CH645465A5 - Immunbiologisches verfahren zur quantitativen bestimmung von haptenen und testausruestung zur durchfuehrung des verfahrens. - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein immunbiologisches Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Haptenen. Sie erlaubt die Bestimmung von Haptenen im Picogrammbereich mit Hilfe immunbiologischer und enzymatischer Reaktionen und be-s ruht schlussendlich auf einer sehr empfindlichen Farbreaktion. Das neue Verfahren kann zur quantitativen Bestimmung verschiedener Arten von Haptenen dienen; es ist von besonderem Wert bei der quantitativen Bestimmung verschiedener Hormone, wie beispielsweise Estrogene, Prostaglandine 10 und Thyroxin, von Polypeptiden, Vitaminen, Glykosiden und dergleichen. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Test-Ausrüstung zur Durchführung solcher quantitativer Messungen, sowie bestimmte neue Bestandteile solcher Ausrüstungen zur Verwendung im neuen Bestimmungsverfahren. 15 Es wurden bereits viele Methoden zur qualitativen und quantitativen Bestimmung niedrigmolekularer Substanzen, wie Hormone und dergleichen, vorgeschlagen. Unter den empfindlichsten vorgeschlagenen Methoden sind solche, die in der Anwendung von Proteinen bestehen, die imstande sind, 20 die zu bestimmenden Substanzen spezifisch zu binden. Ein sehr empfindlicher Test ist die Radioimmunoassay in den verschiedensten Variationen. Radioimmunoassays haben den Nachteil, dass das markierte Gebilde eine verhältnismässig kurze Lebensdauer aufweist, so dass strenge Vorschriften für 25 die Handhabung radioaktiver Materialien bestehen und so dass hochqualifiziertes Personal für die Durchführung solcher Bestimmungen eingesetzt werden muss. Eine Vielzahl von Enzymimmunoassays (Enzymimmunbestimmungsme-thoden) ist bekannt, und ein Teil dieser Bestimmungsmetho-30 den ist in dem Referat über diesen Gegenstand in Clinical Chemistry 22 (1976), S. 1243-1255 zusammengefasst.
Die vorliegende Erfindung liefert ein empfindliches und bequemes Verfahren zur quantitativen Bestimmung kleiner Moleküle (Haptene), wie z.B. Hormone, Vitamine, Glykoside 35 und dergleichen. Haptene sind definiert als proteinfreie Substanzen, deren chemische Konfiguration so ist, dass sie mit spezifischen Antikörpern reagieren können, dass sie selbst jedoch nicht in der Lage sind, die Bildung von Antikörpern zu verursachen. Um Antikörper gegen spezifische Haptene zu 4o bilden, müssen solche Haptene zuerst mit Makromolekülen verbunden werden, und das erhaltene Konjugat wird geeigneten Versuchstieren injiziert.
Die Erfindung betrifft ein immunbiologisches Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Haptenen und ist im Pa-45 tentanspruch 1 definiert. Im Folgenden wird eine besondere Ausführungsart näher erläutert: Es wird ein spezifischer Antikörper für das zu bestimmende Hapten hergestellt, und dieser Antikörper wird auf einem festen Trägerstoff insolubilisiert. Es wird eine kompetitive Reaktion zwischen der unbekannten so Probe und einem Haptenkonjugat durchgeführt. Die Menge an Haptenkonjugat, die an den festen Trägerstoff gebunden ist, ist umgekehrt proportional der Menge an freiem Hapten in der zu bestimmenden Probe. Die Bestimmung erfolgt durch Umsetzung eines enzymmarkierten Antikörpers für 55 den makromolekularen oder niedrigmolekularen Teil des Konjugats, gefolgt von Umsetzung mit einem geeigneten Substrat, das eine Farbreaktion ergibt.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann schematisch wie folgt beschrieben werden:
6o a) Ein Hapten (wie oben definiert, vorzugsweise ein Hormon) als «X» bezeichnet, ist zu bestimmen.
b) Das Hapten wird an einer Verbindung gebunden, die Antikörperbildung hervorruft, und dieses wird in ein Versuchstier injiziert, was die Produktion von Anti-X bewirkt. 65 c) Aus X und einer anderen Substanz Y wird ein Konjugat gebildet.
d) Substanz Y oder ein Y-Konjugat wird Tieren injiziert, und Anti-Y wird gebildet.
