DD228737A1 - Verfahren zur herstellung von influenza-inaktivimpfstoffen mit geringer stammabhaengigkeit - Google Patents
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Abstract
Es wird ein Verfahren zur Herstellung neuartiger Influenza-Inaktivimpfstoffe zur Anwendung im Bereich der Human- und Veterinaermedizin beschrieben. Das Ziel der Erfindung ist die Entwicklung von Influenza-Inaktivimpfstoffen, deren Schutzwirkung sich unabhaengig vom verwendeten Produktionsstamm auf mehrere Varianten des Influenzavirus erstreckt. Das Wesen der Erfindung besteht darin, dass spezielle Antigendeterminanten der leichten Kette des Haemagglutinins (HA2), die bei allen Typen und Subtypen des Influenzavirus nahezu identisch sind, durch das erfindungsgemaesse Verfahren durch Modifikation des HA-Gesamtmolekuels freigelegt bzw. in eine Form gebracht werden, in der sie ihre immunogenen Eigenschaften entfalten koennen. Dabei wird entweder durch Einwirkung von geeigneten Proteasen oder durch reduzierende und/oder proteindesintegrierende Substanzen die schwere Kette (HA1) des HA-Molekuels voellig oder zum ueberwiegenden Teil von der HA2-Kette getrennt, so dass die biologisch als Fusionsfaktor wirkenden Determinaten der HA2-Kette freigelegt werden.
Description
Verfahren zur Herstellung von Influenza-Inaktivimpfsteifen mit geringer Stammabhängigkeit
Die Erfindung "betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Influenza-Inaktivimpfstoffen, die eine vom verwendeten 'Impfstamm unabhängige S'chut'zwirkung auslösen und daher für die InfluensaiiHsunprophylaxe beim Menschen und bei Tieren unabhängig von der epidemiologischen Situation anwendbar sind.
V""' Bei den bekannten und beschriebenen Methoden zur Herstellung von Influenza-Inaktivimpfstoffen wird der Erreger der Influenza (Orthomyxovirus influenzae) zunächst in embryonierten Hühnereiern zur Vermehrung gebracht, wobei seiche Stämme des Influenzavirus verwendet werden, die in der Struktur der Antigendeterminanten der CberflachenglykoDrcteine Hämagglutinin (HA) und ITeuraminidase (ITA) zum aktuellen Stamm eine möglichst enge Verwandtschaft aufweisen. Das auf diese Weise vermehrte Influenzavirus wird danach durch Einwirkung chemischer Agenzien oder durch physikalische Einflüsse in eine nicht mehr vermehrungsfähige Form überführt und anschließend mittels physikalischer Verfahren, vorzugsweise Dichtegradientenzentrifugation, kcnzen-
triert und gleichzeitig von den aus dem Brutei stammenden Begleitstoffen weitgehend befreit.
Das auf diese Weise gereinigte und konzentrierte Virusmaterial kann nach Einstellung auf die für die Stimulierung der Immunantwort erforderliche Viruskonzentration, gegebenenfalls nach Zugabe eines Adjuvans, direkt zu einem Impfstoff verarbeitet werden. Impfstoffe dieses Typs, sog. Vollvirusoder Tirionenimpf stoff e , befinden sich seit vielen Jahren in der Anwendung.
