CH644131A5

CH644131A5 - Process for the preparation of immunogammaglobulin

Info

Publication number: CH644131A5
Application number: CH78581A
Authority: CH
Inventors: Syoji Ono; Shuzi Miura; Tsunemasa Yoshida
Original assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1979-05-23
Filing date: 1979-05-23
Publication date: 1984-07-13
Also published as: DE2953674C2; DK147225B; DE2953674T1; SE8100368L; DK29681A; US4347179A; SE425348B; WO1980002561A1; DK147225C

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Immunogammaglobulin. Genauer gesagt, bezieht sich die vorliegende Verbindung auf ein verbessertes Verfahren für die Herstellung von S-sulfoniertem Immunogammaglobulin.

Immunoglobulin beinhaltet Antikörper gegenüber einer Vielzahl von Krankheiten und wird verwendet für die Prophylaxe und Therapie von diesen Krankheiten, wie auch immer, die Verwendung eines Immunoglobulin-Präparates war beschränkt auf die intramuskuläre Injektion. Wenn nämlich ein Immunoglobulin-Präparat intravenös injiziert wird, so ist dies mit einer Absenkung der komplementären Serum-Konzentration verbunden, und eine Nebenwirkung wird verursacht, welche antikomplementäre Wirkung genannt ist, resultierend aus der Beobachtung von Blutdruckabfall, Körpertemperaturanstieg, Störung im Zirkulationssystem und anderem. Deshalb sind viele Studien gemacht worden, mit dem Ziel, Immunoglobulin stabil zu halten für die intravenöse Verabreichung.

Ein erstes Verfahren besteht darin, jenen Teil abzutrennen, von dem angenommen wird, dass er das menschliche Immunoglobulin bindet, durch Verwendung von Enzymen. Beispielsweise schlug A. Nisonoff die Verwendung von Pepsin als ein Enzym vor (c.f. Science 132.1770 [1970]) und andere Verfahren verwendeten Plasminogen in Serum, Cathepsin und andere als ein Enzym, wie es in der Beschreibung des Japanischen Patentes 47-37529 (1972) beschrieben ist. Wie auch immer, diese Enzym-behandelten Immunoglobuline weisen Mängel auf, indem beispielsweise ihre Halbwärts-Zeit kurz ist und folglich die Dauer der Effizienz kurz ist, wie E. Merler und B. Jager in ihren Artikeln von Vox Snag 13,102 (1967) und Arch. Intora. Med. 119,60 (1967) zeigten.

Ein zweites Verfahren besteht darin, das menschliche Immunoglobulin mit einem Protein-acylierten Reagenz zu behandeln. Beispielsweise wird in der Japanischen Offenlegungsschrift 49-6119 (1974) beschrieben, dass die Acylierang von menschlichem Immunoglobulin ein modifiziertes Immunoglobulin ergibt mit reduziertem antikomplementärem Aktivitäts-Niveau. Aber das acylierte Immunoglobulin, welches durch dieses Verfahren gebildet worden ist, beinhaltet eine Gefahr zur Antigenität in menschlichen Körpern, und die Verabreichung von grossen Mengen wird als schwierig erachtet.

Ein drittes Verfahren besteht darin, die Disulfid-Bin-dungen im menschlichen Immunoglobulin zu reduzieren, gefolgt von einer Alkylierung. Beispielsweise nach der Japanischen Offenlegungsschrift 48-103723 (1973) ergibt dieses Verfahren ein modifiziertes Immunoglobulin, welches das gleiche anscheinende Molekulargewicht wie das unmodifi-

zierte Immunoglobulin und ein reduziertes antikomplementäres Aktivitäts-Niveau hat. Wie auch immer, dieses Verfahren ist ein Zweistufen-Verfahren und die Operationen sind beachtlich kompliziert, was industriell nachteilig ist.

Ein viertes Verfahren besteht darin, dass die Interketten-Disulfidbindungen im menschlichen Immunoglobulin mit Tetrathionat- und Sulfit-Ionen S-sulfoniert werden, um Immunoglobulin-Derivate zu ergeben, welche für die intravenöse Injektion geeignet sind (vergleiche die Jap. OS 50-121421 [1975], 51-1630, 51-76418 und 51-112512 [1976]). Dieses Verfahren ist das beste der bekannten Verfahren. Jedoch wird in diesem Verfahren das unstabile Tetrathionat-Salz als ein Oxidationsmittel verwendet. Daher wird eine grosse Menge an Tetrathionat-Salz benötigt, um die komplette Reaktion zu begünstigen, was oftmals Nebenreaktionen verursacht und ferner die Denaturierung des Proteins bewirkt und die genügende Reduktion des antikomplementären Aktivitäts-Niveaus hemmt, was einen zu verbessernden Mangel darstellt. Ferner ist die Oxidationslcraft des Tetra-thionat-Ions relativ stark, und es hat die Möglichkeit, die Intralcetten-Disulfidbindungen wie auch die Interlcetten-Disulfidbindungen zu brechen, und die erforderliche genügende Vorsicht zur Kontrolle der Reaktion ist unbequem.

