CH638562A5 - Process for obtaining a cleavage product of rabies virus - Google Patents

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CH638562A5
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Behringwerke Ag
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Description

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Spaltprodukt des Tollwut-Virus, das nach dem geannnten Verfahren gewonnen wird. Das erfindungsgemäss gewonnene Spaltprodukt kann als wirksamer Bestandteil in einem Impfstoff verwendet werden.
Zur Gewinnung des Spaltproduktes geht man zweckmässig von einem in der Zellkultur gezüchteten Tollwut-Virus aus. Der Charakter des Virus-Stammes spielt keine entscheidende Rolle. Auch der Charakter der für die Züchtung verwendeten Zellkultur ist von untergeordneter Bedeutung. Bewährt hat sich in einer grösseren Zahl von Experimenten eine Züchtung des ERA-Tollwut-Virus-Stammes in einer Kultur von BHK-21-Zellen. Die Züchtung des Tollwut-Virus in Zellkulturen ist bekannt.
Die Spaltung des Virus mit einem nicht-ionischen oberflächenaktiven Stoff ist ebenfalls bekannt. Die Art ihrer Durchführung ist für die Gewinnung der erfindungsgemäss weiterzuverarbeitenden Glycoprotein-Fraktion nicht entscheidend, sofern sie nur zu einer ausreichenden Spaltung des Virus führt. Vorzugsweise erfolgt die Spaltung durch Einwirkung einer Lösung, die etwa 0,2 bis 5% eines nicht-ionischen oberflächenaktiven Stoffes enthält, bei einer Temperatur von 5 bis 35°C während 10 Minuten bis 6 Stunden.
Die Isolierung der Glycoprotein-Fraktion aus dem Spaltansatz kann beispielsweise auf elektrophoretischem Wege erfolgen. Es kann aber auch das Nucleoproteid durch Zentri-fugierung bei hohen g-Werten abgeschieden werden und der Überstand umittelbar der nachfolgenden Auftrennung nach isoelektrischen Punkten unterworfen werden. Zweckmässig wird dieser Überstand zuvor einer Dialyse unterworfen, um niedermolekulare Bestandteile abzutrennen.
Die so erhaltene Glycoprotein-Fraktion, die in etwa 0,05-0,4%iger wässriger Dispersion vorliegt, wird sodann in Fraktionen unterschiedlicher isoelektrischer Punkte aufgeteilt. Hierfür eignen sich Verfahren, die die Auftrennung von Poly-peptid-Gemischennach ihren isoelektrischen Punkten ermöglichen. Besonders vorteilhaft ist die als «isoelektrische Fokussierung» bekannte Arbeitsmethode, bei der in einer Flüssigkeitssäule mit Hilfe geeigneter zwitterionischer Verbindungen wie Polyamino-Polycarboxy-Alkanen (Ampho-lite) ein pH-Gradient aufgebaut wird und in diesem eine Auftrennung des auf die Säule gegebenen Gemisches erfolgt.
Die Säule zur isoelektrischen Foskussierung wird mit einer etwa 0,2-5%igen Lösung einer zwitterionischen Verbindung, zweckmässig in einem Dichtegradienten, z.B. einem solchen von 0-50% einer nicht-ionischen wasserlöslichen Verbindung wie einer Polyhydroxyverbindung, vorzugsweise eines Poly-sacharids beschickt. Die Fokussierung erfolgt in einem solchen System unter einer elektrischen Spannung, die der für die Säule optimalen Spannung entspricht, während etwa 24 Stunden bis etwa 8 Tage.
Im Anschluss an die isoelektrische Fokussierung wird der Säuleninhalt in Fraktionen aufgetrennt. Die Bestandteile der G-Fraktion konzentrieren sich in 3 Bereichen um die pH-Werte 4,5; 7,0 und 8,0. Die Fraktion entsprechend einem pH-Wert von 7,0 (etwa 6,8 bis 7,4) wird getrennt aufgefangen. Sie enthält in reiner Form das erfindungsgemässe Spaltprodukt frei von anderen hochmolekularen Bestandteilen. Zur Abrennung der bei der isoelektrischen Fokussierung und den vorausgehenden Operationen angewandten Hilfsstoffe kann sie einer weiteren Reinigung, z.B. durch Dialyse, Sedimentation, Chromatographie oder Zentrifugierung unterworfen werden.
Die das Spaltprodukt enthaltende Fraktion kann, um ihre Haltbarkeit oder Wirksamkeit zu erhöhen, mit bekannten Adjuvantien und Stabilisatoren versetzt und/oder lyophilisiert werden.
Beispiel
Eine Tollwutvirus-Kultur (ERA-Stamm) wurde in BHK-21 -Zellen plaque-geklont.
Die Virusvermehrung wurde in Rollkulturen von BGK-21-C-13-Zellen vorgenommen. Die Kulturbedingungen sind in Schneider, L.G., M. Horzinekund H.D. Matheka, 1971, «Purification of rabies virus from tissue culture», Arch. ges. Virusforsch. 34:351-359 beschrieben. Die infektiösen Zellkulturflüssigkeiten und infizierten Zellen wurden abgeerntet, nachdem eine deutliche cytopathologische Wirkung (CPE) offenbar war.
Die Viren aus dem geklärten Überstand wurden 120 Minuten bie 4°C in einem Beckman -R-19-Rotor bei 19000 U./min. abgeschleudert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet über Nacht in einer geringen Menge 0.15M NaCl, 0,01M Tris-HCl von pH 7,4,0,001 EDTA-(STE)-Puffer eluiert. Das Eluat wurde durch langsames Zentrifu-gieren geklärt, auf einen vorgeformten 10-50%igen (Gew./ Vol.) Sucrose-Gradienten geschichtet und 90 Minuten bei 4°C in einem Beckman-SW-27-Roter bei 25 000 U./min. zen-trifugiert. Die Virusbande wurde gesammelt und reichlich gegen STE-Puffer dialysiert. Die Behandlung der Tollwutviren mit Triton X-100 wurde im Prinzip wie bei Helenius und Söderlund «Stepwise dissociation ofthe semliki forest virus membrane with Triton X-100», Biochem. Biophys. Acta
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307:287-300, beschrieben, vorgenommen. Zu einer Suspension von 5 mg Tollwutviren in 5 ml ST-Puffer wurde Triton X-100 bis zur einer Endkonzentration von 1 % zugesetzt (Protein: Triton-Verhältnis 1:10). Die Mischung wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur gehalten und dann im Eisbad s abgekühlt. Die immer noch trübe Lösung wurde 60 Minuten bei 4°C in einem Beckman-SW-65-Rotor bei 45 000 U./min. zentrifugiert. Der Überstand wurde zurückgehalten und das Pellet wieder im ST-Puffer, der2M LiCl und 5 mg/ml Digi-tonin enthielt, suspendiert. Die Suspension wurde 30 io
Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und 60 Minuten bei 4°C im Beckman-S W-65-Rotor bei 45 000 U./min. zentrifugiert. Der Überstand wurde aufbewahrt und das Pellet verworfen.
Der nach Zentrifugieren bei 120 000 x g gewonnene Über- is stand von mit Triton X-100 behandelten Viren wurde aus-
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giebig gegen l%iges (Gew./Vol.) Glycin und l%iges (Gew./ Vol.) Glycerin in dest. Wasser dialysiert. Nach Zugabe von 1% Ampholine(R), pH 3,5 - 10, (LKB, Uppsala, Schweden) wurde derTriton-X-100-Extrakt 10 Minuten bei 5000 x g geklärt und eine Probe von 5 ml wurde auf einen 5-40%igen (Gew./Vol.) Sucrose-Gradienten geschichtet, der 0,1 % Triton X-100 und 1% Ampholin von pH 3,5-10 enthielt. Die Zubereitung wurde 72 Stunden in einer LKB-Säule von 110 ml wie bei Friesen et al. beschrieben elektrofokussiert (Friesen, A.D., J.C. Jamieson und F.E. Ashton, 1971, «Effect of nonionic detergent on fractionation of proteins by isoelectric focu-sing», Anal. Biochem. 41:149-157). Anschliessend wurde der Gradient fraktioniert, die pH-7-Fraktion gesammelt und 2 Tage ausgiebig gegen dest. Wasser dialysiert, um die Triton-X-100-Konzentration zu verringern und Ampholin sowie Sucrose zu entfernen, und schliesslich lyophilisiert.
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Claims (3)