Andere Typen von in Anwendung befindlichen Influenza-Inaktivimpfstoffen, sind die Spalt- -und Subeinheitenimpfstoffe. Bei diesen wird das gereinigte und konzentrierte Virusmaterial zusätzlichen Produktionsschritten unterworfen, wobei
|| entweder durch Einwirkung von oberflächenaktiven 'Substanzen die für die Auslösung der Immunantwort verantwortlichen' · . Oberflächenglykoproteine HA und NA vom Restvirus abgelöst " und danach isoliert werden, oder bei denen durch die Einwirkung von Lipidlösungsmitteln eine völlige Solubilisierung der Viruspartikel und die weitgehende Entfernung der Lipide der äußeren Virusmembran erfolgt. Die immunologische Wirkungsweise von Inaktivimpfstoffen ist, unabhängig vom gewählten Verfahren, nahezu identisch. Sie beruht in erster Linie auf der Stimulierung der humoralen Immunantwort. Dabei ?;erden -vorwiegend Antikörper gebildet, die gegen Antigendeterminanten der Oberflächenglykoproteine EA und' 2TA gerichtet sind. Obwohl die gegen die ITA gerichteten Antikörper durch die Beeinflussung der letzten Phase der Virus-Zellbeziehung, der Virusausschleusung, einen Einfluß auf die Virusverbreitung im Organismus ausüben, besitzen die gegen das HA-Antigen. gerichteten Antikörper für die Protektivität die größere Bedeutung. Es ist bekannt, daß das HA-Molekül, zwei Polypeptide, eine
; schwere (HA1) und eine leichte (HA2) Kette aufweist, die durch Disulfidbrücken verbunden sind. Das C-esamtmolekül ist durch das proximale Ende der leichten Kette in der Lipiddoppelmembran der Virushülle verankert, während das dista-Ie Ende mit der schweren Kette identisch ist.
äach der Immunisierung mit den genannten Typen von Inaktivimpfstoffen werden Antikörper gebildet, die gegen Antigendeterrainanten der schweren Kette gerichtet sind. Diese Antikörper besitzen u.a. auch virusneutralisierende Eigenschaften. Diese Antigendeterminanten der schweren Kette sind infolge der molakularbiοlogisch, determinierten Variabilität des Influenzavirus einem ständigen, im Shift- und Driftphänomen ihren Ausdruck findenden Veränderungen unterworfen. Daraus erwächst die Notwendigkeit einer ständigen Aktualisierung der zur ImpfStoffherstellung verwendeten Stämme an die jeweilige epidemiologische Situation und die Gefahr, daß im Falle einer Veränderung der Antigenstruktur der kursierenden Epidemiestämme oder beim Auftreten völlig neuer, für den Menschen bisher nicht als pathogen bekannte:' Antigenvarianten, diese bei der Impfstoffzusammensetzung nicht berücksichtigt werden konnten, so dai3 ein wirksamer Schutz durch die Impfung nich"i; erzielt werden kann.
Ziel der Erfindung:
Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Inaktivimpfstoffen, die im Gegensatz zu den nach bisher bekannten und beschriebenen Verfahren, eine von den verwendeten Impfstämmen unabhängige Wirksamkeit aufweisen. " "*) Das soll auf der Grundlage von antigenen Determinanten des KA erfolgen, die bei allen 'Typen und Subtypen des Influenzavirus identisch sind und die durch das erfindungsgemäJ3.e Verfahren durch Modifikation des HA-Gesamtmolekuls freigelegt bzw. in eine E'orm gebracht werden, in der sie ihre immunogenen Eigenschaften entfalten können.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Influenza-Inaktivimpfstoffen zu entwickeln, die einen vom verwendeten. Impf stamm und der je- ·. weiligen epidemiologischen Situation unabhängigen-Schutz nach ihrer Anwendung bei Mensch und Tier vermitteln oder die zumindest geeignet sind, nach einer Infektion mit dem Influenzavirus die Krankheitsdauer und den Schweregrad der Erkrankung nachhaltig zu beeinflussen. Das soll auf der Grundlage von antigenen Determinanten des Hämagglutinins (HA) erfolgen, die allen bisher bekannten Typen und Subtypen gemeinsam sind.
Es.wurde nun gefunden, daß nach der Infektion des Menschen mit einem Myxovirus influenzae Antikörper gebildet werden, die gegen die am proximalen Ende der leichten Kette lokalisierten und funktionell als Pusionsfaktor wirksamen Peptidsequenzen gerichtet sind und die, da diese Sequenzen bei allen Influenzaviren identisch sind,, eine von der aktuellen Erregervariante unabhängige Hemmung der Virusvermehrung durch die· Verhinderung der Fusionierung der Virusmembran mit der Zellmembran auslösen. ' Es wurde weiterhin gefunden,daß diese Antikörper nicht nur nach einer natürlichen Infektion gebildet werden, sondern auch nach Immunisierung mit Impfstoffen, die als wirksames Prinzip die nach besonderer Behandlung freigelegten antigenen Determinanten des Amino-terminalen Endes der leichten Kette des Hämagglutinins enthalten.
