CH643532A5 - Verfahren zur herstellung eines dipeptidesters. - Google Patents
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Description
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Dipeptidestern der im Oberbegriff von Anspruch 1 definierten Formel (VI), welches Verfahren die im Kennzeichen von Anspruch 1 genannten Merkmale hat.
Die im erfindungsgemässen Verfahren verwendeten Additionsverbindungen der Formel (I) enthalten Bausteine der Formel (II)
h-n-ch-c-
*• i
(V)
in wässrigem Medium in Gegenwart von Protease hergestellt. Die Monoaminodicarbonsäure der Formel (IV) und der io Aminocarbonsäureester der Formel (V) liegen vorzugsweise in L-Form vor, können aber auch in DL-Form vorliegen.
Die erhaltene Additionsverbindung der Formel (I) wird vom wässrigen Medium abbetrennt und zur Gewinnung des Dipeptidesters der Formel (VI)
15 R.
20
.1
o nh o 0
hoc-(ch0) -ch-c-nh-ch-c-
£ n i r2
-r.
(VI)
mit einer Säure zersetzt. Die N-Schutzgruppe kann in an sich bekannter Weise nachfolgend oder bereits im Zuge der Zersetzung mit Säure zur Bildung von Dipeptidester mit freier 25 Aminogruppe der Formel (VII)
0
ti nh-
I *
0
II
30
hoc-(ch-)_-ch - c-nh-ch-c-r 2 n ,3
(VII)
?1
0 nh o 0
• hoc-(ch0) -ch-c-nh-ch-c-r^ 2 n i J
R2
die in LL-Form vorliegen können, und der Formel (III)
r3-c-ch-nh2
(II)
(III)
die in L-, D- oder hauptsächlich D-Form vorliegen können, wobei Rj, R2 und R3 die oben angegebene Bedeutung haben.
Die Additionsverbindungen der Formel (I) werden durch Umsetzen einer entsprechenden N-substituierten Monoaminodicarbonsäure der Formel (IV)
0 »
?1
nh
I
hoc-(ch0) -ch-coh £ n
(IV)
mit einem entsprechenden Aminocarbonsäureester der Formel (V)
abgespalten werden."
Auf diese Weise können z.B. die a-L-Asparaginyl-L-phe-35 nyl-alaninalkylester, die einen süssen Geschmack wie Zuk-ker besitzen, erhalten werden. a-L-Asparaginyl-L-phenyl-alaninmethylester besitzt eine Süsskraft, die das 200fache derjenigen von Zucker beträgt. Das Asparaginsäuregerüst liegt vor, wenn n = 1 ist; wenn hingegen n = 2 ist, dann 40 liegt das Glutaminsäuregerüst vor.
Allgemein kann Rx eine aliphatische Oxycarbonylgruppe, z.B. eine tert.-Butyloxycarbonylgruppe [(CH^C-O-CO-)] oder tert.-Amyloxycarbonylgruppe [(CH3)2C(C2H5)-0-C0-] oder Benzyloxycarbonylgruppe (0-CH2-O-CO-), oder eine 45 gegebenenfalls kernsubstituierte Benzyloxycarbonylgruppe, wie eine p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe (p-CH3O-0--CH2-0-C0), 3,5-Dimethoxybenzyloxycarbonylgruppe [3,5-(CH3O)2-0-CH2-O-CO-], 2,4,6-Trimethoxybenzyloxy-carbonylgruppe [2,4,6-(CH3O)3-0-CH2-.O-CO-], Benzoyl-50 grappe (0-CO-) oder p-ToluolsuIfonylgruppe (p-CH3-0-SO2-) oder eine aromatische Sulfinylgruppe, z.B. eine o-Nitrosulfi-nylgruppe, bedeuten.
Je nach der Bedeutung von R2 hat die Verbindung (V) das Alaningerüst (R2 = Methyl), das Valingerüst (Rj = Iso-55 propyl), das Leucingerüst (R2 = Isobutyl), das Isoleucin-gerüst (R2 = Isoamyl) oder das Phenylalaningerüst 0*2 = Benzyl).
R3 bedeutet einen Niederalkoxyrest, z.B. Methoxygrup-pen (CH30-), Ethoxygruppen (C2H50-), Propoxygruppen 6o (C3H70-) und Butoxygruppen (C4H90-) oder eine Benzyloxy-oder Benzhydryloxygruppe.
Typische Beispiele für Rj, R2 und R3 sind: Ri = Benzyloxycarbonyl und p-Methoxybenzyloxycarbonyl; R2 = Benzyl;
65 Rs = Methoxy- oder Äthoxy.
Eine typische erfindungsgemäss verwendete Additionsverbindung (I), erhalten durch Umsetzung von N-Benzyloxy-carbonyl-L-asparaginsäure und L-Phenylalaninmethylester,
643532
4
zeigt die nachfolgend wiedergegebenen IR- und NMR-Spek-tren.
IR-Spektrum
3260 cm-1 (N-H-Streckschwingung); 3000 bis 3200 cm-1 (C-H-Streckschwingung); 1740 cm-1 (C=0-Ester); 1720 cm-1 (C=0 Urethan); 1660 cm-1 (erste Amidabsorp-tion); 1630 cm-1 (Carboxylat); 1540 cm-1 (zweite Amid-absorption); 1430 und 1450 cm-1 (C-H-Deformations-schwingung); 1390 cm-1 (Carboxylat); 1220 bis 1290 cm-1 (C-O-C-Streckschwingung und dritte Amidabsorp-tion); 1050 cm-1 (Phenylschwingung in der Ebene); sowie 740 und 695 cm-1 (Schwingung des monosubsti-tuierten Benzolrings ausserhalb der Ebene).
NMR-Spektrum
(1) 5 = 2,75 ppm (2H)
(2) 8 = 3,02 ppm (4H)
(3) 5 = 3,61 ppm (3H) 3,7 ppm (3H)
(4) S = 4,4 to 4,8 ppm (3H)
(5) 8 = 5,05 ppm (2H)
(6) 8 = 5,82 ppm (5H)
(7) 8 = 7,3 ppm (15H).
Die Ergebnisse der Elementaranalyse der Additionsverbindung sind im wesentlichen die gleichen wie die berechneten Werte für die Formel I, in der Rx, R2 und R3 eine Benzyloxycarbonyl-, Benzyl- bzw. Methyloxygruppe bedeuten, und n den Wert 1 hat.
Wenn die Additionsverbindung der Behandlung mit einer starken Säure, wie Chlorwasserstoffsäure, unterworfen und das Produkt mit einem organischen Lösungsmittel, wie Äthyl-acetat, extrahiert wird, erhält man aus der organischen Schicht eine saure Verbindung. Wenn man die vorgenannte typische Additionsverbindung in dieser Weise behandelt, zeigt die erhaltene saure Verbindung charakteristische Eigenschaften, die für die Verbindung der Formel VI in LL-Form, in der Rj, R2, R3 und n die gleiche Bedeutung wie in der vorgenannten typischen Additionsverbindung haben, erwartet werden können.
Wenn die aus der vorgenannten typischen Additionsverbindung erhaltene saure Verbindung der katalytischen Hydrierung mit Wasserstoff unterworfen wird, erhält man den bekannten LL-Asparaginyl-phenylalanin-methylester.
Alle Daten, einschliesslich der IR- und NMR-Spektren, sowie die für die Verbindungen erhaltenen Elementaranalysen in irgendeiner der vorgenannten Stufen, erhärten die in den Formeln gezeigten Strukturen.
Entsprechende Ergebnisse werden auch in dem Fall erhalten, wo die Verbindungen mit anderen Bedeutungen für R1; R2, R3 und n im Rahmen der Formeln (IV) und (V) bzw. (I) verwendet werden.
Wird die Schutzgruppe für die Aminogruppe, d.h. Rt,
nach einer bekannten Methode abgespalten, z.B. durch ka-talytische Hydrierung, so lässt sich der Dipeptidester mit einer Aminogruppe und einer Carboxylgruppe erhalten.
Die so erhältlichen Dipeptidester haben wertvolle Eigenschaften. So lassen sich z.B. a-L-Asparaginyl-phenylalanin--niederalkylester, insbesondere der Methylester, wobei n den Wert 1 besitzt, R2 eine Benzylgruppe ist und Rs eine Nie-deralkoxygruppe, vorzugsweise eine Methoxygruppe, ist, als Süssstoffe verwenden.
Peptide mit einer N-ständigen Schutzgruppe und einer freien C-ständigen Carboxylgruppe, die aus dem Dipeptidester mit einer Schutzgruppe für die Aminogruppe durch übliche Hydrolyse erhalten werden können, bieten ebenfalls wertvolle Eigenschaften. So kann z.B. N-Benzyloxycarbonyl--a-L-glutamyl-phenylalanin als Substrat zur Messung der enzymatischen Aktivität von Carboxypeptidasen verwendet werden.
Bei den als Ausgangsverbindungen verwendeten N-sub-stituierten Monoaminodicarbonsäuren (IV) handelt es sich s um N-substituierte Asparaginsäure für n = 1 und um N-sub-stituierte Glutaminsäure für n = 2.
Für die Wahl der Schutzgruppe Rj gilt allgemein, dass diese die Aminogruppe in der Reaktion schützen und dementsprechend stabil sein soll. Ferner soll sich die Abspal-lo tung von Rx von der Aminogruppe ohne Beinträchtigung des Gerüstes des Produktes erzielen lassen.
Um die Abtrennung von Reaktionsprodukt aus wässrigem Medium zu erleichtern, sollte das Produkt keine die Wasserlöslichkeit erhöhenden Gruppen, wie Sulfonsäuregruppen, 15 enthalten.
Geeignete N-substituierte Monoaminodicarbonsäuren (IV) lassen sich leicht durch Einführung der Schutzgruppe Ri in die Monoaminodicarbonsäure nach üblichen Verfahren herstellen.
20 Die Verbindungen (V) sind Aminosäureester mit einer hydrophoben Gruppe in der Seitenkette, wobei es sich um Alaninester für R2 = Methyl, um Valinester für R2 = Iso-propyl, um Leucinester für R2 = Isobutyl, um Isoleucinester für R2 = sek.-Butyl und um Phenylalaninester für R2 = 25 Benzyl handelt. Von diesen Gruppen R2 stellt die Benzylgruppe, die als Aminosäureester Phenylalaninester liefert, den typischsten Fall dar.
Bei den erfindungsgemäss verwendeten Proteasen handelt es sich vorzugsweise um Metalloproteasen, die ein Me-30 tallion im aktiven Zentrum besitzen. Geeignete Metalloproteasen sind aus Mikroorganismen herrührende Enzyme, wie neutrale Proteasen von Ray fungus, Prolisin, Thermolycin, Collagenase, Crotulus atrox-Protease usw. Es ist auch möglich, rohe Enzyme, wie Thermoase, Tacynase-N, Pronase, 35 usw. zu verwenden. Zur Dämpfung der in den rohen Enzymen enthaltenen Esterase wird es bevorzugt, einen Enzyminhibitor, z.B. einen Potato-Inhibitor, mit den rohen Enzymen zu verwenden. Es ist auch möglich, Thiolproteasen, wie Papain, oder Serinproteasen, wie Trypsin, zu verwenden, je-40 doch besitzen diese Esterase-Aktivität. Man muss somit bei der Durchführung der Reaktion unter Verwendung dieser Enzyme auf die Verhinderung der Esterhydrolyse bzw. Verseifung achten.