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1. Verfahren zur Gewinnung eines Spaltproduktes des Tollwut-Virus, dadurch gekennzeichnet, dass man die aus dem Virus durch Spaltung mit einem oberflächenaktiven Stoff erhaltene Glycoprotein-Fraktion einer Auftrennung in Fraktionen unterschiedlicher isoelektrischer Punkte unterwirft und die Fraktion mit einem isoelektrischen Punkt zwischen 6,8 und 7,4 isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Auftrennung durch isoelektrische Fokussierung erfolgt.
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PATENTANSPRÜCHE
3. Spaltprodukt des Tollwut-Virus, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1.
Es ist bekannt, das Tollwut-Virus einer Spaltung zu unterwerfen, bei der eine Reihe von Spaltprodukten entsteht. Die Spaltung wird insbesondere mit Hilfe nicht-ionischer oberflächenaktiver Stoffe, z.B. Triton X 100 (Reaktionsprodukt aus 1 Mol t-Octylphenol und 9 bis 10 Mol Äthylenoxyd) ausgeführt. Die wichtigsten Produkte dieser Spaltung, die sich elektrophoretisch isolieren lassen, sind eine Nucleoprotein-Fraktion (N), eine Glycoprotein-Fraktion (G) und zwei Fraktionen, die im wesentlichen aus Membran-Proteinen bestehen (Mi und M2). Es ist auch bekannt, dass die immuno-gene Wirkung nach der Spaltung in der Glycoprotein-Fraktion (G) erscheint. Diese Fraktion wurde bisher aufgrund ihres elektrophoretischen Verhaltens als einheitlich angesehen.
Es wurde nun gefunden, dass die G-Fraktion einer weiteren Aufspaltung zugänglich ist, wobei sich wiederum die immunogene Aktivität in einer Fraktion isolieren lässt, wenn man die diese Fraktion bildenden Glycoproteine einer Selektierung hinsichtlich ihrer isoelektrischen Punkte unterwirft.
In diesem Sinne ist der Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung eines Spaltproduktes des Tollwut-Virus, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man die in bekannter Weise durch Spaltung mit einem oberflächenaktiven Stoff des Tollwut-Virus erhaltene Glycoprotein-Fraktion in Fraktionen unterschiedlicher isoelektrischer Punkte auftrennt und diejenigen Fraktion isoliert, die einem isoelektrischen Punkt von etwa 7 entspricht.
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