CH640003A5 - Verfahren zur bestimmung von alpha-amylase. - Google Patents
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Description
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die Nachteile der bekannten Nachweismethoden zu beseitigen und ein Verfahren zur Bestimmung von a-Amylase zu schaffen, welches sich auch fĂŒr die Anwendung auf Analysenautomaten mit mehreren getrennten LösungskreislĂ€ufen eignet.
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Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemÀss durch ein Verfahren zur Bestimmung von a-Amalyse unter Verwendung einer oligomeren oder polymeren StÀrke als Substrat, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine StÀrke verwendet, welche einen unter Farbstoffbildung kupplungsfÀhigen Sub- 5 stituenten trÀgt, die bei der Substratspaltung gebildeten niedermolekularen löslichen Spaltprodukte aus der stÀrkehaltigen Phase abtrennt, mit einer weiteren Farbstoffbildungskomponente kuppelt und den so gebildeten Farbstoff misst.
Wesentliches Merkmal der Erfindung ist die Verwendung ,0 einer StÀrke, welche nicht mit einem Farbstoff, sondern nur mit einer zur Farbstoffbildung befÀhigten niedermolekularen Verbindung substituiert ist. Es ist dabei nicht erforderlich,
eine vernetzte unlösliche StÀrke einzusetzen, vielmehr lÀsst sich sowohl lösliche als auch unlösliche StÀrke verwenden. 15
Die Derivatisierung muss derart sein, dass bei der Spaltung durch die a-Amalyse ein BruchstĂŒck abgespalten wird, welches mit einer weiteren Farbstoffbildungskomponente unter Farbstoffbildung reagieren kann. Da die StĂ€rke keinen umfangreichen Farbstoffrest trĂ€gt, wird auch der Angriff der 20 a-Amalyse nicht gehindert, so dass ein sehr hoher Substitutionsgrad gewĂ€hlt werden kann. Dies hat zur Folge, dass der grösste Teil der entstehenden Spaltprodukte einen unter Farbstoffbildung kupplungsfĂ€higen Substituenten trĂ€gt und die Bestimmung daher einen hohen Empfindlichkeitsgrad 25 aufweist. Vorzugsweise wird daher eine StĂ€rke verwendet,
welche auf je 6 bis 30 Glucoseeinheiten einen unter Farbstoffbildung kupplungsfĂ€higen Substituenten aufweist. Es ist jedoch möglich, auch StĂ€rken mit noch höherem Substitutionsgrad einzusetzen. Andererseits kann es unter gewissen 30 UmstĂ€nden auch ausreichen, wenn ein kupplungsfĂ€higer Substituent auf mehr als 30 Glucoseeinheiten kommt, falls hohe Empfindlichkeit nicht gefordert wird. FĂŒr die Anwendung auf Analysenautomaten hat sich eine StĂ€rke besonders bewĂ€hrt, welche auf je 15 bis 25 Glucoseeinheiten einen 35 kupplungsfĂ€higen Substituenten trĂ€gt.
Prinzipiell lĂ€sst sich jede zur Farbstoffbildung geeignete Komponente als Substituent der StĂ€rke verwenden, welche nicht hochmolekular ist, lösliche Spaltprodukte bei Einwirkung der a-Amalyse ergibt und sich zu einem gut messbaren 40 Farbstoff umsetzen lĂ€sst. Bevorzugt werden solche Substituenten, welche klein genug sind, um das abgespaltene BruchstĂŒck, das bei der Substratspaltung gebildet wird, dialysierbar zu halten. Geeignete Farbstoffbildungskomponenten sind dem Fachmann bekannt, desgleichen die zur Farbstoffbil- 45 dung fĂŒhrenden Reaktionen und Kupplungskomponenten. Der Substituent darf jedoch keine die enzymatische AktivitĂ€t der a-Amalyse beeintrĂ€chtigende Funktion enthalten.