Bei der erfindungsgemässen Synthese erfolgt die Bildung 45 der Peptidbindung in wässrigemMedium, vorzugsweise wäss-riger Lösung, bei solchen pH-Werten, dass die Protease enzymatisch aktiv ist.
Die Reaktion zur Bildung der Additionsverbindung aus Peptid und Aminocarbonsäureester ist somit pH-abhängig so und erfolgt vorzugsweise bei pH-Werten von 4 bis 9, insbesondere 5 bis 8. Demgemäss können die Ausgangsverbin-dungen, nämlich die N-substituierten Monoaminodicarbonsäuren und die Aminocarbonsäureester, in freier Form oder in Salzform vorliegen. Wenn jedoch beide in dem wässrigen 55 Medium gelöst werden, ist es erforderlich, den pH-Wert auf den genannten Bereich einzustellen.
Beispiele für geeignete pH-Regler sind anorganische oder organische Säuren und Basen, wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Essigsäure; Alkalihydroxide, wie Na-60 trium- und Kaliumhydroxid; Alkalicarbonate, wie Natrium-carbonat, Natriumhydrogencarbonat, Kaliumcarbonat und Kaliumhydrogencarbonat; sowie organische und anorganische Amine, wie Ammoniak, Trimethylamin, Triethylamin und Ethanolamin.
65 Die Mengen an Wasserstoffionen und Hydroxylionen, die durch die Reaktion freigesetzt werden, sind äquivalent, wobei die Veränderung des pH-Wertes durch die Reaktion meist nicht gross ist. Zur Verhinderung einer pH-Änderung
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ist die Verwendung von Puffern möglich. Bei technischer Herstellung ist es vorteilhaft, den pH-Wert unter Verwendung eines pH-Reglers, der durch einen pH-Messer gesteuert wird, zu regeln.
Bei dem wässrigen Medium handelt es sich im allgemeinen um wässrige Lösungen. Man kann dem wässrigen Medium auch mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel in solchem Umfang zusetzen, wie das Lösungsmittel die Abscheidung des Reaktionsproduktes nicht verhindert.
Die Bildung der Verbindung (I) wird vorzugsweise bei Temperaturen von 10 bis 90°C, vorzugsweise 20 bis 50°C, unter dem Gesichtspunkt der Erhaltung der Enzymaktivität durchgeführt. Die Reaktion ist im allgemeinen in etwa 30 min bis 24 Std. beendet, obwohl die Reaktionszeit an sich keiner Beschränkung unterliegt.
Die Konzentration beider Ausgangsverbindungen (IV) und (V) im wässrigen Medium unterliegen an sich keiner besonderen Beschränkung; um die Abscheidung des Reaktionsproduktes zu begünstigen, wird aber vorzugsweise bei höheren Konzentrationen gearbeitet. Die Löslichkeit der anfallenden Additionsverbindungen in Wasser ist relativ gering. So beträgt z.B. die Löslichkeit der Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin--methylester und L-Phenylalanin-methylester etwa 0,3 g/ 100 g Wasser bei 20°C. Demgemäss können geeignete Konzentrationen beispielsweise im Bereich von 0,001- bis 7-molar, vorzugsweise 0,1- bis 4-molar, liegen.
Das Verhältnis der Ausgangsverbindungen zueinander unterliegt an sich keiner besonderen Beschränkung. Erfindungs-gemäss kommt es jedoch auf die Verbindung eines Moleküls der N-substituierten Monoaminodicarbonsäure mit 2 Molekülen des Aminocarbonsäureesters an, wobei das stöchio-metrische Molverhältnis der Ausgangsverbindungen 1: 2 beträgt. In der Praxis angewendete Verhältnisse liegen im allgemeinen im Bereich von 100 : 1 bis 1 : 100, vorzugsweise 5 : 1 bis 1 : 5 und insbesondere 2 : 1 bis 1:3.
Es ist nicht immer erforderlich, die gesamten Mengen der Ausgangsverbindungen im wässrigen Medium zu lösen; vielmehr kann man Teilmengen der Ausgangsverbindungen suspendieren, da die Konzentrationen der Ausgangsverbindungen mit zunehmender Reaktion abnehmen, wodurch die suspendierten Ausgangsverbindungen allmählich in Lösung gehen.
In diesem Fall kann eine Veränderung des pH-Wertes eintreten, wobei es erforderlich sein kann, den pH-Wert der Lösung; mit fortschreitender Reaktion einzustellen.
Die Menge der erfindungsgemäss verwendeten Protease unterliegt an sich keiner besonderen Beschränkung. Bei hoher Konzentration des Enzyms kann die Reaktion in kurzer Zeit beendet sein. Bei geringer Konzentration des Enzyms ist die Reaktionszeit verlängert. Somit liegt die Konzentration im allgemeinen im Bereich von etwa 2 bis 400 mg (5 X 10~5 bis 1 X 10-2 mMol), pro 1 mMol der Ausgangsverbindungen, vorzugsweise etwa 5 bis 100 mg (1 X 10~4 bis 3 X IO-3 mMol), pro 1 mMol der Ausgangsverbindun-gen.
Erfindungsgemäss erfolgt die Ausbildung der Peptidbin-dung nur bei L-Isomeren, jedoch nicht bei D-Isomeren. Andererseits können die für die Durchführung der Additionsreaktion zur Bildung der Additionsverbindungen verwendeten Aminosäureester sowohl in L-Form, D-Form als auch als Gemisch vorliegen. Bei Verwendung von DL-Aminocar-bonsäureestern wird das L-Isomere des DL-Aminocarbon-säureesters in der Lösung durch die Peptidsynthesen verbraucht, wodurch der verbleibende Aminosäureester mit überwiegend D-Form für die Bildung der Additionsverbindung aus Dipeptidester und Aminocarbonsäureester Verwendung findet.
Die Verbindungen (IV) und (V) können im wesentlichen mit quantitativer Ausbeute umgesetzt werden, wenn die Konzentrationen der Ausgangsverbindungen hoch sind. Werden 2 Mol DL-Aminocarbonsäureester pro 1 Mol N-substituierte 5 Monoaminodicarbonsäure in L-Form verwendet, so kann man die im wesentlichen aus LL-Dipeptidester und D-Ami-nocarbonsäureester aufgebaute Additionsverbindung erhalten.
Verwendet man die N-substituierte Monoaminodicarbonsäure in DL-Form und den Aminosäureester in L-Form, so io erweist sich das D-Isomere der DL-Form der N-substituierten Monoaminodicarbonsäure als inert und verbleibt in dem wässrigen Medium, wodurch die Additionsverbindung aus dem LL-Dipeptidester und dem L-Aminocarbonsäureester erhalten werden kann. Wird demgemäss die D-Form der 15 N-substituierten Monoaminodicarbonsäure aus dem wässrigen Medium isoliert, so ist es möglich, gleichzeitig die Bildung der Additionsverbindung und die optische Spaltung der N-substituierten DL-Monoaminodicarbonsäure zu erreichen. Unterwirft man die isolierte N-substituierte D-Mono-20 aminodicarbonsäure nach herkömmlichen Verfahren der Racemisierung, so kann das Reaktionsprodukt als Ausgangsverbindung Verwendung finden.
Verwendet man die N-substituierte DL-Monoaminodi-carbonsäure und den DL-Aminocarbonsäureester, so lassen 25 sich die N-substituierte DL-Monoaminodicarbonsäure aus dem wässrigen Medium, und die Additionsverbindung aus dem LL-Dipeptidester und dem D-Aminocarbonsäureester erhalten, wobei die Additionsverbindung wie vorstehend dargelegt, in die Komponenten zerlegt werden kann Hierauf 30 können die Herstellung des Dipeptidesters und die optische Spaltung der N-substituierten DL-Monoaminodicarbonsäure und des DL-Aminocarbonsäureesters gleichzeitig erreicht werden.
Erfindungsgemäss ist es möglich, die Stufen der Einfüh-35 rung und Abspaltung einer Schutzgruppe für die Carboxylgruppe in einer Seitenkette wegzulassen, was man bei den herkömmlichen Verfahren für unabdingbar gehalten hat. Demgemäss lassen sich Verluste an Ausgangsverbindungen vermeiden. Die Produktausbeute ist bei Auswahl entspre-40 chender Bedingungen bemerkenswert hoch.
Für das Verfahren der Erfindung können DL-Ausgangs-verbindungen verwendet werden. Bei den herkömmlichen Verfahren unter Verwendung von Enzymen ist das D-Iso-mere der DL-Ausgangsverbindungen für die Reaktion nutzlos, 45 was einen Verlust an Ausgangsverbindungen mit sich bringt, obwohl die Reaktion hierdurch nicht beeinträchtigt wird.
Beim Verfahren der Erfindung können die D-Ausgangsverbindungen hingegen wirksam für die Abscheidung des Di-peptids verwendet und anschliessend wiedergewonnen wer-50 den.
Die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens lässt sich also mit der optischen Spaltung von N-substituier-ten DL-Aminodicarbonsäuren und DL-Aminocarbonsäure-estern verbinden.
55 Die Zersetzung der Additionsverbindung (I) kann wie oben bereits erwähnt mit Säure, gegebenenfalls auch in Form von saurem Ionenaustauscher wie in einigen Beispielen beschrieben erfolgen. Je nach Wahl kann in wässrigem oder nicht-wässrigem Medium gearbeitet werden. Als Säuren sind 60 anorganische oder organische Säuren geeignet; Br0nsted-Säuren werden häufig bevorzugt. Beispiele für geeignete anorganische Säuren sind Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure. Beispiele für geeignete organische Säuren sind Ameisensäure, Essigsäure, 65 Citronensäure, Toluolsulfonsäure usw. Die Konzentration der Säure ist nicht besonders kritisch und kann unter Berücksichtigung anderer Verfahrensbedingungen gewählt werden.
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Gemäss einer ersten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Zersetzung der Additionsverbindung (I) in einer sauren wässrigen Lösung, in welcher die saure Komponente meist in stöchiometrischer Menge oder darüber vorliegt, z.B. in einer Menge von 1-100 Äquivalent, vorzugsweise 1-20 Äquivalent, insbesondere 1-10 Äquivalent, jeweils bezogen auf 1 Mol der Additionsverbindung (I), da die saure Komponente zur Ionisierung des Aminocarbonsäureesterbausteins und damit zu seiner Auflösung in der wässrigen Lösung in Form seines Salzes führt.
Für einige Zwecke muss der Dipeptidester (VI) nicht besonders rein sein. In solchen Fällen ist es möglich, geringere Mengen der sauren Komponente, als dem stöchiometrischen Verhältnis entspricht, zu verwenden, z.B. 0,5 Äquivalent pro 1 Mol der Additionsverbindung (I). Für einige praktische Zwecke kann man z.B. etwa 0,8 Äquivalent, pro 1 Mol der Additionsverbindung (I), verwenden.
