques. Le caractère désirable de ces systèmes perfectionnés d'administration est donc évident.

En conséquence, le principal but de la présente invention est d'offrir des véhicules perfectionnés d'administration d'agents xénobiotiques sous forme de réservoirs microscopiques ou microréservoirs capables de circuler dans l'organisme de l'hôte. Les véhicules en question, destinés à délivrer des agents xénobiotiques, doivent être compatibles avec des agents xénobiotiques très divers comprenant des composés hydrophobes, hydrophiles ou à la fois hydrophobes et hydrophiles, qui sont également non toxiques et biocompatibles avec l'organisme de l'hôte. Ces véhicules doivent être stables pendant des périodes prolongées de conservation de même que lors de leur utilisation dans l'organisme de l'hôte et ils doivent être favorables à divers techniques d'administration, par exemple par voie orale, intraveineuse, intramusculaire, intrapéritonéale, sous-cutanée, topiquement et par inhalation.

Un autre but de la présente invention est de trouver des véhicules pour l'administration de substances xénobiotiques qui soient capables de modifier et d'influencer de façon prédéterminable et dans un sens bénéfique la pharmacodynamique de la substance xénobiotique délivrée et libérée dans l'organisme de l'hôte. Parmi les activités pharmacodynamiques qui subissent cette modification et cette influence bénéfiques, on mentionne la cinétique du plasma, la distribution dans les tissus, la toxicité, l'absorption orale, l'aptitude chimiothérapeutique, le métabolisme, etc.

Un autre objectif important de la présente invention est de trouver un procédé de formation de véhicules permettant l'administration de substances xénobiotiques, sous forme de microréservoirs capables de circuler dans l'organisme d'un mammifère pour y délivrer la substance xénobiotique en un site prédéterminé, en effectuant une modification bénéfique prédéterminée de la pharmacodynamique de la substance xénobiotique.

Selon l'un de ses aspects, l'invention propose un véhicule d'administration biocompatible avec un mammifère qui le reçoit, pour délivrer et libérer dans l'organisme de l'hôte une substance xénobiotique dont la pharmacodynamique est modifiée dans un sens bénéfique par l'utilisation du véhicule; ce véhicule est caractérisé par le fait qu'il se présente sous forme de microréservoirs renfermant la substance xénobiotique et formés d'un constituant phospholipidique et d'un constituant lipidique non miscible au phospholipide et stable dans un liquide compatible du point de vue physiologique et essentiellement non miscible à ce liquide.

Selon un autre de ses aspects, l'invention propose un procédé de formation d'un véhicule destiné à délivrer dans l'organisme d'un mammifère une substance xénobiotique dont la pharmacodynamique est modifiée et limitée de façon prédéterminable, procédé qui consiste à former des réservoirs microscopiques d'un constituant phospholipidique et d'un constituant lipidique non miscible au phospholipide qui est stable dans un liquide physiologiquement compatible et essentiellement non miscible à ce liquide, et à incorporer dans les microréservoirs la substance xénobiotique à délivrer.

Les caractéristiques et avantages de la présente invention ressor-tiront de la description détaillée qui va suivre, faite en regard des dessins annexés sur lesquels:

la fig. 1 est un schéma d'ensemble illustrant un procédé de préparation des véhicules de l'invention, destinés à délivrer une substance xénobiotique;

la fig. 2 est un schéma partiel illustrant une variante du procédé de la fig. 1 ;

la fig. 3 est une représentation schématique à une échelle très agrandie d'un microréservoir de l'invention, sous la forme vésiculaire;

la fig. 4 est une représentation schématique très agrandie d'un microréservoir de l'invention, sous une forme non vésiculaire;

la fig. 5 est une représentation schématique très agrandie d'un véhicule destiné à délivrer un médicament, du type décrit dans l'art antérieur;

la fig. 6 illustre graphiquement la stabilité in vitro des microréservoirs en contraste avec celle de liposomes, la stabilité in vitro étant exprimée par la variation en fonction du temps de la densité optique des microréservoirs et des liposomes;

la fig. 7 illustre graphiquement la stabilité in vivo des microréservoirs, par la courbe de variation de la quantité d'oléate de cholesté-ryle (ester de cholestérol) restant dans le plasma sanguin d'un rat, en fonction du temps;

la fig. 8 fait apparaître un profil d'élution de microréservoirs renfermant de la daunomycine, tracé en fonction des concentrations en phosphatidylcholine, en oléate de cholestéryle et en daunomycine dans une série de fractions chromatographiques;

la fig. 9 est une représentation schématique illustrant la distribution d'un médicament typique de la classe des anthracyclines peu après l'injection de ce médicament sous la forme libre, montrant la faible quantité du médicament qui reste dans le courant sanguin" pour atteindre le site visé;

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la fig. 10 illustre le degré auquel les microréservoirs en circulation sont capables de modifier dans un sens bénéfique la cinétique de la daunomycine dans le plasma, le graphique représentant des courbes de variation de la quantité de daunomycine restant dans le courant sanguin en fonction du temps écoulé après l'injection du médicament contenu dans les microréservoirs et en fonction de la quantité de daunomycine libre;

la fig. 11 représente une série de courbes donnant le nombre de survivants d'un groupe de souris en fonction du temps écoulé après l'injection à quatre doses différentes de microréservoirs, de daunomycine dans les microréservoirs et de daunomycine sous la forme libre, les courbes illustrant l'aptitude des microréservoirs agissant comme véhicules d'administration à réduire la toxicité de la daunomycine;

la fig. 12 représente une série de courbes de variation du nombre de survivants d'un groupe de souris traitées par injection de cellules tumorales en fonction du temps écoulé après l'injection à deux doses différentes de daunomycine dans les microréservoirs et sous la forme libre, ces courbes illustrant la modification bénéfique de la chimiothérapie de la daunomycine délivrée dans les microréservoirs et libérée par ces derniers;

la fig. 13 représente une série de courbes de variation, en fonction du temps, des vitesses d'émission de la daunomycine de microréservoirs de compositions contenant du trioléate de glycérol comme constituant non miscible au phospholipide et diverses quantités de cholestérol comme agent influençant la vitesse de libération;

la fig. 14 représente une série de courbes de variation en fonction du temps des vitesses d'émission de la daunomycine de microréservoirs de compositions contenant de l'oléate de cholestéryle comme constituant non miscible au phospholipide et diverses quantités de cholestérol comme agent influençant la vitesse de libération;

la flg. 15 est un profil d'élution de microréservoirs renfermant la substance AD 32, en fonction des concentrations en phospholipide, en oléate de cholestéryle et en AD 32 dans une série de fractions chromatographiées ;

la fig. 16 est une courbe de variation de la vitesse d'émission de l'AD 32 de microréservoirs vésiculaires, montrant l'effet qui résulte de l'utilisation d'une petite quantité d'acide phosphatidique dans le constituant phospholipidique de la composition des microréservoirs;

la fig. 17 illustre le degré auquel les microréservoirs en circulation sont capables de modifier dans un sens bénéfique la cinétique dans le plasma de la substance AD 32 dans des microréservoirs et sous la forme libre à la dose de 15 mg/kg;

la fig. 18 est une série de représentations graphiques du nombre de survivants d'un groupe de souris ayant reçu des cellules tumorales, en fonction du temps après l'injection à quatre doses différentes de la substance AD 32 dans les microréservoirs, les courbes faisant apparaître l'aptitude chimiothérapeutique de la substance AD 32 délivrée par les microréservoirs;

la fig. 19 est un profil d'élution de microréservoirs renfermant l'imidocarb, en fonction des concentrations en phospholipide, en oléate de cholestéryle et en imidocarb dans une série de fractions chromatographiées ;

les fig. 20 et 21 illustrent le degré auquel les microréservoirs en circulation sont capables de modifier dans un sens bénéfique la cinétique de l'imidocarb dans le plasma à deux taux de dose, les illustrations étant sous forme de courbes de variation de la quantité d'imi-docarb restant dans le courant sanguin et des rapports de l'imidocarb aux microréservoirs en fonction du temps après l'injection du médicament dans les microréservoirs et en fonction de l'imidocarb libre, aux doses respectives de 5 et de 4,4 mg/kg;

la fig. 22 est un profil d'élution de microréservoirs renfermant de l'undécanoate d'œstradiol, en fonction des concentrations en phosphatidylcholine et en undécanoate d'œstradiol dans une série de fractions chromatographiées;

la fig. 23 est un histogramme montrant les concentrations dans le plasma sanguin, à trois époques différentes, de l'undécanoate d'œstradiol administré oralement sous la forme d'une solution éthanolique et dans des microréservoirs;

la fig. 24 est un profil d'élution de microréservoirs vésiculaires et non vésiculaires renfermant de l'undécanoate d'œstradiol, et

.la fig. 25 est une représentation graphique de la vitesse d'émission de l'undécanoate d'œstradiol à partir de microréservoirs vésiculaires et non vésiculaires.

Les véhicules conformes à l'invention, destinés à délivrer des substances xénobiotiques, sont formés d'un mélange de deux ou plusieurs lipides qui sont essentiellement non miscibles. Plus particulièrement, les systèmes de délivrance sont formés de compositions comprenant un constituant phospholipidique et un constituant lipidique non miscible au phospholipide, qui peut être un ester de cholestérol ou un triglycéride ou un mélange d'esters de cholestérol ou de triglycérides ou de ces deux types de constituants. Le constituant phospholipidique peut renfermer plus d'un phospholipide; la composition du microréservoir peut aussi renfermer un constituant modifiant les liaisons et/ou un constituant influençant la vitesse de libération. Des exemples de phospholipides qui conviennent à la mise en œuvre de l'invention sont la phosphatidylcholine, la phosphatidylsé-rine, le phosphatidylinositol, la phosphatidyléthanolamine, l'acide phosphatidique et la sphingomyêline. On peut aussi utiliser des mélanges de deux ou plusieurs de ces phospholipides. Parmi ces composés, on apprécie la phosphatidylcholine, seule ou en mélange avec d'autres phospholipides.