Als"Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet man durch an sich bekannte Verfahren konzentrierte und gereinigte Suspensionen eines Stammes des Influenzavirus, der sich durch besonders hohe Vermehrungsfähigkeit im embryonierten Hühnerei auszeichnet oder isoliertes reines HA, das ebenfalls durch an sich bekannte Verfahren gewonnen wurde.
Nach Inkubation dieser Virussuspension oder des isolierten reinen HA im schwach sauren Milieu im Bereich von pH 4.5
bis 5.8, vorzugsweise bei pH 5.2 für eine Dauer von 2 bis 30 Minuten, vorzugsweise 10 Minuten und der sich anschließenden Einstellung auf den neutralen pH-Bereich, wird die schwere Kette entweder völlig oder zum überwiegenden Teil durch die Einwirkung einer Protease-vom Typ des Trypsins oder durch die Auflösung der die schwere und leichte Kette verbindenden Disulfidbrücke mittels reduzierender Substanzen nach vorheriger Molekülauffaltung von der leichten Kette getrennt. Als reduzierende Substanz können 8ulfhydril(=SH)-Verbindungen, wie z.B. Mercaptoäthanol und zur Proteinauffaltung strukturbrechende Substanzen-, wie z.B. Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid, verwendet werden.
Bei der Anwendung bestimmter Substanzen, wie z.B. i-Iatriumtrichlorazetat in Kombination mit Mercaptoäthanol kann auch die Ablösung der schweren Kette ohne vorherige Inkubation im sauren Bereich erfolgen. Es kann aber auch die Abspaltung " des .größten Teils der schweren Kette durch Proteasen, die unter sauren Bedingungen wirken, direkt bei niedrigen pH- ' Werten "erfolgen.
Im Falle der Abspaltung der schweren Kette am sonst intakten Viruspartikel kann vorzugsweise die Abtrennung durch Zonalzentrifugation im saccharosehaltigen Dichtegradienten erfolgen. Dabei werden die für die Realisierung des erfi^dur~sgemä-ßen Verfahrens benötigten Fraktionen mit den modifizierten Viruspartikeln in dem Teil des Gradienten angereichert dessen Saccharosekonzentration der Dichte dieser Partikel entspricht. Ss ist aber auch möglich, die nach bekannten Verfahren gereinigte und konzentrierte Virussuspension auf einen Gradienten aufzubringen, der außer Saccharose auch die reduzierenden Substanzen enthält, 1Om dadurch die Abst:altu-~ des HA1 zu bewirken.
v7ird die Abtrennung des HAI vom HA2 an isoliertem HA durchgeführt, dann ist die Isolierung des HA2 vorzugsweise durch Gelchromatographie durchführbar, wobei für die Trennung solche Substanzen eingesetzt werden, die gine Trennung dieser Polypeptide auf der Grundlage ihrer unterschiedlichen Molekulargewichte (HAI : 75000, HA2 : 25000) oder Polarität erlauben.
Bei der Verwendung von Virusmaterial, bei dem die F'reilegung des HA2 am sonst intakten Virion erfolgt, kann die Weiterverarbeitung zu einem Impfstoff direkt oder nach Zugabe einer- die Immunantwort verstärkenden Substanz erfolgen. Wird die Abspaltung des HA2 -vom·HA1 am isolierten KA-MoIe-'-kül vollzogen, dann ist die Inkorporation des isolierten HA2 in Liposomen oder seine Kopplung an ein geeignetes Makromolekül, welches keine sensibilisierenden Eigenschaften entfaltet, für die Immunogenität vorteilhaft. Das gleiche gilt auch, wenn die an sich bekannten Polypeptidsequenzen des HA2 auf gentechnologischem oder völlig synthetischem Wege dargestellt werden.
