CH640218A5 - Peptide derivatives - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Peptidderivate, aus denen Thymosin rJ.x oder \Asn2] -Thymosin «j hergestellt werden können, und zwar Verbindungen der allgemeinen Formel
HgC-CO-SerCR^-X-Ala-Ala-Val-AspCOR^-ThrCR^-SerCR1)--SerCR^-GluCOR^-Ile-ThrCR^-ThrCR^-LysCR^-AspCOR2)--Leu-Lys(R5)-Glu(OR4)-Lys(R5)-Lys(R5)-Glu(OR4)-Val-Val- ' -Glu(OR4)-Glu(OR4)-Ala-Glu(OR4)-Asn-OR6 (I)
worin
X Asn oder Asp (OR2);
R1 eine unter Bildung, der Hydroxygruppe des Serylrestes abspaltbare Gruppe;
R2, R4 und R6 eine unter Bildung einer Carboxylgruppe abspaltbare Gruppe;
R3 eine unter Bildung der Hydroxygruppe des Threonyl-
restes abspaltbare Gruppe und R5 eine unter Bildung der w-Aminogruppe des Lysylrestes abspaltbare Gruppe darstellen.
Die Überführung einer Verbindung I in Thymosin otj bzw. [Asn.2] -Thymosin kann beispielsweise durch Behandlung mit wasserfreiem Fluorwasserstoff erfolgen. Aus einer Verbindung
H3C-CO-Ser(R1)-Asp(OR2)-Ala-Ala-Val-Asp(OR2)-Thr(R3)--Ser(R1)-Ser(R1)-Glu(OR4)-Ile-Thr(R3)-Thr(R3)-Lys(R5)--Asp(OR2)-Leu-Lys(R5)-Glu(OR4)-Lys(R5)-Lys(R5)-Glu(OR4)--Val-Val-Glu(OR4)-Glu(OR4)-Ala-Glu(OR4)-Asn-OR6,
wobei R1-R6 die vorstehend angegebenen Bedeutungen haben, erhält man auf diese Weise Thymosin av während eine Verbindung
H3C-CO-Ser(R1)-Asn-Ala-Ala-Val-Asp(OR2)-Thr(R3)-Ser(R1)--Ser(R1)-Glu(OR4)-Ile-Thr(R3)-Thr(R3)-Lys(R5)-Asp(OR2)--Leu-Lys(R5)-Glu(OR4)-Lys(R5)-Lys(Rs)-Glu(OR4)-V al-V al--Glu(OR4)-Glu(OR4)-Ala-Glu(OR4)-Asn-OR6 [Asn2]-Thymosin tx1 liefert.
Besonders bevorzugte erfindüngsgemässe Verbindungen sind
H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr-(BzI)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)--Lys(Z)-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)--Glu(OBzl)-V al-V al-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)--Asn-OBzl und
H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)--Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)--Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)--V al-V al-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl, worin Bzl Benzyl und Z Benzyloxycarbonyl darstellen.
Beispiele von R1 sind Benzyl, Acetyl, Benzoyl, tert.-Bu-tyl, Trityl, 4-Brombenzyl, 2,6-Dichlorbenzyl und Benzyloxycarbonyl, wobei Benzyl bevorzugt ist. Beispiele von R2, R4 und R6 sind Arylgruppen, insbesondere Phenyl oder durch Alkyl, Halogen, Nitro, Mercapto oder substituiertes Mer-capto, wie Methylthio, substituiertes Phenyl; Aralkylgrup-pen wie Benzyl oder durch Methoxy, Halogen oder Nitro substituiertes Benzyl; Niederalkylgruppen wie Methyl, Äthyl, tert.-Butyl oder tert.-Amyl; substituierte Niederalkylgruppen wie 2-Haloäthyl, ß,ß-Dimethylaminoäthyl oder Cyanome-thyl; Benzhydryl- und Phenacylgruppen; wobei Benzyl bevorzugt ist. Beispiele von R3 sind Benzyl, Acetyl, Benzoyl, tert.-Butyl, Trityl, 2,6-Dichlorbenzyl, 4-Brombenzyl und Benzyloxycarbonyl, wobei Benzyl bevorzugt ist. Beispiel von R5 sind Benzyloxycarbonyl, das gegebenenfalls am aromatischen Ring durch 4-Chlor. 2-Brom, 4-Brom, 2,4-Dichlor, 4-Nitro, 4-Methoxy, 3,5-Dimethoxy, 4-Methyl, 2,5,6-Trime-thyl, 4-Phenylazo, 4-(4-Methoxyphenylazo), 2-(N,N-Dime-thylcarbamido) und 2-Nitro-4,5-dimethoxy substituiert sein kann; Schutzgruppen vom Urethantyp wie 4-Toluolsulfonyl-äthyloxycarbonyl, 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl und verwandte, unter basischen Bedingungen abspaltbare Gruppen, 4-Benzisoxazolylmethylenoxycarbonyl, Methylthio- und Methylsulfonyläthyloxycarbonyl, Isonicotinyloxycarbonyl, Haloäthyloxycarbonyl, Diisopropylmethyloxycarbonyl, Benz-hydryloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, Dinitrodiphenyl-
5
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15
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25
30
35
40
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methyloxycarbonyl, tert.-Butyloxycarbonyl, tert.-Amyloxy-carbonyl, Adamantyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, Methylcyclobutyloxycarbonyl, Methylcyclohexyloxycarbonyl, 2-Arylisopropyloxycarbonyl-gruppen wie 2-(p-BiphenyIyl)--isopropyloxycarbonyl, 2-(4-Pyridyl)-isopropyloxycarbonyI und ähnliche stickstoffhaltige Urethangruppen; Acylgruppen wie Formyl, Trifluoracetyl, Phthaloyl, Benzolsulfonyl, Aceto-acetyl, Chloracetyl, 2-Nitrobenzoyl, 4-Toluolsulfonyl, Sulfe-nylgruppen wie Benzolsulfenyl, o-Nitrophenylsulfenyl und ähnliche Sulfenylgruppen, sowie Aryl-niederalkyl-gruppen wie Diphenylmethyl und Triphenylmethyl, wobei die Benzyl-oxycarbonylgruppe bevorzugt ist.
Die Entfernung der Schutzgruppen aus den geschützten Octacosapeptiden der Sequenz I kann leicht nach an sich bekannten Methoden erfolgen, beispielsweise durch Behandlung mit wasserfreier Säure wie Fluorwasserstoff, vorzugsweise in Gegenwart von Anisol.
Ein geschütztes Octacosapeptid der Sequenz I kann er-findungsgemäss durch Kondensation eines geschützten Tetra-decapeptids der Sequenz
H3C-CO-Ser(R1)-X-Ala-Ala-Val-Asp(OR2)-Thr(R3)-Ser(R1)--Ser(R1)-Glu(OR4)-IIe-Thr(R3)-Thr(R3)-Lys(R5)-OR7 II
mit einem geschützten Tetradecapeptid der Sequenz H-Asp(OR2)-Leu-Lys(R5)-Glu(OR4)-Lys(R5)-Lys(R5)-Glu-(OR4)-V al-V al-Glu(OR4)-Glu(OR4)-Ala-Glu(OR4)--Asn-OR6 III
worin X, R\ R2, R3, R4, R5 und R6 wie oben definiert sind und R7 Wasserstoff oder eine aktivierende Gruppe darstellt, hergestellt werden.
Die Kondensation kann nach Methoden, die aus der Flüssigphasen-Peptidsynthese gut bekannt sind, erfolgen. So kann, zum Beispiel, das Amino-endständige Tetradecapeptid mit 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) und Dicyclohexylcarbo-diimid (DCC) zu dem aktivierten Ester umgesetzt werden, den man dann mit dem Carboxyl-endständigen Tetradecapeptid zu dem gewünschten geschützten Octacosapeptid reagieren lässt.
Die geschützten Tetradecapeptide können nach an sich bekannten Methoden hergestellt werden.
So wurde das geschützte Carboxyl-endständige Tetradecapeptid nach folgender Strategie erhalten:
Zunächst wurde H-Glu(OBzl)-OH an Boc-Ala-OSu zu dem Dipeptidfragment Boc-Ala-Glu(OBzl)-OH gekoppelt, das dann mit HCl. H-Asn-OBzl nach dem DCC/HOSu-Verfahren von Wünsch und Drees, Chem. Ber. 99, 110 (1966) kondensiert wurde. Das Hydrochloridsalz des Aspara-ginbenzylesters wurde aus Boc-Asn-OBzl hergestellt, das wiederum aus kommerziell erhältlichem Boc-Asn-OH und Benzylbromid nach der Cäsiumsalzmethode synthetisiert wurde. Die Boc-Schutzçruppe wurde durch 30minütige Behandlung mit 4N HCl in trockenem Tetrahydrofuran abgespalten.
Die Umsetzung von H-Glu(OBzl)-OH mit Boc-Glu-(OBzl)-OSu lieferte Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-OH in Form eines farblosen klaren Öles, das anschliessend für die Synthese des geschützten Pentapeptids Boc-Glu(OBzl)-GIu(OBzl)--AIa-Glu(OBzl)-Asn-OBzl verwendet wurde, wobei die Umsetzung in Gegenwart von DCC/HOSu mit HCl. H-Ala--Glu(OBzl)-Asn-OBzl stattfand, das aus Boc-Ala-Glu(OBzl)--Asn-OBzl durch Behandlung mit 4N HC1/THF gewonnen wurde. Das geschützte Pentapeptid wurde in reiner, kristalliner Form in guter Ausbeute erhalten.