La phosphatidylcholine est un terme appliqué à des composés qui sont des esters d'acides gras avec l'acide glycérophosphorique et la choline. Ainsi, la phosphatidylcholine peut être représentée par la formule suivante:

FA—CH2 O

I II

FA' - CHCH2 - O - P - O - (CH2)2 - N - (CH3)3 I

o-

dans laquelle FA et FA' sont des résidus d'acides gras. Les acides gras utilisés pour former ces esters peuvent être saturés ou non saturés et peuvent renfermer environ 12 à 20 atomes de carbone. Ces acides gras sont, à titre non limitatif, des acides palmitique, stéari-que, oléique, etc. La phosphatidylcholine utilisée dans les véhicules délivrant une substance active selon l'invention peut être isolée du jaune d'œuf par la méthode décrite par Litman [«Biochemistry», 12: 2545 (1973)] ou d'autres sources naturelles telles que les fèves de soja, ou bien on peut en faire la synthèse par un procédé convenable tel que celui qui a été décrit par Robles et Van der Berg dans «Biochim. Biophys. Acta», 187: 520 (1969).

Dans la description détaillée de l'invention donnée ci-après, le constituant phospholipidique des véhicules délivrant une substance est illustré, pour des raisons de commodité, par la phosphatidylcholine, terme par lequel on entend désigner les esters qui répondent à la formule générale donnée ci-dessus. Dans certaines des formulations de microréservoirs, de petites quantités d'acide phosphatidique sont incorporées aux constituants phospholipidiques pour améliorer la liaison de la substance xénobiotique aux microréservoirs. Il y a lieu de remarquer également que d'autres phospholipides, tels que ceux qui ont été mentionnés, qui satisfont aux conditions indiquées ci-après en ce qui concerne les propriétés chimiques et physiques, peuvent être utilisés à la place de la phosphatidylcholine.

Le constituant ester de cholestérol ou triglycéride utilisé comme composant du véhicule doit être essentiellement non miscible au constituant phospholipidique de même qu'il doit être essentiellement insoluble dans un liquide physiologiquement compatible tel qu'une solution saline en équilibre physiologique, contenant NaCl ou KCl. Le constituant ester de cholestérol ou triglycéride doit aussi être apolaire ou non polaire à un point tel qu'il ne forme pas de monocouche, et il doit être présent à une concentration choisie de manière qu'il soit essentiellement non miscible à la double couche phospholipidique.

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Le cholestérol de formule C27H15OH est un alcool secondaire à mono-insaturation, prompt à former des esters avec les acides gras saturés et non saturés tels que l'acide oléique, l'acide stéarique,

l'acide palmitique, etc. En général, les acides gras ayant 10 à 18 atomes de carbone sont préférables. Des méthodes convenables de formation de ces esters de cholestérol comprennent la condensation d'un chlorure d'acide gras avec le cholestérol et l'isolement de ces esters à partir de sources naturelles.

Dans le choix de l'acide gras pour la formation de l'ester de cholestérol, on préfère qu'il s'agisse d'un acide ayant un faible degré d'insaturation (par exemple pas plus d'environ deux doubles liaisons par molécule d'acide gras). En général, les esters formés d'acides gras ayant de plus hauts degrés d'insaturation donnent des complexes destinés à distribuer des substances xénobiotiques qui ont une plus grande stabilité que ceux qui sont formés d'acides gras à plus forte insaturation.

Les triglycérides aptes à être utilisés conformément à l'invention sont des esters d'acides gras du glycérol qui répondent à la formule générale: q

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dans laquelle les variables R!, R2 et R3 des acides gras formant les esters peuvent avoir 10 à 18 atomes de carbone. Des exemples de ces acides gras comprennent des acides palmitique, stéarique, myristi-que, oléique et linoléique. Ces triglycérides sont avantageusement préparés par condensation du chlorure d'acide gras avec le glycérol. Ils peuvent également être isolés à partir de sources naturelles.

Dans la description générale qui suit, on suppose, pour la commodité, que l'ester utilisé est un ester de cholestérol. Bien entendu, on pourrait aussi utiliser un triglycéride, un mélange d'esters de cholestérol, un mélange de triglycérides ou un mélange d'un ou plusieurs esters de cholestérol avec un ou plusieurs triglycérides dans la formation des microréservoirs utilisés comme véhicules de distribution. On reproduit les exemples dans lesquels un ester de cholestérol ou un triglycéride est utilisé comme constituant non miscible au phospholipide.

Les véhicules de l'invention utilisés pour délivrer les substances xénobiotiques se présentent sous la forme de ce que l'on appelle des microréservoirs dans le présent mémoire. Ces microréservoirs peuvent prendre l'une de deux formes, à savoir une forme vésiculaire qui présente une petite paroi cloisonnée renfermant le milieu utilisé pour former le microréservoir, ou une forme non vésiculaire dans laquelle l'ester de cholestérol et/ou le triglycéride sont renfermés dans la monocouche phospholipidique. Comme on l'indiquera plus loin, le rapport de la phosphatidylcholine à l'ester de cholestérol détermine laquelle de ces formes prédomine dans tout procédé de synthèse. Le choix entre ces formes dépend principalement de la nature de la substance xénobiotique à délivrer et libérer, de la pharmacodynamique de la substance xénobiotique désirée et du mode d'administration.

Deux voies différentes de synthèse pour la formation des microréservoirs ainsi que pour l'incorporation de la substance xénobiotique dans ces microréservoirs sont illustrées schématiquement sur les fig. 1 et 2. Le mode de préparation illustré sur la fig. 1 est fondé sur l'utilisation des ultrasons pour former les microréservoirs constituant un procédé apprécié. Dans ce procédé, la phosphatidylcholine et l'ester de cholestérol sont mélangés dans un liquide organique inerte qui est un solvant pour ces deux constituants à la fois, par exemple le chloroforme; et, le cas échéant, la substance xénobiotique est ajoutée à cette solution de la manière indiquée par une flèche en traits interrompus sur la fig. 1. Le solvant est ensuite chassé par éva-poration sous vide et il reste un mélange résiduel sec qui est ensuite hydraté par l'addition d'un liquide physiologiquement compatible, par exemple une solution aqueuse de NaCl ou de KCl de concentration convenable et un tampon. Si la substance xénobiotique n'est pas ajoutée au mélange initial, on l'ajoute à la suspension liquide résultante avant la formation des microréservoirs.

Dans la formation de la suspension liquide, il est préférable d'utiliser des quantités du mélange résiduel équivalent à environ 1-5% en poids du liquide physiologiquement compatible. Bien que la quantité de substance xénobiotique ajoutée à la composition contenant le phospholipide et l'ester de cholestérol (ou le trigylcêride) puisse varier, il est préférable d'incorporer jusqu'à environ 2%, par rapport au poids de résidu, de la substance xénobiotique dans les microréservoirs.

Comme le fait apparaître la fig. 1, les microréservoirs sont ensuite formés par traitement aux ultrasons de la solution saline en atmosphère non oxydante, par exemple en atmosphère d'azote. On a remarqué que la formation des microréservoirs est plus complète lorsqu'on conduit le traitement aux ultrasons à une température qui équivaut au point de fusion de l'ester de cholestérol ou du triglycéride utilisé comme constituant non miscible au phospholipide ou qui dépasse légèrement cette température. Le traitement aux ultrasons est effectué à un niveau convenable d'énergie et pendant une période suffisante pour que les microréservoirs aient le diamètre désiré. Par exemple, on a trouvé suffisant d'utiliser une puissance d'alimentation de 120 W pendant 20 min. A titre de variante, on peut remplacer le traitement aux ultrasons de la suspension saline par le passage forcé de cette suspension à travers un orifice de petit diamètre pour former les microréservoirs.

Comme le fait apparaître la fig. 2, une variante de la formation des microréservoirs dans un milieu aqueux, par exemple en solution saline, réside dans la formation d'une solution du phospholipide, de l'ester de cholestérol et de la substance xénobiotique en utilisant un solvant organique miscible à l'eau et l'introduction subséquente de cette solution dans une solution aqueuse physiologique de sel. A titre de variante, la substance xénobiotique peut être ajoutée à la solution saline avant l'étape d'injection. Pour illustrer ce mode opératoire, on mentionne l'injection d'une solution éthanolique du mélange lipidique dans une solution aqueuse sous agitation; ou bien l'injection lente d'une solution dans l'éther du mélange lipidique dans un compartiment aqueux.

Le liquide trouble résultant de la formation des microréservoirs dans le milieu aqueux de mise en suspension est ensuite centrifugé pour produire une phase claire et une phase supérieure trouble, cette dernière contenant des microréservoirs non vésiculaires plus grands, par exemple de diamètre compris entre environ 300 et environ 1000 Â. La phase claire est chromatographiée pour produire une fraction de petits microréservoirs non vésiculaires (par exemple de diamètre égal à 250 Â environ) et de microréservoirs vésiculaires dont les diamètres vont d'environ 190 à environ 300 Â.

La répartition des microréservoirs entre les formes vésiculaire et non vésiculaire est détreminée par le rapport molaire du constituant phospholipidique au constituant non miscible au phospholipide. En utilisant la phosphatidylcholine et l'oléate de cholestérol comme exemples illustrant une composition de microréservoirs, on peut démontrer que l'utilisation d'une proportion d'environ 67 à 97 mol% de phosphatidylcholine donne des microréservoirs principalement vésiculaires, tandis que l'utilisation de plus d'environ 50 mol% d'ester de cholestérol donne des microréservoirs principalement non vésiculaires.