Beispiel 1:
10 - 11 tägige Hühnerembryonen werden mit 1000 mittleren Ei-infektiösen Dosen (SID1-,-,) eines definierten Influenzastammes, z.B. A/PR/8/34> -izi einem Inokulationsvolumen von 0.1 ml intraallantoidal infiziert und 48 Ii bei 330C bis-350C inkubiert. Danach werden die virushaltigen Allantoisflussigkeiten gevronnen und vereinigt· Nach Entfernung zellulärer Verunreinigungen durch Zentrifugation (1500 g, 20 min) v;ird das Virusmaterial durch Einleiten in-einen mit einem kontinuierlichen Saccharosegradienten (0 % - 60 % ) beladenen Durchflußzonalrotor gereinigt und konzentriert. Das Virusmaterial wird in den Fraktionen, deren Saccharosekonzentration der Dichte des Influenzavirus entspricht, weitgehend rein erhalten. Durch Pelletierung oder Dialyseverfahren kann der Saccharösegehalt des Virusmaterials vermindert oder gänzlich entfernt werden. Die Virussuspension wird nunmehr, nachdem', der Proteingehalt durch geeignete Verfahren, z.B. nach Lowry bestimmt wurde, mit phosphatgepufferter ilatriumchloridlösung so'verdünnt, daß eine Proteinkonzentration von 5-10 mg/ml resultiert.
Durch Zugabe einer schwachen organischen Säure, z.3, Zitronensäure, wird der pH-Werf dieser Suspension auf 5.2 eingestellt, 10 min bei diesem Wert belassen und danach, z.3. mit !Tatriumhydrogenphosphat, auf einen pH-'»7ert von 7.2 zurückgestellt. Danach wird 30 min mit Trypsin, (mit einer spezifischen Aktivität von ca. 40 "J/mg) im Verhältnis von 1:15 (1 mg Trypsin pro 15 mg Virusprotein) bei 370C inkubiert, die Reaktion mit einem geeigneten Trypsininhibitor gestoppt und 90 min bei 5°C in einem Schwerefeld von 75000 g zentrifugiert. Die "weitgehend vom HAI befreiten Viruspartikel befinden sich im Sediment, das nach zweimaliger Waschung mit phosphatgepufferter !Tatriumchloridlösung und entsprechender Verdünnung zu einem Impfstoff verarbeitet wird.
Eine Virussüspehsion, die analog sum Beispiel 1 hergestellt und der Behandlung bei niedrigen pH-Werten unterzogen wurde, wird mit Harnstoff und 2-i,Iercaptoä~hanoi versetzt (Endkonzentration an Harnstoff 4.5 H, 2-rJerca'ptoäthanol 0.4'Li, Protein 40 mg/ml) und 60 min bei 370C inkubiert. Durch Verdünnen mit isotonischer ilatriumchloridlösung wird danach die Konzentration des 2-ivIercaptoäthano! unter 0.1 M gesenkt. Danach werden die weitgehend vom HA1 befreiten Virionen entsprechend Beispiel 1 pellettiert., gewaschen und zu einem Impfstoff verarbeitet.
Eine Virussuspension, die analog sum Beispiel 1 hergestell" wurde, wird im Saccharosegradienten oder im Batch-Terfahrerjmit einem geeigneten anionischen (s.B. ITatriumcesoirrcholat) oder neutralen Detergens (s.B. Triton Σ-IGC) behandelt, so daß eine Trennung der Cberfiäcnenglvkoproteine HA
und HA vom Restvirus erfolgt. Das in der entsprechenden Gradientenfraktion "bzw. im Überstand befindliche HA wird, durch Säulenchromatographie gereinigt. Die ggf. eingeengte Lösung wird mit Harnstoff und 2-Mercaptoäthanol entsprechend Beispiel 2 versetzt und die Subeinheiten in bekannter Weise isoliert.