645 465
e) Es wird ein Konjugat von Anti-Y und eines geeigneten Enzyms, z.B. Enzym-Anti-Y, gebildet.
Die Bestimmung erfolgt insbesondere in folgender Weise:
1) Anti-X, z.B. der Antikörper für die zu bestimmende Substanz X, wird auf einem geeigneten festen Trägerstoff adsorbiert und auf diese Weise unlöslich gemacht (insolubili-siert). Unter anderen Verbindungen kann als fester Trägerstoff Polystyrol verwendet werden, und die bevorzugte Form besteht in kleinen Reagensröhrchen, die auf der Innenseite mit dem Anti-X-Antikörper beschichtet sind.
2) Die die unbekannte Menge an X und eine bekannte Menge an X-Y-Konjugat enthaltende Probe wird mit dem Farbstoff und dem darauf adsorbierten. Anti-X in Kontakt gebracht, wobei eine kompetitive Reaktion von X und X-Y mit dem Anti-X erfolgt. Die Menge an X und X-Y wird so gewählt, dass alle aktiven Anti-X-Stellen entweder von X oder von dem X des Konjugats X-Y besetzt sind.
3) Das System wird gewaschen, um sämtliches nicht-um-gesetztes X und X-Y zu entfernen.
4) Enzymmarkiertes Anti-Y wird zugegeben, und dieses reagiert mit sämtlichen Y-Stellen des gebundenen X-Y-Kon-jugats.
5) Überschüssiges enzymmarkiertes Anti-Y wird ausgewaschen.
6) Ein geeignetes Substrat wird zugegeben, das eine Farbreaktion bewirkt, die die Menge an gebundenem Enzym anzeigt.
Indem eine Eichkurve aufgestellt wird oder indem gleichzeitig eine Anzahl von Proben untersucht wird, die bekannte Mengen an X enthalten, kann die Menge an X in der zu bestimmenden Probe bestimmt werden. Es ist klar, dass die Menge an Hapten-Konjugat X-Y, die an den festen Trägerstoff gebunden ist, umgekehrt proportional der Menge an freiem Hapten in der Probe ist.
Unter anderen Substanzen, die in sehr niedrigen Konzentrationen bestimmt werden können, können verschiedene Steroide erwähnt werden, beispielsweise Estrogene, Progestine usw., Prostaglandine, PGF2, PGE2 usw., Thyroidhormone, wie beispielsweise Thyroxin, Trijodthyronin usw., Herzgly-koside, wie z.B. Digoxin, Digitoxin usw., Vitamine, wie beispielsweise Vitamin BI2 usw., Heilmittel, wie beispielsweise Diphenylhydantoin, Morphin usw.
Geeignete Substanzen zur Verwendung als Y-Teile sind beispielsweise Trinitrophenyllysin, Sulfanilsäure, p-Amino-benzoesäure, p-Azophenyl-ß-lactosid, Hippursäure, Jodacet-ylaminobenzolazohippursäure, 6-Carboxypurin, 5-Acetyl-uracil, Thymidin, Uridin.
Zur Durchführung des Bestimmungsverfahrens empfiehlt sich eine Testausrüstung, welche standardisierte Präparate von Antihapten-Antikörpern, Anti-X, Haptenkonjugat X-Y und enzymmarkierte Anti-Y-Antikörper enthält und beispielsweise einen festen Trägerstoff enthalten kann, an den Antihapten-Antikörper adsorbiert sind. Die Antikörperbe-schichtung ist vorteilhafterweise auf die Innenseite eines Test-röhrchens aufgebracht.