Zur Herstellung des geschützten Octapeptids Boc-Glu-(OBzl)-V al-V al-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn--OBzl wurde zunächst das geschützte Tripeptid Boc-Glu-(OBzl)-Val-Val-OH hergestellt. Boc-Val-OSu wurde mit freiem Valin umgesetzt zu Boc-Val-Val-OH, das nach Deblockierung mit 4N HCl in THF und anschliessende Reaktion mit Boc-Glu(OBzl)-OSu das gewünschte Tripeptid in kristalliner Form als Cyclohexylaminsalz Boc-Glu(OBzl)--Val-Val-OH . CHA lieferte. Das Cyclohexylaminsalz wurde in die freie Säure übergeführt und dann mittels DCC in Gegenwart von HOSu mit HCl. H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala--Glu(OBzl)-Asn-OBzl, das aus Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala--Glu(OBzl)-Asn-OBzl durch Behandlung mit HCl in THF erhalten wurde, gekoppelt. Das geschützte Octapeptid Boc--Glu(OBzl)-V al-V al-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)--Asn-OBzI wurde in gereinigter Form als amorpher Feststoff erhalten und durch Hydrogenolyse sowie anschliessende Behandlung mit Trifluoressigsäure in der üblichen Weise in das freie Octapeptid Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn übergeführt. Es wurde gereinigt durch Ionenaustausch-Säulenchromatographie und lieferte ein dünnschichtchromato-graphisch und papierelektrophoretisch einheitliches Material.
Für die Herstellung des geschützten Undecapeptids Boc--Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzI)-Val-Val-Glu(OBzl)--Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl wurde zunächst ein Tripeptid synthetisiert aus Boc-Lys(Z)-OSu und H-Lys(Z)-OH. Das erhaltene Dipeptid Boc-Lys(Z)-Lys(Z)-OH wurde mit 4N HCl in THF behandelt und das erhaltene Salz HCl. H--Lys(Z)-Lys-(Z)-OH wurde dann mit Boc-Glu(OBzl)-OSu umgesetzt. Das so erhaltene Tripeptid Boc-Glu(OBzI)-Lys(Z)--Lys(Z)-OH wurde mit DCC und HOSu aktiviert nach Weygand et al., Z. Naturforsch. 21b, 426 (1966) und die Lösung des in situ gebildeten aktivierten Tripeptidesters Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-OSu wurde kombiniert mit dem Trifluoracetat von H-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu-(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl, das aus dem entsprechenden geschützten Octapeptid dürch 30minütige Behandlung mit TFA erhalten wurde. Nach Zusatz einer geringen Menge einer Base wurde das gewünschte geschützte Undecapeptid Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-V al-V al-GIu(OBzI)--Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl erhalten. Abspaltung der Schutzgruppen aus dem geschützten Udecapeptid mit wasserfreier Flussäure lieferte das freie Undecapeptid Glu--Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn, das nach Ionen-austausch-Säulenchromatographie papierelektrophoretisch einheitlich war.
Nach einem ähnlichen Schema erfolgte die Synthese des geschützten Tetradecapeptids Boc-Leu-OSu wurde an H-Lys-(Z)-OH gekoppelt und lieferte Boc-Leu-Lys(Z)-OH. Nach Entfernung der Na-Boc-Gruppe mit 4N HCl in THF und Umsetzung mit Boc-Asp(OBzl)-OSu wurde das geschützte Tripeptid Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-OH in kristalliner Form erhalten. Es wurde in den aktivierten Ester Boc-Asp(OBzl)--Leu-Lys(Z)-OSu übergeführt und mit dem Trifluoracetat von H-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu-(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl, erhalten durch Behandlung des entsprechenden geschützten Undecapeptids mit TFA, kondensiert. Das gewünschte Produkt, Boc-Asp-(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val--Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl, wurde in guter Ausbeute erhalten und war dünnschichtchromato-graphisch einheitlich. Das freie Tetradecapeptid Asp-Leu-Lys--Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn wurde aus der geschützten Verbindung durch Behandlung mit wasserfreier Flussäure und Reinigung an einer Ionenaustauschersäule erhalten.
In ähnlicher Weise wurde das geschützte Amino-endständige Tetradecapeptid H,C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala--Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzi)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)--Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH aus einem acetylierten Te-trapeptidfragment, einem Hexapeptid und einem weiteren Tetrapeptid unter Verwendung allgemein bekannter Methoden hergestellt.
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Zur Herstellung des Amino-endständigen acetylierten Tetrapeptids wurde H3C-CO-Ser(Bzl)-OBzl aus H3C-CO-Ser-(Bzl)-OH und Benzylgromid nach der Cäsiumsalzmethode gewonnen. Die Hydrazinolyse von H3C-CO-Ser(Bzl)-OBzl lieferte H3C-CO-Ser(Bzl)-HNNH2 in reiner kristalliner Form und in guter Ausbeute. Abspaltung der Schutzgruppe aus Boc-Ala-Ala-OH lieferte das Dipeptid-hydrochlorid HCl. H--Ala-AIa-OH. Die Kupplung dieses Dipeptids mit Boc-Asp-(OBzl)-OSu lieferte das geschützte Tripeptid Boc-Asp(OBzl)--Ala-Ala-OH, das als Dicyclohexylaminsalz isoliert wurde. Entfernung der Aminoschutzgruppe und Kondensation mit H3C-CO-Ser(Bzl)-HNNH2 nach der Azidmethode von Honzl und Rudinger, Collection Czech. Chem. Commun. 26, 2333 (1961), lieferte das teilweise geschützte Tetrapeptid H3C-CO--Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-AIa-Ala-OH, das mit einer äquivalenten Menge von Hydrazin in Gegenwart von DCC und HOBT das gewünschte H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-HNNH2 lieferte.
Zur Herstellung des geschützten Hexapeptids Boc-Val--Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(BzI)-Glu(OBzl)-HNNH2 wurde das Verfahren der stufenweisen Ketten Verlängerung vom C-terminalen Ende her angewendet. So wurde H-Glu-(OBzl)-OH mit Boc-Ser(Bzl)-OSu zu dem geschützten Di-peptid Boc-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH gekoppelt, das, nach Entfernung der Boc-Schutzgruppe und Umsatz mit Boc-Ser(Bzl)--OSu das Tripeptid Boc-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH lieferte. Abspaltung der Amino-Schutzgruppe und anschliessende Kondensation des erhaltenen Tripeptidssalzes HCl. H-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH mit Boc-Thr(Bzl)-OSu lieferte das geschützte Tetrapeptid Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)--Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH, von dem durch Behandlung mit HCl in THF die Boc-Schutzgruppe abgespalten wurde und das mit Boc-Asp(OBzl)-OSu zu dem geschützten Penta-peptid Boc-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)--OH umgesetzt wurde. Die Boc-Schutzgruppe dieser Verbindung wurde ebenfalls durch Behandlung mit HCl entfernt und das erhaltene Produkt HCl. H-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser-(BzD-Ser(Bzl)-Glu(OBzD-OH wurde anschliessend mit Boc--Val-OSu zu Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)--Glu(OBzl)-OH gekoppelt. Die Verbindung wurde in reiner kristalliner Form erhalten.
Die a-Carboxylgruppe des terminalen Glutaminsäurerestes im erhaltenen geschützten Hexapeptid wurde dann in eine Hydrazidfunktion durch Umsetzung mit einer äquivalenten Menge Hydrazin unter Verwendung von DCC als Kopplungsreagenz in Gegenwart von HOBT umgewandelt. Das gewünschte geschützte Hexapeptidhydrazid Boc-Val--Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-HNNH2 wurde in reiner kristalliner Form in guter Ausbeute erhalten.
Das geschützte Tetrapeptid Boc-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)--Lys(Z)-OH wurde ebenfalls stufenweise nach der N-Hy-droxysuccinimidester-Methode von Anderson et al., J. Amer. Chem. Soc. 86, 1839 (1964), hergestellt.
Die Umsetzung von Boc-Thr(Bzl)-OSu mit H-Lys(Z)-OH lieferte das Dipeptid Boc-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH in Form eines Öles, das nach Abspaltung der a-Aminoschutzgruppe mit Boc-Thr(Bzl)-OSu weiter zu dem Tripeptid Boc-Thr(Bzl)--Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH, einem kristallinen Produkt, umgesetzt wurde. Entfernung der Boc-Schutzgruppe und Umsetzung des erhaltenen Materials, HCl. T-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)--OH, mit Boc-Ue-OSu lieferten das gewünschte geschützte Tetrapeptid Boc -Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH in reiner, kristalliner Form nach Chromatographie an einer Kieselgelsäule. Dieses geschützte Tetrapeptid wurde dann nach Abspaltung der Amino-endständigen Schutzgruppe mit dem geschützten Hexapeptid Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)--Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-HNNH2 nach der Azidmethode kondensiert, wodurch das geschützte Decapeptid Boc-Val-Asp(OBzl)--Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)--Lys(Z)-OH in guter Ausbeute erhalten wurde.
Die Entfernung der Boc-Schutzgruppe aus dem Decapeptid mit TFA und anschliessende Kopplung an das N-termi-nale geschützte Tetrapeptid H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)--Ala-Ala-HNNH2 nach der Azidmethode lieferte das gewünschte geschützte Tetradecapeptid H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp-(OBzl)-Ala-Aala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)--Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH. In einer letzten Kopplungsreaktion wurde dieses Acetyltetradecapeptid aktiviert mit DCC und HOBT, und der erhaltene aktivierte Ester wurde dann mit TFA. H-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)--Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-GIu(OBzl)-Glu(OBzl)--Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl, das aus dem entsprechenden, an der endständigen Aminogruppe geschützten Tetradecapeptid durch Behandlung mit TFA gewonnen wurde, zu dem geschützten Acetyloctacosapeptid H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)--Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(BzI)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu-(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)--Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzI)-Val-VaI-Glu(OBzl)--Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl umgesetzt.