Als besonders geeignet erwiesen sich im Rahmen der Erfindung StÀrken, welche mit einer Verbindung der Formel I 50
(I)
substituiert sind, in der R ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder einen Rest -(CH2)n-X, X eine zur Bildung einer covalenten Bindung mit einer OH-Gruppe der StÀrke geeignete Funktion und n die Zahl 1,2,3 oder 4 Bedeuten.
Eine andere bevorzugte Gruppe von StÀrken ist substituiert mit Gruppen der Formel II
in der R! ein Wasserstoffatom oder eine abspaltbare Schutzgruppe, wie z.B. eine Acylgruppe, und X und n die bei Formel I angegebenen Bedeutungen aufweisen.
Eine weitere bevorzugte Gruppe von StÀrken entspricht der Formel III
X
<-Q
(III)
60
t>5
x-(CH2)n
(II)
in der X] = N bzw. N-N
II
N
Als zur Bildung einer covalenten Bindung mit einer OH-Gruppe der StÀrke geeignete Funktion haben sich besonders bewÀhrt Oxirangruppen, Halogenatome, SÀurechloridgruppen, Isocyaiiatgruppen, Isothiocyanatgruppen, Tosylatgrup-pen, Dichlortriazingruppen oder Mesilatgruppen. Diese AufzÀhlung ist jedoch nicht erschöpfend und zahlreiche weitere, mit einer OH-Gruppe der StÀrke reaktionsfÀhige Gruppen sind dem Fachmann bekannt.
â . Die mit den Substituenten der Formel I und II unter Farbstoffbildung kupplungsfĂ€hige weitere Komponente ist vorzugsweise eine Diazoniumsalz oder eine zur oxidativen Kupplung mit Phenolen oder Anilinen geeignete Verbindung. Besonders geeignet innerhalb dieser bevorzugten Gruppe sind N-Alkylpyridon-(4-)hydrazone, N-Methyl-benzthiazo-lon-hydrazon, Aminodimethylanilin oder l-Phenyl-2,3-dime-thyl-4-amino-3-pyrazolin-5-on (4-Aminophenazon).
Zur oxidativen Kupplung eignen sich vor allem FeCl3, Kaliumferricyanid, Kupfersulfat, Silbernitrat, Natriumhypochlorit, Bleidioxid, Ce(S04)2, H202 oder allgemein H202 bildende Reaktionssysteme.
Eine bevorzugte Verbindung der Formel I ist N-Methyl-N-l-(2,3-epoxy)-propylanilin. Bei der oxidativen Kupplung mit N-Methylbenzthiazolon-hydrazon (MBTH) entsteht ein Farbstoff mit einem sehr hohen Extinktionsmaximum bei den WellenlĂ€ngen 570 bis 600 m|i, der fĂŒr die Messung besonders gut geeignet ist.
Die Abtrennung der bei der Substratspaltung gebildeten niedermolekularen löslichen Spaltprodukte kann beispielsweise durch Dialyse, Filtration oder Zentrifugation erfolgen. Diese Methoden eignen sich besonders bei Verwendung einer unlöslichen StĂ€rke. Bei Verwendung von löslichen StĂ€rken hingegen wird besonders die Dialyse oder Ultrafiltration zur Abtrennung eingesetzt. Vorzugsweise trennt man bei löslichen StĂ€rken die niedermolekularen Spaltprodukte durch Dialyse ab, indem man aus einem ersten kontinuierlichen FlĂŒssigkeitsstrom einen prozentualen Anteil der Spaltprodukte in einen zweiten FlĂŒssigkeitsstrom ausdialysiert, der auf der anderen Seite der Dialysemembran entlanggefĂŒhrt wird. Als Dialysemembran verwendet man hierzu zweckmĂ€ssig eine solche mit hoher DurchlĂ€ssigkeit sowohl bezĂŒglich der QualitĂ€t als auch der MolekĂŒlgrösse.