Hormonmengen, die bestimmt werden können, liegen im Picogrammbereich. Die Empfindlichkeit und Genauigkeit entspricht allen Anforderungen solcher Bestimmungen für medizinische Zwecke. Zur Ausführung des neuen Verfahrens ist kein radioaktives Material erforderlich, und die Ausrüstung zur Handhabung solcher Materialien ist überflüssig. Verschiedene Haptene können auf bequeme Weise bestimmt werden. Unter diesen können Hormone erwähnt werden, wie beispielsweise Steroide, Prostaglandine, Thyroidhormone, Peptide, Polysaccharide, Vitamine, Herzglykoside usw. Der erforderliche enzymmarkierte Antikörper kann leicht hergestellt werden und kann für alle diese niedrigmolekularen Verbindungen verwendet werden. Die Reagenzien sind stabil und können ohne merkbare Zersetzung über einen verhältnismässig langen Zeitraum gelagert werden, und demzufolge können Ausrüstungen für die Durchführung des neuen'Bestimmungsverfahrens hergestellt und in den Handel gebracht werden, s Die erforderlichen Instrumente sind einfach und in klinischen Laboratorien leicht erhältlich.
Im folgenden werden an Hand von Beispielen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung näher erläutert.
io Beispiel 1
Bestimmung von Serum Estradiol
A. Verfahren unter Verwendung von Estradiol-g-DNP-Lysin (Estradiol-6-s-dinitrophenyllysin)
1. Beschreibung des Bestimmungsverfahrens i5 Eine Menge an Estradiol-6-s-DNP-Lysin-Konjugat wird zu einer Probe gegeben, die Estradiol enthält, und die Mischung wird in einem Polystyrolröhrchen, das mit Antiestra-diol beschichtet ist, inkurbiert. Die Menge an Estradiol-DNP, die in dem Röhrchen gebunden ist, ist umgekehrt proportio-20 nal der Menge an freiem Estradiol in der Probe. Die tatsächliche Menge an Estradiol-DNP wird durch Verwendung von peroxidasemarkierten Anti-DNP-Antikörpern bestimmt, gefolgt von Zugabe von Peroxidasesubstrat und kolorimetri-scher Bestimmung.
25 2. Materialien a) Anti-Estradiol-Antiserum wurde durch Immunisierung einer Ziege mit 17ß-Estradiol-6-carboxymethyl-Rinderserum-albumin hergestellt. Der Ziege wurde intradermal 2 mg Antigen in vollständigem Freunds Adjuvans injiziert, sie erhielt
30 Auffrischungsdosen (boosters) nach 30 und 60 Tagen und am achten Tag nach der letzten Dosis wurde sie zu Ader gelassen.
b) Anti-Dinitrophenyl-Antiserum (Anti-DNP) wurde durch Immunisierung von Kaninchen mit Dinitrophenylrin-derserumalbumin hergestellt. Den Kaninchen wurde 1 mg
35 Antigen in vollständigem Freunds Adjuvans injiziert, sie erhielten Verstärkungsdosen wie oben beschrieben und wurden dann zu Ader gelassen.
c) Die Gammaglobulinfraktionen des Anti-DNP-BSA-4o Antiserums wurden durch Ammoniumsulfatfällungen isoliert, gefolgt von DEAE-Cellulose-Chromatographie, sie wurden von Anti-BSA-Antikörpern durch Immunadsorption an BSA-Agarose-Säulen (6 mg/ml) gereinigt.
Meerrettichperoxidase (Miles-l-Grad) wurde mit Glutar-45 aldehyd an die IgG-Fraktion von Anti-DNP-Serum gekoppelt. Das Peroxidase Konjugat wurde dann durch Chromatographie an Sephadex-G-200-Säulen gereinigt, und das Molverhältnis von Peroxidase zu IgG wurde durch UV-Absorp-tion bestimmt. Die in der Bestimmungsmethode verwendeten so Konjugate hatten Molverhältnisse von 1,8 bis 1.