Durch Abspaltung aller Schutzgruppen mit wasserfreiem Fluorwasserstoff und Reinigung durch Ionenaustausch-chromatographie kann aus dieser Verbindung Thymosin ax erhalten werden.
In ähnlicher Weise wurde aus dem geschützten Tetradecapeptid H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-V al- Asp-(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)--Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH das freie Tetradecapeptid H3C-CO-Ser--Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-OH gewonnen.
Nach dem gleichen Schema wie für Thymosin beschrieben, kann die Synthese von [Asn2]-Thymosin erfolgen. Mit Ausnahme des N-terminalen Acetyltetrapeptid-hydrazids H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-HNNH2 wurden die gleichen Zwischenprodukte verwendet. Dieses Tetra-peptidhydrazid wurde folgendermassen erhalten: Zunächst wurde Boc-Ala-Ala-OH in Boc-Ala-Ala-OBzl übergeführt, das durch selektive Entfernung der Boc-Schutzgruppe mit HCl das Dipeptidestersalz HCl. H-Ala-Ala-OBzl lieferte. Dieses wurde dann mit Boc-Asn-OH under Verwendung der DCC/HOBT-Methode von König und Geiger (Chem. Ber. 103, 788 (1970)) zu dem geschützten Tripeptidester Boc--Asn-Ala-Ala-OBzl umgesetzt, von dem dann die Boc-Schutzgruppe durch Behandlung mit HCl in THF entfernt wurde. Das erhaltene Produkt, HCl. H-Asn-Ala-Ala-OBzl, wurde dann nach der DCC/HOBT- Methode mit H3C-CO-Ser-(Bzl)-OH . DCHA gekoppelt zu dem gewünschten geschützten Tetrapeptid H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-OBzl. Durch Hydrazinolyse dieser Verbindung wurde das entsprechende Hydrazid, H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-HNNH„ erhalten, das mit dem Decapeptidsalz TFA . H-Val-Asp(OBzl)-Thr-(BzI)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(BzI)--Lys(Z)-OH zu dem geschützten Tetradecapeptid H-C-CO--Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser-(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH kondensiert wurde. Diese Verbindung wurde dann mit dem an der end-ständigen Aminogruppe ungeschützten C-terminalen Tetra-decapeptid-TFA-Salz zu dem geschützten [Asn2l -Thymosin «j gekoppelt. Entfernung aller Schutzgruppen durch Behandlung mit wasserfreiem Fluorwasserstoff und anschliessende Ionenaustausch-Säulenchromatographie lieferte reines [Asn2]-Thymosin asj.
Von den im Text verwendeten Abkürzungen bedeuten: Boc = tert.-Butyloxycarbonyl; Bzl = Benzyl; DCC = Di-cyclohexylcarbodiimid- DMF =Dimethylformamid; THF = Tetrahydrofuran- HOSu = N-Hydroxysuccinimid; Triton
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B = 40% methanolische Lösung von Trimethylbenzylam-moniumhydroxid; NMM = N-Methylmorpholin; CHA = Cyclohexylamin; DCHA = Dicyclohexylamin; Z = Benzyloxycarbonyl; DMSO = Dimethylsulfoxid; TFA = Trifluor-essigsäure; DC = Dünnschichtchromatographie; Et3N = Triäthylamin; HOBT = 1-Hydroxybenzotriazol.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Synthese der er-findungsgemässen Verbindungen und deren Überführung in Thymosin at und [Asn2]-Thymosin im Detail. Die bei der Synthese verwendeten spezifischen Schutzgruppen können durch andere, dem Fachmann geläufige äquivalente Gruppen ersetzt werden.
Beispiel 1
A. a) 11,0 g Boc-Asn-OH wurden in 200 ml Methanol und 20 ml Wasser gelöst. Die Lösung wurde mit einer 20%-igen wässrigen Lösung von Cäsiumcarbonat (ca. 55 ml) auf ein pH von 7,0 eingestellt. Das Gemisch wurde zur Trockene eingeengt, der Rückstand noch zweimal bei 45°C aus je 120 ml DMF eingeengt und der so erhaltene weisse Rückstand mit 8,9 g Benzylbromid in 120 ml DMF 6 Stunden gerührt. Nach Einengen zur Trockene und Behandlung mit einer grossen Menge Wasser verfestigte sich das Produkt. Es wurde abfiltriert, in Äthylacetat aufgelöst, mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene gebracht und aus Äthylacetat/Petroläther umkristallisiert. Ausbeute: 13,8 g (90,3%) Boc-Asn-OBzl, F. 120-122°C, [a]D25 = -17,29° (c = 1, DMF).
13,7 g Boc-Asn-OBzl wurden in 80 ml THF gelöst und mit 500 ml AN HCl in THF behandelt. Das Gemisch wurde 45 Minuten stehengelassen, während welcher Zeit sich ein Niederschlag zu bilden begann. Behandlung mit 1003 ml Äther lieferte ein weisses festes Material, das abfiltriert, mit Äther gewaschen und über Natriumhydroxid im Vakuum getrocknet wurde. Ausbeute: 10,3 g (94%) HCl. H-Asn--OBzl, F. 122-126°C, [a]D25 = +6,82°.
b) 7,0 g fein zerriebenes H-Glu(OBzl)-OH und 8.8 g Boc-AIa-OSu wurden 48 Stunden in 250 ml DMF und 6 ml NMM gerührt. Es wurde weiteres NMM zugesetzt, um die Reaktion leicht basisch zu halten. Dann wurde das Lösungsmittel abgezogen und der Rückstand zwischen 300 ml Äthylacetat und 500 ml Wasser mit einem Gehalt von 2 ml 10%-iger Schwefelsäure verteilt. Die organische Phase wurde dreimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene gebracht. Der Rückstand wurde in einer geringen Menge Äther aufgenommen und mit einem grossen Volumen Petroläther behandelt. Es bildete sich ein weisser amorpher Niederschlag, der dünnschichtchromatographisch einheitlich war. Ausbeute: 11.0 g (91,5%) Boc-Ala-Glu-(OBzl)-OH, F. 84-88°C, [a]D25 = 8,08° (c = 1, DMF).
10.4 g Boc-Ala-Glu(OBzl)-OH, 6.56 g HCl. H-Asn-OBzl und 5.9 g HOSu wurden in 250 ml DMF bei 0°C gelöst. Es wurden 5,7 g DCC und 3,5 ml Triäthylamin zugesetzt. Das Gemisch wurde dann 2 Stunden bei 0°C und 40 Stunden bei 25°C gerührt, unter weiterem Zusatz von Triäthylamin, um die Reaktion leicht basisch zu halten. Die unlöslichen Nebenprodukte wurden abfiltriert, während das Filtrat zur Trockene eingeengt wurde. Der erhaltene ölige Rückstand verfestigte sich bei Behandlung mit Wasser. Das Rohprodukt wurde in Chloroform aufgenommen, dreimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Ein sich bildender Niederschlag wurde abfiltriert und das Filtrat wurde mit Petroläther behandelt. Es wurde ein kristallines Produkt erhalten. Ausbeute: 8,0 g (51,4%) Boc-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl, F. 102-105°C, [a]D25 = 12,5° (c = 1, DMF).
c) 4,74 g fein verriebenes H-Glu(OBzl)-OH und 0,7 g Boc-Glu(OBzl)-OSu wurden in DMF in Gegenwart von 3,6
ml NMM 36 Stunden gerührt. Die erhaltene Lösung wurde eingeengt und der zähflüssige Rückstand mit Wasser behandelt. Der Niederschlag wurde in Äthylacetat aufgenommen, mit 5 %ige Essigsäure und dreimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Es wurden 14,03 g eines klaren Öles erhalten, das unter Petroläther stehengelassen wurde. Schliesslich wurden 10,2 g (90%) öliges Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-OH erhalten, [a]D25 = —7,59° (c = 1, DMF). Das Produkt war dünnschichtchromatographisch einheitlich.
d) 28,2 g Boc-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl wurden 1 Stunde lang mit 1,1 Liter 4N HCl in THF behandelt. Durch Einengen wurde ein Öl erhalten, das noch zweimal mit THF aufgenommen und wieder eingeengt wurde. Bei Behandlung mit einer grossen Menge Äther ging das Öl in festes HCl. H-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl über- das mit 25,6 g Boc-Glu-(OBzl)-Glu(OBzD-OH, 10,6 g HOSu und 10,9 g DCC in 540 ml DMF eine Stunde bei 0°C und dann 48 Stunden bei 25°C gerührt wurde. Es wurde Triäthylamin zugesetzt, um die Reaktion leicht basisch zu halten. Die unlöslichen Nebenprodukte wurden abfiltriert, während das Filtrat zur Trockene eingeengt wurde. Das Rohprodukt wurde in Chloroform aufgenommen, dreimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Bei Behandlung mit Petroläther verfestigte sich das Produkt. Umkristallisa-tion aus Isopropanol lieferte 28,9 g (59,8%) Boc-Glu(OBzl)--Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl, F. 169-175°C, [a]D25 = —11,78° (c = 1, DMF).