Das Verhältnis der sauren wässrigen Lösung zu den Ausgangsverbindungen liegt vorzugsweise in einem Bereich, in dem der Dipeptidester (VI) in festem Zustand vorliegen kann, da der erhaltene Dipeptidester (VI) als Feststoff abgetrennt wird. Viele Dipeptidester (VI) besitzen jedoch eine geringe Löslichkeit in Wasser oder in der sauren wässrigen Lösung, z.B. im Fall des N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl--L-phenylalaninmethylesters, dessen Löslichkeit 0,028 g/ 100 g Wasser und 0,017 g/100 g verdünnter Salzsäure (10~2-molar) bei 25°C beträgt. Demgemäss kann der Anteil der sauren wässrigen Lösung relativ hoch sein. Andererseits wird bei dem Verfahren der Erfindung die Additionsverbindung (I) mit der sauren wässrigen Lösung vorzugsweise so in Berührung gebracht, dass man Bedingungen zur Feststoff-Flüssigkeits-Trennung vorliegen hat. Es ist somit nicht zweckmässig, ein zu niedriges Verhältnis anzuwenden. Geeignete Mengen der sauren wässrigen Lösung liegen im Bereich von 1,5 bis 50 Gewichtsteile, vorzugsweise 2 bis 10 Gewichtsteile, jeweils pro 1 Gewichtsteil der Additionsverbindung (I).
Die Temperatur zur Umsetzung der Additions Verbindung (I) mit der sauren wässrigen Lösung liegt im allgemeinen im Bereich von 0 bis 100°C, vorzugsweise 5 bis 80°C. Wenn man das Gemisch ausreichend rührt, ist die Zersetzung der Additionsverbindung (I) in etwa 10 Minuten beendet.
Handelt es sich bei Rx um eine Schutzgruppe, die leicht hydrolysiert werden kann, z.B. um eine p-Methoxybenzyl-oxycarbonylgruppe, so ist es zweckmässig, Reaktionszeit und -temperato sorgfältig zu überwachen, um eine Abspaltung der Schutzgruppe zu verhindern.
Vorzugsweise erfolgt die Zersetzung der Additionsver-bindung unter Bildung des Dipeptidesters (VI) und eines Salzes des Aminosäureesters (V) mit einer Säurekomponente der wässrigen Säurelösung. Ein erheblicher Teil des Dipeptidesters (VI) liegt nach der Zersetzungsreaktion meist in festem Zustand vor, da er in der wässrigen Säurelösung nur eine geringe Löslichkeit besitzt, wie vorstehend dargelegt. Da sich das Salz in der Lösung gut löst, entsteht als Reaktionssystem ein Gemisch aus dem festen Dipeptidester und der Salzlösung, die einen Überschuss der Säurekomponente enthalten kann. Der erhaltene feste Dipeptidester kann in üblicher Weise, z.B. durch Filtration oder Zentrifugieren, abgetrennt werden. Aus der abgetrennten Salzlösung kann der Aminosäureester in üblicher Weise isoliert werden, z.B. durch Auskristallisieren oder durch Lösungsmittelextraktion nach der Freisetzung des Aminosäureesters.
Erfindungsgemäss kann der Dipeptidesster (VI) in einfacher Weise hergestellt und abgetrennt werden durch Zersetzung der Additionsverbindung (I), und zwar ohne komplizierte Stufen, wie Extraktion und Ionenaustauscherharzbehandlung. Ausbeute und Reinheit des Dipeptidesters (VI) sind meist bemerkenswert hoch. Die Herstellung von a-L-
-Asparaginyl-L-phenylalanin-alkylestern, die als Süssmittel Verwendung finden, ist weiter unten beschrieben.
Eine andere Möglichkeit zur Zersetzung der Additionsverbindung besteht darin, dass man die Additionsverbindung, 5 in der Rx z.B. eine p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe darstellt, vorzugsweise die Additionsverbindung aus einem N-p--Methoxybenzyloxycarbonyl-a-asparaginylphenyl-alanin-alkylester und einem Phenylalaninalkylester (1: 1), in einem flüssigen Medium auflöst und in diesem mit einer Säure un-10 ter Bildung des Dipeptidesters mit einer freien Aminogruppe der Formel (VII) zersetzt.
Geeignete flüssige Medien zur Lösung der Additionsverbindung (I) sind organische Lösungsmittel, insbesondere Ketone, wie Aceton; Sauerstoff enthaltende organische Lois sungsmittel, wie Dioxan und Tetrahydrofuran; chlorierte niedere Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, Methylendi-chlorid und Äthylendichlorid; nicht-protonische polare organische Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Dimethyl-sulfoxid, und flüssige Carbonsäuren, wie Essigsäure und 20 Ameisensäure. Auch Gemische aus zwei oder mehr der vorgenannten Lösungsmittel können verwendet werden.
Des weiteren kann man auch Ester, wie Äthylacetat, und Alkohol wie Methanol, Äthanol oder Propanol, verwenden. Bei Verwendung solcher Lösungsmittel ist die Produktaus-25 beute normalerweise erniedrigt, und zwar wegen unerwünschter Nebenreaktionen, z.B. Umesterungsreaktionen oder Veresterung der Carboxylgruppe.
Die Additionsverbindung besitzt meist eine geringe Löslichkeit in Wasser. Demgemäss ist Wasser allein meist nicht 30 als flüssiges Medium geeignet, obwohl es möglich ist, Wasser zu dem flüssigen Medium in solchem Umfang hinzuzusetzen, dass eine ausreichende Löslichkeit der Additionsverbindung in dem flüssigen Medium gewährleistet bleibt.
Die Menge des flüssigen Mediums richtet sich nach der 35 Art des flüssigen Mediums und dem Lösevermögen für die Additionsverbindung. Die Menge ist im allgemeinen grösser als 10 Gewichtsteile und beträgt vorzugsweise 20 bis 100 Gewichtsteile, pro 1 Gewichtsteil der Additionsverbindimg.
Bei den für die Zersetzung der Additionsverbindung ver-40 wendeten Säuren handelt es sich vorzugsweise um Br0nsted-Säuren, vorzugsweise anorganische Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure oder Perchlorsäure, und organische Säuren, wie Tri-fluoressigsäure oder p-ToluoIsulfonsäure. 45 Das Verhältnis der Säure zur Additionsverbindung ist vorzugsweise mindestens stöchiometrisch; vorzugsweise finden 2 Äquivalent oder mehr Säure, pro 1 Mol der Additionsverbindung, Anwendung.
Die Konzentration der Säure in dem flüssigen Medium so liegt im allgemeinen im Bereich von 0,1 bis 10 n, vorzugsweise 1 bis 5 n. Vorzugsweise wird die genaue Konzentration nach Massgabe der anderen Reaktionsbedingungen festgelegt, da die Reaktion unter anderem von der Reaktionszeit, der Reaktionstemperatur und der Art der Säure abhängt. Hohe 55 Konzentrationen, die den vorgenannten Bereich übersteigen und zu unerwünschten Nebenreaktionen, z.B. der Hydrolyse der Ester führen könnten, sollten jedoch vermieden werden.
Bei der Säure kann es sich um wässrige oder wasserfreie Säure handeln. Wenn es sich bei dem flüssigen Medium um 60 ein mit Wasser nicht mischbares Medium, z.B. einen chlorierten Kohlenwasserstoff handelt, wird die Verwendung wasserfreier Säuren bevorzugt, da die Verwendung wässriger Säuren zur Ausbildung von zwei Phasen führen würde, was eine sehr langsame Reaktion zur Folge hätte. 65 Reaktionstemperatur und -zeit unterliegen an sich keinen besonderen Beschränkungen. Die Reaktion erfolgt im allgemeinen bei 20 bis 100°C für eine Dauer von 10 Minuten bis 6 Stunden.
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Bei Anwendung der Säure in geringerer Konzentration dauert die Reaktionszeit länger oder die Reaktionstemperatur ist höher. Bei höherer Säurekonzentration ist es von Vorteil, eine kürzere Reaktionszeit und eine niedrigere Reaktionstemperatur zu wählen.
Nach der Zersetzung der Additionsverbindung können der erhaltene Dipeptidester mit der freien Aminogruppe (VII), Anisalkohol und der Aminosäureester (V) nach nachfolgend beschriebenen Methoden getrennt werden. So kann man z.B. nach der Reaktion den Anisalkohol in eine Lösungsmittelphase extrahieren. Hierbei geht man so vor, dass man geeignete Mengen Wasser und Lösungsmittel, das eine separate Phase mit Wasser zu bilden vermag, wie Chloroform oder Diäthyläther, der Reaktionslösung zusetzt, anschliessend schüttelt und dann absitzen lässt, wobei eine Phasentrennung in eine Lösungsmittelphase und eine wäss-rige Phase erfolgt. Andererseits wird der pH-Wert der wässrigen Phase durch Zugabe einer Base, wie NaOH, NaHC03, Na2C03, Ammoniak oder Triäthylamin, auf einen Wert von 5 bis 6 eingestellt, worauf der abgeschiedene Dipeptidester mit der freien Aminogruppe (VII) durch Filtration oder dgl. abgetrennt wird. Der pH-Wert des Filtrats wird dann mit der Base auf einen pH-Wert von 8 bis 10 eingestellt, worauf der freie Phenylalaninalkylester mit einem Lösungsmittel, wie Chloroform, Diäthyläther oder Äthylacetat, extrahiert wird. Der Dipeptidester mit der freien Aminogruppe und der Aminosäureester können auch in einfacher Weise durch die übliche Methode unter Anwendung eines Kationenaustauscherharzes isoliert werden.
Die oben beschriebenen Methoden zur optischen Spaltung können auch in diesem Fall Anwendung finden.
Dieses Verfahren ist höchst vorteilhaft anwendbar auf die Herstellung von a-L-Asparaginylphenylalanin-niederalkyl-estern aus der Additionsverbindung von N-p-Methoxybenzyl-oxycarbonyl-a-L-asparaginyl-L-phenylalanin-niederalkyl-estern mit Phenylalanin-niederalkylestern, wobei R1; R^ R3 und n eine N-p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe, Benzylgruppe bzw. Niederalkylgruppe, vorzugsweise eine Methyloder Äthylgruppe, bedeuten und n den Wert 1 hat.
Erfindungsgemäss können die Abspaltung des Aminocar-bonsäurebausteins und der N-ständigen Schutzgruppe der p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe von dem Dipeptidester gleichzeitig erfolgen. Der abgetrennte Anisalkohol kann wiedergewonnen und durch Umsetzung mit Phosgen in ein p-Methoxybenbzyloxycarbonylierungsmittel überführt werden.
Die Beispiele erläutern die Herstellung der Additionsverbindung und deren Zerlegung zur Gewinnung der Dipeptidester.
Beispiel 1
1335 mg (5 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagin-säure und 1078 mg (5 mMol) L-Phenylalaninmethylester-hy-drochlorid werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 20 ml Wasser versetzt. Bei der Auflösung wird der pH mit 7%igem Ammoniakwasser auf einen Wert von 6 eingestellt.
Die erhaltene Lösung wird mit 50 mg Thermolysin vermischt und dann bei 38 bis 40°C über Nacht geschüttelt. Der Niederschlag wird abgetrennt, mit 40 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 1145 mg feine, nadeiförmige Kristalle vom F. 117 bis 120°C (eine Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenyl-alaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester [1: 1]); Ausbeute 75,5%, bezogen auf L-Phenylalaninmethylester--hydrochlorid.