Les microréservoirs de l'invention ont des propriétés structurales remarquables en raison de l'utilisation d'un mélange du constituant phospoholipidique et d'un constituant lipidique (ester de cholestérol, triglycéride ou leurs mélanges) qui est essentiellement non miscible au phospholipide. Cette structure, dans ses formes vésiculaire et non vésiculaire, est illustrée schématiquement sur les fig. 3 et 4. L'insolubilité tant des phospholipides (représentés par la phosphatidylcho-

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line sur les fig. 3 et 4) que du constituant lipidique non miscible (représenté par un ester de cholestérol) engendre une structure organisée de microréservoir selon laquelle un contact entre les lipides non miscibles et le milieu aqueux est évité ou réduit à un minimum. Cette organisation confère quant à elle une bien plus grande stabilité aux microréservoirs que l'on ne pourrait en attendre d'un véhicule formé conformément aux indications données par Gregoriadis (loc. cit.) dans l'art antérieur. On peut s'en rendre compte en comparant les fig. 3 et 4 avec la fig. 5, laquelle représente schématiquement la structure d'un réservoir délivrant un médicament selon Gregoriadis. Il ressort de la fig. 5 que, lorsque des lipides miscibles sont utilisés pour former le liposome, la structure résultante est lamellaire, ce qui donne lieu à une réalisation instable due vraisemblablement à l'oxydation des phospholipides qui déstabilise l'organisation lamellaire, ou à la cristallisation des phospholipides si la température s'abaisse au-dessous de leur température de transition.

La structure stable des microréservoirs de l'invention représentés sur les fig. 3 et 4 peut être attribuée, au moins en partie, à une force motrice thermodynamique qui empêche l'exposition de l'ester de cholestérol ou du triglycéride au milieu aqueux. Il en résulte que l'intégralité structurale des microréservoirs de l'invention est grandement améliorée. Cela signifie à son tour que l'aptitude des microréservoirs à influencer et modifier la pharmacodynamique des substances xénobiotiques qui y sont incorporées est de même favorisée comparativement à d'autres réservoirs de distribution. En outre, l'absence de polarité des microréservoirs, qui est la conséquence de l'utilisation d'esters de cholestérol ou de triglycérides à la place du cholestérol et d'une substance similaire, empêche essentiellement l'agrégation des microréservoirs. Il s'agit là naturellement d'une caractéristique très avantageuse, attendu qu'une telle agrégation libérerait autrement les esters de cholestérol ou les triglycérides dans un milieu aqueux, et qu'il en résulterait une forte réduction de la libre énergie du système. Par conséquent, les microréservoirs individuels, qui sont semblables à tout point de vue aux lipoprotéines sériques naturelles en circulation, sont particulièrement bien adaptés à la circulation dans le plasma sanguin d'un mammifère dans l'organisme duquel ils sont incorporés et à la retenue dans le plasma où ils exercent leur efficacité maximale.

La grande amélioration de la stabilité in vitro des microréservoirs de l'invention, comparativement à celle des liposomes dont l'utilisation a été préconisée dans l'art antérieur, est illustrée dans l'exemple 1 et sur la fig. 6.

Exemple 1 :

On évapore à sec sous vide divers mélanges de 60 jjmol de phosphatidylcholine de jaune d'œuf, diverses quantités d'oléate de cholestéryle et 4 mg de daunamycine en partant d'une solution chloro-formique de ces constituants des microréservoirs. On ajoute au résidu obtenu 5 ml de solution de KCl 0,1 M et 10 mmol de trihy-droxyméthylamine (tampon de pH égal à 8,0); on traite ensuite la suspension résultante aux ultrasons pendant 15 min à 51'C sous atmosphère d'azote avec une puissance d'entrée de 120 W. Les suspensions sont ensuite centrifugées à 100000 x g pendant 1 h pour éliminer tout lipide non dispersé.

Des chromatogrammes sur couche mince des liqueurs centrifugées ne présentent aucun signe de dégradation de la phosphatidylcholine ou de la daunomycine. Des portions aliquotes de 4 ml de chaque échantillon sont ensuite placées dans des cuvettes bouchées et les échantillons sont soumis à l'incubation à 37 C. A divers moments, les densités optiques des deux solutions sont déterminées à 400 nm et à 600 nm. Les résultats ainsi obtenus sont reproduits graphiquement sur la fig. 6 par la variation en fonction du temps du rapport de ces densités optiques, à savoir A400/A600. Etant donné que les deux structures ont initialement la même grandeur moléculaire, le rapport A400/A600 donne une indication de toute augmentation de diamètre des particules par suite d'une désorganisation structurale du liposome.

La fig. 6 illustre la différence considérable de stabilité entre les microréservoirs de l'invention et des liposomes de grandeur semblable. Tandis que l'absorbance des microréservoirs contenant 33% d'oléate de cholestéryle, ainsi que des quantités plus faibles de l'ester de cholestérol, est relativement stable, celle du liposome augmente rapidement depuis le début de la période d'évaluation et au bout de 10 d, les liposomes se sont dégradés au-delà de toute limite pratique. Comme on l'a déjà supposé, la dégradation prononcée des liposomes est vraisemblablement due à l'interaction avec le milieu aqueux et l'agrégation en particules plus grandes, ces deux facteurs n'existant pas dans le cas des microréservoirs en raison de leur stabilité structurale et de leur absence de polarité.

En plus de leur stabilité in vitro, les microréservoirs de l'invention ont également une stabilité très élevée in vivo par rapport aux liposomes. Cette supériorité est illustrée dans l'exemple 2 et par la fig. 7.

Exemple 2:

On dissout 100 jimol de phosphatidylcholine de jaune d'œuf, 10 nmol d'oléate de cholestéryle marqué au 14C et 10 jimol d'acide phosphatidique de jaune d'œuf dans du chloroforme et on évapore la solution à sec sous vide. On ajoute 5 ml de NaCl 0,154M et 10 mmol de trihydroxyméthylamine (pH 8,0) au résidu sec du mélange de lipides. La suspension résultante est traitée aux ultrasons pendant 15 min à 51 - C sous atmosphère d'azote. Le mélange traité aux ultrasons est ensuite chromatographié sur une colonne de Se-pharose 4B de 2,5 x 40 cm. Les fractions individuelles qui coïncident dans le profil d'élution des phospholipides et de l'oléate de cholestéryle sont rassemblées, puis concentrées par ultrafiltration. On injecte 1,1 ml de ces microréservoirs concentrés dans la veine caudale d'un rat. On prélève des échantillons de plasma à divers intervalles et on mesure la radio-activité associée aux microréservoirs contenus dans l'échantillon de plasma. Les résultats ainsi obtenus sont reproduits graphiquement sur la fig. 7 en fonction du temps écoulé après l'injection.

Bien que la cinétique soit complexe, on peut constater d'après la fig. 7 que, à l'équilibre, la clairance des microréservoirs a une période de 5,5 h. Au contraire, des liposomes traités aux ultrasons renfermant une charge négative similaire ont une période dans le plasma de 8 min seulement [voir R.L. Juliano et D. Stamp, «Biochem. Biophys. Res. Comm.» 63: 651 (1975)]. Il semble logique d'admettre que la multiplication de la période par un facteur proche de 40 que l'on obtient dans le cas des microréservoirs puisse être attribuée à une amélioration de la stabilité structurale.

L'association d'une substance xénobiotique incorporée aux microréservoirs est illustrée dans l'exemple 3 et sur la fig. 8.

Exemple 3:

On mélange ensemble dans du chloroforme 2180 jimol de phosphatidylcholine de jaune d'œuf, 242 jimol d'oléate de cholestéryle marqué au carbone 14C [activité spécifique = 1,6 x 104 désintégrations/min (dpm/nmol)] et 36 mg de daunomycine et on évapore la solution à sec sous vide. Le résidu sec mixte est réhydraté par addition de 110 ml de solution de KCl 0,1M et de 10 (tmol de trihydroxyméthylamine (pH 8,0). Cette suspension est ensuite traitée aux ultrasons à l'aide d'un appareil Branson W-185 pendant 15 min à 51 C sous atmosphère d'azote.

Le liquide traité aux ultrasons est ensuite chromatographié sur une colonne de Sepharose 4B de 2,5 x 40 cm. Les fractions individuelles résultant de la Chromatographie sont ensuite analysées par la méthode de Gomori [«J. Lab. Clin. Med.», 27: 955 (1949)] pour doser la phosphatidylcholine, par la radio-activité pour doser l'oléate de céryle et par des mesures de fluorescence pour doser la daunomycine. Les résultats de ces analyses sont reproduits sur la fig. 8, sur laquelle les résultats analytiques de l'oléate de cholestéryle, de la phosphatidylcholine et de la daunomycine ont été superposés.

On a trouvé pour le diamètre des microréservoirs vésiculaires des valeurs d'environ 200 à 300 Â, d'après leur profil d'élution sur la

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637 825

colonne de gel qui avait été préalablement étalonnée en utilisant des liposomes de phosphatidylcholine de jaune d'œuf traités aux ultrasons.

On peut constater d'après la fig. 8 que les profils d'élution de la phosphatidylcholine (d'après la méthode d'analyse au phosphate), de l'oléate de cholestéryle (d'après la méthode d'analyse par la radio-activité) et de la daunomycine (d'après la méthode d'analyse par fluorescence) coïncident, ce qui indique que la substance xénobiotique (daunomycine) a été associée aux microréservoirs vésiculaires. Etant donné que la daunomycine est un médicament relativement hydrophobe, avec certaines caractéristiques hydrophiles, il est raisonnable de supposer que le site de localisation du médicament réside dans l'organisation lipidique des microréservoirs.

Parmi les activités pharmacodynamiques d'une substance xénobiotique qui peuvent être modifiées de manière à rendre cette substance plus efficace, on mentionne la cinétique dans le plasma, le degré de toxicité et l'efficacité thérapeutique. La daunomycine est actuellement testée en clinique en tant que médicament chimiothérapeutique contre le cancer; mais il s'agit d'une substance relativement hydrophobe et très difficile à maintenir dans le courant de plasma, comme cela est mis en évidence par le fait que, moins de 2 min après l'administration, environ 95% de cette substance ont quitté le courant sanguin et sont passés dans divers organes, ce qui ne laisse qu'environ 5% atteindre le tissu visé, en l'occurrence une tumeur. Cela est illustré par la fig. 9 qui reproduit la distribution d'un médicament typique de la classe des anthracyclines, administré par voie intraveineuse, 2 min après l'injection. On sait enfin que la daunomycine est une substance toxique, notamment parce qu'elle tend à se concentrer dans les tissus cardiaques, ce qui nécessite non seulement de contrôler avec soin son administration, mais aussi de l'administrer à des doses très faibles.