3,9 g Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl wurden 30 Minuten lang mit 15 ml 4N HCl in THF behandelt. Dann wurden 210 ml Äther zugesetzt. Der Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und aus Äthanol und Äther umkristallisiert. Ausbeute: 2,58 g (75,1%) HCl. H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl, F. 148-151°C, [a]D25 = -3,65° (c = 1, DMF).
e) 12,6 g Boc-Val-OSu und 4,68 g Valin wurden 96 Stunden lang in 250 DMF in Gegenwart von 2 ml Triäthylamin miteinander umgesetzt. Es wurde weiteres Triäthylamin zugesetzt, um die Reaktion leicht basisch zu halten. Das unlösliche Material wurde abfiltriert, während das Filtrat bei 45°C eingeengt wurde. Der Rückstand wurde zwischen Äther und verdünnter Schwefelsäure (ca. 1 %) verteilt und die organische Phase dreimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Das erhaltene Produkt wurde aus Äther und Petroläther umkristallisiert. Ausbeute: 12.2 g (96,4%) Boc-Val-Val-OH, F. 155-158°C, [a]D25 = +1,10° (c = 1, DMF).
40,5 g Boc-Val-Val-OH wurden eine Stunde lang mit 1,8 Liter 4N HCl in THF behandelt. Einengen und Behandlung mit Äther lieferte 34.5 g HCl. H-Val-Val-OH in Form eines weissen amorphen Pulvers, das mit 55,6 g Boc-Glu-(OBzl)-OSu in 1 Liter DMF während 24 Stunden in Gegenwart von 54 ml Triäthylamin umgesetzt wurde. Das Gemisch wurde von unölslichen Material befreit und zur Trok-kene eingeengt. Der ölige Rückstand wurde in 1,5 1 Äthylacetat aufgenommen, die Lösung zweimal mit 5%iger Essigsäure und dreimal mit Wasser gewaschen, die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingeengt. Es wurde ein farbloses klares Öl erhalten, das nicht kristallisierte. Es wurde in 3,2 1 Äther gelöst und mit 17 ml CHA auf pH 7,5 eingestellt. Der erhaltene feste Rückstand wurde abfiltriert und aus Methanol und Äther umkristallisiert. Ausbeute: 58.9 g (72,7%) Boc-Glu(OBzl)-Val-Val--OH . CHA, F. 158-160°C, [a]D25 = 33,41° (c = 1, MeOH).
Zu einer Suspension von 1,69 g Boc-Glu(OBzl)-Val-Val--OH . CHA in 40 ml Wasser und 40 ml Äthylacetat wurden in einem Schütteltrichter 4 ml 1 M Schwefelsäure gegeben. Nach starkem Schütteln löste sich das Produkt und die or5
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ganische Phase wurde mehrmals mit Wasser gewaschen,
über Natriumsulfat getrocknet und zu einem Öl eingeengt. Das so erhaltene freie Tripeptid wurde mit 2,58 g HCl. H--Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-AIa-Glu(OBzl)-Asn-OBzl in 15 ml DMF in Gegenwart von 0,612 g HOSu, 0,3 NMM und 0,63 g DCC kondensiert, wobei das Reaktionsgemisch 1 Stunde bei 0°C und 60 Stunden bei 25°C gehalten wurde. Es wurde weiteres NMM zugesetzt, um die Reaktion leicht basisch zu halten. Unlösliche Nebenprodukte wurden abfiltriert, während das Filtrat bei 45°C eingeengt wurde. Der erhaltene ölige Rückstand verfestigte sich bei Zusatz von Wasser. Das Rohprodukt wurde in 50 ml DMF gelöst und mit 300 ml Methanol wieder ausgefällt. Ausbeute: 2,25 g (58,7%) Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala--Glu(OBzl)-Asn-OBzl, F. 277-280°C, [a]D25 = -12,43° (c = 1, DMF).
0,72 g dieses Produktes wurden über 0,5 g eines 5 %igen Pd/BaS04-KataIysators 3 Stunden bei 3,4 Atmosphären in einem Gemisch aus 40 ml DMF, 30 ml Methanol und 2 ml Wasser hydriert. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat zur Trockene eingeengt. Anschliessend wurde während 30 Minuten mit 5 ml TFA behandelt und der nach Einengen erhaltene Rückstand wurde mehrere Male mit Äther behandelt. Der resultierende weisse Rückstand wurde in 20 ml Wasser aufgenommen und lieferte nach Lyophilisation 0,47 g eines Rohprodukts, das auf eine Säule (3 X 32 cm) eines stark basischen Polystyrolharzes (Bio-Rad AG1-X 2), equi-Iibriert mit Ammonacetatpuffèr vom pH 8,1 (2% ige Essigsäure, die mit Ammoniak auf pH 8,1 eingestellt wurde) gegeben wurde. Die Säule wurde sukzessive mit jeweils 200 ml 0,025 M Ammoniumacetat (pH 5,5), 0,025 M HOAc, 0,05 M HOAc, 0,1 M HOAc, 0,25 M HOAc, 0,5 M HOAc, 0,75 M HOAc und 1 M HOAc eluiert. Es wurden Fraktionen von jeweils 12 ml gesammelt und jede Fraktion wurde dünn-schichtchromatographisch untersucht. Die Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthielten (Fraktionen 225-229) wurden vereinigt und lieferten nach zweimaliger Lyophilisation 0.223 g (48,1%) reines Glu-Val-Val-Glu-GIu-Ala-Glu--Asn, das dünnschichtchromatographisch und papierelektrophoretisch einheitlich war.
f) 15 g Boc-Lys(Z)-OH wurden mit 5,8 g HOSu und 8,66 g DCC in 200 ml THF 3 Stunden gerührt. Ein unlösliches Nebenprodukt wurde abfiltriert und das Filtrat wurde zur Trockene eingeengt. Der zurückbleibende Sirup (24,2 g) wurde mit 150 ml Isopropanol und 150 ml Petroläther behandelt und lieferte 21 g Boc-Lys(Z)-OSu in öliger Form. Es wurde mit 10,6 g H-Lys(Z)-OH in 250 ml DMF in Gegenwart von 5,5 ml Triäthylamin 72 Stunden lang umgesetzt. Während der Reaktion wurde weiteres Triäthylamin zugesetzt, um das Reaktionsgemisch leicht basisch zu halten. Das Gemisch wurde dann filtriert und das Filtrat bei 45°C eingeengt. Der erhaltene ölige Rückstand wurde mit einem Liter 5%iger Essigsäure behandelt. Der gebildete Niederschlag wurde mit Äthylacetat extrahiert und die organische Phase wurde mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt zu einem öl, das aus 300 ml Äthylacetat und 10 ml DCHA kristallisiert wurde. Umkristallisa-tion aus Methanol und Äther lieferte 22,7 g (72.5%) Boc--Lys(Z)-Lys(Z)-OH . DCHA, F. 160-162°C, [a]D25 = -2,21° (c = 1, MeOH).
10 g Boc-Lys(Z)-Lys(Z)-OH . DCHA wurden zwischen einem Liter Äthylacetat und einem Liter 0,1 N H2S04 verteilt. Die organische Phase wurde dreimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingeengt. Die erhaltene freie Säure, Boc-Lys(Z)-Lys(Z)-OH, wurde während 30 Minuten mit frisch bereiteter 4N HCl in THF behandelt. Das Lösungsmittel und überschüssige Säure wurden durch Einengen bei 30°C abgezogen, während der
Rückstand zweimal mit THF aufgenommen und wieder eingeengt wurde. Der erhaltene Rückstand, HCl. H-Lys(Z)--Lys(Z)-OH, verfestigte sich bei Behandlung mit Äther,
wurde abfiltriert und mehrere Male mit Äther gewaschen. Das erhaltene Produkt, 6,7 g, wurde in 70 ml DMF gelöst, in einem Eisbad abgekühlt, mit 1,63 ml Triäthylamin und 5,54 g Boc-Glu(OBzl)-OSu versetzt. Das Gemisch wurde
1 Stunde bei 0°C und 24 Stunden bei 25°C gerührt. Es wurde weiteres Triäthylamin zugesetzt, um ein pH von 7,5 aufrecht zu erhalten. Schliesslich wurde mit einigen ml Essigsäure angesäuert (pH 3,5) und das Lösungsmittel wurde abgedampft. Der erhaltene Rückstand wurde in Äthylacetat aufgenommen, dreimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingeengt. Nach Behandlung mit Äther und Umkristallisation aus Äthylacetat wurden 7,26 g (69,5%) Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-OH, F. 153-155°C, [a]D25 = -2,71° (c = 1, THF), erhalten.
g) 1,7 g Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)--Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl wurden während 30 Minuten mit 24 ml TFA behandelt. Nach Entfernung der überschüssigen Säure durch Eindampfen bei 30°C wurde der Rückstand mit Äther behandelt. Das erhaltene Pulver wurde sorgfältig mit Äther und Petroläther gewaschen, im Vakuum über Natriumhydroxid getrocknet und lieferte 1,71 g des Trifluor-acetats des Octapeptids. Dann wurde der aktivierte Ester Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-OSu in situ durch Umsetzung von 0,995 g Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-OH mit 0,16 g HOSu und 0,274 g DCC in 15 ml DMF während 3 Stunden bei 0°C erzeugt. Dieser Lösung wurden 1,71 g des Octa-peptidsalzes CF3COOH. H-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)--Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl zusammen mit 0,2 ml Triäthylamin zugesetzt. Nach Zusatz einiger weiterer Tropfen Triäthylamin und 15 ml DMF wurde das Gemisch
3 Tage bei 25°C gerührt, mit Essigsäure angesäuert und dann mit Wasser behandelt. Der weisse Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser, Methanol und Äther gewaschen, so dass 2,25 g eines Rohproduktes mit dem Schmelzpunkt 310-313°C erhalten wurden, das in DMF gelöst und mit Methanol wieder ausgefällt wurde. Ausbeute: 1,75 g (68,3%) Boc-Glu-(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu-(OBzl)-Ala-Glu(OBzD-Asn-OBzl, F. 314-316°C, [«]D25 = 13,68° (c = 1, DMSO). Das Material war dünnschichtchromatographisch einheitlich.
