CH639977A5

CH639977A5 - Antibiotikum c-11924 f-1 und seine herstellung.

Info

Publication number: CH639977A5
Application number: CH56978A
Authority: CH
Inventors: Toru Hasegawa; Mitsuko Asai; Kazunori Hatano
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1977-01-24
Filing date: 1978-01-19
Publication date: 1983-12-15
Also published as: GB1597662A; JPS5913190B2; FR2378043B1; JPS5392702A; DE2802792A1; NL7800730A; US4189472A; FR2378043A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Antibiotikum C-11924 F-l und auf ein Verfahren zur Herstellung desselben.

Bei der Suche nach neuen Antibiotika wurden Mikroorganismen aus einer reichlichen Anzahl von Bodenproben isoliert und getrennt. Die durch solche Mikroorganismen entwickelten Antibiotika wurden untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass gewisse solcher Mikroorganismen ein neues Antibiotikum zu entwik-keln vermögen und dass diese Mikroorganismen der Gattung Streptoverticillium angehören. Es wurde auch festgestellt, dass solche Mikroorganismen in der Kulturbrühe das besagte Antibiotikum anreichern. Dieses Antibiotikum wurde als Antibiotikum C-11924 F-l bezeichnet.

Der das Antibiotikum C-11924 F-l (nachstehend kurz C-11924 bezeichnet) erzeugende Stamm gehört, wie bereits angedeutet, der Gattung Streptoverticillium an. Streptoverticillium cinnamoneum Nr. C-11924 (nachstehend kurz als Stamm-Nr. C-l 1924 bezeichnet), welches aus einer Bodenprobe isoliert wurde, die bei Gero, Gifu Prefecture, Japan, gefunden wurde, ist eines der Mikroorganismen, das man am vorteilhaftesten für das vorliegende Verfahren dieser Erfindung verwendet. Der obige Stamm des Mikroorganismus wurde am 8. Dezember 1976 beim Institute for Fermentation, 17-85, Juso-honmachi2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532 (Japan) unter der Nr. IFO13713, beim Fermentation Research Institute of the Agency of Industriai Technology, Chiba-city (Japan) unter Eingangsnummer 3837 des schriftlichen Antrags und bei American Type Culture Collection, Rockville (MD, USA) unter der Nr. ATCC-31364 hinterlegt. Die mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes Nr. C-11924 sind gemäss der Sherling & Gottlieb'schen Methode (International Journal of SystematicBacteriology, Band 16, Seiten 313-340, 1966) nach Äblauf von dreiwöchiger Prüfung wie folgt festgestellt worden:

(1) Morphologische Eigenschaften:

Quirlartige Hyphen in Sporenform. Zylindrische oder pha-lanxförmige Sporen (0,5-0,7 x 0,9-1,1 |x) werden gebildet; glatte Oberflächen.

(2) Züchtungseigenschaften:

Dieser Stamm erzeugt ein baumwollartiges oder samtartiges Luftmycel von weisslich bis gelber, rosagrau bis rosapurpurrot-grauem Farbton. Das Substratmycel ist gelb bis gelbÜch-lohfar-ben. Im wesentlichen werden keine löslichen Pigmente erzeugt. Auch die Produktion von Melanoidpigmenten bleibt aus.

Die Züchtungseigenschaften, die physiologischen Eigenschaften und das Kohlenstoffassimilierungsspektrum dieses Stammes finden sich in den Tabellen 1 bis 3.

50

Tabelle 1

Züchtungseigenschaften bei verschiedenen Medien

Medium

Farbe des Substratmycels auf der Rückseite

Oberflächenfärbung des Sub- Oberflächenwachstum der Kolonie und deren Lösliches stratmycels Farbe Pigment

Saccharose-Ni-trat-Agar

Glucose-Aspa-ragin-Agar

Glycerin-Aspa-ragin-Agar

Anorganische Salze enthaltendes Stärkeagar

Tyrosin-Agar

Farblos

Hellgelb (2 ea) - mattgelb-orange (3 ic)

Hellgelb (2 ga) - mattgelb (2 ic)

Hellgelb (2 ga)

Farblos

Spärlich, hellrosafarben (4 ca)

Hellgelb (2 ea) - mattgelb- Reichlich, weiss mit einem Stich nach leuch-orange (3 ic)

Kein

Hellgelb (2 ga) - mattgelb (2 ic)

Hellgelb (2 ga)

tend bräunlich-grau (3 ec)

Mässig, beschränktes Wachstum, beige mit Kein einem Stich nach rosafarben (4 ec)

Samtartiges, reichliches Wachstum, beige Kein mit einem Stich nach rosa (4 ec)

Hellgelb (2 ca)-gelblich- Hellgelb (2 ca)-gelblich- Mässiges Wachstum, faltig und beschränkt; Kein lohfarben (3 ne) lohfarben (3 ne) weisslich bis gelb

3

639 977

Medium Farbe des Substratmycels auf Oberflächenfärbung des Sub- Oberflächenwachstum der Kolonie und deren Lösliches der Rückseite stratmycels Farbe Pigment