Das Reaktionsprodukt wird aus einem Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat und n-Hexan umkristallisiert. Die physikalischen Eigenschaften und die Ergebnisse der Elementaranalyse sind nachfolgend zusmmengestellt.
F. 120-124°C.
[a]D25 : + 7,1 (C=l, Methanol).
Elementaranalyse: C32H37N3Og ber. (%) C 63,24 H 6,13 N 6,97
s gef.: (%) C 63,15 H 6,15 N 7,00
Die IR- und NMR-Spektren des Produkts bestätigen die Struktur.
1145 mg des Reaktionsprodukts werden in 40 ml ln-HCl io gelöst und dann 3mal mit 30 ml Äthylacetat extrahiert. Hierauf werden die Extrakte vermischt, mit jeweils 20 ml Wasser (3mal) gewaschen und dann mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Einengen der Lösung führt man durch Zugabe von n-Hexan Kristallisation herbei. Hier-15 bei erhält man 640 mg eines kristallinen Produkt. Die physikalischen Eigenschaften und die Ergebnisse der Elementaranalyse sind nachfolgend angegeben.
F. 115-125°C
[a]D25 : -15,3 (C=l, Methanol)
20 Elementaranalyse: C22H24N207
ber.: (%) C 61,67 H 5,65 N 6,54 gef.: (%) C 61,52 H 5,65 N 6,57
Die IR- und NMR-Spektren zeigen die für N-Benzyloxy-25 carbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester erwarteten Eigenschaften.
Die Ergebnisse stimmen mit denjenigen überein, die man bei Benzyloxycarbonylierung der Aminogruppe des L-Aspara-ginyl-L-phenylalaninmethylesters erhält. 30 Der L-Phenylalaninmethylester wird aus einem Gemisch der Salzsäurephase und der Waschwasserfraktion, die von der Äthylacetatextraktion herrühren, gewonnen.
Es bestätigt sich somit, dass die durch die vorgenannte Reaktion erhaltene Verbindung eine Additionsverbindung 35 aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninme-thylester und L-Phenylalaninmethylester darstellt. Gleichzeitig bestätigt das NMR-Spektrum, dass das Molverhältnis 1: 1 beträgt.
40 Beispiel 2
1335 mg (5 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagin-säure und 1078 mg (5 mMol) L-Phenylalaninmethylester-hy-drochlorid werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 10 ml Wasser versetzt. Bei der Auflösung wird der pH mit 45 7%igem Ammoniakwasser auf einen Wert von 6 eingestellt. Die erhaltene Lösung wird mit 50 mg Thermolysin vermischt und dann bei 38 bis 40°C über Nacht geschüttelt. Der Niederschlag wird gesammelt, aus der Lösung abgetrennt und getrocknet. Hierbei erhält man 1504 mg einer Additionsso Verbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginylphenyl-alaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester (1: 1). Ausbeute: 99,1%, bezogen auf L-Phenylalaninmethylester-hy-drochlorid; F. 104 bis 113°C.
55 Beispiel 3
Gemäss Beispiel 2, wobei jedoch die Mengen an N-Ben-zyloxycarbonyl-L-asparaginsäure und L-Phenylalaninmethylester auf 534 mg (2 mMol) bzw. 863 mg (4 mMol) verändert werden, erhält man 1068 mg einer Additionsverbindung aus 60 N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethyl-ester und L-Phenylalaninmethylester (1:1) vom F. 116 bis 119°C. Ausbeute 70,4%, bezogen auf N-Benzyloxycarbonyl--L-asparaginsäure.
65 Beispiel 4
534 mg (2 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagin-säure und 863 mg (4 mMol) L-Phenylalaninmethylester-hy-drochlorid werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit
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8 ml Wasser versetzt. Bei der Auflösung wird der pH mit 7 %igem Ammoniakwasser auf einen Wert von 6,2 eingestellt.
Die erhaltene Lösung wird mit 50 mg Thermolysin vermischt und dann bei 38 bis 40°C über Nacht geschüttelt. Der Niederschlag wird gesammelt, aus der Lösung abgetrennt und getrocknet. Hierbei erhält man 1099 mg einer Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phe-nylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester (1: 1). Ausbeute 90,5%, bezogen auf N-Benzyloxycarbonyl-L--asparaginsäure.
Beispiel 5
267,2 mg (1 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagin-säure und 537,6 mg (3 mMol) L-Phenylalaninmethylester werden in 5 ml Pufferlösung (Mcllvain's Puffer, pH 7,0) gelöst.
Die erhaltene Lösung wird mit 100 mg Thermoase und 100 mg Potato-Inhibitor versetzt und dann 20 Stunden bei 38°C geschüttelt. Der Niederschlag wird gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 580 mg einer rohen kristallinen Additionsverbindung aus N-Benzyl-oxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester (1 : 1) vom F. 123 bis 125°C. Ausbeute 95,5%, bezogen auf N-Benzyloxycarbonyl-L-aspa-raginsäure.
Nachdem man das Reaktionsprodukt in 40 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Dimethylformamid und Wasser (1 : 1- gelöst hat, wird die Lösung unter gründlichen Rühren mit einem stark sauren Kationenaustauscherharz in der H-Form versetzt. Nach Abtrennung des Harzes wird das Filtrat unter vermindertem Druck eingeengt. Nachdem man den Rückstand in Dimethylformamid gelöst hat, wird die Lösung mit Wasser versetzt. Hierbei erhält man einen Niederschlag aus 330 mg N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenyl-alaninmethylester vom F. 123 bis 125°C. Ausbeute 77,0%, bezogen auf N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure.
Beispiel 6
267,2 mg (1 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagin-säure und 358,4 mg (2 mMol) L-Phenylalaninmethylester werden in 5 ml Pufferlösung (Mcllvain's Puffer, pH 7,0) gelöst. Die Lösung wird mit 100 mg Tacynase N und 100 mg Potato-Inhibitor versetzt und dann 6 Stunden bei 38°C geschüttelt. Der Niederschlag wird gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 120 mg einer rohen kristallinen Additionsverbindung aus N-Benzyloxy-carbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester (1: 1) vom F. 119 bis 123°C. Ausbeute 19,7%.
Das erhaltene Reaktionsprodukt wird gemäss Beispiel 5 der Behandlung mit dem stark sauren Kationenaustauscherharz in H-Form unterworfen. Hierbei erhält man 50 mg N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethyl-ester vom F. 95 bis 105°C. Ausbeute 11,7%.
Beispiel 7
1335 mg (5 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagin-säure und 1078 mg (5 mMol) L-Phenylalaninmethylester werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 4 ml Wasser versetzt. Bei der Auflösung wird der pH mit Triäthylamin auf einen Wert von 6,8 eingestellt.
Die erhaltene Lösung wird mit 20 mg Thermolysin versetzt und dann 2 Tage bei 38 bis 40°C geschüttelt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit 40 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 475 mg einer Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenyl-alaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester (1: 1).
Ausbeute 31,3%, bezogen auf L-Phenylalaninmethylester--hydrochlorid.
Das erhaltene Reaktionsprodukt wird aus einem Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat und n-Hexan umkristallisiert. Die physikalischen Eigenschaften und die Ergebnisse der Elementaranalyse sind nachfolgend angegeben.
F. 120 bis 124°C [a]D25 : + 7,2 (C=l, Methanol)
Elementaranalyse:
ber.: (%) C 63,24 H 6,13 N 6,97 gef.: (%) C 63,52 H 6,22 N 7,04
Beispiel 8
Gemäss Beispiel 7, wobei jedoch der pH auf einen Wert von 5,2 eingestellt wird, erhält man 753 mg einer Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phe-nylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester (1:1). Ausbeute 49,5%, bezogen auf L-Phenylalaninmethylester.
Beispiel 9
133,6 mg (0,5 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagin-säure und 89,6 mg (0,5 mMol) L-Phenylalaninmethylester werden in 2,5 ml Pufferlösung (Mcllvain's Puffer, pH 7,0) mit 0,07 ml Triäthylamin gelöst.
Die erhaltene Lösung, die einen pH-Wert von 6,7 besitzt, wird mit 50 mg Thermoase und 50 mg Potato-Inhibi-tor versetzt und dann 20 Stunden bei 38°C geschüttelt. Der Niederschlag wird abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Hierbei erhält man 130 mg einer rohen Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninme-thylester und L-Phenylalaninmethylester (1:1) vom F. 115 bis 124°C. Ausbeute 85,5%, bezogen auf L-Phenylalanin-methylester.
Das Reaktionsprodukt wird in 20 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Dimethylformamid und Wasser (1: 1) gelöst und hierauf gemäss Beispiel 5 der Behandlung mit dem stark sauren Kationenaustauscherharz in H-Form unterworfen. Hierbei erhält man 75 mg N-Benzyloxycarbonyl-L-phenyl-alaninmethylester. Gesamtausbeute 70%, bezogen auf eine 50%ige Ausnutzung der Menge an Ausgangs-L-Phenylala-ninmethylester.
Beispiel 10
Gemäss Beispiel 9, wobei jedoch 0,05 ml N-Methylmor-pholin anstelle von 0,07 ml Triäthylamin Verwendung finden, wird die Umsetzung mit einem pH-Wert von 6,4 zu Beginn durchgeführt. Hierbei erhält man 120 mg einer rohen kristallinen Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl--L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester (1 : 1) vom F. 118 bis 124°C. Ausbeute 78,9%, bezogen auf L-Phenylalaninmethylester.
Das Reaktionsprodukt wird gemäss Beispiel 9 der Behandlung mit dem stark sauren Kationenaustauscherharz in H-Form unterworfen. Hierbei erhält man 70 mg kristallinen N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalaninmethylester. Gesamtausbeute 66%, bezogen auf eine 50% ige Nutzung der Menge des Ausgangs-L-Phenylalaninmethylesters.
Beispiel 11
Gemäss Beispiel 4, wobei jedoch die Umsetzung bei einem pH-Wert von 6,5 unter Schütteln für eine Dauer von 1 Stunde erfolgt, erhält man 920 mg einer Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenyl-alaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester (1: 1), Ausbeute 75,8%.
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Beispiel 12
534 mg (2 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure und 863 mg (4 mMol) L-Phenylalaninmethylester-hydro-chlorid werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 2 ml Wasser versetzt. Bei der Auflösung wird der pH durch Zugabe von 5,5 ml 1 n-NaOH auf einen Wert von 7 eingestellt.
Die erhaltene Lösung wird mit 50 mg Thermolysin versetzt und dann 2 Stunden bei 38 bis 40°C geschüttelt. Der erhaltene Niederschlag wird abgetrennt und getrocknet. Hierbei erhält man 734 mg einer Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethyl-ester und L-Phenylalaninmethylester (1: 1) vom F. 106 bis 118°C. Ausbeute 60,5 %.
Beispiel 13
540 mg (2 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagin-säure und 863 mg (4 mMol) L-Phenylalaninmethylester-hy-drochlorid werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 7 ml Wasser versetzt. Bei der Auflösung wird der pH mit 7%igem Ammoniakwasser auf einen Wert von 6 eingestellt.