Die Erfinder richteten ihre Forschung auf die Verbesserung von solchen Mängeln und haben gefunden, dass, wenn Trithionat-Ionen, welche eine hohe Stabilität und eine passende Reaktivität aufweisen, und Sulfit-Ionen zusammen als Oxidationsmittel verwendet werden, die Interketten-Disul-fidbindungen im menschlichen Immunoglobulin gespalten und gleichzeitig die gespaltenen Schwefelatome S-sulfoniert (-S-SOr) werden, wodurch Immunoglobulin-Derivate erhalten werden, die geeignet für die intravenöse Injektion verwendet werden, weil sie frei von den obigen Mängeln sind, wodurch der Zweck der vorliegenden Erfindung erreicht ist.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich nämlich auf ein Verfahren zur Herstellung von Immunoglobulin-Derivaten, welches gekennzeichnet ist durch die Ausführung einer Reaktion von menschlichen Immunoglobulinen mit einer Verbindung, welche fähig ist, Trithionat-Ionen zu bilden, und einer anderen Verbindung, welche fähig ist, Sulfit-Ionen zu bilden in Wasser, um die Interketten-Disulfidbindungen im menschlichen Immunoglobulin zu Spalten und gleichzeitig die getrennten Schwefelatome zu S-sulfoniert (-S-SO3).

Figur 1 (a), (b) und (c) zeigen Darstellungen der elektro-phoretischen Wanderung von Immunoglobulin (IG), sulfo-niertem Gammaglobulin (GGS), welches gemäss Beispiel 1 erhalten worden ist, und einem weiteren sulfonierten Gammaglobulin, erhalten als Natrium-dodecyl-sulfonat. Figur 1 (d) zeigt die Beziehung zwischen jeder Bande der obigen Darstellungen und dem Molekulargewicht.

Figur 2 (a) und (b) zeigen die Gel-Filtrations-Darstellungen von sulfoniertem Gammaglobulin (GGS), erhalten gemäss Beispiel 1, und einem weiteren sulfonierten Gammaglobulin (GGS), erhalten unter Verwendung von Sephadex G 200.

Jede Verbindung kann als eine Trithionat-Ionen-Quelle verwendet werden, was einem Oxidationsmittel entspricht, welches in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, falls sie Trithionat-Ionen in Wasser bilden kann, wie auch immer, ein Alkalimetallsalz von Trithionat, wie etwa Natrium-Tri-thionat oder Kalium-Trithionat, ist bevorzugt.

Jede Verbindung kann verwendet werden als eine Sulfit-Ionen-Quelle, wenn sie Sulfit-Ionen in Wasser bilden kann; wie auch immer, ein bevorzugtes Beispiel ist Schwefligsäure, Natriumsulfit, Natriumbisulfit, Kaliumsulfit oder Natrium-pyrobisulfit.

Die Menge der Verbindung, welche fähig ist, Sulfit-Ionen

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zu bilden, entspricht der zweifachen oder mehrfachen, vorzugsweise mehr als zehnfachen molaren Quantität der Inter-ketten-Disulfidbindungen, welche im Immunoglobulin gespalten werden müssen. Die Menge der Verbindung, welche fähig ist, Trithionat-Ionen zu bilden, beträgt mehr als ein Mol, vorzugsweise zwei oder mehrere Mole pro Mol der Interketten-Disulfidbindungen, welche im Immunoglobulin gespalten werden müssen. Die Reaktion wird in Wasser durchgeführt, und der pH-Wert wird vorzugsweise im Bereich von 6,0 bis 10,0 während der Reaktion gehalten.

Die Reaktionstemperatur beträgt 50°C oder weniger, bevorzugt wird der Bereich von 10°C bis 45°C. Wenn die Temperatur 50°C übersteigt, wird das Immunoglobulin-Molekül unerwünschterweise anfälliger für eine Protein-Denaturierung, währenddem niedrigere Temperaturen als 10°C das Fortschreiten der Reaktion extrem verzögern, was industriell unpraktisch ist.

Die Reaktionszeit, in welcher die Interketten-Disulfidbin-dungen im Immunoglobulin gespalten und S-sulfoniert werden, hängt von der Menge der Oxidationsmittel und der Reaktionstemperatur ab. Im allgemeinen wird ein Bereich von 0,5 bis 24 Stunden gewählt.