Wie oben bereits erwĂ€hnt, eignet sich das erfindungsge-mĂ€sse Verfahren gut zur Anwendung auf ĂŒblichen Analysenautomaten, insbesondere auch auf solchen, bei denen mehrere getrennte LösungskreislĂ€ufe vorliegen, die miteinander durch eine Dialysemembran in Verbindung stehen. Dann enthĂ€lt der PrimĂ€rkreislauf die lösliche oder unlösliche StĂ€rke. Das niedermolekulare lösliche Spaltprodukt mit dem zur Farbstoffbildung befĂ€higten Substituenten, tritt durch die Dialysemembran in den SekundĂ€rkreislauf ĂŒber und wird dort zum Farbstoff umgesetzt und letzterer gemessen. Die Messung des Farbstoffs erfolgt ĂŒblicherweise unter Verwendung eines Photometers, welches im sichtbaren Bereich oder gegebenenfalls auch im UV misst.
640 003
4
Die erfindungsgemÀss verwendete StÀrke wird im allgemeinen in Mengen zwischen 0,05 und 3 Gew.-%, vorzugsweise 0,5 bis 2 Gew.-%, eingesetzt. Die Einwirkung der a-Amylase erfolgt in der Regel bei pH-Werten zwischen 5,0 und 9,0, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5. Zur Aktivierung der Amylase werden zweckmÀssig Chloridionen, z.B. NaCl oder KCl, in Mengen zwischen 0,01 und 12%, vorzugsweise 0,05 und 5%, zugesetzt. Die Inkubinationszeit hÀngt ab von der Temperatur und dem Substitutionsgrad der verwendeten StÀrke. Bei einer Inkubinationstemperatur von 45 °C reichen im allgemeinen Inkubinationszeiten zwischen 3 und 12 Minuten aus.
Ein zur DurchfĂŒhrung des erfindungsgemĂ€ssen Verfahrens verwendbares Reagens zur Bestimmung der a-Amylase enthĂ€lt als wesentlichen Bestandteil eine StĂ€rke, welche einen unter Farbstoffbildung kupplungsfĂ€higen Substituenten trĂ€gt.
Bevorzugt enthÀlt das Reagens eine StÀrke der Formel IV
S-Y-(CH ) â
2 n in der R ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder den Rest-(CH2)n-Y-S, Y den Rest einer mit OH-Gruppen reaktiven Funktion, S die StÀrke und n die Zahl 1,2,3 oder 4 bedeuten.
Weiter wird bevorzugt eine StÀrke der Formel V
S-Y-(CH0) z n verwendet, in der Ri ein Wasserstoffatom oder eine abspaltbare Schutzgruppe, wie z.B. eine Acylgruppe, und S, Y und n die zu Formel IV angegebenen Bedeutungen aufweisen.
Vorzugsweise enthÀlt das Reagens getrennt von der StÀrke eine Farbstoffbildungskomponente, die mit dem Substituenten der StÀrke unter Farbstoffbildung reagieren kann. Vorzugsweise handelt es sich hierbei um Diazoniumsalz oder um eine zur oxidativen Kupplung mit Phenolen oder Anilinen geeignete Verbindung, zusammen mit einem Oxidationsmittel. Zur oxidativen Kupplung geeignete Verbindungen sind insbesondere N-Alkylpyridon-(4)-hydrazone N-Methylbenzthiazo-lonhydrazon, Aminodimethylanilin oder 4-Aminophenazon.
Ferner enthÀlt das Reagens zweckmÀssig noch Puffersubstanz und Chloridionen.
Das Reagens kann auch auf einem saugfÀhigen TrÀger imprÀgniert vorliegen, welches blattförmig oder stÀbchenförmig sein kann. Bei derartigen Teststreifen ist es auch möglich, die modifizierte StÀrke covalent mit dem TrÀgermaterial, beispielsweise Filterpapier zu verbinden. Eine derartige Verbindung ist mit OH-Reagentien, wie den oben erwÀhnten, möglich, beispielsweise mittels Epichlorhydrin.