Die erhaltene Lösung wird mit 100 mg Thermoase versetzt und über Nacht bei 38 bis 40°C geschüttelt. Der erhaltene Niederschlag wird mit 70 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 550 mg einer Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenyl-alaninmethylester (1: 1) vom F. 113 bis 116°C. Ausbeute 45,3%.
Beispiel 14
270 mg (1 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagin-säure und 432 mg (2 mMol) L-Phenylalaninmethylester werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 4 ml Wasser versetzt. Bei der Auflösung wird der pH 7 mit 7 %igem Ammoniakwasser auf einen Wert von 6 eingestellt.
Die erhaltene Lösung wird mit 50 mg Thermoase versetzt und dann 40 Stunden bei 38 bis 40°C geschüttelt. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert, vom Wasser abgetrennt und getrocknet. Hierbei erhält man 177 mg einer Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L--phenylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester (1: 1) vom F. 103 bis 112°C. Ausbeute 29,1%.
Beispiel 15
Gemäss Beispiel 14, wobei jedoch der Reaktionslösung zusätzlich 50 mg Potato-Inhibitor zugesetzt werden, erhält man 381 mg des gleichen Produkts vom F. 105 bis 117°C. Ausbeute 62,7%.
Beispiel 16
534 mg (2 mMol) N-Benzoyloxycarbonyl-L-asparaginsäure und 863 mg (4 mMol) DL-Phenylalaninmethylester-hydro-chlorid werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 7 ml Wasser versetzt. Bei der Auflösung wird der pH mit 7%igem Ammoniakwasser auf einen Wert von 6,2 eingestellt.
Die erhaltene Lösung wird mit 50 mg Thermolysin versetzt und dann bei 38 bis 40°C über Nacht geschüttelt. Der Niederschlag wird abfiltriert, vom Wasser getrennt und getrocknet. Hierbei erhält man 1045 mg Kristalle einer Additionsverbindung aus N-Benzoyloxycarbonyl-asparaginyl-phe-nylalaninmethylester und Phenylalaninmethylester (1 : 1) vom F 104 bis 108°C. Ausbeute 86,1%, bezogen auf N-Benzovl-carbonyl-L-asparaginsäure.
Nach dem Umkristallisieren aus einem Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat und n-Hexan erhält man eine Substanz mit den nachfolgend angegeben Daten.
F. 127-135°C
[a]D25 : —4,6 (C=l, Methanol)
Elementaranalyse:
C32ÌH37N3O9
ber.: (%) C 63,24 H 6,13 N 6,97 gef.: (%) C 63,52 H 6,19 N 6,92
5 Es handelt sich vermutlich um die Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninme-thylester und D-Phenylalaninmethylester (1:1), und zwar deshalb, weil das IR-Spektrum und das NMR-Spektrum der Substanz die gleichen Eigenheiten wie diejenigen von Beilo spiel 1 aufweisen.
800 mg des Reaktionsprodukts werden in 40 ml 1 n HCl gelöst und dann mit 30 ml Methylendichlorid 3mal extrahiert. Hierauf wird die Methylendichloridphase mit Wasser gewaschen und dann mit wasserfreiem Magnesiumsulfat ge-15 trocknet. Nachdem man das Methylendichlorid abdestilliert hat, wird der freie feste Rückstand aus einem Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat und n-Hexan umkristallisiert. Hierbei erhält man 450 mg Kristalle mit den nachfolgend angegebenen Eigenschaften.
20 F. 124-132°C
[a]D25 : —15,3 (C=l, Methanol)
Elementaranalyse: C22H24N207
ber.: (%) C 61,67 H 5,65 N 6,54 gef.: (%) C 61,38 H 5,58 N 6,29
25
Bei dem Reaktionsprodukt handelt es sich um N-Benzyl-oxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester.
Die rückständige wässrige Phase aus der Extraktion mit Methylenchlorid wird zur Einstellung des pH auf einen Wert 30 von 8,7 mit Natriumhydrogencarbonat vermischt. Hierauf wird das Produkt mit 30 ml Methylenchlorid 3mal extrahiert. Nachdem man den Extrakt mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet hat, wird Chlorwasserstoffgas in den Extrakt für eine Dauer von etwa 10 Minuten eingeleitet. 35 Nach dem Einengen wird die Methylenchloridlösung mit Äthyläther versetzt. Hierbei rekristallisiert das Produkt, und man erhält 29,0 mg D-Phenylalaninmethylester-hydrochlorid vom F. 149 bis 151 °C.
[a]D25 : —15,1 (C=l, Methanol).
40 Das IR- und NMR-Spektrum stimmt mit demjenigen der L-Form überein.
Die Annahme über die Additionsverbindung ist somit zutreffend. Bei dem durch die Umsetzung erhaltenen Produkt handelt es sich um die Additionsverbindung aus dem 45 N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethyl-ester und dem D-Phenylalaninmethylester (1 : 1).
Beispiel 17
50 1069 mg (4 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-DL-asparagin-säure und 863 mg (4 mMol) L-Phenylalaninmethylester-hy-drochlorid werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 2 ml Wasser versetzt. Hierauf wird der pH mit 7 %igem Ammoniakwasser auf einen Wert von 6 eingestellt. 55 Die erhaltene Lösung wird mit 50 mg Thermolysin versetzt und dann 2 Stunden bei 38 bis 40°C geschüttelt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit 20 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 787 mg einer Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenyl-60 alaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester (1: 1) vom F. 105 bis 110°C. Ausbeute 64,8%, bezogen auf N-Benzyl-oxycarbonyl-L-asparaginsäure.
Das Produkt wird aus einem Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat und n-Hexan umkristallisiert. Hierbei erhält man 65 das gewünschte Produkt vom F. 121 bis 125°C.
[a]D25: 7,2 (C= 1, Methanol).
Die n-Benzyloxycarbonyl-asparaginsäure (hauptsächlich in D-Form) wird aus der restlichen Reaktionslösung isoliert.
643532
10
Beispiel 18
Beispiel 17 wird wiederholt, wobei jedoch DL-Phenyl-alaninmethylester anstelle von L-Phenylalaninmethylester Verwendung findet. Hierbei erhält man 765 mg einer Addi-tionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L--phenylalaninmethylester und D-Phenylalaninmethylester (1: 1) vom F. 105 bis 111°C. Ausbeute 62,3%, bezogen auf N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure.
Beim Umkristallisieren aus einem Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat und n-Hexan erhält man das gewünschte Produkt vom F. 126 bis 134°C.
[a]D25 : —6,5 (C=l, Methanol).
Die N-Benzyloxycarbonylasparaginsäure (hauptsächlich in D-Form) wird aus der verbleibenden Reaktionslösung isoliert.
Beispiel 19
5,34 g (20 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure und 7,53 g (42 mMol) L-Phenylalaninmethylester werden in einem 100 ml fassenden Kolben mit 70 ml Wasser versetzt. Hierbei erhält man eine Lösung mit einem pH von 6,2 bis 6,3.
Die erhaltene Lösung wird mit 200 mg Thermolysin versetzt und 4 Stunden bei 38 bis 40°C geschüttelt. Der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, mit 70 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 10,11 g Kristalle vom F. 117 bis 120°C. Bei diesem Produkt handelt es sich um eine Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbo-nyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und L-Phenyl-alaninmethylester (1:1), und zwar aufgrund der nachfolgend angegebenen Eigenschaften (nach Umkristallisieren aus Äthylacetat/n-Hexan).
F. 120-124°C
[a]D25 : + 7,2 (C=l, Methanol)
Elementaranalyse: C^Hj^Og ber.: (%) C 63,24 H 6,13 N 6,97 gef.: (%) C 63,16 H 6,14 N 6,99
Die IR- und NMR-Spektren zeigen die gleichen Eigenschaften, die vorstehend für die l:l-Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethyl-ester und L-Phenylalaninmethylester beschrieben sind.
Beim Behandeln mit starker Säure und Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, wie Äthylacetat, erhält man nach Abdestillieren des organischen Lösungsmittels den N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethyl-ester.
1,00 g (1,65 mMol) der erhaltenen Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninme-thylester und L-Phenylalaninmethylester werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 2 ml Wasser und 2,0 ml 1-n HCl unter Rühren bei Raumtemperatur während 10 Minuten versetzt. Nachdem man die erhaltene Aufschlämmung filtriert hat, wird der Niederschlag mit 4 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 0,72 g Kristalle des N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethyl-esters mit einer Ausbeute von 98,8%.
Nachdem man die erhaltenen Kristalle in Äthylacetat gelöst hat, versetzt man mit n-Hexan zur Rekristallisation des Produkts. Die physikalischen Eigenschaften und die Ergebnisse der Elementaranalyse des Endprodukts sind nachfolgend angegeben.
F. 121-124°C
[a]D25 : -15,4 (C=l, Methanol)
Elementaranalyse: C22H24N2O1J
ber.: (%) C 61,67 H 5,65 N 6,54 gef.: (%) C 61,58 H 5,64 N 6,56
Das IR-Spektrum des Produkts stimmt mit demjenigen der Standardverbindung überein.
Darüberhinaus wird die Identität des Produkts durch Vergleich einer wässrigen Lösung des Produkts mit derjenigen der Standardverbindung mittels Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie bestätigt.
Beispiel 20
1,00 g (1,65 mMol) der Additionsverbindung aus N-Ben-zyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester, hergestellt in Beispiel 19, werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 2 ml Wasser und 1,32 ml 1 n HCl versetzt. Nachdem man das Gemisch 10 Minuten bei' Raumtemperatur gerührt hat, wird gemäss Beispiel 19 aufgearbeitet. Hierbei erhält man 0,70 g feine prismatische Kristalle vom F. 100 bis 126°C mit einem Gehalt an N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethyl-ester von 96,8%.
Beispiel 21
0,534 g (2 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure und 0,863 g (4 mMol) DL-Phenylalaninmethylester-hydro-chlorid werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 10 ml Wasser versetzt. Bei der Auflösung wird der pH mit 7 %igem Ammoniakwasser auf einen Wert von 6,0 eingestellt.
Die erhaltene Lösung wird mit 50 mg Thermolysin versetzt und dann bei 38 bis 40°C über Nacht geschüttelt. Der Niederschlag wird abgetrennt, mit 10 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 0,90 g Kristalle vom F. 120 bis 126°C.
Ein Teil der Kristalle wird aus einem Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat und n-Hexan umkristallisiert. Hierbei erhält man das gewünschte Produkt vom F. 128 bis 134°C; [a]D25 = —6,3 (C=l, Methanol). Die mit diesem Produkt erhaltenen IR- und NMR-Spektren sind im wesentlichen die gleichen wie diejenigen der Additionsverbindung aus N-Ben-zyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester (1:1).
Elementaranalyse: C^H^NjOg ber.: (%) C 63,24 H 6,13 N 6,97
gef.: (%) C 63,42 H 6,17 N 6,95
Bei Behandlung mit Säure erhält man hieraus den N-Ben-zyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und den D-Phenylalaninmethylester im Molverhältnis 1: 1.
Die Ergebnisse bestätigen, dass die erhaltenen Kristalle die Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-aspara-ginyl-L-phenylalaninmethylester und D-Phenylalaninmethyl-ester (1: 1) darstellen.