d) Haptenkonjugat-Estradiol-6-e-DNP-Lysin wurde aus Estradiol-6-carboxymenthyloxim und e-Dinitrophenyllysin unter Verwendung von N-Hydroxysuccinimid hergestellt. Das Produkt wurde spektrophotometrisch bestimmt, indem
55 UV-Absorptionsspektren bei 260 nm für Steroidoximreste und bei 360 nm für DNP-Moleküle aufgezeichnet wurden. Das Molverhältnis von Estradiol zu s-DNP-Lysin wurde mit 1,0 ermittelt. Das Produkt wurde auch durch Radioimmuno-assay mit Anti-Estradiol-BSA-Antiserum bestimmt. 60 e) Die Gammagiobuhnfraktion von Anti-Estradiol-6-BSA-Serum wurde durch Chromatographie an DEAE-Cellu-lose bestimmt und durch Immunoadsorption von Anti-BSA-Antikörpern gereinigt. Das Fehlen von BSA-Antikörpern wurde durch Immunoelektrophorese nachgewiesen, und die 65 Stärke des Antiserums ebenso wie die Spezifität gegen Estradiol wurde durch Radioimmunoassay bestimmt. Die gereinigte Fraktion von Antiestradiol wird bei der Durchführung des Bestimmungsverfahrens als Beschichtungslösung zur Her-
645465
Stellung von mit Antikörper beschichteten Polystyroloberflächen verwendet.
f) Polystyrolröhrchen (75 x 12 mm Lab-Tek Cat. Nr. 4411) werden als feste Träger verwendet.
g) Estradiol (Ikapharm Code Nr. 1995) wird als Standardantigen verwendet.
h) Das für die Enzymreaktion verwendete Substrat besteht aus 120 mg 5-Aminosalicylsäure in 100 ml 0,02 m Phosphatpuffer (pH-Wert 6,5) und 1 ml 1 %iger Wasserstoffper-oxydlösung.
i) Beschichtete Antikörperteströhrchen wurden wie folgt hergestellt: Die Polystyrolröhrchen wurden mit Carbonatpuf-fer (0,5 m; pH-Wert 9,5) gewaschen und mit 2 ml Beschich-tungslösung gefüllt, die sorgfältig mit Phosphatpuffersalzlösung verdünnt war und 18 Stunden lang bei 4 °C aufbewahrt worden war. Die Röhrchen wurden bei 4 °C in 0,01 m Phosphat (0,15 m Salzlösung) (pH-Wert 7,4) (PBS) gelagert. Sie können auf diese Weise mindestens 6 Monate ohne Verluste an Aktivität gelagert werden.
3. Die Bestimmung
Um die Enzymbestimmung durchzuführen, wird 1 ml Pufferlösung, die jeweils verschiedene Estradiolstandards (5,-15,50,150,500,1000 pg/ml) und 300 pg/ml Estradiol-DNP-Konjugat enthält, 2 Stunden lang bei 37 °C in mit Antikörper beschichteten Röhrchen inkubiert. In das Röhrchen mit der Blindprobe wird lediglich Pufferlösung eingefüllt, und in das «Null»-Röhrchen wird kein Estradiolstandard gegeben, sondern lediglich 300 pg/ml Haptenkonjugat in Pufferlösung. Nach 2 Stunden Inkubation werden die Lösungen dekantiert, die Röhrchen werden mit Puffer-PBS gewaschen, und es wird in jedes Röhrchen 1 ml Reagens Peroxidase-Anti-DNP-Kon-jugat, verdünnt im Verhältnis von 1:1000, zugegeben, und die Röhrchen werden 2 Stunden bei Zimmertemperatur inkubiert.
Die Lösungen werden durch Aspiration (Aufsaugung) entfernt, und die Röhrchen werden sorgfältig zweimal mit PBS 0,02% Tween 20 und zweimal mit Wasser gewaschen. Dann wird in jedes Röhrchen 1 ml Substratlösung gegeben, und man lässt die Enzymreaktion 30 bis 60 Minuten lang ablaufen. Die Enzymreaktion wird durch Zugabe von 0,1 ml 0,1 n Natronlaugelösung unterbrochen. Die Adsorption wird bei 450 nm gemessen, und die OD-Ablesungen werden auf halblogarithmisches Papier gegen steigende Konzentrationen an Estradiol in Picogramm/ml aufgetragen.
4. Ergebnisse
Die Eichkurve überdeckt einen Bereich von 5 bis 1000 pg/ml Estradiol, konkurrierend mit 300 pg/ml Estradiol-DNP-Antigen an den Antikörperstellen auf der Polystyroloberfläche.
Tabelle I zeigt die Inhibitionskurve als direkte kolorime-trische Ablesungen der Adsorption gegen die Konzentrationen an Estradiol bzw. Estradioloxim, die in der Probe vorhanden sind.