Nähragar

Hefeextrakt-Malzextrakt -Agar

Hafer-Agar

Braun (4 ni) - dunkelloh- Braun (4 ni)

färben

Gelblichorange (3 nc) - Gelblichorange (3 nc) -

gelblichbraun (3 ne) gelblichbraun (3 ne)

Mettgelb (2 lc)

Stumpf gelb (2 lc)

Mässig, leuchtend bränlichgrau (3 ec) Kein

Samtartig, gutes Wachstum, leuchtend Kein bräunlichgrau (3 ec)

Samtartig, gutes Wachstum, leuchtend Kein oder bräunlichgrau (3 ec) gelblichbraun (3 cb) sehr schwach

Die durch Klammern wiedergegebenen Symbole geben die Farbcode gemäss «Color Harmony Manual», 4. Ausgabe (Container Corporation of America, 1958) wieder.

Tabelle 2

Physiologische Eigenschaften Temperaturbereich für das Wachstum Verflüssigung von Gelatine Hydrolyse von Stärke Koagulierung von entrahmter Milch Peptonisierung von entrahmter Milch Erzeugung von Melanoidpigmenten I) Tyrosin-Agar II) Pepton-Hefeextrakt-Eisenagar Reduktion von Nitraten

Tabelle 3

Assimilierung von Kohlenstoffquellen

L-Arabinose

D-Xylose

D-Glucose

D-Fructose

D-Galactose

D-Trehalose

Saccharose

L-Rhamnose

Raffinose i-Inositol

D-Mannitol

Blindversuch (ohne Zusatz)

+ + + : reichliches Wachstum ++: gutes Wachstum +: Wachstum ±: schwaches Wachstum —: kein Wachstum

20

10 bis 40° C positiv positiv negativ positiv negativ negativ negativ

25

30

35

Wachstum ±

± + + +

40

+ bis+ +

+

++ +

±

± 45 ± + + +

+

50

55

Ein Vergleich der oben erwähnten Eigenschaften mit den entsprechenden Angaben in S. A. Waksman's The Actinomyce-tes, Band2,1961, The Williams and Wilkins Company; E. B. Scherling und D. Gottlieb's Bericht in International Journal of SystematicBacteriology 18,69 (1968), do. 18,279 (1968), do. 19, 391 (1969) und do. 391 (1969) und do. 22,265 (1972); R. Locci et al Bericht in Giornale di Microbiologia 17,1-60 (1969) ; und Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, (1974), The Williams and Wilkins Company, zeigt, dass der Stamm C-11924 Streptoverticillium cinnamoneum und Streptoverticillium hachijoense ähnelt. Zu Vergleichszwecken wurden der erfindungsgemässe Stamm und die bekannten aus Institute for Fermentation, Osaka, nämlich Streptoverticillium cinnamoneum IFO-12852 (ISP 5005), Streptomyces cinnamomeus f. azacoluta IFO-12363 (Streptoverticillium cinnamoneum f. azaco-luta) und Streptomyces hachijoensis, IFO-12782 (ISP 5114) (Streptoverticillium hachijoense), zugänglichen Stämme auf verschiedenen Medien gezüchtet. Wie sich aus der Tabelle 4 ergibt, zeigt der Stamm C-l1924 bezüglich der Farbe des Luftmycels, der physiologischen Eigenschaften, des Spektrums in bezug auf die Kohlenstoffverwertung usw. eine starke Ähnlichkeit mit den vorgenannten drei Mikroorganismen-Stämmen. Streptomyces hachijoensis unterscheidet sich indessen vom Stamm Nr. C-l 1924 darin, dass der erstere auf einem Glycerin-Asparagin-Agar-Medium oder einem Tyrosin- Agar-Medium nicht zu wachsen vermag. DerStammNr. C-l1924 scheint Streptomyces cinnamomeus f. azacoluta näherzukommen, insofern als beide Stämme ein hellgelbes bis stumpf-gelbes Substratmycel liefern und Milch peptonisieren. Der letztere Stamm unterscheidet sich jedoch vom Stamm Nr. C-11924 darin, dass er auf Tyrosin-Agar nicht wachsen kann. Ferner unterscheidet sich der Stamm Nr. C-11924 von den besagten bekannten Organismen darin, dass er ein helloliv-farbenes Luftmycel auf Glycerin-Nitrat-Agar ergibt. Aufgrund der obigen Feststellung wurde der Stamm Nr. C-11924 als ein Stamm von Streptoverticillium cinnamoneum und ihn als Streptoverticillium cinnamoneum Nr. C-11924 identifiziert.