Die Teststreifen können in die zu untersuchende Lösung eingetaucht und nach einer bestimmten Reaktionszeit wieder entnommen werden. Anschliessend kann die Farbkupplungs-reaktion entweder in der Lösung, die die derivatisierten BruchstĂŒcke enthĂ€lt, vorgenommen werden, oder auf dem Teststreifen selbst, wobei in diesem Fall die Kupplung mit den nicht abgespaltenen farbstoffbildenden Substituenten erfolgt.
Die folgenden Beispiele erlÀutern die Erfindung weiter.
Beispiel 1
A. Herstellung der derivatisierten StÀrke
100 g Zulkowski-StĂ€rke (K.Kulkowski, Ber. 13 [1880] 1395) werden in einer Lösung von 600ml und 20g NaOH gelöst. Hierzu werden 10ml N-Methyl-N-l-(2,3-epoxy)-propylanilin (hergestellt nach J. Chem. Soc. (1950), 890 ff.) gegeben. Die entstehende Emulsion wird 5 Tage bei Raumtemperatur gerĂŒhrt. Das Produkt wird anschliessend durch Eintropfen in die 4fache Menge Methanol ausgefĂ€llt, abgesaugt und getrocknet.
Ausbeute 95%, Stickstoffgehalt 0,46% (entspricht einer Anilingruppe je 18 Glucoseeinheiten).
B. Oxidative Kupplung mit MBTH
Eine 0,5%ige wĂ€ssrige Lösung der nach A. mit Epoxypro-pyl-N-methylanilin derivatisierten Zulkowski-StĂ€rke in 0,1 mol/1 Phosphatpuffer, pH 7,0 mit 5% NaCl wird mit Hilfe einer Schlauchpumpe ĂŒber einen Schlauch mit einem Fliessvolumen von 1,0 ml/min angesaugt. Nach Luftsegmentierung dieses FlĂŒssigkeitsstroms wird mit einem Fliessvolumen von 0,1 ml/min die Serumprobe mit a-Amylase zudosiert. Dieser luftsegmentierte FlĂŒssigkeitsstrom wird nach einer Inkubinationszeit von 7 Minuten bei 45 °C oberhalb einer Dialysemembran entlanggeleitet. Die durch die a-Amylase abgespaltenen Anilin-StĂ€rke-BruchstĂŒcke dialysieren zu einem ĂŒber den jeweiligen Bereich gleichbleibenden Prozentsatz. Auf der Gegenseite der Dialysemembran strömt netzmittelhaltiges Wasser (BrijÂź-35) mit einem Fliessvolumen von 1 ml/min entlang. Zu diesem ebenfalls luftsegmentierten, durch das Dialy-sat angereicherten FlĂŒssigkeitsstrom wird eine 0,5%ige wĂ€ssrige Lösung von Methylbenzthiazolonhydrazon (MBTH) mit 0,1 ml/min zudosiert und nach Mischen in einer Mischschlange wird eine l%ige wĂ€ssrige Lösung von K3[Fe(CN)6] mit 0,23 ml/min zugegeben. Die Extinktion des entstehenden violetten Farbstoffs wird in einer DurchflusskĂŒvette im Photometer bei 560 nm gemessen und durch einen Schreiber aufgezeichnet. Durch Vergleich mit der Extinktion einer Probe mit bekannter Konzentration an a-Amylase wird die a-Amylasekonzentration in der unbekannten Probe ermittelt.
Beispiel 2
A. Kupplung von Anilin ĂŒber Schiffsche Base an oxidierte StĂ€rke
Zu einer Lösung von 100 g Zulkowski-StĂ€rke in 1,3 1 Wasser werden 6,6 g Natriumperjodat gegeben. Der Ansatz wird ĂŒber Nacht gerĂŒhrt, dann wird die oxidierte StĂ€rkelösung durch Eintropfen in 41 Methanol ausgefĂ€llt.
50 g der oxidierten StĂ€rke werden in 600ml Wasser gelöst, dann werden 350ml 15%ige EssigsĂ€ure zugegeben. Zu dieser Lösung werden langsam unter RĂŒhren 50 ml Anilin getropft. Nach 20 Stunden Reaktionszeit wird das Produkt durch Eintropfen in die 3fache Menge Methanol gefĂ€llt, abgesaugt, mit Ăther gewaschen und getrocknet.