Tabelle I
Enzymbestimmungsverfahren für Estradiol
Estradiol Null 12,5 pg/ml 25 pg/ml 50 pg/ml 5 100 pg/ml 250 pg/ml 500 pg/ml
0,608 0,432 0,354 0,275 0,191 0,130 0,106
Antigenkonzentration
Estradiol-6-CMO-Null 5 pg/ml 15 pg/ml 50 pg/ml
150 pg/ml 500 pg/ml 1000 pg/ml
OD 450nm
(Hintergrund substrahiert)
0,632
0,594
0,450
0,402
0,332
0,204
0,152
io Tabelle II zeigt den prozentualen Anteil an Gesamtenzymaktivität, die als Ergebnis der Inhibierung durch Estradiol oder Estradioloxim an beschichtete Tuben gebunden festgestellt wurde.
ls Tabelle II
Enzyminhibierungsbestimmung von Estradiol (E.I-. A.)
Antigenkonzentration
20
Estradiol-6-CMO-Null
5 pg/ml
15 pg/ml
25 50 pg/ml
150 pg/ml
500 pg/ml
1000 pg/ml
30 Estradiol Null 12,5 pg/ml 25 pg/ml 50 pg/ml 100 pg/ml 35 250 pg/ml 500 pg/ml
Prozent an gebundener enzyma-tischer Aktivität E/E0 X100 100 94 71 64 52 32 24
100 83 71 56 39 20 17
Die Neigung der Reaktion wird sehr stark durch die Affinitätskonstanten beider Antigene zum Antiserum, das zum 40 Beschichten der Polystyrolröhrchen verwendet wird und durch die Qualität des spezifischen Peroxidasereagens beein-flusst.
Der Substitutionsgrad des Haptenkonjugats ist von entscheidender Bedeutung für die Bestimmung. Im Prinzip stel-45 len die optimalen Bedingungen ein Kompromiss zwischen der Leichtigkeit des Nachweises des makromolekularen oder niedrigmolekularen Teils des Haptenkonjugats und der Empfindlichkeit des immunologischen Systems auf der festen Phase dar.
50
Beispiel 2 Bestimmung von Estradiol Auf der Basis von Estradiol-6-carboxymethyloxim-ovalbumin 55 1. Beschreibung der Bestimmung
Eine Menge an Estradiol-6-CMO-Ovalbumin-Konjugat wird zu einer Estradiol enthaltenden Probe gegeben und die Mischung wird in einem Polystyrolröhrchen, das mit Anti-estradiol beschichtet ist, inkubiert. Die Menge an Estradiol-6-60 CMO-Ovalbumin, die an das Röhrchen gebunden ist, ist umgekehrt proportional zu der Menge an Estradiol in der Probe. Die tatsächliche Menge an Estradiol-6-CMO-Ovalbumin wird mittels Verwendung von peroxidasemarkierten Anti-ovalbumin-Antikörpern bestimmt, gefolgt von Zugabe von 65 Peroxidasesubstrat und kolorimetrischer Bestimmung.
Beispiel 3 Bestimmung von Estradiol
645 465
Auf der Basis von Estradiol-6-carboxymethyloxim-lysozym
1. Beschreibung der Bestimmung
Eine Menge an Estradiol-6-CMO-Lysozymkonjugat wird zu einer Estradiol enthaltenden Probe gegeben, und die Mischung wird in einem Polystyrolröhrchen, das mit Antiestra-diol beschichtet ist, inkubiert. Die Menge an Estradiol-6-CMO-Lysozym, die an das Röhrchen gebunden ist, ist umgekehrt proportional zu der Menge an Estradiol in der Probe. Die tatsächliche Menge an Estradiol-6-CMO-Lysozym wird mittels Verwendung von peroxidasemarkierten Antilysozym-Antikörpern bestimmt, gefolgt von Zugabe von Peroxidase-substrat und kolorimetrischer Bestimmung.