Tabelle 4

Vergleich des Stammes Nr. C-11924 mit bekannten Arten

Medium

Stamm Nr. C-11924

Streptomyces cinnamo

Streptomyces hachijo

Streptoverticillium cinna-

meus azacoluta ensis momeum

Saccharose-

Wachstum

Schwach, farblos

Mässig

Schwach, farblos

Nitrat-Agar

Luftmycel

Mässig, hellrosafarben

Mässig, hellbeige

Mässig, hellrosafarben

Rückseite

Farblos

Hellbeige

Farblos

Pigment

Kein

639 977

4

Medium

Stamm Nr. C-11924

Streptomyces cinnamo

Streptomyces hachijo

Streptoverticillium cinna-

meus azacoluta ensis momeum

Glycerin-Ni-

Wachstum

Gut, faltig

Gut

Gut, faltig

Gut, begrenzter trat-Agar

Luftmycel

Mässig, hellolive-

Reichlich, samtartig,

Mässig, weiss mit ei

Wachstum

farben weiss mit einem Stich nem Stich nach beige

Mässig, leuchtend

Rückseite

Hellgelb nach rosafarben

bräunlichgrau

Lösliches

Kein oder sehr hellgelb

Hellgelb

Gelblichbraun

Braun bis dunkelgelb

Pigment

Kein oder sehr hellgelb

Kein

Glycerin-

Wachstum

Mässig, beschränktes

Gut, faltig und ver

Kein Wachstum

Mässig, beschränkt

Asparagin-

Wachstum stärktes Wachstum

Mässig, beige mit einem

Agar (ISP-)

Luftmycel

Reichlich, beige mit ei

Stich nach rosafarben

nem Stich nach rosa nem Stich nach rosa

Dunkelbraun

farben farben

Kein

Rückseite

Hellgelb bis mattgelb

Stumpf gelb

Lösliches

Kein

Pigment

Stärkeagarmit

Wachstum

Gut

Mässig bis gut anorganischen

Luftmycel

Reichlich, samtartig;

Reichlich; beige mit ei

Salzen (ISP-4)

beige mit einem Stich beige mit einem Stich beige mit einem Stich nem Stich nach rosa

nach rosafarben nach rosafarben nach rosafarben farben

Rückseite

Hellgelb

Braun bis dunkelloh-

Lösliches

Kein

Kein farben

Pigment

Kein

Tyrosin-Agar

Wachstum

Mässig, beschränktes

Kein Wachstum

(ISP-7)

und faltiges Wachstum

Luftmycel

Spärlich, weisslich bis

gelb

Rückseite

Gelblichbraun

Lösliches Pig

Kein

ment

Verflüssigung von Gelatine

+ + +

+

Peptonisierung von Milch

+ + +

++ +

-

Hydrolyse von Stärke

+ + +

++ +

+++

Reduktion von Nitraten

-

Verwertung von Kohlehydraten

Mannitol

±

+

-

Inositol

+ + +

+

Glycerin

+ + +

+ + bis + + +

Glucose

+ + +

+++

-

Arabinose

±

+

-

Xylose

+

-

Rhamnose

+

Fructose

+ bis + +

+ +

+ bis + +

■

Raffinose

±

Mannose

+ + +

+++

+ +

Stärke

+ + +

+++

+ + +

Blindversuch

±

-

+ ++: reichliches Wachstum; + + : gutes Wachstum; +

: Wachstum; ±: schwaches Wachstum; — kein Wachstum

Da andererseits das durch den Stamm Nr. C-11924 erzeugte neue Antibiotikum C-11924 zur Phlenomycin-Bleomycin-Grup-pe von Antibiotika gehört, wurde der Stamm Nr. C-11924 mit den Antibiotika dieser Gruppe erzeugenden Mikroorganismen verglichen.

Dabei wurde festgestellt, dass der Stamm C-11924 sich vom Streptomyces verticillus, dem Phleomycin-Bleomycin erzeugenden Stamm, wie er in Journal of Antibiotics 12 A, 111 (1959), 19 A, 200-209 (1966) beschrieben ist, darin unterscheidet, dass der letztere ein weiss bis graues oder ein graues Luftmycel mit einem

Stich nach grün aufweist. DerStammNr. C-l1924 unterscheidet 60 sich auch eindeutig von den folgenden Stämmen hinsichtlich der sporenbildenden Hyphen und anderen morphologischen Eigenschaften, nämlich Streptomyces flavoviridis (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 22687/1973); Streptopmyces bikiniensis var. zorbonensis, dem Zorbamycin erzeugenden, in Journal of Bacte-65 riology 105,880-885 (1971) beschriebenen Stamm; Streptomyces humidus var. antitumoris, YA-56X und Y-Erzeuger gemäss Journal of Antibiotics 26,70-76 (1973) ; Streptosporangium violaceochromogenes, einem XK-49-lB-2-Erzeuger, wie er in

der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 42896/1974 beschrieben ist; und Streptomyces olivogriseus, dem SS-70A und -B-erzeu-genden Mikroorganismus gemäss Japanischer Offenlegungsschrift Nr. 15693/1976.