B. Oxidative Kupplung mit 4-Aminophenazon
Es wird wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch unter Verwendung der durch Oxidation und Kupplung mit Anilin erhaltenen StÀrke von A. Anstelle von MBTH wird 4-Aminophenazon eingesetzt, als Oxidationsmittel dient FeCl3. Die Auswertung erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.
Beispiel 3
A. Herstellung des Derivats
100 g unlösliche StĂ€rke werden in einer Lösung von 150 ml Wasser und 20 g NaOH suspendiert. Dann werden 10 ml Ortho-2,3-epoxyprophylphenol (hergestellt gemĂ€ss J.Org. Chem. 24 [1959] 1197) zugegeben und die erhaltene Mischung wird 5 Tage bei Raumtemperatur gerĂŒhrt. Das Produkt wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
o5
5
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B. Oxidative Kupplung mit 4-Aminophenazon
Zu einer Suspension von 10 mg des nach A. hergestellten Substrats in 10ml Phosphatpuffer (20 mMol/1), pH 7,0 unter Zusatz von 50 mMol/1 NaCl werden 0,1 ml die a-Amylase enthaltende Probe gegeben. Es wird 15 Minuten bei 30 °C inkubiert. Anschliessend wird der nicht in Lösung gegangene Anteil des Substrats abzentrifugiert. Zum Ăberstand werden 0,1 ml einer 0,5%igen wĂ€ssrigen Lösung von 4-Aminophenazon sowie 0,1 ml einer l%igen Lösung von K3[Fe(CN)6] gegeben. Die Extinktion des entstandenen Farbstoffs wird bei 578 nm gemessen.
Beispiel 4
POD-katalysierte oxidative Kupplung
Eine 2%ige wĂ€ssrige Lösung der mit Epoxypropyl-N-methylanilin derivatisierter Zulkowski-StĂ€rke von Beispiel 1 in 0,1 mol/1 Phosphatpuffer, pH 7,0, mit 0,06% NaCl und 2 U Glucoseoxidase (GOD)/ml wird mit Hilfe einer Schlauchpumpe ĂŒber einen Schlauch mit einem Fliessvolumen von 0,8 ml/min angesaugt. Nach Luftsegmentierung dieses FlĂŒssigkeitsstromes wird mit einem Fliessvolumen von 0,1 ml/min die Urinprobe zudosiert, weiterhin eine wĂ€ssrige Glucoselö-sung mit einer Konzentration von 200 mg/100 ml mit 0,1 ml/ min. Dieser FlĂŒssigkeitsstrom wird nach einer Inkubinations-zeit von 7 Minuten bei 45 °C oberhalb einer Dialysemembran entlanggeleitet. Die durch die a-Amylase abgespaltenen Ani-lin-StĂ€rke-BruchstĂŒcke und das durch die GOD-Reaktion entstandene H202 wandern durch die Membran, auf deren anderer Seite strömt netzmittelhaltiges Wasser mit einem Fliessvolumen von 0,6 ml/min. Zu diesem ebenfalls luftseg-mentierten, durch das Dialysat angereicherten FlĂŒssigkeitsstrom wird eine 0,05%ige wĂ€ssrige Lösung von MBTH und 5 U Peroxidase (POD)/ml in 0,1 mol/1 CitronensĂ€ure/Citrat-Puffer, pH 4,0 mit 0,42 ml/min zugegeben. Nach Mischen in einer Mischschlange wird der FlĂŒssigkeitsstrom durch eine 5 DurchflusskĂŒvette in einem Photometer geleitet. Die Extinktion des entstandenen Farbstoffs wird bei 560 nm gemessen und ĂŒber einen Schreiber aufgezeichnet. Durch Vergleich mit der Extinktion einer Probe mit bekannter Konzentration an a-Amylase wird die a-Amylasekonzentration in der unbe-10 kannten Probe ermittelt.