Beispiel 4
Bestimmung von Estradiol
Auf der Basis von Estradiol-6-carboxymethyloximarsa-niltyrosin
1. Beschreibung der Bestimmung
Eine Menge an Estradiol-6-CMO-Arsaniltyrosinkonjugat wird zu einer Estradiol enthaltenden Probe gegeben, und die Mischung wird in Polystyrolröhrchen, die mit Antiestradiol beschichtet sind, inkubiert. Die Menge an Estradiol-6-CMO-Arsaniltyrosin, die an das Röhrchen gebunden ist, ist umgekehrt proportional der Menge an Estradiol in der Probe. Die tatsächliche Menge an Estradiol-6-CMO-Arsaniltyrosin wird mittels Verwendung von peroxidasemarkierten Antiarsanil-antikörpern bestimmt, gefolgt von Zugabe von Peroxidase-substrat und kolorimetrischer Bestimmung.
Beispiel 5
Bestimmung von Serum Thyroxin
1. Materialien a) Die Antigen T4BSA zur Herstellung von Antithyroxin-serum wurde aus Thyroxinpentahydrat, Natriumsalz (Sigma, USA) 50 mg und Rinderserumalbumin 100 mg, hergestellt, wobei 135 mg l-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodi-imidhydrochlorid für die Herstellung des Konjugats verwendet wurden. Die Charakterisierung und Wertbestimmung des Konjugats erfolgte spektrophotometrisch durch Aufnahme der UV-Absorptionsspektren des Thyroxinrestes bei 324 nm und des Proteinmoleküls bei 280 nm, und es wurde ein Verhältnis von 20 Thyroxinresten zu einem Molekül BSA festgestellt. Das Produkt wurde zur Immunisierung verwendet.
b) Das Antithyroxinserum wurde durch Immunisierung von Kaninchen auf folgende Weise hergestellt: 2,5 mg Anti-gen-T4-BSA in Salzlösung mit 0,5 ml Bordetella Pertusis in 2,5 ml vollständigem Freunds Adjuvans wurde intradermal injiziert. Verstärkungsinjektionen (booster injections) wurden 3V2 Monate nach der primären Immunisierung und in 1-Mo-nats-Intervallen danach verabreicht, wobei die gleichen Mengen an Antigenmischung ohne Bordetella Pertusis-Zugabe verwendet wurden. Grössere Blutentnahmen wurden 7 bis 12 Tage nach den Injektionen vorgenommen.
c) Die Gammaglobulinfraktion von Antithyroxinserum wurde durch Ammoniumsulfatausfällung isoliert, gefolgt von DEAE-Cellulose Chromatographie und Reinigung von Anti-BSA-Antikörpern durch Immunoabsorption an BSA-Agaro-se-Säulen (6 mg/ml). Die gereinigte Fraktion von Antithyro-xin wird in der Bestimmung als Beschichtungslösung zur Herstellung von mit Antikörper beschichteten Polystyroloberflächen verwendet.
d) Meerrettichperoxidasekonjugat von Anti-BSA-Serum wurde aus IgG-Fraktion von Anti-BSA-Serum (Miles
65-111) und Meerrettichperoxidase (Miles 36-451) durch Konjugation mit Glutaraldehyd hergestellt. Das Peroxidase-konjugat wurde an Sephadex G-200-Säulen gereinigt, und das Molverhältnis von Gammaglobulin zu Enzym wurde durch UV-Absorption bestimmt. Das in der Bestimmungsmethode verwendete Konjugat hatte ein Molverhältnis von 1:1.
e) Polystyrolröhrchen (75 x 12 mm; Lab-Tek, Cat. Nr. s 4411) wurden als feste Träger verwendet.
f) Thyroxinpentahydrat, Natriumsalz (Sigma) wird als Standardantigen verwendet.
g) Das für die Enzymreaktion verwendete Substrat besteht aus 120 mg 5-Aminosalicylsäure in 100 ml Phosphatpuf-
ìofer (0,02m; pH-Wert 6,5) und 1 ml l%iger Wasserstoffperoxydlösung.
h) Beschichtete Röhrchen werden wie folgt hergestellt: Die Polystyrolröhrchen werden mit Carbonatpuffer 0,05 m (pH-Wert 9,5) gewaschen und mit Beschichtungslösung (2
is ml), sorgfaltig verdünnt mit Phosphatpuffer-Salzlösung, gefüllt und 18 Stunden lang bei 4 °C aufbewahrt. Die Röhrchen werden bei 4 °C in 0,01 m Phosphatpuffer, 0,15 m Salzlösung (pH-Wert 7,4) (PBS) gelagert und können auf diese Weise mindestens 6 Monate lang ohne Verlust an Aktivität aufbe-2o wahrt werden.