Ähnlich anderen Mikroorganismen der Gattung Streptoverticillium vermag der Stamm Nr. C-l1924 seine Eigenschaften zu verändern. So kann er eine Mutation eingehen, wenn er einer künstlichen mutagenen Behandlung, z. B. einer Bestrahlung mit ultraviolettem Licht, Röntgenstrahlen oder anderen Strahlen, oder mit einem künstlichen Mutagen behandelt wird. Dabei ist zu verstehen, dass selbst solche Mutanten ohne weiteres für das vorliegende Verfahren zur Anwendung gelangen können, vorausgesetzt, dass sie C-11924 F-l zu erzeugen vermögen.

Beim erfindungsgemässen Verfahren kann man als Medium für die Züchtung des Stammes Nr. C-11924 ein beliebiges flüssiges oder festes Medium verwenden, obzwar man flüssigen Medien den Vorzug gegeben wird. Man kann entweder eine Oberflächenzüchtung oder eine Schüttelkultur zur Anwendung bringen. Submerse Züchtung wird bevorzugt. Im Medium werden Kohlenstoff quellen, welche der Stamm C-l1924 zu assimilieren vermag, einverleibt, wiez. B. Stärke, Glucose, Dextrin, Glycerin, Saccharose, n-Paraffin, Alkohole, z. B. Methanol, usw. Auch Stickstoffquellen, wie z. B. Maisquellflüssigkeit, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Pepton, Fleischextrakte, Harnstoff usw. werden als organische Stickstoffquellen oder dann Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat usw. als anorganische Stickstoffquellen verwendet. Nötigenfalls kann man auch geeignete Mengen an anorganischen Salzen, z.B. Salze, einschliesslich Natrium-, Kalium-, Magnesium-, Calcium-oder Phosphorsalze, Schwermetallsalze, z. B. Eisen-, Mangan-, Zink-, Kobalt-, Kupfer-, Nickelsalze usw., Antischaumkörper, z. B. Sojabohnenöl, Specköl, Hühneröl, Silikonöl, Actocol (Takeda Chemical Industries Ltd., Japan) usw., zugeben. Arbeitet man in einem flüssigen Kulturmedium, so wird der pH-Wert des Mediums vorzugsweise in der Nähe des neutralen pH-Wertes und vorzugsweise bei 6 bis 8 liegen. Die Inkubationstemperatur und -dauer liegen vorzugsweise bei 24 bis 30° C und 90 bis 140 Stunden. Die Änderung im Titer der Aktivität als Funktion der Züchtungsdauer kann durch die Papierscheibenmethode unter Verwendung von Salmonella typhimurium IFO12529 als Testorganismus (Testmedium: Trypticase-Soja-Agar BBL) verfolgt werden.

Das erfindungsgemäss erhältliche C-11924 F-l ist ein kupfer-haltiges, basisches Peptidantibiotikum und kann nach an sich bekannten Methoden aus der Kulturbrühe abgetrennt, gewonnen und gereinigt werden. So kann man das Einengen unter vermindertem Druck, eine Lyophilisierung, eine Lösungsmittelextraktion, eine Dialyse, eine Adsorption auf Aktivkohle, Kieselgel, Aluminiumoxyd oder dergleichen, oder auf einem synthetischen Adsorbens vom makroporäsen, nicht-ionogenen Typus, wie z. B. Amberlite XAD-2, Diaion HP-10, oder dergleichen, einem schwach sauren lonenaustauschharz, einem Gelfiltriermittel, einem Ionenaustausch-Gelfiltriermittel usw. anwenden. Dabei kann man die einzelnen Massnahmen gegebenenfalls in Kombination oder in Wiederholung vornehmen.

Ein beispielsweises Reinigungsverfahren wird nachstehend beschrieben. Da C-11924 F-l in der flüssigen Phase der Kulturbrühe vorhanden ist, werden die Zellen zuerst durch ein Filtrierhilfsmittel, z. B. Diatomeenerde, aus der Kulturbrühe entfernt und die wirksame Komponente des Filtrats auf einer Säule von Diaion HP-10 (Mitsubishi Kasei K. K., Japan) adsorbiert. Nach einem gründlichen Waschen mit Wasser wird die aktive Komponente mit einer Mischung von Wasser und einem oder mehreren hydrophilen Lösungsmitteln, z. B. niedrigen Ketonen, wie Aceton, Methyläthylketon, oderniedrigen Alkoholen, wiez. B. Methanol, Äthanol, Isopropanol, n-Propanol, n-Butanolusw. eluiert. Die aktiven Fraktionen werden hierauf unter vermindertem Druck eingeengt, um das organische Lösungsmittel zu

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entfernen, worauf das Konzentrat über einem Gelfiltriermittel der Molekularsiebchromatographie unterworfen wird.