Entsprechend der vorliegenden Erfindung werden die Interketten-Disulfidbindungen im Immunoglobulin gespalten, und das Disulfid wird in S-sulfonierte Gruppen (-S-SO3) übergeführt, um die H-Kette und die L-Kette zu ergeben. Das Reaktionsprodukt wird getrennt durch herkömmliche Reinigungsverfahren wie etwa Dialyse, Aussalzen oder Säurenchromatographie. Beispielsweise wird das Reaktionsgemisch dialysiert mit normaler Salzlösung, um die erwünschte Substanz in normaler Salzlösung zu ergeben.

Die vorliegende Erfindung wird näher illustriert durch die nachfolgenden Beispiele. Es sei festgehalten, dass diese Beispiele als illustrativ gelten und dass sie in keiner Art und Weise als begrenzend für die vorliegende Erfindung betrachtet werden sollen.

1. Herstellung von Natrium-Trithionat

Die erwünschte Verbindung wurde erhalten aus Natrium-Thiosuifat und 30%igem wässrigem Wasserstoffperoxid durch ein Verfahren, welches in neuen Serien von experimenteller Chemie («Shin Jikken Kagaku Koza»), Vol 8., Synthèses of inorganic Compounds (II), S. 482, Maruzen Tokyo, beschrieben ist.

Im wesentlichen wurde keine Veränderung beobachtet, wenn sie bei Raumtemperatur während mehreren Monaten stehengelassen wurde. Ferner verursachte die Erwärmung der wässrigen Lösung auf eine Temperatur von 45°C während 4,5 Stunden kaum Veränderungen.

2. Herstellung von Natrium-Tetrathionat

Natrium-Tetrathionat wurde hergestellt aus Natrium-

Thiosulfat und Jod durch ein Verfahren, welches im Handbuch der Präparativen Anorganischen Chemie, Vol 1., S. 362, Ferdinand Enke Verlag, Stuttgart 1960, beschrieben ist.

Das Produkt fiel auf 85%ige Reinheit, wenn es bei Raumtemperatur während einer Woche stehengelassen wurde, und entwickelte den Geruch von Schwefeldioxyd. Ferner resultierte die Erwärmung der wässrigen Lösung auf eine Temperatur von 45°C während 4,5 Stunden in der Reduktion der Reinheit auf weniger als 50%.

Beispiel 1

Eine menschliche Immunoglobulin-Lösung in 16°/oiger Konzentration in normaler Salzlösung, welche mit Phosphat-Lösung (5 ml) auf einen pH-Wert von 7,5 gepuffert war, wurde mit normaler Salzlösung (5 ml) vereint, welche Natriumsulfit (0,1616 g, 6,4fache molare Quantität der Interketten-Disulfidbindungen im Immunoglobulin) und Natrium-Trithionat (0,076 g, 16fache molare Menge der Interketten-Disulfidbindungen) enthielt, und wurde mit Phosphat-Lösung auf einen pH-Wert von 7,5 gepuffert, und die Reaktion wurde durchgeführt bei einer Temperatur von 45°C während 4,5 Stunden. Nach der Beendigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch mit normaler Salzlösung dialysiert, bis die Reaktanten in einer Konzentration von 0,1 mMol/1 oder weniger anstanden, um 11 ml einer sulfonierten Gammaglo-bulin-Lösung in normaler Salzlösung in 7%iger Konzentration zu erhalten.

Das antikomplementäre Aktivitäts-Niveau CHso wurde bestimmt mit einer 5%igen Lösung gemäss dem Verfahren, welches von Kabat und Mayer (Expérimental Immunoche-mistry, S. 221,1961) beschrieben wurde, und man erhielt einen Wert von 14,9%.

Der CHso-Wert einer 5%igen Lösung an menschlichem Immunoglobulin im Ausgangsmaterial betrug 90%.

Der Titer der anti-Diphterie des Produktes wurde bestimmt und betrug 0,8 Einheiten/ml, was demselben Niveau entspricht, wie dem menschlichen Immunoglobulin, dem Ausgangsmaterial.

Ferner wurde das Produkt einer Natrium-Dodecylsul-fonat-Scheibenelektrophoresis unterworfen in Übereinstimmung mit einem Verfahren von Weber und Osborne (J. Biol. Chem. 244,446,1969). Das Resultat ist in Fig. 1 (b) gegeben, welches definitiv zeigt, dass das Produkt nahezu in die H-Kette und L-Kette zerlegt worden ist und die Interketten-Disulfidbindungen sulfoniert wurden.

In der Zwischenzeit wurde die gleiche Reaktion ausgeführt unter Verwendung von 35S-markiertem Natriumsulfit, um zu bestätigen, dass 7-8,5 Mol von -S-SO.r-Gruppen eingeführt wurden pro Mol an Immunoglobulin.