0,5 g Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val--Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl wurden in
2 ml TFA gelöst und während 15 Minuten mit 15 ml Flusssäure bei 0°C gerührt. Nach Verdampfen überflüssiger Säure bei 0°C wurde der Rückstand in 5%iger wässriger Essigsäure gelöst, die Lösung dreimal mit Äther gewaschen, eingeengt und lyophilisiert. Es wurden 0,34 g rohes Glu-Lys-Lys-Glu--Val-Val-GIu-GIu-Ala-GIu-Asn erhalten, das durch Chromatographie an einer Jonenaustauschersäule gereinigt wurde. Ausbeute: 0,13 g (42,1%). [œ]D25 = —85,65° (c = 1, H20).
h) 4,0 g Boc-Leu-OSu und 3,42 g H-Lys(Z)-OH wurden in 75 ml DMF in Gegenwart von 1,7 ml Triäthylamin während 48 Stunden kondensiert. Durch periodischen Zusatz von Triäthylamin wurde das pH auf 7,5 gehalten. Unlösliches Material wurde abfiltriert und das Filtrat zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde in 200 ml Äther gelöst, die Lösung mit 3 ml DCHA behandelt, der kristalline Niederschlag mit Äther gewaschen und aus Methanol und Äther umkristallisiert. Ausbeute: 5.7 g (69,5%) Boc-Leu-Lys(Z)--OH . DCHA, F. 140-142°C, [a]D25 = -7,20° (c = 1, MeOH).
2,97 g Boc-Leu-Lys(Z)-OH . DCHA wurden in die freie Säure überführt (verteilt zwischen Äthylacetat und 0,1 N H2S04) und das erhaltene farblose Öl (2,2 g) wurde während 30 Minuten mit 4N HCl in 40 ml THF behandelt. Über5
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schüssige Säure und Lösungsmittel wurden durch Erwärmen auf 30°C abgezogen und der Rückstanl wurde mit Äther behandelt. Das verbleibende Öl wurde in Äther gelöst, eingeengt und noch zweimal jeweils nach Zusatz von Äther eingeengt. Der Rückstand wurde schliesslich mit 1,85 g Boc-Asp-(OBzl)-OSu in Gegenwart von 1,85 ml Triäthylamin über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde zur Trockene eingeengt und lieferte einen öligen Rückstand, der in Äthylacetat aufgenommen, dreimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingeengt wurde. Das so erhaltene Rohprodukt wurde aus Äthylacetat und Petroläther kristallisiert und lieferte 1,52 g (49,6%) reines Boc--Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-OH, F. 109-111°C, [a]D25 = -16,14° (c = 1, DMF).
1,2 g Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val--Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl wurden während 30 Minuten mit 35 ml TFA behandelt. Überschüssige Säure wurde schnell abgezogen und der Rest mehrere Male mit Äther behandelt, so dass 1,2 g des Undecapeptid TFA-Salzes in Form eines weissen Pulvers erhalten wurde. Das Salz wurde in einem Gemisch aus 5 ml DMF und 2 ml DMSO gelöst und mit in situ durch Rühren von 0,381 g Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-OH während 3 Stunden bei 0°C mit 0,126 g HOSu und 0,124 g DCC in 3 ml OMF erzeugtem Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-OSu behandelt. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 0°C und dann 3 Tage bei 25°C gerührt, während welcher Zeit periodisch Triäthylamin zugesetzt wurde, um ein leicht basisches Milieu aufrecht zu erhalten. Die sich bildende gelatinöse Substanz wurde mit 5%-iger Essigsäure behandelt und der resultierende weisse Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser, Methanol und Äther gewaschen und lieferte 1,28 g rohes Boc-Asp(OBzl)-Leu--Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzI)-Val-VaI-Glu-(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl, F. 325-326°C. Umfällung aus DMF/DMSO (10 ml/5 ml) und Methanol (230 ml) lieferte 1,22 g (80.2%) reines Material, F. 326-237°C, [a]D25 = -15,71° (c = 1, DMF/DMSO).
1,128 g dieses Produkts wurden mit 7 ml Anisol gemischt und 15 Minuten mit 25 ml wasserfreier Flussäure bei 0°C behandelt. Überschüssige Säure wurde bei 0°C abgezogen und der verbleibende Rückstand zwischen Wasser und Äther verteilt. Die wässrige Phase wurde zweimal mit Äther gewaschen, auf die Hälfte des ursprünglichen Volumens eingeengt und lyophilisiert. Es wurden 0,69 g Rohmaterial erhalten das in der oben für das Octapeptid beschriebenen Weise chromatographiert wurde. Das in den Fraktionen 101-120 eluierte Material wurde vereinigt, lyophilisiert und lieferte 0.25 g eines Produkts, das noch leicht verunreinigt war. Es wurde daher an der gleichen Säule rechromatographiert und lieferte 0,155 g (22%) reines Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys--Glu-Val-Val-Glu-Glu-AIa-Glu-Asn, [a]D25 = -86,27° (c = 1, 0,1 N HCl). Das Material war papierelektrophoretisch einheitlich.
B. a) Eine Lösung von 18,6 g H-Ser(Bzl)-OH in 45 ml Triton B wurde zur Trockene eingeengt, der Rückstand zweimal mit jeweils 100 ml DMF aufgenommen und wieder eingeengt und schliesslich 20 Stunden mit 16,9 g AcOSu in 150 ml DMF gerührt. Von Zeit zu Zeit wurde N-Methyl-morpholin zugesetzt, um das Reaktionsmedium leicht basisch zu halten. Es wurde das Lösungsmittel enfernt und mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit einer geringen Menge 10%iger Essigsäure und Wasser (da das Produkt wasserlöslich ist, wurde ein sehr geringes Volumen Wasser verwendet) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Es wurden 14,5 g Ac-Ser(Bzl)-OH in Form eines klaren Öles erhalten, das nicht kristallisierte. Die Verbindung wurde in einem Gemisch aus 300 ml Methanol und 30 ml Wasser gelöst, die Lösung mit 20%igem Cs2COs auf pH 7,0 titriert und dann bis zur Trockene eingeengt. Das erhaltene Salz wurde noch zweimal mit DMF aufgenommen und wieder eingeengt und schliesslich mit 15,4 g Benzylbromid in 250 ml DMF während 18 Stunden gerührt. 5 Nach Abziehen des Lösungsmittels wurde der Rückstand in 600 ml Wasser aufgenommen und die erhaltene ölige Lösung mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Die Kristallisation aus Äthylacetat und Petroläther io lieferte 10,42 g (32,2%) H3C-CO-Ser(Bzl)-OBzl, F. 89-91°C.
Eine Lösung von 2,2 g H3C-CO-Ser(Bzl)-OBzl in 75 ml Äthanol wurde über Nacht mit 5 ml Hydrazin gerührt. Unlösliches Material wurde abfiltriert und das Filtrat zu einem Öl, das sich bei Behandlung mit Äther verfestigte, einge-15 engt. Umkristallisation aus einer geringen Menge Äthanol und Äther lieferte 1,40 g (82,8%) H3C-CO-Ser(Bzl)-HNNH2, F. 128-130°C, [a]D25 = +5,80° (c = 1, MeOH).
b) Eine Lösung von 3,57 g L-Alanin in 18,8 ml Triton B wurde zur Trockene eingeengt und der ölige Rückstand 20 zweimal mit jeweils 30 ml DMF aufgenommen und wieder eingeengt. Das erhaltene Salz wurde 20 Stunden mit 11,45 g Boc-Ala-OSu in 40 ml DMF und 4 ml NMM gerührt. Das Lösungsmittel wurde entfernt und der Rückstand in 100 ml 10%iger Essigsäure aufgenommen. Das Reaktionsprodukt 25 wurde in Essigester extrahiert (4 X 100 ml), der Extrakt zweimal mit einem geringen Volumen Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, auf ein kleines Volumen eingeengt und mit Petroläther solange behandelt bis die Lösung wolkig wurde. Beim Stehenlassen über Nacht bildete 30 sich im Kühlschrank ein kristallines Produkt. Ausbeute: 8,2 g (76,3%) Boc-Ala-Ala-OH, F. 115-118°C.
36,2 g Boc-Ala-Ala-OH wurden 30 Minuten lang mit 3 1 4 N HCl in THF behandelt. Einengen und Aufarbeitung in der üblichen Weise lieferten ein öliges Produkt, das sich bei 35 Behandlung mit Äther verfestigte. Umkristallisation aus Methanol mit Äther lieferte 9,1 g (33,3%) HCl. H-Ala--Ala-OH, F. 209-211°C.
Eine in einem Eisbad gekühlte Lösung von 2,36 g HCl. H-Ala-Ala-OH in 20 ml DMF wurde mit 1,68 ml (12 mmol) 40 Triäthylamin behandelt und mit 12 mmol Boc-Asp(OBzl)--OSu versetzt. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 0° und dann über Nacht bei 25°C gerührt unter Zusatz eines weiteren Äquivalents Triäthylamin (12 mmol) um das pH auf etwa 8,0 zu halten. Nach Zusatz einiger ml Essigsäure wurde 45 das Gemisch zur Trockene eingeengt, mit Äthylacetat extrahiert, der Extrakt dreimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zu einem öligen Rückstand eingeengt. Dieser wurde in Äthylacetat aufgelöst und mit DCHA auf pH 8,0 titriert. Es fiel ein kristallines Salz aus, das aus 50 Isopropanol und Petroläther umkristallisiert wurde. Ausbeute: 5,1 g (65,7%) Boc-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH . DCHA, F. 138-141°C, [a]D25 = -13,33° (c = 1, MeOH).