Zuerst werden unter Verwendung einer Säule von Sephadex LH-20, (Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden) die im Lösungsmittel löslichen Verunreinigungen durch Entwicklung mit wässrigem Alkohol entfernt, worauf die aktiven Fraktionen unter vermindertem Druck eingeengt und lyophilisiert werden, um zu rohen Pulvern zu gelangen. Um die rohen Pulver zu reinigen, bedient man sich am besten der Säulenchromatographie mittels eines Ionenaustausch-Gelfiltriermittels, wobei angesichts der basischen Natur der Substanz CM-Sephadex C-25 sich bestens bewährt hat. Die rohen Pulver werden in einer verdünnten Ameisensäurelösung in Ammoniak gelöst und die Lösung über CM-Sephadex C-25 adsorbiert, wobei die Eluierung mit einem Gemisch von Ameisensäure und Ammoniak in verschiedenen Mischungsverhältnissen erfolgt. Die wirksamen Fraktionen, welche man bei einem einzelnen Peak bei 0,32 bis 0,37 Mol-Konzentration der Ameisensäure-Ammoniak-Mischung erzielt, werden gesammelt und auf einer Säule von Diaion HP-10 adsorbiert. Die Eluierung erfolgt mittels wässrigem Alkohol und das entsalzte Eluat wird lyophilisiert. Auf diese Weise erhält man C-11924 F-l, welches sich bei der Papierchromatographie als einzelne Substanz erweist.

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften von C-11924 F-l, welches gemäss Beispiel 1 erhalten wird, sind die folgenden:

1. Aussehen: blaues, amorphes Pulver

2. Elementaranalyse:

c

= 40,81,

40,87,

40,55

H

= 5,72,

5,02,

5,55

N

= 16,35,

16,58,

16,40

S

= 3,95,

3,97,

3,50

Cu

= 3,64,

3,46,

3,29

3. Schmelzpunkt (Zersetzung):

nicht weniger als 195° C (kein bestimmter Zersetzungspunkt)

4. Molekulargewicht:

(I) Dampfdruckosmose: n-(l,0x 103), wobei n eine ganze Zahl darstellt (destilliertes Wasser). Es liegt vollkommen im Bereiche des Möglichen, dass n die Zahl 2 darstellt.

(II) Molekulargewicht, berechnet nach der Annahme, dass jedes Molekül ein Kupferatom enthält: 1800 ± 50

5. Ultraviolettabsorptionsspektrum :

Wie aus Fig. 1 ersichtlich ist, gibt es Absorptionsmaxima in wässriger Lösung bei 243 nm ± 2 (E1^ 167 ± 16) und 297 nm ± 2 (Eifern 55 ± 6).

6. Infrarotabsorptionsspektrum:

Das nach der KBr-Methode erhaltene Spektrum ergibt sich aus der Fig. 2. Hauptsächliche Peaks im Infrarotabsorptionsspektrum sind die folgenden (cm-1):

3350,2920,1715,1650,1625,1600,1550,1520,1450,1370,1345, 1090, 1060, 1005, 980.

7. Löslichkeit:

In Wasser leicht löslich, in Methanol löslich, in Äthanol spärlich löslich, in Äthylacetat, Butylacetat, Chloroform, Benzol, Cy-clohexan, Äthyläther und Petroläther unlöslich.

8. Farbreaktion:

Die Sakaguchi-, Ninhydrin-, Ehrlich-, Dragendorff-, Kaliumpermanganat" und Greig-Leaback-Reaktionen sind positiv.

9. Beständigkeit:

Unter neutralen Bedingungen beständig, unter alkalischen Bedingungen leicht unbeständig, unter sauren Bedingungen unbeständig.

10. Azidität, Neutralität oder Basizität:

Basisch.

11. Papierchromatographie (aufsteigende Methode): Lösungsmittelsystem C-11924 F-l Rf-Wert

(1)50% Aceton und 50% Wasser 0,20

(2) 75% Phenol 0.95

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

639 977

(3) Mischung von n-Butanol, Essigsäure und Wasser im Mischungsverhältnis von 2:1:1 0,37

(4) Mischung von n-Butanol, Pyridin,

Essigsäure und Wasser im Mischungs- 5

Verhältnis von 15:10:3:12 0,18

(5) Mischung von n-Butanol, Essigsäure und Wasser (obere Schicht im

Michungsverhältnisvon4:l:5) 0,13

(6) 3%iges Ammoniumchlorid 0,8210 Zu Vergleichszwecken werden nachstehend die entsprechenden papierchromatographischen Rf-Werte für YA-56-X, YA-56-Y, SS-70-A und SS-70-B wiedergegeben:

.15

Aus den obigen Resultaten geht eindeutig hervor, dass C-11924F-l ein neues Antibiotikum ist, welches von jedem der bekannten Antibiotika der Belomycin-Phleomycin-Gruppe verschieden ist.

Antimikrobielles Spektrum Das antimikrobielle Spektrum von C-11924 F-l, bestimmt nach der Agarverdünnungsmethode unter Verwendung von Trypticase-Soja-Agar als Testmedium (Baitimor Biologicals Limited, USA) findet sich in der Tabelle 5.