Beispiel 5
Diazokupplung mit Echtrotsalz
Es wird die Versuchsanordnung von Beispiel 1 verwendet. 15 Im SekundÀrkreislauf wird jedoch mit einem Fliessvolumen von 0,6 ml/min netzmittelhaltigem Wasser aufgenommen. Anstelle von MBTH wird eine 0,6%ige Lösung von Echtrotsalz in 0,025 N H2S04 mit einem Fliessvolumen von 0,4 ml/ min zugegeben.
20 Die Messung der Extinktion erfolgt bei 505 nm.
Herstellung eines Teststreifens
Filterpapier wird in Streifenform geschnitten und in eine Lösung von Epichlorhydrin in Aceton eingetaucht. Nach 1 25 Stunde werden die Streifen entnommen und mit einer nach Beispiel 1 A. hergestellten derivatisierten StĂ€rke beschichtet. Das beschichtete modifizierte Filterpapier wird mit erwĂ€rmter 2n NaOH behandelt. Hierbei erfolgt eine covalente VerknĂŒpfung zwischen Papier und StĂ€rke. Der so erhaltene Strei-30 fen wird noch mit Wasser gewaschen und getrocknet.
G
Claims (15)
1. Verfahren zur Bestimmung von a-Amylase unter Verwendung einer oligomeren oder polymeren StÀrke als Substrat, dadurch gekennzeichnet, dass man eine StÀrke verwendet, welche einen unter Farbstoffbildung kupplungsfÀhigen Substituenten trÀgt, die bei der Substratspaltung gebildeten niedermolekularen löslichen Spaltprodukte aus der stÀrkehaltigen Phase abtrennt, mit einer weiteren Farbstoffbildungskomponente kuppelt und den so gebildeten Farbstoff misst.
2. n substituiert ist, in der R ein Wasserstoffatom oder eine Alkyl-gruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder einen Rest Xâ(CH2)nâ, X eine zur Bildung einer covalenten Bindung mit einer OH-Gruppe der StĂ€rke geeignete Funktion und n die Zahl 1,2,3 oder 4 bedeuten.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine StÀrke verwendet, welche einen unter Farbstoffbildung kupplungsfÀhigen Substituenten auf je 6 bis 30 Glucoseeinheiten aufweist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man eine StÀrke verwendet, welche einen unter Farbstoffbildung kupplungsfÀhigen Substituenten auf je 15 bis 25 Glucoseeinheiten trÀgt.
4. Verfahren nach einem der AnsprĂŒche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man eine StĂ€rke verwendet, welche mit einer Verbindung der Formel I
X-(CH~)
5. Verfahren nach einem der AnsprĂŒche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man eine StĂ€rke verwendet, welche mit einer Verbindung der Formel II
x-<CH2>n umgesetzt ist, in der Rj ein Wasserstoffatom oder eine abspaltbare Schutzgruppe, z.B. eine Acylgruppe, darstellt und X und n die in Anspruch 4 angegebenen Bedeutungen aufweisen.
6. Verfahren nach einem der AnsprĂŒche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man eine StĂ€rke, bei der jede 10. bis 50. Glucoseeinheit oxidiert wurde, mit einem Anilin- bzw. Phenylhydrazin umsetzt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die entstandenen Schiffschen Basen bzw. Hydrazone durch Reduktion in die entsprechende Amine ĂŒberfĂŒhrt.
8. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass X eine Oxirangruppe, ein Halogenatom, eine SĂ€urechloridgruppe, Isocyanatgruppe, Isothiocyanatgruppe, Tosylatgruppe, Dichlortriazingruppe oder Mesilatgruppe bedeutet.
9. Verfahren nach Anspruch 4,5,6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass man als weitere Farbstoffbildungskomponente ein Diazoniumsalz verwendet.