3,5 g Boc-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH . DCHA wurden zwischen 500 ml Äthylacetat und 350 ml Wasser, enthaltend 55 10 ml 10% ige Schwefelsäure, verteilt. Die wässrige Phase wurde mit 250 ml Äthylacetat extrahiert und die vereinigten Äthylacetatphasen wurden zweimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene eingeengt und lieferten 2,5 g rohes Boc-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH. Dieses Ma-6o terial wurde während 30 Minuten mit 200 ml frisch hergestelltem 4 N HCl in THF behandelt. Nach Einengen bei 32°C zu einer sirupösen Flüssigkeit, zweimaliger Wiederaufnahme und Einengung mit THF wurde HCl. H-Asp(OBzl)--Ala-Ala-OH in Form eines öligen Rückstandes erhalten, der 65 sich bei Behandlung mit Äther verfestigte. Ein Gemisch aus 1,24 g H3C-CO-Ser(Bzl)-HNNH2 in 25 ml DMF wurde bei —25°C mit 7,42 ml 3,3 N HCl in THF und 0,99 ml Iso-amylnitrit 30 Minuten gerührt. Die Azidlösung wurde auf
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—35°C abgekühlt, mit 4,1 ml Triäthylamin vermischt und dann mit 1,93 g HCl. H-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH versetzt. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei —20°C und dann 2 Tage bei 4°C gerührt. Weiteres Triäthylamin wurde zugesetzt, um die Reaktion leicht basisch zu halten. Aufarbeitung in üblicher Weise lieferte eine kristalline Substanz, die aus THF und Petroläther umkristallisiert wurde. Ausbeute: 1,85 g (65,6%) H,C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH, F. 167-170°C, [aJn25 = -18,91° (c = 1, DMSO).
Zu einer im Eisbad auf 0°C abgekühlten Lösung von 0.825 g H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH in 4 ml DMF wurden 54,3 mg Hydrazin, 0,475 g HOBT . HaO und 0,32 g DCC gegeben. Das Gemisch wurde mit NMM auf pH 7,5 eingestellt und 2 Stunden bei 0°C sowie anschliessend 17 Stunden bei 25°C gerührt. Es verfestigte sich zu einem Gel und wurde mit Methanol verdünnt. Das feste Material wurde abfiltriert und sorgfältig mit Methanol, Äther und Petroläther gewaschen. Es wurde eine Substanz vom Schmelzpunkt 229-232°C erhalten, die umgefällt wurde aus DMF und Methanol und 0,51 g (61,0%) H3C-CO-Ser(OBzl)--Asp(OBzl)-Ala-Ala-HNNH2, F. 230-232°C, [a]D25 = — 17,94° (c = 1, DMSO), lieferte.
c) Eine Lösung von 39,4 g H-Glu(OBzl)-OH und 65,0 g Boc-Ser(Bzl)-OSu in 900 ml DMF und 2,3 ml Triäthylamin wurde über Nacht gerührt, wobei weiteres Triäthylamin zugesetzt wurde, um die Reaktion leicht basisch zu halten. Die Lösung wurde zur Trockene eingeengt und der ölige Rückstand zwischen 1,5 Liter Äthylacetat und 2 Liter Essigsäure verteilt. Die organische Phase wurde zweimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zu einem klaren Öl eingeengt (90,0 g), das in 3 Litern Äther aufgenommen und mit 25 ml Cyclohexylamin behandelt wurde. Der gebildete Feststoff wurde aus Methanol und Äther umkristallisiert. Ausbeute: 76,2 g (74,8%) Boc-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)--OH . CHA, F. 154-156,5°C, [<x]D25 = +6,32° (c = 1, MeOH).
76,2 g Boc-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH . CHA wurden in einem Gemisch aus 1,5 Litern Wasser und 1.5 Litern Äthylacetat suspendiert. Diesem Gemisch wurde 10%ige Schwefelsäure bis zu einem pH von etwa 2.5 zugesetzt, wobei Lösung eintrat. Die organische Phase wurde zweimal mit Wasser gewaschen, getrocknet, zur Trockene eingeeengt und lieferte 68,5 g eines klaren Öles, das mit 3 1 frisch hergestellter 4,1 N HCl in THF 45 Minuten behandelt und zur Trockene eingeengt wurde. Nach weiterem zweimaligem Aufnehmen mit THF und Einengen wurde als Rückstand HCl. H-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH erhalten, das in 500 ml DMF aufgenommen, auf 0°C abgekühlt und mit 48.66 g Boc-Ser-(Bzl)-OSu sowie 27 ml Triäthylamin versetzt wurde. Das Gemisch wurde über Nacht bei 25°C gerührt unter weiterem Zusatz von Triäthylamin, um ein leicht basisches Milieu zu gewährleisten. Kleine Mengen unlöslicher Substanz wurden durch Filtration abgetrennt, und das Filtrat wurde eingeengt, der Rückstand in Äthylacetat aufgenommen, mit 5%iger Essigsäure und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingeengt. Nach Kristallisation aus Äthylacetat mit Petroläther wurden 71.8 g (83.7%) Bac-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH, F. 112-113°C, [a]D25 = +17.91° (c = 1, THF), erhalten.
71.6 g Boc-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH wurden 45 Minuten mit 3,7 Litern frisch bereiteter 3.9 N HCl in THF behandelt und dann zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde noch zweimal mit THF aufgenommen und wieder eingeengt. Der erhalteie feste Rückstand (59.3 g), F. 161-165°C, wurde mit Äther gewaschen und in 500 ml DMF in Gegenwart von 25 ml Triäthylamin mit 38.2 g Boc-Thr(Bzl)--OSu eine Stunde bei 0°C und dann 15 Stunden bei 25°C gerührt unter Zusatz von weiteren 14.5 ml Triäthylamin, um ein leicht basisches Reaktionsmilieu zu gewährleisten. Unlösliches Material wurde abfiltriert, das Filtrat zu einem Öl eingeengt, in 1,5 Litern Äthylacetat gelöst, mit 5%iger Essigsäure und zweimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Kristallisation aus Äthylacetat mit Petroläther lieferte 64,8 g (78,1 %) Boc-Thr(Bzl)--Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu-(OBzl)-OH, F. 115-118°C, [a]D2B = + 11,64° (c = 1, DMSO).
54,5 g Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH wurden mit 1,5 1 4,1 N HCl in THF behandelt und lieferten nach der üblichen Aufarbeitung 46,3 g HCl. H-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)--Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH in Form eines weissen Pulvers, das dann in 500 ml DMF mit 23,7 g Boc-Asp(OBzl)-QSu in Gegenwart von 16 ml Triäthylamin zunächst 2 Stunden bei 0°C und dann 15 Stunden bei 25°C unter weiterem Zusatz von 7,4 ml Triäthylamin gerührt wurde. Übliche Aufarbeitung und Kristallisation aus CH2C12 und Petroläther lieferte 50,35 g (82,7%) Boc-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)--Glu(OBzl)-OH, F. 111-113°C, [a]D25 = +7,21° (c = 1, DMSO).
50,0 g Boc-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu-(OBzl)-OH wurden mit 4,15 N HCl in THF behandelt und in üblicher Weise aufgearbeitet. Es wurden 45,4 g einer weissen Substanz erhalten, die in 1,5 1 THF gelöst und mit 7 Litern Äther behandelt wurden. Nach Stehen über Nacht bei 0°C wurden 44,0 g HCl. H-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH, F. 179-184°C, erhalten. 43,7 g dieses Materials wurden in 500 ml DMF gelöst, die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und mit 15,4 Boc-Val-OSu und 10 ml Triäthylamin behandelt. Das Gemisch wurde 15 Stunden gerührt unter Zusatz von weiteren 7,9 ml Triäthylamin, um die Reaktion leicht basisch zu halten. Unslösliches Material wurde abfiltriert und das Filtrat zur Trockene eingeengt. Der ölige Rückstand wurde in CH,C12 gelöst, mit 5 %-iger Essigsäure und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und auf ein Volumen von 0,5 1 eingeengt. Nach Zusatz von Petroläther kristallisierte über Nacht langsam Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH aus. Umkristallisation aus THF und Isopropanol lieferte eine Ausbeute von 26.3 g (51,4%); F. 174-177°C, [«]D25 = + 0,84° (c = 1, THF).
Eine auf 0°C gekühlte Lösung von 13,0 g Boc-Val-Asp-(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH in 50 ml DMF wurde mit 0,421 g Hydrazin, 3,688 g HOBT und 2,48 g DCC behandelt. Mit NMM wurde ein pH von 7,5 eingestellt. Das Gemisch wurde 18 Stunden gerührt, filtriert, das Filtrat zur Trockene eingeengt und der Rückstand mit Wasser behandelt. Der erhaltene Feststoff wurde aus DMF und Isopropanol umkristallisiert und lieferte 8,7 g (66,4%) Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)--HNNH2. F. 215-218°C, [a]D25 = +7,62° (c = 1, DMSO).
d) Eine Lösung von 14,0 g Boc-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH in 500 ml A N HCl in THF wurde zur Trockene eingeengt und der Rückstand noch zweimal mit THF aufgenommen und wieder eingeengt. Der ölige Rückstand verfestigte sich bei Behandlung mit Äther. Das getrocknete Material (11,4 g) wurde in 140 ml DMF gelöst, die Lösung auf 0°C abgekühlt und mit 8 8g Boc-Thr(Bzl)-OSu sowie 3,5 ml Triäthylamin behandelt. Es wurde 24 Stunden bei 25°C unter Zusatz einiger weniger Tropfen Triäthylamin, um die Reaktion leicht basisch zu halten, weitergerührt, dann mit 5 ml Essigsäure angesäuert und mit einem grossen Volumen Wasser verdünnt. Das ausgefallene Produkt wurde in Äthylacetat gelöst, die Lösung mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingeengt. Umkristallisation aus Äthylacetat und Petroläther lieferte 13,8 g (83,7%) Boc-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH. F. 110-112°C, [a]D2S = + 19,45° (c = 1, Äthylacetat).