Lösungsmittelsystem

YA-56-X (+)

YA-56-Y (+)

SS-70-A (++)

SS-70-

B

(++)

(1)

0,05

0,90

(2)

0,93

0,06

(4)

0,30

0,45

(5)

0,23

0,31

(6)

0,87

0,91

20

+: gemäss J. Antibiotics 26, 77 (1973)

++: gemäss japanischen Offenlegungsschriften Nr. 15693/76 und 115694/76

Das vorliegende Antibiotikum wird mit den bekannten Antibiotika wie folgt verglichen:

Unter den bekannten, wasserlöslichen, kupferhaltigen, basischen Peptidantibiotika befinden sich Antibiotika der Phleomy-cingruppe [Ikekawa et al, Journal of Antibiotics 17 A, 194 (1964)], Antibiotika der Bleomycingruppe [Umezawa et al, Journal of Antibiotics 19 A, 200 (1966)], Zorbamycin, Zorbono-mycin B, Zorbonomycin C [A. D. Algoudelis et al. Journal of Antibiotics 24,543 (1971); YA-56-X und YA-56-Y [Itch et al, Journal of Antibiotics 24,727 (1971)] ; XK-49-1-B-2 (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 42896/1974) ; und SS-70-A und SS-70-B (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 15693/1976).

Das Verhältnis der Absorption von C-l1924 F-l im ultravioletten Licht bei 243 nm und bei 297 nm liegt bei 3,04, während die entsprechenden Verhältnisse für die Bleomycine, Phleomycin C, D2 und F, Zorbonomycin B und XK-49-1-B-2 im Bereiche von 1,1 bis 1,3 liegen. Somit ist C-l1924 F-l von diesen bekannten Antibiotika grundsätzlich unterscheidbar.

Auch in bezug auf die Papierchromatographiewerte ist C-11924 F-l von bekannten Antibiotika zu unterscheiden.

Da aber indessen die Verhältnisse für Phleomycin Di, E, G, H und I, Zorbamycin YA-56-X, YA-56-Y, SS-70-A und SS-70-B im Bereiche von 2,7 bis 2,9 liegen, findet sich diesbezüglich zwischen diesen Antibiotika und dem erfindungsgemässen Antibiotikum eine gewisse Ähnlichkeit. So wird zufälligerweise in Journal of Antibiotics 26,77 (1973) berichtet, dass YA-56-X und Zorbamycin die gleiche Substanz darstellen.

Fig. 3 zeigt das Eluierungsschema einer Mischung von SS-70-B und C-l 1924 F-l aus einer Chromatographiesäule aus CM-Sephadex C-25. Die beiden Komponenten geben unabhängige Peaks, woraus eindeutig hervorgeht, dass sie verschiedene Substanzen darstellen. Bezüglich der Unterschiede in bezug auf die Phleomycin-Antibiotika ist darauf hinzuweisen, dass YA-156-X und YA-56-Y oder SS-70-A gemäss Darlegungen in der Japanischen Offenlegungsschrift Nr. 15 694/1976 durchwegs vor dem Antibiotikum SS-70-B eluiert werden, während aus Fig. 3 hervorgeht, dass das Antibiotikum C-l 1924 F-l erst nach dem Antibiotikum SS-70-B auftaucht. Daraus ergibt sich, dass das erfindungsgemässe Antibiotikum sich auch von diesen bekannten Antibiotika unterscheidet.

25

Tabelle 5 Antimikrobielles Spektrum

Testorganismen

Minimale Hemmkonzentration mcg/ml C-11924 F-l

30

35

40

45

50

55 ;

60

65

Staphylococcus aureus FD A 209 P Bacillus subtilis PCI 219 Bacillus cereus IFO 3514 Bacillus pumilus IFO 3813 Escherichia coli NIHJ Proteus vulgaris IFO 3045 Proteus mirabilis IFO 3849 Pseudomonas aeruginosa IFO 3080 Salmonella typhimurium IFO 12529 Alcaligenes faecalis IFO 13111 Mycobacterium sp. 607 Aspergillus niger IFO 4066 Candida albicans IFO 0583

2,0 1,0 20,0 >100 0,2 >100 >100 >100 0,1 >100 0,5 5,0 >100

Toxizität

Die akute Toxizität LD50 bei Mäusen bei intravenöser Verabreichung liegt bei ungefähr 200 mg/kg.

Wie aus den oben erwähnten antimikrobiellen Spektrumswerten hervorgeht, ist das erfindungsgemässe Antibiotikum C-11924 F-l gegenüber gramnegativen Bakterien, grampositiven Bakterien, Mycobakterien und Fungi äusserst wirksam und ist eine wertvolle Substanz mit starker keimtötender Wirkung. So ist das erfindungsgemässe Antibiotikum auch wertvoll als germicides Mittel und als Desinfektionsmittel gegen pathologische Mikroorganismen und dies in ähnlicher Weise wie die oben erwähnten Testorganismen.

Da das erfindungsgemässe Antibiotikum bei mittels Escherichia coli infizierten Mäusen therapeutische Wirkungen ausübt, ist es auch ein wirksames Mittel für die Behandlung von durch solche Bakterien infizierte Menschen und Säugetiere.