0,50 g (0,82 mMol) der Additionsverbindung werden mit 4 ml Wasser und 0,26 g Citronensäure vermischt. Nachdem man das Gemisch bei Raumtemperatur 10 Minuten gerührt hat, erfolgt die Aufarbeitung gemäss Beispiel 19. Hierbei erhält man 0,35 g Kristalle des N-Benzyloxycarbonyl-L--asparaginyl-L-phenylalaninmethylesters mit einer Reinheit von 100% und einer Ausbeute von 99,3%.
Beispiel 22
0,50 g (0,82 mMol) der Additionsverbindung aus N--Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester, hergestellt gemäss Beispiel 19, werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 4 ml Wasser und 0,24 g (1,2 mMol) p-Toluolsulfonsäuremonohydrat versetzt. Bei der Aufarbeitung gemäss Beispiel 19 erhält man 0,33 g Kristalle des N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L--phenylalaninmethylesters mit einer Reinheit von 100% und einer Ausbeute von 93,6%.
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Beispiel 23
0,45 g (8,2 mMol) 85%ige Ameisensäure und 8 ml Wasser werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 0,50 g (0,82 mMol) der Additionsverbindung aus N-Benzyloxycar-bonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester, hergestellt in Beispiel 19, versetzt. Nachdem man das Gemisch 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt hat, wird das Reaktionsprodukt abfiltriert, mit 10 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 0,312 g weisse Kristalle des N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagi-nyl-L-phenylalaninmethylesters mit einer Reinheit von 100% und einer Ausbeute von 88,6%.
Beispiel 24
0,47 g (8,2 mMol) Eisessig und 8 ml Wasser werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 0,50 g (0,82 mMol) der Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagi-nyl-L-phenylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester versetzt. Nachdem man das Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt hat, wird das Reaktionsprodukt abfiltriert, mit 10 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 0,308 g weisse Kristalle des N-Benzyloxy-carbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylesters mit einer Reinheit von 100% und einer Ausbeute von 87,2%.
Beispiel 25
1,00 g (1,65 mMol) der Additionsverbindung aus N-Ben-zyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester, hergestellt in Beispiel 19, werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 2 ml Wasser und 2,0 ml 1 n HCl versetzt. Nachdem man das Gemisch 3 Minuten bei 60°C gerührt hat, erfolgt die Aufarbeitung gemäss Beispiel 19. Hierbei erhält man 0,35 g Kristalle des N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethyl-esters mit einer Reinheit von 100% und einer Ausbeute von 100%.
Beispiel 26
0,594 g (2 mMol) N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl-L--asparaginsäure und 0,860 g (4 mMol) L-Phenylalaninme-thylester-hydrochlorid werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 1 n NaOH versetzt. Hierbei wird der pH auf einen Wert von 6,0 eingestellt.
Die erhaltene Lösung wird mit 50 mg Thermolysin versetzt und hierauf bei 38 bis 40°C über Nacht geschüttelt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit 10 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 0,928 g Kristalle vom F. 68 bis 74°C.
Die nachfolgenden Ergebnisse bestätigen, dass es sich bei dem Reaktionsprodukt um die Additionsverbindung aus N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenyl-alaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester (1:1) handelt.
Beim Umkristallisieren aus einem Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat und n-Hexan erhält man das gewünschte Produkt mit den nachfolgend angegebenen Eigenschaften. F. 72-76°C
[a]D25. +6,5 (C=l, Methanol)
Elementaranalyse: C„H,9N,Oin ber.: (%) C 62,15 H 6,16 N 6,59
gef.: (%) C 61,85 H 6,04 N 6,46
Die IR- und NMR-Spektren zeigen, dass es sich bei dem Reaktionsprodukt um die Additionsverbindung der Formel I handelt, in der Ru R2, R3 und n eine p-Methoxybenzyloxy-carbonylgruppe, Benzylgruppe, Methoxygruppe bzw. den Wert 1 bedeuten.
0,500 g (0,78 mMol) der Additionsverbindung aus N-p--Methoxybenzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin-methylester und L-Phenylalaninmethylester, die in vorgenannter Weise hergestellt worden ist, werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 2 ml Wasser und 0,94 ml (0,94 mMol) 1 n HCl versetzt. Hierauf wird das Reaktionsgemisch 3 Minuten bei 60°C gerührt.
Nach Filtrieren der erhaltenen Aufschlämmung, Waschen mit 6 ml Wasser und Trocknen erhält man 0,32 g Kristalle.
Die nachfolgenden Ergebnisse zeigen, dass es sich bei dem Reaktionsprodukt um N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl--L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester (Reinheit 100%, Ausbeute 89,1%) handelt.
Nachdem man die Kristalle in Äthylacetat gelöst hat, versetzt man mit n-Hexan zur Rekristallisation des Produkts. Die physikalischen Eigenschaften und die Ergebnisse der Elementaranalyse sind nachfolgend angegeben.
F. 128 bis 130°C [a]D25 : -15,1 (C=l, Methanol)
Elementaranalyse: C23H26N2Oa ber.: (%) C 60,25 H 5,72 N 6,11 gef.: (%) C 60,30 H 5,74 N 5,99
IR- und NMR-Daten zeigen, dass es sich um ein Endprodukt der Formel VI handelt, in der R1; R2, R3 und n eine p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe, Benzylgruppe, Methoxygruppe bzw. den Wert 1 bedeuten.
0,2 Gewichtsteile des erhaltenen N-p-Methoxybenzyloxy-carbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylesters werden in 2 Gewichtsteilen Aceton gelöst. Nachdem man die erhaltene Lösung mit 1 Gewichtsteil 4 n HCl versetzt hat, wird das Gemisch auf dem Wasserbad 1,5 Stunden unter schwachem Rückfluss erhitzt. Hierbei findet vollständige Zersetzung unter Bildung einer Lösung statt, die als Hauptkomponenten L-Asparaginyl-L-phenylalaninmethylester, L-Phenylalaninmethylester und Anisalkohol enthält. Aus dieser Lösung erhält man den L-Asparaginyl-L-phenylalaninmethyl-ester.
Beispiel 27
0,562 g (2 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminsäure und 0,860 g (4 mMol) L-Phenylalaninmethylester-hydrochlo-rid werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 1 n NaOH versetzt. Bei der Auflösung wird der pH-Wert auf 6,0 eingestellt.
Die erhaltene Lösung wird mit 50 mg Thermolysin versetzt und hierauf bei 38 bis 40°C über Nacht geschüttelt.
Nach dem Abtrennen wird der Niederschlag mit 10 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 0,510 g Kristalle vom F. 80 bis 85°C.
Die nachfolgend angegebenen Ergebnisse bestätigen, dass es sich bei dem Reaktionsprodukt um eine Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-glutamyl-L-phenylalanin-methylester und L-Phenylalaninmethylester (1 : 1) handelt.
Beim Umkristallisieren aus Äthylacetat/n-Hexan erhält man das gewünschte Produkt. Die physikalischen Eigenschaften und die Ergebnisse der Elementaranalyse sind nachfolgend zusammengestellt.
F. 92-97°C
Tain25: 0,1 (C=l, Methanol)
Elementaranalyse: C33H3gN3Og ber.: (%) C 63,75 H 6,32 N 6,76 gef.: (%) C 63,61 H 6,31 N 6,65
IR- und NMR-Daten zeigen, dass es sich bei dem Reaktionsprodukt um die Additionsverbindung der Formel I handelt, in der Rj, R2, R3 und n eine Benzyloxycarbonylgruppe, Benzylgruppe, Methoxygruppe bzw. den Wert 2 bedeuten.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
643532
12
0,001 g der Additionsverbindung aus N-Benzyloxycar-bonyl-L-glutamyl-L-phenylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester werden in einem 15 ml fassenden Reagenzglas unter Rühren zu 2,3 ml (0,32 mMol) 0,14 n HCl hinzugefügt. Hierauf wird das Gemisch 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.
Der erhaltene weisse Niederschlag wird abfiltriert, mit 3 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 0,683 g Kristalle.
Die nachfolgend angegebenen Ergebnisse bestätigen, dass es sich bei dem Reaktionsprodukt um den N-Benzyloxycar-bonyl-L-glutamyl-L-phenylalaninmethylester (Reinheit 100%, Ausbeute 95,8%) handelt
Nachdem man die Kristalle in Äthylacetat gelöst hat, versetzt man zur Rekristallisation mit n-Hexan.
Die physikalischen Eigenschaften und die Ergebnisse der Elementaranalyse sind nachfolgend angegeben.
F. 97-99°C
[a]D25 : —11,0 (C=l, Methanol)
Elementaranalyse: C23H2BN207
ber.: (%) C 62,43 H 5,92 N 6,33 gef.: (%) C 62,63 H 5,94 N 6,24
IR- und NMR-Daten zeigen, dass es sich bei dem Endprodukt um die Verbindung der Formel VI handelt, in der Rj, R2, R3 und n eine Benzyloxycarbonylgruppe, Benzylgruppe, Methoxygruppe bzw. den Wert 2 bedeuten.
Der erhaltene N-Benzyloxycarbonyl-L-glutamyl-L-phe-nylalaninmethylester kann durch Reduktion bzw. Hydrierung mit Wasserstoff in den L-Glutamyl-L-phenylalaninme-thylester, und durch Hydrolyse bzw. Verseifung in das N-Benzyloxycarbonyl-L-glutamyl-L-phenylalanin überführt werden.
Beispiel 28
0,686 g (3,12 mMol) L-Phenylalaninmethylester-hydro-chlorid werden in einem 100 ml fassenden Kolben mit 25 ml Wasser versetzt. Bei der Auflösung versetzt man unter Kühlen mit Eis und unter Rühren mit wässrigem 2 n NaOH bis zum pH 7,5. Hierauf versetzt man die Lösung unter Rühren allmählich mit 0,360 g (1,44 mMol) N-Benzyloxycarbonyl--L-asparaginsäureanhydrid, wobei man den pH-Wert durch Zugabe von wässrigem 2 n NaOH auf 7,0 bis 7,5 hält. Nach beendeter Zugabe rührt man das Gemisch noch 2 Stunden und versetzt dann mit wässrigem 1 n HCl bis zum pH 6. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert, mit 50 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 0,416 g einer Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L--asparaginylphenylalaninmethylester (Gemisch aus 86% N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-(Co)-L-phenylalaninme-thylester und 14% N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-(C^)--L-phenylalaninmethylester) und L-Phenylalaninmethylester (1: 1) vom F. 108 bis 115°C. Durch die Reaktion entsteht eine erhebliche Menge N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl--C^-L-phenylalaninmethylester, der grösste Teil der Verbindung verbleibt jedoch im Filtrat und im Waschwasser.
In einem 12 ml fassenden Becherglas werden 0,200 g (0,329 mMol) der erhaltenen Additionsverbindung aus N--Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-(Ca und C^-L-phenyl-alaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester zu 1,7 ml (0,7 mMol) wässrigem 0,4 n HCl unter Rühren hinzugefügt. Hierauf wird das Reaktionsgemisch weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.