Claims (6)
- Patentansprüche1. Verfahren zur !Herstellung'von inaktivierten Influenzaimpf stoffen, die aufgrund gemeinsamer und vom jeweils verwendeten Virusstamm unabhängiger Strukturen oder Peptidsequenzen des Hämagglutinin-(HA)moleküls eine '· von der aktuellen epidemiologischen Situation unabhängige Wirksamkeit besitzen, gekennzeichnet dadurch, daß die dafür erforderlichen Oberflächenstrukturen auf der Oberfläche ansonsten intakter Viruspartikel freigelegt oder in künstliche Lipidvesikel (Virosomen) inkorporiert v/erden, wobei entweder durch Einwirkung von geeigneten Proteasen oder durch reduzierende und/oder proteindesintegrierende Substanzen die schwere (HA1)-Kette des HA-Moleküis völlig oder zum größten Teil vorder leichten (HA2)Kette getrennt wird und dadurch eine Freilegung der biologisch als Fusionsfaktor wirksamen Determinanten der leichten ,Kett.e erfolgt oder durch Inkorporation von isolierten Teilen des HA-Moleküls, z.B. der HA2-Kette oder synthetisch oder gentechnologisch hergestellter Peptidsequenzen des HA-IIoleküls in Viro-, .somen bzw. durch chemische Verknüpfung dieser ",loieküiteile mit geeigneten Trägermolekülen immunologisch wirksame Strukturen erzeugt werden.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Abspaltung des EA1 nach 1 bis 30 min Aufbewahrung, vorteilhaft 10 min, im sauren Bereich von pH 4.5 bis 5.5, vorteilhaft bei pH 5.2, durch Einwirkung von Proteasen, die einen dem Trypsin ähnlichen Wirkungsmechanismus aufweisen, erfolgt.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Abspaltung des HA1 nach 1 bis 30 min Aufbewahrung, vorteilhaft 10 min, im sauren Bereich von pH 4.5 bis 5.5, vorteilhaft bei pH 5.2, durch Einwirkung von reduzierenden Substanzen erfolgt.
- 4. Verfahren nach einen der Ansprüche 1-3, gekennzeichnet dadurch, daß die durch die Abspaltung des HA1 modifizierten Viruspartikel direkt zu einem Impfstoff verarbeitet werden.
- 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, gekennzeichnet dadurch, daß die durch die Abspaltung des HA1 modifizierten Viruspartikel nach Zugabe eines organischen oder anorganischen Adjjuvans zu einem Impfstoff verarbeitet werden.
- 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, gekennzeichnet dadurch, daß die durch die Abspaltung des HAT modifizierten Viruspartikel nach Mischung mit durch an sich bekannten Verfahren inaktivierten -und gereinigten Viruspartikeln eines aktuellen Epidemiestammes zu einem Impfstoff verarbeitet werden.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD26913284A DD228737A1 (de) | 1984-11-06 | 1984-11-06 | Verfahren zur herstellung von influenza-inaktivimpfstoffen mit geringer stammabhaengigkeit |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD26913284A DD228737A1 (de) | 1984-11-06 | 1984-11-06 | Verfahren zur herstellung von influenza-inaktivimpfstoffen mit geringer stammabhaengigkeit |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD228737A1 true DD228737A1 (de) | 1985-10-23 |
Family
ID=5561962
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD26913284A DD228737A1 (de) | 1984-11-06 | 1984-11-06 | Verfahren zur herstellung von influenza-inaktivimpfstoffen mit geringer stammabhaengigkeit |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD228737A1 (de) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0621339A3 (en) * | 1992-09-17 | 1995-11-29 | Takara Shuzo Co | Immunogenic human influenza a virus haemagglutinin polypeptides. |
| US5631350A (en) * | 1992-09-17 | 1997-05-20 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Anti-human influenza virus antibody |
| EP2698380A1 (de) * | 2008-03-28 | 2014-02-19 | Sea Lane Biotechnologies, LLC | Neutralisierung von Molekülen in Virusantigene |
-
1984
- 1984-11-06 DD DD26913284A patent/DD228737A1/de unknown
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0621339A3 (en) * | 1992-09-17 | 1995-11-29 | Takara Shuzo Co | Immunogenic human influenza a virus haemagglutinin polypeptides. |
| US5631350A (en) * | 1992-09-17 | 1997-05-20 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Anti-human influenza virus antibody |
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