Les exemples 4 à 6 suivants et les fig. 10 à 12 illustrent l'aptitude des microréservoirs de l'invention circulant dans le courant sanguin à modifier la cinétique dans le plasma, la toxicité et l'efficacité chimiothérapeutique de la daunomycine.

Exemple 4:

On dissout 200 (îmol de phosphatidylcholine de jaune d'œuf, 20 nmol d'oléate de cholestéryle et 4 mg de daunomycine dans du chloroforme, puis on évapore la solution à sec sous vide. On ajoute ensuite au résidu sec résultant 5 ml de NaCl 0,154M et 10 (imol de trihydroxyméthylamine (pH 7,4). On traite ensuite cette suspension aqueuse aux ultrasons pendant 15 min à 51 C sous une atmosphère d'azote. La daunomycine qui n'est pas renfermée dans les microréservoirs vésiculaires produits est séparée de ces derniers par passage sur une colonne de gel de Sephadex G-50 de 2,5 x 20 cm. Le volume des vides qui contenaient la daunomycine incorporée aux microréservoirs est concentré à 3 mg de daunomycine/ml.

On prépare également un échantillon témoin de daunomycine libre à la même concentration et dans le même tampon.

On injecte à trois rats par voie intraveineuse les microréservoirs contenant la daunomycine; et on injecte à six autres rats par voie intraveineuse la daunomycine libre. La dose de daunomycine contenue dans les microréservoirs est de 4 mg/kg; la dose de daunomycine libre est de 4 mg/kg pour trois rats et de 10 mg/kg pour les trois rats restants. On prélève à divers moments 0,5 ml de sang de chaque rat. On sépare le plasma des échantillons de sang et on dose la daunomycine par la méthode de fluorescence par fusion. Les résultats ainsi obtenus sont reproduits graphiquement sur la fig. 10 en fonction du temps après injection.

Il ressort de la fig. 10 que l'utilisation des microréservoirs en circulation comme véhicule de distribution de la daunomycine modifie dans un sens bénéfique et améliore la cinétique de ce médicament dans le plasma. D'après une comparaison des courbes A et B représentant le même taux de dose, on peut constater que, après environ 15 min, la concentration de la daunomycine dans les microréservoirs en circulation dans le plasma est d'environ 4 |xg/ml; tandis que la concentration de la daunomycine libre dans le plasma est égale à

environ 0,4 Hg/ml. Par conséquent, à ce stade, la concentration, dans le courant sanguin, de la daunomycine transportée par les microréservoirs en circulation est quelque dix fois plus grande que lorsque cette substance active est introduite directement dans le courant sanguin. En outre, comme le fait apparaître la fig. 10, la daunomycine libre est pratiquement absente du courant sanguin au bout de 33/4 h, tandis que sa concentration après cet intervalle de temps atteint environ 0,4 (ig/ml dans les microréservoirs en circulation. Ainsi, la concentration dans le courant sanguin de la substance active transportée dans les microréservoirs en circulation au bout de 33/t h équivaut à la concentration qui existe au bout de 15 min seulement lorsque la substance active est introduite sous la forme libre.

Une autre comparaison de la courbe A avec la courbe C (daunomycine libre à la dose de 10 mg/kg) montre que, au bout de 1 h, la concentration de la substance active dans le plasma est d'environ 1,3 |ig/ml lorsque cette substance est transportée par les microréservoirs en circulation alors qu'elle est d'environ 0,5 |ig/ml lorsque la substance active est sous la forme libre; au bout de 3 h, ces valeurs sont, respectivement, égales à environ 0,5 |ig/ml et environ 0,3 ng/ml; au bout de 6 h, elles sont, respectivement, égales à environ 0,21 ng/ml et environ 0,14 |ig/ml. Par conséquent, l'utilisation des microréservoirs en circulation selon l'invention peut faire circuler dans le courant sanguin des concentrations de cette substance active qui sont notablement plus grandes que celles que l'on obtient lorsque la même substance active est administrée sous la forme libre à des doses deux fois et demie plus grandes que lorsque l'administration est effectuée sous la forme des microréservoirs.

La modification de la cinétique plasmatique d'un médicament tel que la daunomycine (comme représenté sur la fig. 10), signifie que cette substance exerce un effet toxique moindre, attendu qu'elle est maintenue plus longtemps dans le courant sanguin et qu'elle ne peut donc pas se concentrer dans les organes tels que le foie, le rein et le cœur. Cela signifie également que toute dose administrée est plus efficace lorsqu'elle est transportée par les microréservoirs en circulation que lorsqu'elle circule librement, attendu que le tissu visé est d'autant plus exposé à la dose de daunomycine que cette substance reste en plus grande quantité dans le courant sanguin. Puisque l'efficacité avec laquelle cette substance détruit les cellules tumorales est fondée sur l'aptitude de ces cellules à fixer ladite substance, un contact maximal entre la substance active et les cellules est essentiel à l'obtention du maximum d'efficacité.

Enfin, la modification de la cinétique dans le plasma d'une substance xénobiotique comme illustré sur la fig. 10 offre la possibilité de réduire les doses; en effet, si le comportement, par exemple, de la dose de 10 mg/kg correspondant à la courbe C pouvait être considéré comme satisfaisant à des fins chimiothérapeutiques, il est évident que le taux de dose pourrait être réduit au-dessous de la valeur de 4 mg/kg si le médicament était délivré et libéré par les microréservoirs en circulation. Une telle réduction de la dose réduirait aussi notablement la toxicité.

Le fait qu'une nette réduction de la toxicité de la daunomycine résulte de l'utilisation des microréservoirs en circulation est illustré dans l'exemple 5 et par la fig. 11.

Exemple 5:

On dissout dans du chloroforme 1000 jimol de phosphatidylcholine de jaune d'œuf, 100 (imol d'oléate de cholestéryle et 20 mg de daunomycine et on évapore la solution à sec sous vide. On ajoute au mélange résiduel sec obtenu 20 ml de KCl 0,1 M et 10 pmol de trihydroxyméthylamine (pH 8,0). On traite la suspension aqueuse par les ultrasons pendant 15 min à 51 C sous une atmosphère d'azote. Le liquide traité par les ultrasons est chromatographié sur une colonne de gel de Sepharose 4B de 2,5 x 40 cm. On ne rassemble que les fractions qui présentent une concordance entre les profils d'élution de la phosphatidylcholine, de l'oléate de cholestéryle et de daunomycine. Les fractions rassemblées sont ensuite concentrées par ultrafil-tration au moyen d'une membrane XM-50, à une concentration finale de daunomycine de 3 mg/ml.

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On prépare également un échantillon similaire de microréservoirs ne contenant pas de daunomycine et on les concentre à la même concentration en microréservoirs. On prépare en outre une solution témoin de daunomycine libre à une concentration de 3 mg/ml dans KCl 0,1 M et 10 mol de trihydroxyméthylamine (pH 8,0) destinée à être utilisée comme daunomycine libre.

Les microréservoirs contenant la daunomycine, les microréservoirs ne contenant pas la substance active et la substance active libre sont injectés à différentes doses à des souris, en une injection intra-péritonéale unique. On utilise dix souris BDF, dans chaque protocole expérimental; les résultats obtenus sont représentés graphiquement sur la fig. 11. Ces graphiques illustrent le taux de survie des souris en fonction du temps. Il y a lieu de remarquer que les microréservoirs eux-mêmes, en l'absence de daunomycine, sont dépourvus de toxicité. A toutes les doses, l'utilisation des microréservoirs en circulation pour transporter la daunomycine réduit les effets toxiques de la substance active comparativement aux effets produits par la daunomycine libre. Aux doses réduites, l'aptitude des véhicules distributeurs à réduire la toxicité s'accentue comparativement à la substance active libre. On suppose que cette réduction de toxicité peut être expliquée au moins en partie par l'aptitude des microréservoirs en circulation à maintenir la daunomycine dans un courant sanguin et à l'écart des tissus et des organes, notamment du cœur.

L'effet chimiothérapeutique de la daunomycine délivrée au moyen des véhicules conformes à l'invention est illustré dans l'exemple 6 et sur la fig. 12.

Exemple 6:

On suit le mode opératoire de l'exemple 5 pour préparer des microréservoirs vésiculaires avec et sans daunomycine et pour préparer de la daunomycine destinée à être utilisée comme substance active libre. On injecte à plusieurs souris par voie intrapéritonéale

1 x 106 cellules tumorales P388. 24 h plus tard, on injecte des doses intrapéritonéales quotidiennes uniques des microréservoirs vésiculaires avec et sans daunomycine et de la daunomycine libre pendant une période de 5 d après les implantations de tumeurs. Un groupe de souris utilisé comme groupe témoin ne reçoit pas de substance active, sous quelque forme que ce soit. On utilise cinq souris pour chaque protocole expérimental et deux taux de dose différents, à savoir 4 mg/kg et 2 mg/kg. Les résultats obtenus dans ces tests sont représentés graphiquement sur la fig. 12 par la variation du nombre de survivants en fonction du temps.

Les souris auxquelles les microréservoirs sans daunomycine sont injectés ont un taux de survie (non représenté graphiquement) semblable à celui des souris témoins (courbes C sur les graphiques). A la dose de 4 mg/kg. la daunomycine délivrée par les microréservoirs en circulation exerce un effet chimiothérapeutique, tandis que la substance active libre au même taux de dose déploie une toxicité sensiblement plus grande que les cellules tumorales. A la faible dose de

2 mg/kg, la daunomycine délivrée par les microréservoirs en circulation exerce une plus grande réponse chimiothérapeutique que ne le fait la substance active libre.