10. Verfahren nach Anspruch 4, 5,6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass man als weitere Farbstoffbildungskomponente eine zur oxidativen Kupplung mit Phenolen oder Anilinen geeignete Verbindung verwendet.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man ein N-Alkyl-pyridon-(4)-hydrazon, N-Methyl-benzthiazolon-hydrazon, Aminodimethylanilin oder 1-Phe-
nyl-2,3-dimethyl-4-amino-3-pyrazolin-5-on verwendet.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass man zur oxidativen Kupplung FeCl3, Kalium-ferricyanid, Kupfersulfat, Silbernitrat, Natriumhypochlorit, Bleidioxid, Ce (S04)2, H202 oder ein H202 bildendes Reaktionssystem verwendet.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden AnsprĂŒche, dadurch gekennzeichnet, dass die Abtrennung des niedermolekularen löslichen Spaltprodukts durch Dialyse, Filtration oder Zentrifugation erfolgt.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man bei löslichen StĂ€rken die niedermolekularen löslichen Spaltprodukte durch Dialyse abtrennt, indem man aus einem ersten kontinuierlichen FlĂŒssigkeitsstrom die Spaltprodukte zu einem prozentualen Anteil in einen zweiten FlĂŒssigkeitsstrom dialysiert, den man auf der anderen Seite der Dialysemembran entlangfĂŒhrt.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Dialysemembran mit hoher DurchlÀssigkeit verwendet.
Das Enzym a-Amylase spaltet bekanntlich die ct-1,4-glycosidische Bindung in Polysacchariden, wie Amylose, Amylopectin und Glycogen sowie in deren Abbauprodukten mit einer KettenlÀnge von mindestens 3 D-Glucose-resten. Reaktionsprodukt ist das Disaccharid Maltose. Die Maltose kann z.B. von a-Glucosidase in Glucose gespalten werden, welche wiederum enzymatisch bestimmt werden kann. Bei dieser komplexen Nachweisreaktion stört unter anderem die im Serum schon enthaltene Glucose.
Bei einer anderen bekannten Nachweisreaktion fĂŒr a-Amylase nutzt man die bekannte JodstĂ€rke-reaktion. Dabei misst man das Verschwinden der blauen Farbe der Jodeinschlussverbindung im StĂ€rkemolekĂŒl. Da diese Einschlussverbindung von einer helikalen Kettenstruktur der StĂ€rke abhĂ€ngt, die nur teilweise vorliegt, ist diese Bestimmungsmethode relativ ungenau (DE-OS 2508714).
Eine grössere Bedeutung hat dagegen ein Bestimmungsverfahren erlangt, bei dem aus einer durch einen Farbstoff gefĂ€rbten unlöslichen StĂ€rke durch die Einwirkung der a-Amylase lösliche farbige BruchstĂŒcke freigesetzt werden, die dann die ĂŒberstehende Lösung anfĂ€rben. Die AnfĂ€rbung dieser Lösung ist ein Mass fĂŒr die Menge der a-Amylase. Neben der Schwierigkeit, ein reproduzierbar gleich stark vernetztes unlösliches StĂ€rkederivat herzustellen, stört bei dieser Methode auch stets der durch Hydrolyse freigesetzte Farbstoff, der einen gewissen Leerwert bedingt. Besonders störend wirkt sich auch das hohe Molekulargewicht des Reaktivfarbstoffs aus. Dies bedingt, dass in unmittelbarer Nachbarschaft der Bindungsstelle an der Zuckerkette aus sterischen GrĂŒnden kein Angriff durch die a-Amylase erfolgen kann. Die Konzentration des Farbstoffs auf der StĂ€rke kann daher nicht beliebig erhöht werden, wodurch auch die messbare Extinktion begrenzt ist. Da das Molekulargewicht von StĂ€rkebruchstĂŒcken im VerhĂ€ltnis zu dem des Farbstoffs relativ klein ist, ist z.B. auch keine Trennung von niedermolekularen, gefĂ€rbten BruchstĂŒcken von gefĂ€rbter löslicher StĂ€rke durch Dialyse möglich. Gerade eine derartige Abtrennung im fliessen-den Lösungssystem wĂ€re aber fĂŒr eine Bestimmung mit Analysenautomaten erwĂŒnscht.
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