Um C-l1924 F-l als keimtötendes und desinfizierendes Mittel zu verwenden, kann man es beispielsweise als flüssiges Präparat, welches 5 bis 200 jxg pro ml enthält, verwenden, wobei die Konzentrationen vom beabsichtigten Anwendungsgebiet abhängen. C-11924 F-l kann auch in Salbenform verwendet werden, indem man beispielsweise 50 mg dieses Antibiotikums gründlich mit 10 g Petrolatum album vermischt.

Wird das Antibiotikum C-11924F-l am mit Sarcom 180 Ascitestumorzellen geimpften Mäusen verabreicht, so wird dadurch die Vermehrung von Tumorzellen kräftig gehemmt und die Lebensdauer der Tiere entsprechend verlängert. Somit ist das Antibiotikum C-l1924F-l auch als Antitumormittelfür die Behandlung von Tumorzellen bei Menschen und Säugetieren wertvoll.

Die folgenden Beispiele mögen die vorliegende Erfindung näher erläutern.

In diesen Beispielen bedeutenTeile jeweils Gewichtsteile, so weit nichts anderes angesagt wird. Das Verhältnis zwischen Teilen und Volumenteilen entspricht jenem zwischen g und ml.

Der Ausdruck «%» bezieht sich auf Gewichtsprozent/Volumenprozent, sofern nichts anderes angesagt wird.

Beispiel

Fermentierungsbehälter mit einem Fassungsvermögen von 2000 Volumenteilen wurden jeweils mit 500 Volumenteilen eines Mediums gefüllt, welches aus 3 % löslicher Stärke, 2 % Glucose,

1 % rohes Soyabohnenmehl, 1 % Maisquellwasser, 0,5 % Pepton, 0,3 % Natriumchlorid und 0,5 % Calciumcarbonat (pH 7,0) bestand. Die Behälter wurden hierauf sterilisiert und anschliessend mit Streptoverticillium cinnamomeum Nr. C-l1924 (IFO 13713 ; FERM Annahmenummer 3837; ATCC-31364) inokuliert, worauf man während 40 Stunden bei 28° C die Züchtung unter Schütteln durchführte. 1500 Volumenteile der so erhaltenen Samenkultur wurden in einen Behälter von 200000 Volumenteile Fassungsvermögen übergeführt, welcher 100 000 Volumenteile eines Mediums enthielt, welches sich aus 3 % Glucose,

2 % löslicher Stärke, 2 % Proflo (Traders Oil Mill Company), 0,5 % Pepton, 0,3 % Natriumchlorid und 0,5 % Calciumcarbonat (pH 7,0) zusammensetzte, worauf man die Züchtung unter Rühren und unter aeroben Bedingungen während 90 Stunden bei 28°C (100 Vol/Vol.% Belüftung, 200 U/Min.) ausführte.

Zu 80000 Volumenteilen der so erhaltenen Kulturbrühe gab man 1500 Teile Diatomeenerde als Filtrierhilfsmittel hinzu, worauf man das Gemisch unter vermindertem Druck filtrierte; auf diese Weise erhielt man 66000 Volumenteile einer Lösung. Diese Lösung wurde bei einem pH-Wert von 7,5 über eine mit 7500 Volumenteilen Diaion HP-10 (Mitsubishi Kasei Kogyo K. K., Japan) beschickte Säule geleitet, wodurch die aktive Fraktion auf dem Harz adsorbiert wurde. Nach dem Spülen der Säule mit 30000 Vol.-Teilen Wasser wurde sie mit 30000 Vol.-Teilen von 20 V/V% Methanol gewaschen. Die Eluierung erfolgte mittels eines Konzentrationsgradienten unter Verwendung von 25 000 Vol.-Teilen einer 40-volumenprozentigen Methanollösung und 25 000 Vol.-Teilen einer 90-volumenprozentigen Methanollösung, worauf das Eluat in Fraktionen von 5000 Volumenteilen gesammelt wurde. C-11924 F-l wurde in den Fraktionen Nr. 3 bis 10 eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt, um das Methanol zu entfernen. Der Rückstand wurde über eine mit 500 Volumenteilen Diaion HP-10 beschickte Säule ein zweites Mal hindurchgeleitet. Die Säule wurde hierauf mit 2000 Volumenteilen Wasser gespült und hierauf die Eluierung mittels eines Konzentrationsgradienten unter Verwendung von 1500 Volumenteilen 40%igem Methanol und 1500 Volumenteilen 90-volumenprozentigem Methanol aus639 977

geführt. Das Eluat wurde in Fraktionen von jeweils 300 Volumenteilen gesammelt, wobei man die Aktivität in den Fraktionen Nr. 2 bis 8 feststellte. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt, unter vermindertem Druck eingeengt und lyophilisiert. Auf diese Weise erhielt man 17 Teile rohes Pulver.