Dans la formulation des microréservoirs de l'invention, il peut être désirable d'inclure un ou plusieurs agents modifiant la liaison de la substance xénobiotique, capables d'élever ou de réduire la quantité relative de substance xénobiotique retenue par les microréservoirs au cours de leur formation. Par exemple, on a constaté qu'un faible pourcentage molaire, c'est-à-dire environ 5 mol% ou plus, d'acide phosphatidique (lipide chargé), ajouté au constituant phospholipidique des microréservoirs peut accroître l'affinité de la substance xénobiotique pour les microréservoirs. Il est donc possible, conformément à l'invention, d'utiliser un ou plusieurs phospholipides différents pour former le constituant phospholipidique de la composition des microréservoirs. Il est en outre concevable de choisir un seul phospholipide ou un mélange optimal de phospholipides comme constituant phospholipidique des microréservoirs pour obtenir une fixation prédéterminée de la substance xénobiotique.

Il est aussi possible de modifier la liaison d'une substance xénobiotique au réservoir par l'inclusion d'autres lipides qui sont solubles dans le constituant phospholipidique ou légèrement solubles dans l'ester de cholestérol ou le triglycéride. Les modifications obtenues dans un système formé d'un microréservoir et de daunomycine sont illustrées dans l'exemple 7 et sur le tableau 1 ; l'effet exercé par ces modifications sur les vitesses d'émission ou de libération de la substance xénobiotique des microréservoirs résultants est illustré dans l'exemple 8 et sur les fig. 13 et 14.

Exemple 7:

On prépare une série de formulations de microréservoirs contenant 105 jamol de phosphatidylcholine de jaune d'œuf marquée au carbone 14C (activité spécifique de 4160 dpm/|a.mol de phosphatidylcholine), 11,6 |imol d'oléate de cholestéryle et 11,6 (xmol de trioléine (trioléate de glycéryle), contenant ou non un second phospholipide représenté par une quantité de 11,6 (imol d'acide phosphatidique, et contenant ou non du cholestérol comme agent modificateur en quantité de 0 à 75 |imol. Dans chaque formulation, on utilise 1,72 mg de daunomycine comme substance xénobiotique devant être véhiculée et libérée.

Les formulations sont préparées sous forme de solutions chloro-formiques qui sont évaporées à sec dans des fioles de 10 ml à capuchon vissable et maintenues sous vide pendant environ 18 h. Chaque échantillon de formulation est ensuite hydraté avec 3 ml de NaCl 0,154M et 10 mmol de trihydroxyméthylamine (pH 7,2), puis agité par tourillonnement pendant plusieurs minutes à la température ambiante. Chaque échantillon est ensuite traité par les ultrasons à la température désirée pendant 20 min dans un courant d'azote. Le traitement aux ultrasons des échantillons contenant de l'oléate de cholestéryle est effectué à 51 °C; celui des échantillons contenant de la trioléine est effectué à 3°C. Après le traitement aux ultrasons, chaque échantillon est centrifugé pendant 10 min dans une centrifugeuse de laboratoire, pour éliminer tous fragements de titane.

On fait passer chaque échantillon sur une colonne de Sephadex G-50de2,5 x 15 cm en utilisant du chlorure de sodium 0,154M et 10 mmol de trihydroxyméthylamine comme tampon d'élution. Le volume interstitiel de chacune des colonnes de G-50, contenant les microréservoirs, est recueilli et analysé en vue de déterminer la radio-activité de la phosphatidylcholine de jaune d'œuf marquée au carbone 14C et la fluorescence venant de la daunomycine. Les résultats de ces mesures, exprimés en microgrammes de daunomycine par micromole de phosphatidylcholine et en microgrammes de daunomycine par micromole de phospholipide total et par le pourcentage de fixation de daunomycine par les microréservoirs, sont reproduits sur le tableau 1.

Dans la reproduction de ces résultats, le pourcentage de daunomycine encapsulée a été rapporté à l'échantillon présentant le plus haut degré d'encapsulage de daunomycine par micromole de phospholipide total.

( Tableau en tête de la page suivante )

Il ressort des résultats reproduits sur le tableau 1 que l'inclusion d'une petite quantité d'acide phosphatidique dans le constituant phospholipidique (échantillons 1 et 7) accroît l'absorption de daunomycine par les microréservoirs. Contrairement à l'imidocarb (exemples 13 à 15), qui nécessite l'inclusion d'acide phosphatidique, la daunomycine, qui possède un groupe fonctionnel amino ionisable, bénéficie de l'utilisation d'acide phosphatidique comme portion du constituant phospholipidique. On voit donc que l'acide phosphatidique est applicable à des substances xénobiotiques de natures diverses.

L'incorporation de cholestérol, lipide miscible aux phospholipides, à la composition des microréservoirs inhibe la liaison de la daunomycine aux microréservoirs. L'addition de cholestérol aux compositions de microréservoirs contenant du trioléate de glycérol (échantillons 3 à 6) exerce un effet bien moindre sur la liaison de la substance active que lorsque la composition des microréservoirs

8

5

10

1S

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

9

637 825

Tableau l

Effet de la composition du constituant phospholipidique et de l'addition de lipides miscibles au phospholipide sur la fixation de la daunomycine par des microréservoirs

N° de l'échantillon

Composition du microréservoir (mol %)

Microgrammes de daunomycine par

Proportion encapsulée (%)

PC

GTO

CO

PA

Chol micromole de PC

micromole de PL

1

82

9

9

6,67

6,03

100

2

90

10

—

—

—

4,90

4,90

81

3

82

9

—

—

9

4,26

4,26

71

4

72

8

—

—

20

4,14

4,14

69

5

65

7

—

—

28

4,03

4,03

67

6

54

6

—

—

40

3,91

3,91

65

7

82

—

—

9

—

5,83

5,27

87

8

90

—

10

—

—

4,41

4,41

73

9

82

—

9

—

9

4,21

4,21

70

10

72

—

8

—

20

3,43

3,43

57

11

65

—

7

—

28

3,14

3,14

52

12

54

—

6

—

40

2,36

2,36

40

PC = phosphatidylcholine

GTO = trioléate de glycérol

CO = oléate de cholestéryle

PA = acide phosphatidique

Chol = cholestérol

PL = phospholipides totaux (PC et PA)

contenait de l'oléate de cholestéryle (échantillons 9 à 12). Finalement, les résultats du tableau 1 montrent que, dans le cas de la daunomycine, l'utilisation de trioléate de glycérol (échantillons 1 à 6) à la place de l'oléate de cholestéryle (échantillons 7 à 12), facilite la 35 liaison de cette substance xénobiotique aux microréservoirs. Il est donc évident que, par le choix du constituant phospholipidique et du constituant non miscible au phospholipide (avec ou sans addition d'agent modifiant la liaison de la substance xénobiotique), il est possible d'influencer et de prédéterminer le degré d'absorption de la 40 substance xénobiotique dans les microréservoirs ou son degré de liaison aux microréservoirs. Cette influence confère de la souplesse à la composition de l'invention destinée à délivrer une substance xénobiotique, en ce qui concerne les taux de dose, la vitesse de libération de la substance xénobiotique, etc. 45

La liaison à l'équilibre d'une substance xénobiotique peut non ■ seulement être affectée par la composition des microréservoirs, mais la vitesse d'émission ou de libération de cette substance peut aussi être influencée et prédéterminée par la composition. L'illustration en est donnée par l'utilisation d'un modèle qui permet de déterminer les so vitesses d'émission d'une substance xénobiotique des microréservoirs en réaction à des conditions non équilibrées, comme indiqué en détail dans l'exemple 8 et comme représenté sur les fig. 13 et 14.

Exemple 8: 55

On formule des microréservoirs de la manière décrite dans l'exemple 7. Pour établir les conditions désirées de non-équilibre, on fait incuber des microréservoirs contenant de la daunomycine comme substance xénobiotique avec un grand excès de dispersions de phosphatidylcholine de jaune d'œuf non traitées par les ultrasons. <>0 Ces dispersions sont obtenues par addition de portions aliquotes des microréservoirs des diverses compositions contenant environ 1 (imol de phosphatidylcholine de jaune d'œuf à 9 |imol de phosphatidylcholine de jaune d'œuf non traitée aux ultrasons dans 1,0 ml de NaCl 0,154M et 10 mmol de trihydroxyméthylamine (pH 7,2). On «s prépare des dispersions témoins comparables qui contiennent une quantité équivalente de daunomycine libre à la place de la daunomycine portée par les microréservoirs.

Dans la détermination de la vitesse de libération de la daunomycine, l'un des mélanges ainsi formés est utilisé pour chaque temps choisi. Aux temps indiqués, l'échantillon est centrifugé à 15000 x g pendant 2 min et, dans ces conditions, la dispersion non traitée par les ultrasons est aisément séparée des microréservoirs restants dans la liqueur surnageante qui en résulte. Etant donné que la daunomycine tend à se rééquilibrer entre les microréservoirs et les dispersions phospholipidiques non traitées par les ultrasons, la vitesse d'équilibre peut être utilisée comme paramètre cinétique pour évaluer le rôle joué par les divers constituants formant la composition des microréservoirs dans la détermination de la vitesse de libération de la daunomycine contenue dans les microréservoirs.

Une portion aliquote de la liqueur surnageante formée est analysée pour déterminer la fluorescence, et la quantité de fluorescence qui subsiste est comparée avec celle qui est initialement présente dans le mélange. Cette quantité de daunomycine restant dans la liqueur surnageante représente donc la quantité de substance active encore contenue dans les microréservoirs.

Les résultats obtenus dans cette série de mesures sont reproduits graphiquement sur les fig. 13 et 14 qui montrent la décroissance de la fluorescence en fonction du temps pour les microréservoirs contenant du trioléate de glycérol (fig. 13) et pour ceux qui contiennent de l'oléate de cholestéryle (fig. 14). D'après les résultats reproduits graphiquement sur les fig. 13 et 14, on peut constater que la daunomycine libre est très rapidement enlevée de la liqueur surnageante.

tandis que celle qui est fixée aux microréservoirs est retenue à un degré beaucoup plus grand. L'inclusion de 9 mol% d'acide phosphatidique dans le constituant phospholipidique des microréservoirs réduit notablement la vitesse de libération, tandis que l'addition de cholestérol fait croître cette vitesse. Enfin, l'utilisation d'un triglycéride à la place de l'ester de cholestérol réduit légèrement la vitesse de libération.