Es wurde gefunden, dass der Verlauf der Immunoelektro-phoresis ganz zusammenfällt mit dem des Produktes, welches durch Verwendung von Natrium-Tetrathionat erhalten wurde (siehe Fig. 1 [c]).

Als Referenz wird der Verlauf von menschlichem Immunogammaglobulin in Fig. 1 (a) gegeben.

Ferner ist in Fig. 2 (a) der Verlauf der Gel-Filtration unter Verwendung von Sephadex G-200 gegeben. Die OD450 einer 5%igen Lösung betrug 0,950.

Beispiel 2

Die Reaktion wurde in der gleichen Art und Weise ausgeführt wie in Beispiel 1, ausgenommen, dass 0,015g(3,2fache molare Quantität der Interketten-Sulfidbindunger)} Natrium-Trithionat verwendet wurden, um sulfoniertes Gammaglobulin zu bilden mit einem antikomplementären Aktivitäts-Niveau CH50 von 15,2%.

Eine menschliche Immunoglobulinlösung in 16%iger Konzentration und Phosphat-gepuffert in normaler Salzlösung (5 ml) wurde vereint mit einer anderen normalen Salzlösung, welche mit einer Phosphatlösung (5 ml) auf einen pH-Wert von 7,5 gepuffert war und Natriumsulfit (0,1616 g, 64fache molare Quantität der Interketten-Disulfidbindungen im Immunoglobulin) und Natrium-Tetrathionat-Dihydrat (0,098 g, 16fache molare Menge der Interketten-Disulfidbindungen) enthielt, und die Reaktion wurde ausgeführt bei einer Temperatur von 45°C während 4,5 Stunden. Nachdem die Reaktion beendet war, wurde das Reaktionsgemisch dialysiert mit normaler Salzlösung, bis die Konzentration der Reaktanten weniger als 0,1 mMol/1 betrug, um 11 ml einer Lösung von sulfoniertem Gammaglobulin in normaler Salzlösung in 7%iger Konzentration zu ergeben.

Es wurde gefunden, dass das antikomplementäre Aktivi-

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täts-Niveau CHso der 5%igen Lösung 20,2% betrug, und OD450 betrug 0,112.

Der Verlauf der Natrium-Dodecylsulfat-Scheibenelektro-phoresis des Produktes ist in Fig. 1 (c) dargestellt, und der Verlauf der Gel-Filtration unter Verwendung von Sephadex G-200 ist in Fig. 2 (b) dargestellt.

In der vorliegenden Erfindung werden relativ stabile Trithionat-Ionen und Sulfit-Ionen verwendet als Sulfonierungs-Reagenzien, und die unerwünschte Zersetzung dieser Reagenzien kann vermieden werden. So werden grosse Mengen an diesen Reagenzien unnötig, und dadurch führt dies zu weniger Nebenreaktionen. Demnach weist die vorliegende Erfindung die Vorteile auf, Immunogammaglobulin-Deri-vate zu liefern, welche geeignet sind für die intravenöse Injektion, weil sie ein niedriges antikomplementäres Aktivitäts-Niveau und Trübung aufweisen und unmittelbar mit sehr einfachen Operationen gereinigt werden können.

Das gemäss der vorliegenden Erfindung hergestellte S-sul-5 fonierte Immunogammaglobulin kehrt zum ursprünglichen Immunoglobulin in vivo zurück und widersteht der Zersetzung im Blut und beinhaltet nicht die Gefahr der Herstellung von Antigenität. Ausserdem weist genanntes S-sulfoniertes Immunogammaglobulin Charakteristiken auf für die Ermög-10 lichung der intravenösen Injektion wegen seines reduzierten antikomplementären Aktivitäts-Niveaus ohne jeglichen nachteiligen Effekt auf verschiedene Arten von Antikörper-Aktivitäten und wegen einer lang anhaltenden Periode der Wirksamkeit in vivo.

1 Blatt Zeichnungen

Claims

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung von Immunogammaglobulin-Derivaten, dadurch gekennzeichnet, dass man menschliches Immunogammaglobulin mit einer Verbindung, welche fähig ist zur Bildung von Trithionat-Ionen, und einer anderen Verbindung, welche fähig ist zur Bildung von Sulfit-Ionen in Wasser, in Wasser zur Reaktion bringt, um die Interketten-Disulfidbindungen in genanntem Immunogammaglobulin zu spalten und gleichzeitig die getrennten Schwefelatome S-zu sulfonieren (-S-SOJ).
2. Verfahren zur Herstellung von Immunoglobulin-Deri-vaten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung, welche fähig ist zur Bildung von Trithionat-Ionen in Wasser, ausgewählt ist aus Natriumtrithipnat, Kali-umtrithionat oder deren Gemisch.