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Eine Lösung von 41,5 g Boc-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)--OH in 500 ml frisch hergestellter 3,55 N HCl in THF wurde eingeengt, zweimal mit THF aufgenommen und wieder eingeengt und schliesslich mit Äther behandelt. Es wurden 37,4 g des rohen Hydrochloridsalzes erhalten, das in 500 ml DMF gelöst, auf 0°C abgekühlt und mit 17,4 g Boc-Ile-OSu sowie 16 ml Triäthylamin versetzt wurde. Das Gemisch wurde über Nacht bei 25°C gerührt, unter Zusatz von weiteren 6,2 ml Triäthylamin, um die Reaktion leicht basisch zu halten. Dann wurde filtriert und das Filtrat eingeengt, mit Äthylacetat extrahiert, der Extrakt mit 5 %iger Essigsäure und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Kristallisation aus Äthylacetat und Petroläther lieferte 39,6 g eines Rohproduktes, das noch einige Verunreinigungen enthielt und daher chromatographisch an einer Kieselgelsäule gereinigt wurde, unter Verwendung von Chloroform/Methanol (95:5, v/v) als Elutionsmittel. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen, die durch Dünnschichtchromatographie festgestellt wurden, wurden vereinigt und eingeengt. Kristallisation aus Chloroform und Petroläther lieferte 19,1 g (41,2%) Boc-IIe-Thr(Bzl)-Thr-(Bzl)-Lys(Z)-OH, F. 144-146°C, [a]D25 = +2,40° (c = 1, CHClj).
0,493 g Boc-Ue-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH wurden durch Behandlung mit 4 N HCl in THF während 30 Minuten und üblicher Aufarbeitung in 0,39 g HCl . H-Ile-Thr-(Bzl)-Thr(BzI)-Lys(Z)-OH übergeführt. Eine Lösung von 0.59 g Boc-Val-Asp(OBzI)-Thr(Bzl)-Ser(BzI)-Ser(BzI)-Glu-(OBzl)-HNNH2 in 6 ml DMF wurde auf — 25°C gekühlt und mit 0,57 ml 4,3 N HCl in 2,46 mmol THF sowie 0,1 ml Isoamylnitrit versetzt. Nach 30minütigem Rühren bei —20 -—25°C wurde die Temperatur auf —35°C gesenkt und 0,42 ml Triäthylamin sowie 0,39 g HCl. H-IIe-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)--Lys(Z)-OH zugesetzt. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei —20°C und dann 48 Stunden bei 4°C unter Zusatz von weiterem Triäthylamin, um ein pH von etwa 7,5 aufrecht zu erhalten, gerührt. Dann wurde mit 250 ml 5%iger Essigsäure verdünnt und das gebildete feste Produkt abfiltriert, mit Wasser, Methanol und Äther gewaschen, über Natriumhydroxid getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Das erhaltene Rohmaterial wurde in DMSO gelöst und durch Zusatz von Methanol wieder ausgefällt. Ausbeute: 0,698 g (81,7%) Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser-(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH, F. 268-271 °C.
Eine auf — 20°C abgekühlte Suspension von 0,408 g H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-HNNH2 in 10 ml DMF wurde mit 0,627 ml einer frisch hergestellten Lösung von 5,43 N HCl in THF sowie 1,39 ml einer 10%igen Lösung von Isoamylnitrit in DMF versetzt. Nach 30minütigem Rühren wurde auf — 30°C abgekühlt und mit 0.476 ml Triäthylamin sowie 1,334 g TFA-Salz des Decapeptids H-Val--Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(BzI)-GIu(OBzl)-Ile-Thr(BzI)--Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH versetzt. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei — 20°C gerührt und dann 5 Tage bei 4°C unter weiterem Zusatz von Triäthylamin und DMSO, um ein basisches Milieu aufrecht zu erhalten und Gelbildung zu verhindern, gerührt. Das Gemisch wurde dann in 300 ml 5% ige Essigsäure gegossen und der gebildete Niederschlag abfiltriert. mit Wasser, Methanol und Äther gewaschen und getrocknet. Das Rohprodukt wurde durch Ausfällung mit Methanol aus DMSO gereinigt. Ausbeute: 1,40 g (85,37%) H,C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr-(Bzh-Ser(BzI)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys-(Z)-OH, [a]p25 = +6,37° (c = 1, DMSO).
1,35 g des so erhaltenen geschützten Tetradecapeptids wurden mit 0,188 g HOBT . HoO einige Minuten in einem Gemisch aus jeweils 15 ml DMF und DMSO gerührt. Das
Gemisch wurde in einem Eisbad abgekühlt, mit 0,126 g DCC versetzt und weitere 24 Stunden unter Kühlung gerührt. Durch Behandlung von 4,0 g Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys-(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-V al-V al-Glu(OBzl)--Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl mit 40 ml TFA wurde das TFA-Salz des Tetradecapeptids gebildet, das durch Zusatz eines grösseren Volumens Äther ausgefällt wurde. Nach Waschen des abgetrennten Niederschlages wurden 3,74 g des TFA-Salzes des C-terminalen Tetradecapeptids erhalten. 1,567 g dieser Verbindung wurden mit dem aus dem Amino--terminalen Tetradecapeptid in DMF-DMSO hergestellten aktivierten Ester umgesetzt. Durch Zusatz einiger Tropfen NMM wurde das pH auf 7,5-8,0 gebracht. Es wurde eine Stunde bei 0°C und 5 Tage bei 25°C gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch in 1,5 Liter 5% ige Essigsäure gegessen und der gebildete Niederschlag abfiltriert und mit Wasser, Methanol, DMF, Methanol und Äther gewaschen. Ausbeute: 2,21 g H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-Val-Asp-(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr-(Bzl)-Lys(Z)-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)--Glu(OBzl)-V al-V al-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)--Asn-OBzl, F. > 300°C.
Das erhaltene geschützte Octacosapeptid (2,21 g) wurde in 8 ml TFA gelöst, die Lösung mit 4 ml Anisol versetzt und mit wasserfreier Flussäure 30 Minuten bei 0°C gerührt. Durch Vakuumdestillation bei 0°C wurden die flüchtigen Säuren entfernt und der Rückstand in 200 ml Wasser gelöst, die Lösung zweimal mit Äther gewaschen, auf 100 ml eingeengt und lyophilisiert. Das erhaltene Rohprodukt (1,1 g) wurde zunächst an einer Sephadex® G-10-Säule (3 X 80 cm; 0,2 M HOAc) und dann an einer DEAE-Sephadex®-Säule (3 X 75 cm) gereinigt, wobei mit Ammoniumacetat steigender Konzentration (pH 7,0, 0,025M, 0,25M) und anschliessend mit verdünnter Essigsäure eluiert wurde. Die Fraktionen, die das gewünschte Material enthielten, wurden vereinigt und lieferten nach Lyophilisation 0,281 g H-C-CO-Ser-Asp--Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu--Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-V al-V al-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn [Thymosin aj in Form eines amorphen weissen Pulvers.
Die Identität des erhaltenen synthetischen Materials mit natürlichem, aus Rinder-Thymusdrüsen isoliertem Thymosin al wurde durch Acrylamidgel-Isoelektrofokussierung bestätigt [Proc. Nati. Acad. Sei, (USA), 74, 725 (1977)].
Beispiel 2
7,23 g Boc-Ala-Ala-OH wurden in einem Gemisch aus 200 ml Methanol und 20 ml Wasser gelöst. Es wurde eine 20% ige wässrige Cs2C03-Lösung zugesetzt, bis ein pH von 7,0 erreicht war (ca. 30 ml) und das erhaltene Gemisch wurde zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde zweimal mit je 150 ml DMF aufgenommen und wieder eingeengt und der gelatinöse Rückstand mit 7,2 g Benzylbromid in 120 ml DMF während 15 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde verdampft und der Rückstand mit 500 ml Wasser behandelt. Das sich zunächst als Öl abscheidende Material verfestigte sich beim Stehen, wurde in 400 ml Äthylacetat aufgenommen, dreimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zu einem Sirup eingeengt, der bei Behandlung mit Petroläther zu kristallisieren begann. Umkristallisation aus Äthylacetat und Petroläther lieferte 7,2 g (73,8%) Boc-Ala-Ala-OBzl, F. 71-73°C.
6,0 g Boc-Ala-Ala-OBzl wurden während 30 Minuten mit 380 ml frisch bereiteter 4 N HCl in THF behandelt. Überschüssige Säure und Lösungsmittel wurden abgezogen und der verbleibende Sirup zweimal mit THF aufgenommen und wieder eingeengt. Bei Behandlung mit Äther verfestigte sich der Rückstand, der aus Methanol und Äther umkristal-
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lisiert 4,30 g (76,4%) HCl. H-Ala-Ala-OBzl, [a]D25 = -38,86° (c = 1, MeOH), lieferte.