Ces évaluations cinétiques fondées sur les vitesses de libération contribuent à l'importance des résultats présentés sur le tableau 1 en ce qui concerne la liaison à l'équilibre de la daunomycine aux microréservoirs; ces résultats confirment également le fait que la composition des microréservoirs peut être choisie pour prédéterminer et influencer la pharmacodynamique de la substance xénobiotique renfermée dans les microréservoirs utilisés comme véhicule distributeur de substance active selon la présente invention.

La substance AD 32 est un analogue très hydrophobe de l'adria-mycine, utilisé en chimiothérapie. Etant donné que cette substance active est totalement insoluble dans un tampon aqueux, il est néces-

637 825

<4

saire d'utiliser conjointement un détergent et un liquide organique pour former une solution de AD 32 qui convient aux applications cliniques. Un exemple de solvant actuellement en usage est un mélange de volumes égaux d'éthanol et d'un détergent consistant en un ester sulfurique d'éthylèneglycol (émulphol).

Malgré la nature hydrophobe de la substance AD 32, il est possible d'incorporer cette substance aux microréservoirs conformément à la présente invention et, par conséquent, de modifier au sens bénéfique la pharmacodynamique de cette substance en ce qui concerne tant la cinétique dans le plasma que l'efficacité thérapeutique,

comme illustré dans les exemples 9 à 12 et sur les fig. 15 à 18.

Exemple 9:

On dissout dans du chloroforme 1090 |imol de phosphatidylcholine provenant de jaune d'œuf, 121 jxmol d'oléate de cholestéryle marqué à l'hydrogène 3H (activité spécifique de 190000 dpm/nmol) et 17.5 mg de AD 32, puis on évapore la solution à sec et on la maintient sous vide pendant environ 18 h. On ajoute au mélange sec 5,5 ml de NaCl 0,154M et 5 mmol de trihydroxyméthylamine (pH 7.41). Le liquide est traité par les ultrasons à 48 C sous atmosphère d'azote et, après cette opération, il est chromatographié sur une colonne de Sepharose 4B de 2,5 x 40 cm. Des fractions individuelles ainsi obtenues sont analysées pour déterminer la teneur en phosphatidylcholine, la teneur en oléate de cholestéryle et la teneur en AD 32, comme indiqué ci-dessus. Le profil d'élution, qui représente un ensemble des analyses, est reproduit graphiquement sur la fig. 15. D'après ce graphique, on peut voir que la substance AD 32 est associée à des microréservoirs non vésiculaires (fractions 2-5) ainsi qu'à des microréservoirs vésiculaires (fractions 6 à 18).

L'inclusion d'une petite quantité d'acide phosphatidique dans le constituant phospholipidique de la composition des microréservoirs exerce peu ou pas d'effet sur la vitesse de libération de la substance AD 32 lorsqu'un triglycéride est utilisé comme constituant non miscible au phospholipide. Cela ressort de l'exemple 10 et de la fig. 16.

Exemple 10:

On utilise une formulation de base pour microréservoirs contenant 104,6 jimol de phosphatidylcholine de jaune d'œuf et 11,6 nmol de trioléate de glycérol marqué à l'hydrogène3 H (activité spécifique 1,5 x 105 dpm/|imol). On ajoute 1,73 mg de AD 32 et on ajoute également dans l'une des formulations 11,62 ^mol d'acide phosphatidique dérivé de jaune d'œuf. On évapore ces formulations à sec à partir d'une solution chloroformique et on maintient les résidus sous vide pendant environ 18 h. On ajoute à chaque échantillon 3 ml de NaCl 0,154M et 10 mmol de trihydroxyméthylamine et on traite les liquides hydratés par les ultrasons pendant 20 min à 3° C sous une atmosphère d'azote. On fait passer chaque échantillon sur une colonne de Sephadex G-50 de 2,5 x 20 cm et on fait incuber une quantité de chaque échantillon obtenu de microréservoirs vésiculaires équivalant à 1 jamol de phospholipide avec 9 nmol de liposomes de phosphatidylcholine dans 0,46 ml d'une solution saline tamponnée pour former une dispersion.

A diverses périodes, on centrifuge les dispersions résultantes à 15 000 x g pendant 2 min et on détermine la quantité de fluorescence restant dans la liqueur surnageante. Les résultats de ces déterminations de la vitesse de libération sont reproduits graphiquement sur la fig. 16. On peut constater que la vitesse de libération de la substance AD 32 est relativement grande et reste essentiellement non affectée par l'inclusion d'acide phosphatidique dans la composition des microréservoirs.

Bien que la vitesse de libération de la substance AD 32 des microréservoirs soit relativement grande, l'utilisation de microréservoirs produit une modification bénéfique prononcée de la cinématique de cette substance active dans le plasma, comparativement aux formes posologiques actuellement en usage. Cela est illustré dans l'exemple 11 et sur la fig. 17.

Exemple II :

Les fractions 6 à 18 de l'exemple 9 sont concentrées par ultrafil-tration à une concentration en substance AD 32 de 3,2 mg/ml. On injecte par voie intraveineuse des quantités suffisantes de la substance AD 32 dans les microréservoirs à des rats pesant 150 g de manière que le taux de dose soit de 15 mg/kg; et on injecte de la même façon au même taux de dose à trois rats témoins une formulation clinique de substance AD 32 dissoute dans un mélange à 1:1 en volume d'éthanol et d'émulphol. On prélève des échantillons de plasma à différents moments et on détermine par fluorescence les concentrations en AD 32 dans ces échantillons de plasma. Les résultats obtenus (moyenne de trois rats pour chaque point) sont reproduits graphiquement sur la fig. 17 et expriment le nombre d'équivalents de AD 32 en fonction du temps à partir de l'injection initiale.

La fig. 17 démontre la nette modification de la cinétique de la substance AD 32 dans le plasma, obtenue par l'utilisation des microréservoirs de l'invention, parce que les concentrations en AD 32 dans le plasma dans lequel le médicament a été incorporé sous la forme enfermée dans des microréservoirs sont nettement supérieures (d'un facteur compris entre 2 et 3 en tous points) aux concentrations obtenues pour la substance AD 32 libre introduite sous la forme d'une solution clinique. En laissant à la substance active davantage de temps pour trouver les cellules tumorales, cette modification de sa cinétique dans le plasma améliore son efficacité en tant qu'agent chimiothérapeutique. Cela est illustré dans l'exemple 12 et sur la fig. 18.

Exemple 12:

Des microréservoirs vésiculaires contenant la substance AD 32 sont formulés comme dans l'exemple 9 et concentrés à 3,2 mg de AD 32 par millilitre. On injecte à plusieurs souris par voie intrapérito-néale 1 x 106 cellules tumorales (leucémiques) P388. 24 h plus tard, on injecte des doses intrapéritonéales quotidiennes uniques des microréservoirs vésiculaires contenant la substance AD 32 et des solutions salines témoins pendant une période de 5 d après l'implantation des cellules tumorales. On utilise cinq souris pour chaque protocole expérimental et quatre doses différentes, à savoir 7,3 mg/kg, 4 mg/kg, 2 mg/kg et 1 mg/kg. Les résultats obtenus dans ces essais sont reproduits graphiquement sur la fig. 18 par le nombre de survivants en fonction du temps. Dans tous les cas, les souris auxquelles sont injectés les microréservoirs contenant la substance AD 32 ont un taux de survie supérieur à celui des souris témoins. En outre, même aux très faibles taux de dose de 1 mg/kg, la substance AD 32 délivrée par les microréservoirs en circulation exerce un effet chimiothérapeutique et produit une amélioration notable du taux de survie des souris ayant reçu des cellules leucémiques P388.

Comme dans le cas de la daunomycine, les mêmes concentrations en AD 32 dans le plasma peuvent être obtenues avec de plus faibles taux initiaux de AD 32 véhiculés par les microréservoirs, comparativement aux formulations cliniques. De plus, la composition des microréservoirs a une meilleure biocompatibilité avec le sang que le solvant mixte formé d'éthanol et d'un détergent que l'on doit actuellement utiliser dans des formulations cliniques de AD 32.

L'adriamycine, la daunomycine et la substance AD 32, de même que la carminomycine, sont des agents chimiothérapeutiques contre le cancer qui entrent dans la classe générale des médicaments du type anthracycline. Les exemples précédents illustrent l'efficacité du véhicule de l'invention dans la modification bénéfique de la pharmacodynamique de cette classe d'agents chimiothérapeutiques. Les microréservoirs de l'invention peuvent aussi être utilisés pour délivrer d'autres classes d'agents chimiothérapeutiques comprenant, par exemple, des nitroso-urées et des métabolites.

L'imidocarb est un médicament qui s'est montré très efficace comme parasiticide dans le traitement de l'anaplasmose chez des animaux, en détruisant des parasites dans le courant sanguin. Toutefois, lorsque cette substance est administrée à ses taux de dose les plus efficaces, des traces d'imidocarb tendent à rester dans le tissu animal, ce qui est indésirable si l'animal est destiné à la consomma10

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tion humaine. Par conséquent, il serait avantageux de trouver un véhicule distributeur capable de maintenir l'imidocarb dans le courant sanguin en circulation, ce qui lui permettrait d'assumer sa fonction thérapeutique sans s'accumuler dans le tissu animal.

L'imidocarb et son chlorhydrate sont des composés hydrophiles, caractère par lequel ils se distinguent des médicaments hydrophobes ou à la fois hydrophobes et hydrophiles. Toutefois, comme le démontrent les exemples 13 et 14 suivants et les fig. 19 à 21, les microréservoirs sont tout aussi efficaces dans la modification bénéfique de la pharmacodynamique d'une substance xénobiotique hydrophile telle que l'imidocarb.