Der erhaltene weisse Niederschlag wird abfiltriert, mit 3 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 0,136 g (Ausbeute 96,3%) Kristalle des N-Benzyloxycarbo-nyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylesters (enthaltend
17 % N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-C^-L-phenylalanin-methylester) vom F. 110 bis 118°C.
Beispiel 29
In einem 30 ml fassenden Kolben werden 0,543 g (2 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure und 0,918 g (4 mMol) L-Phenylalaninäthylester-hydrochlorid in 5 ml Wasser gelöst. Hierauf versetzt man mit wässriger Lösung
4 n NaOH bis zum pH 6.
Die erhaltene Lösung wird mit 50 mg Thermolysin versetzt. Das erhaltene Gemisch wird dann bei 38 bis 40°C über Nacht geschüttelt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit 30 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 0,913 g Kristalle vom F. 85 bis 90°C.
Bei dem Produkt handelt es sich um die Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenyl-alaninäthylester und L-Phenylalaninäthylester (1: 1).
Das Produkt wird aus einem Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat und n-Hexan umkristallisiert. Die physikalischen Eigenschaften und die Ergebnisse der Elementaranalyse sind nachfolgend angegeben.
F. 93-95°C
[a]D25 : +6,0 (C— 1, Methanol)
Elementaranalyse: C^H^NgOg ber.: (%) C 64,23 H 6,50 N 6,61 gef.: (%) C 64,50 H 6,56 N 6,63
IR- und NMR-Daten zeigen, dass es sich bei dem Reaktionsprodukt um die Additionsverbindung der Formel I handelt, in der R1; R2, R3 und n eine Benzyloxycarbonylgruppe, Benzylgruppe, Äthoxygruppe bzw. den Wert 1 bedeuten.
In einem 30 ml fassenden Kolben werden 0,125 g (0,197 mMol) der erhaltenen Additionsverbindung aus N-Benzyl-oxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninäthylester und L-Phenylalaninäthylester mit 2 ml Wasser und 0,24 ml 1 n HCl (0,24 mMol) vermischt. Das erhaltene Gemisch wird 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Nach Filtrieren der erhaltenen Aufschlämmung wird das Produkt mit
5 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 0,0807 g Kristalle des N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl--L-phenylalaninäthylesters mit einer Reinheit von 100% und einer Ausbeute von 92,6%. Diese Kristalle werden aus Äthylacetat/n-Hexan umkristallisiert. Die physikalischen Eigenschaften und die Ergebnisse der Elementaranlyse des erhaltenen Produkts sind nachfolgend angegeben.
F. 128-135°C
[a]D25 : -17,3 (C=l, Methanol)
Elementaranalyse: C23H26N207
ber.: (%) C 62,43 H 5,92 N 6,33 gef.: (%) C 62,82 H 5,96 N 6,40
Beispiel 30
5,00 g (16,82 mMol) N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl-L--asparaginsäure und 7,26 g (33,64 mMol) L-Phenylalanin-methylester-hydrochlorid werden in einem 100 ml fassenden Kolben durch Zugabe von wässrigem 1 n NaOH gelöst. Der pH wird auf einen Wert von 6,0 eingestellt.
Die erhaltene Lösung wird mit 2,0 g Thermolysin und 0,4 g Potato-Inhibitor vermischt und dann 5 Stunden bei 38 bis 40°C geschüttelt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit 100 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 8,11 g Kristalle vom F. 88 bis 92°C. Die Ausbeute beträgt 75,6% als Additionsverbindung von N-p-Methoxy--benzyloxycarbonylasparaginyl-phenylalaninmethylester und Phenylalaninmethylester (1:1).
Das Produkt wird aus Äthylacetat/n-Hexan umkristallisiert. Die physikalischen Eigenschaften und die Ergebnisse der Elementaranalyse der erhaltenen Kristalle sind im we5
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sentlichen identisch mit denjenigen der in Beispiel 26 hergestellten Additionsverbindung.
0,3 g der Additionsverbindung aus N-p-Methoxybenzyl-oxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester werden in einem 20 ml fassenden Kolben in 3 ml Aceton gelöst. Nach Zugabe von 2 ml 2,4 n HCl lässt man 1 Stunde bei 60°C reagieren.
Ein Teil des Reaktionsgemisches wird mit Wasser, wässrigem 1,2 n NaHCOg und Cyclohexanon als innerem Standard zu einer Probe vermischt. Die Umwandlung zu ac-L--Asparaginyl-L-phenylalaninmethylester wird durch Hochge-schwindigkeits-Flüssigchromatographie bestätigt. Die Ausbeute beträgt 72,7%.
Beispiel 31
0,3 g der in Beispiel 30 erhaltenen Additionsverbindung aus N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenyl-alaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester werden in einem 20 ml fassenden Kolben vorgelegt.
Gemäss Beispiel 30, jedoch unter Verwendung von Di-oxan anstelle von Aceton, werden die Zersetzung der Additionsverbindung und die Analyse des Produkts durchgeführt.
Die Ausbeute an a-L-Asparaginyl-L-phenylalaninmethyl-ester beträgt 73,0%.
Beispiel 32
Beispiel 31 wird unter Verwendung von Methanol anstelle von Dioxan wiederholt. Die Ausbeute an a-L-Asparagi-nyl-L-phenylalaninmethylester beträgt 63,3%.
Beispiel 33
Beispiel 31 wird unter Verwendung von N,N-Dimethyl-formamid anstelle von Dioxan wiederholt. Die Ausbeute an a-L-Asparaginyl-L-phenylalaninmethylester beträgt 28,1%.
Beispiel 34
Beispiel 31 wird wiederholt, wobei jedoch 4 ml Dioxan, 1 ml einer HCl-Dioxan-Lösung (5,3 n) und Triäthylamin als Neutralisationsmittel, anstelle von 3 ml Dioxan, 2 ml 2,4 n HCl bzw. wässrigem 1,2 n NaHC03 Verwendung finden. Die Ausbeute an a-L-Asparaginyl-L-phenylalaninmethylester beträgt 98,6%.
Beispiel 35
Beispiel 34 wird wiederholt, wobei jedoch die Reaktionsbedingungen 20 Minuten bei 90°C anstelle von 1 Stunde bei 60°C betragen. Die Ausbeute an a-L-Asparaginyl-L-phenyl-alaninmethylester beträgt 88,5%.
Beispiel 36
Beispiel 34 wird wiederholt, wobei jedoch 4,5 ml Dioxan und 0,5 ml HCl-Dioxan-Lösung (5,5 n) anstelle von 4 ml bzw. 1 ml verwendet werden, und wobei man die Umsetzung bei 90°C anstelle von 60°C durchführt. Die Ausbeute an a-L-Asparaginyl-L-phenylalaninmethylester beträgt 84,4%.
Beispiel 37
Beispiel 34 wird wiederholt, wobei jedoch 3 ml Dioxan und 2 ml HCl-Dioxan-Lösung (5,3 n) anstelle von 4 ml bzw. 1 ml verwendet werden, und wobei die Reaktionsbedingungen 120 Minuten bei 30°C anstelle von 1 Stunde bei 60°C betragen. Die Ausbeute an a-L-Asparaginyl-L-phenylalanin-methylester beträgt 98,6%.
Beispiel 38
Das Verfahren von Beispiel 34 wird wiederholt, wobei jedoch 4,5 ml Dioxan und 0,5 ml 60%ige Perchlorsäure anstelle von 4 ml Dioxan bzw. 1 ml der HCl-Dioxan-Lösung
(5,3 n) Verwendung finden. Die Ausbeute an a-L-Asparagi-nyl-L-phenylalaninmethylester beträgt 65,5%.
Beispiel 39
5 Beispiel 34 wird wiederholt, wobei jedoch 4,85 ml Dioxan und 0,15 ml konzentrierte Schwefelsäure anstelle von 4 ml Dioxan und 1 ml der HCl-Dioxan-Lösung (5,3 n) verwendet werden. Die Ausbeute an a-L-Asparaginyl-L-phenyl-alaninmethylester beträgt 89,9 %.
Beispiel 40
0,3 g der Additionsverbindung aus N-p-Methoxybenzyl-oxacarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und 15 L-Phenylalaninmethylester (1: 1), hergestellt in Beispiel 30, werden in 2 ml Dioxan gelöst. Nachdem man mit 3 ml Tri-fluoressigsäure versetzt hat, lässt man 1 Stunde bei 60°C reagieren.
Nachdem man das Reaktionsgemisch unter vermindertem 2o Druck eingedampft hat, versetzt man einen Teil hiervon mit Wasser, Triäthylamin und Cyclohexanon als innerem Standard. Die erhaltene Probe wird der Analyse mittels Hoch-geschwindigkeits-Flüssigchromatographie unterworfen. Die Ausbeute an a-L-Asparaginyl-L-Phenylalaninmethylester be-25 trägt 96,4%.
Beispiel 41
1,000 g der Additionsverbindung aus N-p-Methoxybenzyl-30 oxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester (1: 1), erhalten in Beispiel 30, 14 ml Dioxan und 4 ml HCl-Dioxan-Lösung (5,3 n) werden in einem 50 ml fassenden Kolben 1 Stunde bei 60°C gerührt. Nachdem man das Dioxan aus dem Reaktionsgemisch un-35 ter vermindertem Druck abdestilliert hat, versetzt man den öligen Rückstand mit 6 ml Wasser und 20 ml Diäthyläther unter Rühren. Anschliessend werden die beiden Phasen getrennt. Die wässrige Phase wird zusätzlich mit 10 ml Diäthyläther versetzt, um das Produkt in ähnlicher Weise, wie 40 vorstehend beschrieben, zu extrahieren. Die letzte Extraktion wird 3mal wiederholt.
Die Diäthylätherphasen werden gesammelt, hierauf 2mal mit 5 ml einer 5%igen wässrigen Natriumhydrogencarbo-natlösung gewaschen und dann mit wasserfreiem Magne-45 siumsulfat getrocknet. Nach Abdestillieren des Diäthyl-äthers unter vermindertem Druck erhält man 0,176 g (Ausbeute 81,2%) an rohem Anisalkohol.
Die wässrige Phase wird mit 7 %igem wässrigem Natriumhydroxid bis pH 6 neutralisiert und dann bei etwa 5°C so über Nacht gehalten. Die erhaltenen ausgeschiedenen Kristalle werden abfiltriert, mit 2 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 0,136 g (Ausbeute 68,5%) rohen L-Asparaginyl-L-phenylalaninmethylester.
Des Filtrat mit der Waschwasserfraktion wird mit 7%-55 igem wässrigem NaOH bis zum pH 9 versetzt; das Produkt wird hierauf mit 15 ml Dichlormethan 3mal extrahiert. Die Dichlormethanphasen werden gesammelt, mit 5 ml Wasser gewaschen und dann mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet.
60 Nach dem Abdestillieren des Dichloräthans unter vermindertem Druck erhält man 0,234 g (Ausbeute 83,4%) rohen L-Phenylalaninmethylester.
65 Beispiel 42
1,189 g (4 mMol) N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl-L--Asparaginsäure und 1,837 g (8 mMol) L-Phenylalaninäthyl-ester-hydrochlorid werden in einem 30 ml fassenden Kolben
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durch Zugabe von wässrigem 1 n,NaOH bis zum pH-Wert 6,0 gelöst.