Eine auf 0°C abgekühlte Lösung von 4,25 g HCl. H--Ala-Ala-OBzl in 60 ml DMF wurde mit 3,45 g Boc-Asn-OH, 4,02 g HOBT, 2 ml NMM und 3,37 g DCC 2 Stunden bei 0rC und dann 20 Stunden bei 25°C gerührt. Von Zeit zu Zeit wurde weiteres NMM zugesetzt, um die Reaktion leicht basisch zu halten. Unlösliche Nebenprodukte wurden abfiltriert und das Filtrat wurde zur Trockene eingeengt. Der erhaltene ölige Rückstand verfestigte sich bei Behandlung mit Wasser, wurde in Äthylacetat aufgenommen, dreimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und bis zur beginnenden Kristallisation eingeengt. Nach Zusatz einer gleich grossen Menge Petroläther wurde das Gemisch über Nacht stehengelassen. Das erhaltene Rohprodukt wurde aus THF und Petroläther umkristallisiert. Ausbeute: 5,2 g (75,6%) Boc-Asn-Ala-Ala-OBzl, F. 153-155°C, [a]D25 = -55,61° (c = 1, MeOH).
2,2 g Boc-Asn-Ala-Ala-OBzl wurden während 30 Minuten mit 220 ml 4,0 N HCl in THF behandelt. Überschüssige Säure und Lösungsmittel wurden abgezogen und der Rückstand zweimal mit THF aufgenommen und wieder eingeengt. Der ölige Rückstand verfestigte sich bei Behandlung mit Äther. Das so erhaltene Hydrochloridsalz (1,85 g) wurde in 40 ml DMF gelöst, die Lösung auf 0°C abgekühlt und mit 1,97 g HsC-CO-Ser(Bzl)-OH . DCHA versetzt. Nach 30minütigem Rühren bei 0°C wurden 1,19 g HOBT und 1,08 g DCC zugesetzt. Das Gemisch wurde durch Zusatz von einigen Tropfen NMM auf pH 7.5 gebracht, 2 Stunden bei 0°C und dann über Nacht bei 25°C gerührt. Nach Abtrennung der unlöslichen Nebenprodukte wurde das Filtrat zur Trockene eingeengt, der Rückstand mit Wasser und Äthylacetat gewaschen und aus 40 ml DMF und 500 ml Isopropanol kristallisiert. Ausbeute: 1,57 g (56,9%) HsC-CO--Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-OBzl, F. 213-215°C, [a]D25 = -23,11° (c = 1, DMSO).
Eine Lösung von 1,57 g H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala--OBzl in 20 ml DMF wurde 18 Stunden mit 2 ml Hydrazin gerührt. Der sich bildende Niederschlag wurde abgetrennt und mit DMF, Äthanol und Äther gewaschen. Ausbeute: 1,22 g (89,6%) H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-HNNH2, F. 262-264°C, [a]„25 = -26,7° (c = 1, DMSO).
0,698 g Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)--Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH wurden 30 Minuten lang mit 10 ml TFA behandelt. Durch Zusatz von Äther wurde das Peptidsalz ausgefällt, mit Äther gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 0,652 g. In einem separaten Kolben wurden 0,17 g H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-HNNH2 in
7 ml DMF suspendiert und mit 0,27 ml 6,18 N HCl in THF bei —20°C behandelt. Dem Gemisch wurden 0,68 ml einer Lösung von 10% Isoamylnitrit in DMF zugesetzt. Es wurde 30 Minuten bei —20°C gerührt, dann, die Temperatur auf —30°C gesenkt und 0,2344 ml Triäthylamin sowie 0,652 g des oben erhaltenen TFA-Salzes des Decapeptids zugesetzt. Das Gemisch wurde bei — 20°C mit 3 ml DMSO verdünnt, durch Zusatz einiger Tropfen Triäthylamin auf pH-7,5 gebracht, 30 Minuten bei —20°C und 5 Tage bei +4°C gerührt. Während dieser Zeit wurden weitere 5 ml DMSO und etwas Triäthylamin zugesetzt, um ein leicht basisches pH zu gewährleisten und die Gelbildung zu verhindern. Dann wurde die Lösung in 250 ml 5%ige Essigsäure gegossen, der gebildete weisse Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser, Methanol und Äther gewaschen und getrocknet. Das erhaltene Rohprodukt (0,702 g) wurde in DMSO gelöst und mit Methanol wieder ausgefällt. Ausbeute: 0,348 g (42,0%) H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser-(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH, F. 296-298°C (Zers.), [a]D25 = +3,77° (c = 1, DMSO).
Das erhaltene Produkt (0,866 g) wurde mit 0,126 g HOBT . H20 in einem Gemisch aus 8 ml DMSO und 6 ml DMF gelöst, die Lösung in einem Eisbad abgekühlt und mit 0,085 g DCC versetzt und 24 Stunden bei 0°C gerührt. Es wurde dann mit 1,05 g des TFA-Salzes des gemäss Beispiel 1 B. d) hergestellten Tetradecapeptids und 2 ml DMSO vermischt. Durch Zusatz einiger Tropfen NMM wurde das pH auf 7,5-8,0 eingestellt. Es wurde 1 Stunde bei 0°C und 5 Tage bei 25°C gerührt und wie in Beispiel 1 B. d) aufgearbeitet. Ausbeute: 1,5775 g H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala--Val-Asp(OBzI)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile--Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)--Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzI)--Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl.
Das erhaltene, vollständig geschützte Octacosapeptid (1,5775 g) wurde in 10 ml TFA und 3 ml Anisol gelöst.
Nach Zusatz von 45 ml Fluorwasserstoff wurde das Gemisch 30 Minuten bei 0°C gerührt und dann wie in Beispiel 1 B. d) aufgearbeitet. Die Reinigung an einer Sephadex® G-10- und einer DEAE-Sephadex®-Säule wie vorstehend beschrieben, lieferte 0,283 g reines H3C-CO-Ser-Asn-Ala-Ala-Val-Asp--Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys--Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn [(Asn2)-Thymosin ax] in Form eines weissen amorphen Pulvers. In Übereinstimmung mit dem Strukturunterschied wanderte das [Asn2]--Thymosin ax bei der Acrylamidgel-Isoelektrofokussierung an eine etwas weniger saure Position.
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- 6402182PATENTANSPRÜCHE1. Peptidderivate der allgemeinen Formel HjC-CO-SerCR^-X-Ala-Ala-Val-AspCOR^-ThrCR^-SerCR1)--Ser(R1J-Glu(OR4)-Ile-Thr(R3)-Thr(R3)-Lys(R5)-Asp(OR2)--Leu-Lys(R5)-Glu(OR4)-Lys(R5)-Lys(R5)-Glu(OR4)-V al-V al--Glu(OR4)-Glu(OR4)-Ala-Glu(OR4)-Asn-OR6 (I) worinX Asn oder Asp(OR2);R1 eine unter Bildung der Hydroxygruppe des Serylrestes abspaltbare Gruppe;R2, R4 und R6 eine unter Bildung einer Carboxylgruppe abspaltbare Gruppe;R3 eine unter Bildung der Hydroxygruppe des Threonyl-restes abspaltbare Gruppe und R5 eine unter Bildung der to-Aminogruppe des Lysylrestes abspaltbare Gruppe darstellen.
- 2. Eine Verbindung gemäss Anspruch 1 der Formel H3C-CO-Ser(R1)-Asn-Ala-Ala-Val-Asp(OR2)-Thr(R3)-Ser(R1)--Ser(R1)-Glu(OR4)-Ile-Thr(R3)-Thr(R3)-Lys(R5)-Asp(OR2)--Leu-Lys(R5)-Glu(OR4)-Lys(R5)-Lys(Rs)-Glu(OR4)-V al-V al--Glu(OR4)-Glu(OR4)-Ala-Glu(OR4)-Asn-OR6worinR1 - R6 die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen haben.
- 3. Eine Verbindung gemäss Anspruch 1 der Formel H3C-CO-Ser(RI)-Asp(OR2)-Ala-Ala-Val-Asp(OR2)-Thr(R3)--Ser(R1)-Ser(R1)-Glu(OR4)-Ile-Thr(R3)-Thr(R3)-Lys(R5)-Asp-(OR2)-Leu-Lys(R5)-Glu(OR4)-Lys(R5)-Lys(R5)-Glu(OR4)-Val--Val-Glu(OR4)-Glu(OR4)-Ala-Glu(OR4)-Asn-OR6worinR1 - R6 die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen haben.
- 4. Eine Verbindung gemäss Anspruch 1 der Formel H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr-(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)--Lys(Z)-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu-(OBzl)-V al-V al-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn--OBz!worin Bzl Benzyl und Z Benzyloxycarbonyl darstellen.
- 5. Eine Verbindung gemäss Anspruch 1 der Formel H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser-(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-Asp-(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val--Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl worin Bzl Benzyl und Z Benzyloxycarbonyl darstellen.Thymosin o/n ist ein hitzestabiles, stark saures Polypeptid aus 28 Aminosäureeinheiten der folgenden Sequenz:5 10HjC-CO-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-15 20 25-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu--Ala-GIu-Asn-OH.Dieses Peptid, das ein starkes immunpotenzierendes Mittel ist, wurde aus der Thymosinfraktion 5 durch Goldstein et al. durch eine Kombination von Ionenaustauschchromato-graphie und Gelfiltration isoliert [Proc. Nati. Acad. Sei. USA 74, 725-729 (1977)].Auch das [Asn2]-Analoge des Thymosin ccj wirkt stark immunopotenzierend bei einer täglichen Dosierung von etwa 1-100 mg pro kg Körpergewicht bei intravenöser Verabreichung.
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PL | Patent ceased | ||
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