Exemple 13:

On dissoutt 900 nmol de phosphatidylcholine de jaune d'œuf, 100 (jmol d'acide phosphatidique, 100 |imol d'oléate de cholestéryle marqué au 3H (activité spécifique 1,6 x I04 dpm/nmol) et 9,16 mg d'imidocarb marqué au l4C et on évapore la solution à sec sous vide. Le résidu sec mixte résultant est ensuite hydraté par addition de 45 ml de NaCl 0,154M et de 290 mM de trihydroxyéthylamine (pH 8,0) au résidu lipide/médicament mixte. Le liquide est ensuite traité par les ultrasons pendant 15 min à 51 C sous une atmosphère d'azote.

Le liquide traité aux ultrasons est ensuite chromatographié sur une colonne de Sepharose 4B de 2,5 x 40 cm. Des fractions chro-matographiques individuelles sont ensuite analysées pour déterminer la quantité de phosphatidylcholine et d'acide phosphatidique par la méthode Gomori, et pour déterminer les quantités d'oléate de cholestéryle marqué au 3 H et d'imidocarb marqué au 14C par mesure de la radio-activité. Les résultats de ces analyses sont représentés graphiquement sur la fig. 19 en fonction du nombre de fractions, les résultats analytiques étant superposés comme sur la fig. 8. Le diamètre des microréservoirs vésiculaires se situe dans la plage d'environ 200 à 300 Â.

On peut constater que des profils d'élution des trois constituants des microréservoirs concordent de la fraction 5 à la fraction 9, ce qui indique que l'imidocarb est associé aux microréservoirs.

La modification bénéfique de la cinétique de l'imidocarb dans le plasma, résultant de l'utilisation des véhicules de la présente invention, est illustrée dans l'exemple 14 et sur les fig. 20 et 21.

Exemple 14:

On dissout dans du chloroforme 100 |tmol de phosphatidylcholine et 10 |imol d'acide phosphatidique dérivé de jaune d'œuf, 10 nmol d'oléate de cholestéryle et 2 mg d'imidoacarb marqué au 14C et on évapore la solution à sec sous vide. Le résidu mixte résultant est mis en suspension dans 5 ml de NaCl 0,154M et 10 mmol de trihydroxyméthylamine (pH 8,0) et la suspension résultante est traitée par les ultrasons pendant 15 min à 5PC sous une atmosphère d'azote. Le liquide est ensuite chromatographié sur une colonne de gel de Sepharose 4B de 2,5 x 40 cm et les fractions présentant une coïncidence de l'imidocarb marqué au 14C, des phospholipides et de l'oléate de cholestéryle sont rassemblées et concentrées par ultrafil-tration à une concentration finale de 0,6 mg d'imidocarb par millilitre.

On prépare également comme témoin une solution d'imidocarb libre à une concentration de 0,6 mg/ml dans NaCl 0,154M et 10 mmol de trihydroxyméthylamine (pH 8,0), destinée à être utilisée dans l'administration d'imidocarb libre.

On injecte des microréservoirs contenant de l'imidocarb ainsi que de l'imidocarb libre dans les veines caudales de rats à deux taux de dose, à savoir 5 mg/kg et 4,4 mg/kg. On prélève des échantillons de plasma à divers intervalles et on détermine la quantité d'imidocarb dans ces échantillons par des mesures de leur radio-activité. Les résultats de ces mesures, reproduits graphiquement par la variation des équivalents d'imidocarb en fonction du temps, sont donnés sur les fig. 20 et 21.

La modification bénéfique de la cinétique dans le plasma par l'utilisation des microréservoirs en circulation pour transporter l'imidocarb dans le courant sanguin d'un mammifère vivant ressort nettement des fig. 20 et 21. Par exemple, à une dose de 5 mg/kg, la concentration de l'imidocarb dans les microréservoirs contenant l'imidocarb dans le courant sanguin est environ 140 fois supérieure à celle de l'imidocarb libre au bout de 4 h; et à la dose de 4,4 mg/kg, elle est environ 200 fois supérieure après la même période. En outre, comme indiqué sur la fig. 21, le courant sanguin contient encore une quantité sensible d'imidocarb sous la forme microréservoir/imido-carb après 24 h, alors qu'il n'en contient pratiquement plus lorsque l'imidocarb est utilisé sous la forme libre.

La variation du rapport de l'imidocarb aux microréservoirs en fonction du temps est également reproduite pour chaque taux de dose sur les fig. 20 et 21 ; ces représentations graphiques font nettement ressortir le fait que la substance active est libérée à une vitesse qui peut être influencée et prédéterminée pour tout ensemble donné de conditions. Il ressort également des fig. 20 et 21 qu'il est éventuellement possible de réduire les taux de dose de la substance active à une valeur bien inférieure aux doses actuellement considérées comme efficaces dans la destruction des parasites du sang qui causent l'anaplasmose chez les animaux.

L'un des principaux buts de la modification bénéfique de la pharmacodynamique d'une substance xénobiotique est l'aptitude à modifier la distribution de cette substance dans les tissus. L'exemple 15 et le tableau 2 montrent que ce résultat peut être obtenu pour l'imidocarb lorsqu'on utilise les microréservoirs de l'invention.

Exemple 15:

Les animaux utilisés dans l'exemple 14 sont sacrifiés 4 h après l'injection d'imidocarb libre ou des microréservoirs contenant l'imidocarb. Divers tissus tels que muscle, rate, foie et rein sont prélevés sur les animaux. Ces tissus sont brûlés dans un appareil de combustion de Searle et l'anhydride carbonique 14C02 résultant est recueilli et soumis à un comptage de radio-activité. On compte le nombre de désintégrations par gramme de tissu; les résultats sont reproduits sur le tableau 2.

Tableau 2

Distribution dans les tissus de l'imidocarb et d'imidocarb véhiculé dans des microréservoirs

Tissu

Imidocarb

Microréservoir/ imidocarb

Variation (%)

(dpm/g de tissu)

Muscle

3 985

3511

-12

Rein

40194

59984

+49

Rate

9498

15339

+ 61

Foie

27059

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L'aptitude à maintenir une substance xénobiotique dans le courant sanguin et dans certains organes est particulièrement importante dans le cas d'une substance active telle que l'imidocarb. Ainsi, la réduction de 12% de la quantité d'imidocarb dans le tissu musculaire que l'on peut obtenir en utilisant les microréservoirs est importante pour l'utilisation de ce parasiticide dans le traitement d'animaux destinés à la consommation humaine. En outre, la plus grande concentration du médicament dans le foie et dans la rate, organes qui renferment une plus forte proportion du micro-organisme responsable de l'anaplasmose, constitue un autre paramètre important dans l'exploitation de l'imidocarb.

Parmi les activités pharmacodynamiques d'une substance xénobiotique qui peuvent être modifiées de façon bénéfique par le véhicule distributeur de l'invention, on mentionne l'absorption orale, la modification étant obtenue par le fait que la substance xénobiotique est rendue apte à traverser le tractus gastro-intestinal et à pénétrer

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dans le courant sanguin en vue d'une circulation efficace. Actuellement, plusieurs solutions sont disponibles pour administrer dans le courant sanguin des substances xénobiotiques qui ne traversent pas le tractus gastro-intestinal ou qui ne le traversent qu'à un degré très limité. L'une de ces solutions réside dans la modification chimique de la substance xénobiotique, par exemple la formation de l'ester d'acide undécanoïque de l'œstradiol qui est essentiellement insoluble dans l'eau et sa mise en suspension dans une huile, sa transformation en une dispersion microcristalline ou la préparation d'une solution dans un solvant organique tel que l'éthanol.

L'incorporation d'undécanoate d'œstradiol (utilisé comme agent limitant la fertilité) dans des microréservoirs conformément à la présente invention supprime la nécessité d'utiliser des milieux liquides tels que des huiles et des solvants organiques et permet en même temps d'obtenir un passage beaucoup plus efficace de la substance xénobiotique dans le courant sanguin. L'incorporation d'undécanoate d'œstradiol dans les microréservoirs de l'invention est illustrée dans l'exemple 16 et par la fig. 22.

Exemple 16:

On dissout dans du benzène 300 |xmol de phosphatidylcholine de jaune d'œuf, 30 |imol d'oléate de cholestéryle et 6 (imol d'undécanoate d'œstradiol marqué à l'hydrogène 3H (activité spécifique 4,6 nCi/nmol) et on lyophilise la solution. On ajoute ensuite au mélange anhydre résultant 5 ml de NaCl 0,154M et 5 mmol de trihydroxyméthylamine; puis on traite le liquide résultant par les ultrasons pendant 17 min à 48 C sous une atmosphère d'azote. Le mélange obtenu traité par les ultrasons est ensuite fractionné par Chromatographie sur une colonne de Sepharose 4B pour produire le profil d'élution de la fig. 22. Les fractions 12 à 30 constituent les microréservoirs vésiculaires contenant la substance xénobiotique utilisés pour effectuer une évaluation in vivo du véhicule distributeur de la présente invention.

L'aptitude des microréservoirs de l'invention à faciliter l'absorption orale de l'undécanoate d'œstradiol est en outre illustrée dans l'exemple 17, sur la fig. 23 et sur le tableau 3.

Exemple 17:

On encapsule de l'undécanoate d'œstradiol marqué à l'hydrogène 3H dans des microréservoirs formés de phosphatidylcholine de jaune d'œuf et d'oléate de cholestéryle marqué au 14C. On dissout dans de l'éthanol des quantités équivalentes d'undécanoate d'œstradiol marqué au 3H. On administre oralement à deux groupes de 9 rats des doses de 1,63 mg/kg. Après 1, 4 et 24 h, on sacrifie trois rats de chaque groupe et on en recueille le sang. On sépare le plasma des érythrocytes par centrifugation et on ajoute 0,5 ml de chaque échantillon de plasma à 9,5 ml de mélange de chloroforme et de méthanol à 2/1 en volume contenant 1,6 jimol d'œstradiol et d'œs-trone non marqués, comme véhicules. Le liquide résultant est filtré et une quantité suffisante de solution saline est ajoutée aux filtrats pour former un système de deux phases. La phase inférieure est évaporée à sec, puis redissoute dans 2,0 ml de méthanol. On soumet 0,2 ml de cette solution à un comptage de radio-activité. Le volume restant (1,8 ml) est déposé sur une plaque de Chromatographie sur couche mince et développé dans un mélange de benzène et d'acétate d'éthyle à 3/2 en volume. Les plaques sont brièvement exposées à de la vapeur d'iode pour permettre la visualisation des stéroïdes de support, puis la vapeur d'iode est chassée par un chauffage modéré. Les taches qui correspondent à l'œstradiol et à l'œstrone sont découpées et soumises à un comptage de radio-activité. Les équivalents en undécanoate d'œstradiol marqué au 3H dans le plasma sont reproduits graphiquement sur la fig. 23. On peut constater que, pendant la première heure, les microréservoirs vésiculaires ont favorisé l'apparition d'équivalents d'undécanoate d'œstradiol marqué au 3H dans le plasma comparativement à la solution êthanolique témoin. Au bout de 4 h, la quantité d'équivalents d'undécanoate d'œstradiol s'est abaissée pour les deux formulations.