Hierauf versetzt man mit Wasser bis zu einer Gesamtmenge vonl5ml. Nachdem man die erhaltene Lösung mit 0,1 g Thermolysin versetzt hat, wird das Gemisch 7 Stunden bei 38 bis 40°C gerührt.
Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert, mit 30 ml Wasser gewaschen und getrocknet, Hierbei erhält man 2,401 g (Ausbeute 90,2%) der Additionsverbindung aus N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylala-ninäthylester und L-Phenylalaninäthylester (1: 1). Dies wird durch die nachfolgend angegebenen Analysendaten bestätigt.
Das Produkt wird aus einem Lösungsmittelgemisch aus Methanol und Diäthyläther umkristallisiert. Die physikalischen Eigenschaften und die Ergebnisse der Elementaranalyse sind nachfolgend angegeben.
F. 82-87°C
[a]D25 : +6,0 (C = 1, Methanol)
Elementaranalyse: C35H4aN3O10
ber.: (%) C 63,14 H 6,51 N 6,31
gef.: (%) C 63,52 H 6,57 N 6,54
Diese IR- und NMR-Daten zeigen, dass es sich bei dem Produkt um die Additionsverbindung der Formel I handelt, in der Rx, R2, R3 und n eine p-Methoxybenzyloxycarbonyl-gruppe, Benzylgruppe, Äthoxygruppe bzw. den Wert 1 bedeuten.
Beispiel 34 wird wiederholt, wobei jedoch die erhaltene Additionsverbindung anstelle der Additionsverbindung aus N-p-Methoxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethyl-ester mit L-Phenylalaninmethylester verwendet wird. Hierbei erhält man den L-Asparaginyl-L-phenylalaninäthylester. Die Ausbeute an a-L-Asparaginyl-L-phenylalaninäthylester beträgt 95,5%.
Beispiel 43
1,189 g (4 mMol) N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl-L--asparaginsäure und 1,725 g (8 mMol) DL-Phenylalanin-methylester-hydrochlorid werden in einem 30 ml fassenden Kolben durch Zugabe von wässrigem 1 n NaOH bis zum pH-Wert 6,0 gelöst. Hierauf versetzt man mit Wasser bis zu einer Gesamtmenge von 15 ml. Nachdem man die erhaltene Lösung mit 0,1 g Thermolysin vermischt hat, wird das Gemisch 50 Minuten bei 38 bis 40°C gerührt.
Der Niederschlag wird abfiltriert, mit 30 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man'2,109 g Kristalle vom F. 119 bis 128°C. Das Produkt wird aus einem Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat und n-Hexan umkristallisiert und dann 7 Stunden unter vermindertem Druck bei 80°C getrocknet. Bei dem Produkt handelt es sich um die Additionsverbindung aus N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl--L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und D-Phenylalaninmethylester (1 : 1) in Form des Halbhydrats. Dies wird durch die nachfolgend angegebenen Analysendaten bestätigt.
F. 131 bis 133°C [a]D25 : -4,2 (C= 1, Methanol)
Elementaranalyse: (C33H39N3OU,. 3^H20)
ber.: (%) C 61,29 H 6,23 N 6,50 gef.: (%) C 61,50 H 6,12 N 6,49
Das IR- und NMR-Spektrum zeigen die gleichen charakteristischen Merkmale wie bei der Additionsverbindung der Formel I, hergestellt in Beispiel 26, in der R2, R2, R3 und n eine p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe, Benzylgruppe, Methoxygruppe bzw. den Wert 1 bedeuten, wobei jedoch die Absorptionen infolge der Protonen des Wassers und infolge der Protonen der -NH- und NH+3-Gruppen nach 4,1 ppm verschoben sind, und zwar wegen der durch die Anwesenheit von Wasser verursachten Störungen, weil das Produkt Kristallwasser enthält, wie nachfolgend dargelegt. 1,5024 g des Produkts werden zur Trocknung dieser Probe 12 Minuten in einem Mikrowellenerhitzer mit einer Frequenz von 2,45 GHz und einer Leistung von 1,2 kW bestrahlt. Hierdurch vermindert sich das Gewicht der Probe auf 1,48152 g. Der Trocknungsverlust beträgt somit 0,02091 g.
Die Elementaranalyse der bestrahlten Probe bringt folgendes Ergebnis:
fur: C33H39N3O10
ber.: (%) C 62,15 H 6,16 N 6,69 gef.: (%) C 62,07 H 6,17 N 6,69
Das IR- und NMR-Spektrum der bestrahlten Probe besitzt die gleichen charakteristischen Merkmale wie bei der Additionsverbindung der Formel I, hergestellt in Beispiel 26.
1,0 g der bestrahlten Probe werden mit 4 ml Wasser und 2 ml 1 n HCl vermischt. Das erhaltene Gemisch wird hierauf 3 Minuten bei 60°C gemischt. Nach der Fest-Flüssig--Trennung der erhaltenen Aufschlämmung isoliert man den N-p-Methoxycarbonyl-L-phenylalaninmethylester und den D-Phenylalaninmethylester im Molverhältnis 1: 1 aus der festen bzw. der flüssigen Phase.
Beispiel 34 wird wiederholt, wobei jedoch 0,3 g der erhaltenen Additionsverbindung (Halbhydrat anstelle der in Beispiel 30 erhaltenen Verbindung) verwendet werden. Die Ausbeute an a-L-Asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und D-Phenylalaninmethylester beträgt 95,9 .
Beispiel 44
0,3 g der Additionsverbindung aus N-p-Methoxybenzyl-oxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und L-Phenylalaninmethylester (1: 1), hergestellt in Beispiel 30, werden in 10 ml HCl-Chloroform-Lösung (0,31 n) gelöst. Hierauf lässt man 2 Stunden bei 60°C reagieren. Nach Abdestillieren der flüssigen Bestandteile unter vermindertem Druck versetzt man den Rückstand mit Wasser, Triäthylamin und Cyclohexanon als innerem Standard. Die erhaltene Probe wird der Analyse mittels Hochgeschwindigkeits- Flüssigchromatographie unterworfen. Die Ausbeute an a-L--Asparaginyl-L-phenylalaninmethylester beträgt 94,3%.
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Claims (3)
- ?1O O NH O Ol--C-CH-NH_ • HOC- (CH_) -CH-C-NH-CH-C-R.. 3,2 2 n , J(I)abzuscheiden,(b) Abtrennung der Additionsverbindung vom wässrigen Medium,(c) Umsetzung der Additionsverbindung mit einer Säure zur Zersetzung der Additionsverbindung und(d) Gewinnung des Dipeptidesters aus den Zersetzungsprodukten.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung der Formel (VI) in LL-Form gewonnen wird.3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Additionsverbindung vor ihrer Umsetzung mit Säure gemäss Schritt (c) in einem organischen Lösungsmittel gelöst wird.4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel ein Keton, Dioxan, Tetra-hydrofuran, ein chlorierter niederer Kohlenwasserstoff, ein nicht-protonisches polares organisches Lösungsmittel, ein Ester oder ein Alkohol ist.Es ist bekannt, dass Proteasen, wie Papain und Chymo-35 trypsin, zum Aufbau von Peptidbindungen als Umkehrreaktion der Proteinzersetzung Verwendung finden. So erfolgte z.B. nach Bergmann die Herstellung von Aniliden unter Verwendung von Papain, und die Peptidsynthesen unter Verwendung von Monoaminomonocarbonsäuren, wie Leucin 40 mit N-ständiger Benzoylschutzgruppe und Leucin und Glycin, beide mit C-ständiger Amid- oder Anilidschutzgruppe, gelang Fruton mit Papain und Chymotrypsin [Advances in Protein Chemistry, Bd. 5, S. 33 (1949), Academic Press Inc. New York, N.Y.].45 Kürzlich wurde von Peptidsynthesen unter Verwendung von Aminosäuren mit N-ständiger Benzyloxycarbonylschutz-gruppe und Aminosäuren mit C-ständiger Estergruppe mit Enzymen, wie Papain, Prolisin, Subtilisin BPN', usw. berichtet [Abstracts of the 35th Autumn Conference of the so Chemical Society of Japan, S. 482 und 486 (1976)].In diesen Verfahren werden die Produkte in wässrigem Medium als wasserunlösliche Produkte abgeschieden, die durch den Verlust wasserlöslicher Gruppen entstehen (dies ist erforderlich, um die reversible Reaktion in Richtung der 55 Peptidbildung zu zwingen). Wenn demgemäss eine wasserlösliche Gruppe in dem Reaktionsprodukt noch erhalten bleiben soll, wie dies z.B. der Fall ist, wenn man die Aminosäuren mit einer zweiten Carboxylgruppe in der Seitenkette (z.B. Asparaginsäure oder Glutaminsäure) als Ausgangs-60 Verbindung verwendet, scheint es erwünscht zu sein, die wasserlösliche Gruppen der Ausgangsverbindung mit einer weniger hydrophilen Schutzgruppe zu maskieren.Erfindungsgemäss wurde nun gefunden, dass bei Verwendung von Monoaminodicarbonsäuren, wie Asparaginsäure 65 und Glutaminsäure, die eine N-ständige Schutzgruppe besitzt, als Ausgangsverbindungen die erhaltenen Dipeptide selbst jedoch nicht abgeschieden werden, und dass bei Wahl bestimmter Aminosäuren mit einer C-ständigen Estergruppe
- 3643532(Aminocarbonsäureester) als andere Ausgangsverbindungen die Abscheidung von Additionsverbindungen aus den Dipepti-den, bei denen es sich um enzymatische Reaktionsprodukte handelt, und den Aminosäureestern erfolgt.Es ist bekannt, dass Peptidderivate verschiedene physiologische Aktivitäten besitzen, und diese Peptidderivate können nach verschiedenen Methoden hergestellt werden. Die Peptide mit einem sauren Aminosäurerest, wie a-L-Aspara-ginylphenylalanin-niederalkylester, die sich als Süssmittel eignen, können aus einer Vorstufe mit einer Benzyloxycar-bonylgruppe als N-ständige Schutzgruppe durch Abspaltung der Schutzgruppe erhalten werden.Die Peptide mit N-ständiger Schutzgruppe, wie N-Ben-zyloxycarbonyl-L-a-glutamylphenylalanin-niederalkylester, können leicht zu Peptiden mit freier C-ständiger Carboxyl-gruppe hydrolysiert werden, und diese hydrolysierten Peptide werden als Substrate zur Messung der enzymatischen Aktivität von Carboxypeptidasen verwendet.Die N-geschützten oder -ungeschützten Dipeptidester können durch Umsetzung von sauren Aminosäureanhydriden mit einer geschützten oder ungeschützten Aminogruppe mit Aminosäurealkylestem erhalten werden (bekanntgemachte JA-PA 14217/74 und JA-OS 61451/73, 76835/73, 58025/75 und 71642/75).Die gewünschten Dipeptidester können jedoch nicht in einfacher Weise nach den üblichen Verfahren erhalten werden, da nach diesen Verfahren neben den gewünschten Dipeptidestern zwangsläufig auch Dipeptidester mit Peptidbin-dungen an den seitenständigen Carboxylgruppen der sauren Aminosäuren entstehen.
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