Das nach den obigen Angaben erhaltene, rohe Pulver wurde über einer Säule von Sephadex LH-20 gereinigt. 10 Teile des rohen Produktes wurden in 20 Volumenteilen einer 40-volumenprozentigen Methanollösung gelöst und nach dem Entfernen der unlöslichen Bestandteile wurde das Filtrat in eine gründlich gespülte, mit 900 Volumenteilen Sephadex LH-20 beschickten Säule eingetragen. Die besagte Säule wurde zuvor gründlich mit 40-volumenprozentigem Methanol gespült. Dann wurde mit 40-volumenprozentigem Methanol entwickelt. Das Eluat wurde in Fraktionen von jeweils 50 Volumenteilen gesammelt, wobei die Wirksubstanz sich in den Fraktionen Nr. 9 bis 11 befand. Durch Lyophilisierung erhielt man 3,1 Teile rohes Pulver. Dieses rohe Pulver wurde in 200 Volumenteilen 0,05 molarem Ammonium-formiat gelöst und über einer mit 130 Volumenteilen CM-Sephadex C-25 beschickten Säule adsorbiert. Die Säule wurde mit 200 Volumenteilen einer 0,1 molaren Ammoniumformiatlö-sung gewaschen und mittels eines Konzentrationsgradienten eluiert unter Verwendung von 1000 Volumenteilen einer 0,1 molaren Ammoniumformiatlösung und 1000 Volumenteilen einer 1,0 molaren Ammoniumformatlösung. Die aktive Substanz wurde in den Fraktionen, welche den 0,32 molaren bis 0,37 molaren Ammoniumformiatlösungen entsprachen, eluiert. Das Eluat wurde über eine mit 30 Volumenteilen Diaion HP-10 beschickten Säule adsorbiert, wobei die Säule gründlich mit Wasser gespült wurde. Hierauf erfolgte die Eluierung mit einer 20-volumenprozentigen Methanollösung. Nach diesem Entsalzungsvorgang wurde das Eluat lyophilisiert, wobei man 0,046 Teile eines reinen, blauen Produktes, bestehend aus C-11924 F-l erhielt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen Fig. 1 zeigt ein ultraviolettes Absorptionsspektrum von C-11924 F-l (gemessen in Wasser).

Fig. 2 zeigt ein infrarotes Absorptionsspektrum von C-11924 F-1 (KBr).

Fig. 3 ist ein Chromatogramm von C-l1924 F-l und SS-70-B, bestimmt mittels CM-Sephadex C-25(H+) unter Verwendung einer 0,1 molaren Natriumchloridlösung als Entwicklungslösungsmittel.

7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

M

3 Blatt Zeichnungen

Claims

639 977

PATENTANSPRÜCHE

1. Antibiotikum C-l1924 F-l, welches die folgenden Eigen-

schatten aufweist:

(a) Elementaranalyse:

5

C = 40,81,

40,87,

40,55

H = 5,72,

5,02,

5,55

N = 16,35,

16,58,

16,40

S = 3,95,

3,97,

3,50

Cu = 3,64,

3,46,

3,29

10

(b) Schmelzpunkt (Zersetzung):

nicht niedriger als 195°C (kein bestimmter Zersetzungspunkt)

(c) Molekulargewicht:

n-(l,0 X 103), worin n eine ganze Zahl darstellt (destilliertes Wasser, Dampfdruckosmose); 1800±50 (berechnet aufgrund der15 Annahme, dass jedes Molekül 1 Kupferatom enthält)

(d) Ultraviolettabsorptionsspektrum:

243±2 nm (E1^ 167±16)

/»£ 297±2 nm (Efcm 55 ±6)

(e) Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) cm"1:

3350,2920,1715,1650,1625,1600,1550,1520,1450,1370,1345, 1090, 1060, 1005, 980.

(f) Löslichkeit:

in Wasser leicht löslich, in Methanol löslich, in Äthanol spärlich löslich, in Äthylacetat, Butylacetat, Chloroform, Benzol, Cy-clohexan, Äthyläther aund Petroläther unlöslich

(g) Farbreaktionen:

positiv in bezug auf Sakaguchi-, Ninhydrin-, Ehrlich-, Dragen-dorff-, Kaliumpermanganat- und Greig-Leaback-Reaktionen

(h) Beständigkeit:

unter neutralen Bedingungen beständig, unter alkalischen Bedingungen leicht unbeständig und unter sauren Bedingungen unbeständig

(i) Azidität, Neutralität oder Basizität;

eine basische Substanz.
2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums C-l 1924F-l, dadurch gekennzeichnet, dass man einen das Antibiotikum C-

11924F-l erzeugenden Stamm der Gattung Streptoverticillium in einem Kulturmedium so züchtet, dass dieser Stamm in der Kulturbrühe das besagte Antibiotikum bildet und anreichert, worauf man das Antibiotikum C-11924 F-l gewinnt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus Streptoverticillium cinnamoneum verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass 45 man als Mikroorganismus Streptoverticillium cinnamoneum Nr. C-11924 (IFO-13713 ; FERM Annahmenummer 3837; ATCC-31364) verwendet.

25

30

35

40