Il est connu que l'œstradiol est la forme active du médicament et l'œstrone la forme inactive. En outre, on suppose que les esters d'œstradiol sont inactifs jusqu'au moment où ils ont été hydrolysés en œstradiol. Par conséquent, le rapport de l'œstradiol à l'œstrone dans le plasma doit être un indice de l'aptitude des microréservoirs à favoriser la forme active du médicament.

Les résultats de l'analyse chromatographique sur couche mince des dérivés marqués d'œstradiol dans le plasma sont indiqués sur le tableau 3. On peut constater d'après ces résultats que le rapport d'œstradiol à l'œstrone lorsqu'on utilise les microréservoirs est supérieur de 60% à la valeur qu'ils présentent lorsqu'on utilise une solution êthanolique.

Tableau 3

Rapport du 3H-œstradiol à la 3H-œstrone dans le plasma 1 h après l'administration orale d'undécanoate d'œstradiol

Formulation

Œstradiol/œstrone *

En solution êthanolique Dans des microréservoirs

1,14 1,84

* Ce rapport est fondé sur la moyenne de trois rats.

Le microréservoir utilisé comme moyen distributeur conformément à l'invention offre également la possibilité d'une administration orale de substances xénobiotiques jusqu'à présent inadaptées à ce mode d'administration. Du fait du passage de ces médicaments à travers le tractus gastro-intestinal, il est possible de les délivrer indirectement au courant sanguin, en éliminant ainsi leur métabolisme dans le tractus gastro-intestinal et la nécessité de procéder à des injections, ainsi que la gêne et les complications qui accompagnent cette forme d'administration.

Les microréservoirs peuvent être utilisés sous leur forme vésiculaire ou non vésiculaire ou selon une combinaison de ces deux formes. Cela est illustré par l'exemple 18 et par les fig. 24 et 25.

Exemple 18:

On dissout dans du chloroforme 25 (imol de phosphatidylcholine d'œuf, 75 nmol d'oléate de cholestéryle marqué au 14C et 2 (tmol d'undécanoate d'œstradiol marqué au 3H et on évapore la solution à sec. Le mélange de lipides est évaporé à sec sous vide pendant environ 18 h, puis hydraté avec 4,4 ml de NaCl 0,154M et 5 mmol de trihydroxyméthylamine (pH 7,2). Le liquide résultant est traité par les ultrasons à 40°C pendant 20 min sous une atmosphère d'azote, puis chargé sur une colonne de Sepharose 4B. Le profil d'élution résultant est reproduit sur la fig. 24. On peut observer que l'undécanoate d'œstradiol a une plus grande affinité pour la forme vésiculaire des microréservoirs que pour la forme non vésiculaire, d'après le rapport de l'undécanoate d'œstradiol à l'oléate de cholestéryle dans les deux formes de microréservoirs. La substance qui se trouve dans le volume interstitiel de la colonne est constituée par la forme non vésiculaire, tandis que la substance qui se trouve dans le volume interne est la forme vésiculaire.

Des échantillons des deux formes, non vésiculaire et vésiculaire, contenant de l'undécanoate d'œstradiol et environ 1 |imol de lipides totaux sont traités par incubation avec 9 p.mol de dispersion de phosphatidylcholine d'œuf non traitée par les ultrasons. A diverses époques, les échantillons sont centrifugés à 15000 x g pendant 2 min et la liqueur surnageante contenant les microréservoirs est soumise à un comptage de radio-activité. Etant donné que l'oléate de cholestéryle est un corps non échangeable dans ce système, le rapport de l'undécanoate d'œstradiol marqué par le 3H à l'oléate de cholestéryle marqué par le 14C est une indication de la vitesse de libération de l'undécanoate d'œstradiol par les microréservoirs non vésiculaires ou vésiculaires dans la dispersion de phosphatidylcho-

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line. Les résultats sont reproduits sur la fig. 25. Il y a lieu de remarquer que l'undécanoate d'œstradiol reste associé aux deux formes de microréservoirs, ce qui indique que ces deux formes sont satisfaisantes pour le transport et la libération de substances xénobiotiques.

Los microréservoirs de l'invention contenant des substances xé- 5 nobiotiques peuvent être présentés sous diverses formes posologi-ques. Ainsi, par exemple, on peut les disperser dans un liquide physiologiquement compatible, on peut les utiliser à sec pour former des comprimés ou bien ils peuvent être enfermés dans des capsules en une matière biocompatible convenable.

Il ressort de la description et des exemples détaillés qui précèdent que le véhicule distributeur de l'invention est capable de modifier dans un sens bénéfique la pharmacodynamique de substances xénobiotiques ayant une large plage de caractéristiques chimiques et physiques de même qu'une large plage d'applications et de propriétés biologiques.

10 feuilles dessins

Claims (15)

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1. Véhicule distributeur biologiquement compatible avec un mammifère-hôte, pour introduire et libérer dans l'organisme de i'hôte une substance xénobiotique dont la pharmacodynamique est modifiée dans un sens bénéfique par l'utilisation dudit véhicule, caractérisé par le fait qu'il se présente sous la forme de microréservoirs contenant ladite substance xénobiotique, ces microréservoirs étant formés d'un constituant phospholipidique et d'un constituant lipidique non miscible au phospholipide, stable et essentiellement non miscible à un liquide physiologiquement compatible.

2. Véhicule distributeur suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que les microréservoirs sont sous une forme vésiculaire ayant des diamètres de 190 à 300 Â; sous une forme non vésiculaire ayant des diamètres de 250 à 1000 Â; ou à la fois sous les formes non vésiculaire et vésiculaire.

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REVENDICATIONS

3. Véhicule distributeur suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que les microréservoirs sont formés d'une proportion de 50 à 97 mol% dudit constituant phospholipidique.

4. Véhicule distributeur suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que les microréservoirs comprennent un agent modificateur de liaison de la substance xénobiotique ou un agent limitant la vitesse de libération de ladite substance.

5 sous la forme vésiculaire, ayant des diamètres de 190 à 300 Â, des fractions contenant les microréservoirs sous la forme non vésiculaire, ayant des diamètres de 250 à 1000 Â.

5. Véhicule distributeur suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que le constituant phospholipidique est la phosphatidyl-choline et peut renfermer de l'acide phosphatidique en quantité équivalant à au moins 5 mol%.

6. Véhicule distributeur suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que le constituant lipidique non miscible au phospholipide est un ester de cholestérol d'un acide gras ayant 10 à 18 atomes de carbone ou un triglycéride.

7. Véhicule distributeur suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que la substance xénobiotique est un médicament tel qu'un médicament chimiothérapeutique contre le cancer, un parasi-ticide ou un agent limitant la fertilité.

8. Véhicule distributeur suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que la substance xénobiotique est un médicament dont la cinétique dans le plasma, la toxicité, l'efficacité chimiothérapeutique ou l'absorption orale sont modifiées dans un sens bénéfique.

9. Procédé de production du véhicule distributeur suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il consiste à former des microréservoirs d'une composition comprenant un constituant phospholipidique et un constituant lipidique non miscible au phospholipide qui est stable et essentiellement non miscible au liquide physiologiquement compatible et à incorporer auxdits microréservoirs la substance xénobiotique à délivrer.

10. Procédé suivant la revendication 9, caractérisé par le fait que l'étape de formation des microréservoirs consiste:

a) à préparer avec un solvant une solution du constituant phospholipidique et du constituant lipidique non miscible au phospholipide;

b) à chasser le solvant pour produire un mélange résiduel sec du constituant phospholipidique et du constituant lipidique non miscible au phospholipide;

c) à hydrater le mélange résiduel avec un liquide physiologiquement compatible pour former une suspension;

d) à traiter ladite suspension par les ultrasons en atmosphère non oxydante à une température qui équivaut au moins au point de fusion dudit constituant lipidique non miscible au phospholipide pour former des microréservoirs, et e) à séparer les microréservoirs ainsi formés.

11. Procédé suivant la revendication 10, caractérisé par le fait que l'étape d'incorporation de la substance xénobiotique dans les microréservoirs consiste à ajouter ladite substance à ladite solution dans l'étape a; ou à ajouter la substance xénobiotique à la suspension de l'étape c avant le traitement par les ultrasons.

12. Procédé suivant la revendication 10, caractérisé par le fait que l'étape de séparation des microréservoirs ainsi formés consiste à

centrifuger la suspension traitée par les ultrasons et à chromatogra-phier la phase limpide résultant de la centrifugation pour former une série de fractions chromatographiées; et, le cas échéant, à séparer les fractions chromatographiées qui contiennent les microréservoirs

13. Procédé suivant la revendication 10, caractérisé par le fait qu'il consiste à ajouter une substance modifiant la liaison de la subs-

îo tance xénobiotique ou un agent influençant la vitesse de libération de la substance xénobiotique à ladite solution.

14. Procédé suivant la revendication 9, caractérisé par le fait qu'il consiste à mettre en suspension les microréservoirs contenant la substance xénobiotique dans le liquide physiologiquement compati-

15 ble de manière que ladite substance soit sous une forme posologique liquide ou à encapsuler les microréservoirs contenant ladite substance xénobiotique dans une capsule formée d'une substance acceptable du point de vue physiologique.