2. Beschreibung der Bestimmung
Eine Menge an Thyroxin-BSA-Konjugat wird zu einer Thyroxin enthaltenden Probe gegeben, und die Mischung wird in einem Polystyrolröhrchen inkubiert, das mit Antithy-25 roxinantikörpern beschichtet worden ist. Die Menge an Thy-roxin-BSA, die an das Röhrchen gebunden ist, ist umgekehrt proportional der Menge an freiem Thyroxin in der Probe. Die tatsächliche Menge an Thyroxin-BSA wird mittels der Verwendung von peroxidasemarkierten Anti-BSA-Antikörpern 30 bestimmt, gefolgt von Zugabe von Peroxidasesubstrat und kolorimetrischen Bestimmungen.
Beispiel 6
Bestimmung von Serum Progesteron 35 1. Materialien a) Das Antigen zur Herstellung von Antiprogesteronse-rum wurde durch Kupplung von Progesteron-1 la-hemisucci-nat, 50 mg, mit Rinderserumalbumin, 200 mg, hergestellt, wobei 200 mg l-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodi-
40 imidhydrochlorid für die Konjugation verwendet wurden. Die Charakterisierung und Wertbestimmung des Konjugats Progesteron-1 la-BSA erfolgte spektrophotometrisch durch Aufnahme der UV-Absorptionsspektren des Progesteronrests bei 240 nm und des Rinderserumalbumins bei 280 nm; es 45 wurde ein Verhältnis von 24 Progesteronresten pro ein Molekül BSA festgestellt. Das Produkt wurde zur Immunisierung verwendet.
b) Das Antiprogesteron-1 la-BSA-Serum wurde durch Immunisierung von Kaninchen auf folgende Weise herge-
50 stellt: 2,5 mg des Antigen-Progesteron-1 la-BSA in Salzlösung mit 0,5 ml Bordetella Pertusis in vollständigem Freunds Adjuvans, 2,5 ml, wurde intradermal injiziert. Verstärkungsinjektionen wurden 3 l/i Monate nach der Primärimmunisierung verabreicht und dann in 1-Monats-Intervallen, wobei die glei-55 chen Mengen an Antigenmischung, ohne Bordetella Pertusis-Zugabe, verwendet wurden. Hauptblutentnahmen erfolgten 7 bis 12 Tage nach den Injektionen.
c) Die Gammaglobulinfraktion von Antiprogesteronse-rum wurde durch Ammoniumsulfatausfällung isoliert, ge-
6o folgt von DEAE-Cellulose-Chromatographie und Reinigung von Anti-BSA-Antikörpern durch Immunoadsorption an BSA-Agarose-Säulen (6 mg/ml). Die gereinigte Fraktion von Antiprogesteron wird in der Bestimmung als Beschichtungslösung zur Herstellung von mit Antikörpern beschichteten 65 Polystyroloberflächen verwendet.
d) Meerrettichperoxidasekonjugat von Anti-BSA-Serum wurde aus IgG-Fraktion von Anti-BSA-Serum (Miles
65-111) und Meerrettichperoxidase (Miles 36-451) durch
645465 6
Konjugation mit Glutaraldehyd hergestellt. Das Peroxidase- mit 0,5 ml Bordetella Pertusis in 2,5 ml vollständigem konjugat wurde an Sephadex G-200-Säulen gereinigt, und Freunds Adjuvans wurde intradermal injiziert. Verstärkungs-
das Molverhältnis von Gammaglobulin zum Enzym wurde injektionen wurden 31 ji Monate nach der Primärimmunisie-
durch UV-Absorption bestimmt. Das in der Bestimmung ver- rung vorgenommen und dann in 1-monatigen Intervallen,
wendete Konjugat hatte ein Molverhältnis von 1:1. 5 wobei dieselben Mengen an Antigenmischung verwendet e) Polystyrolröhrchen (75 x 12 mm; Lab-Tek; Kat. Nr. wurden, jedoch ohne Zugabe von Bordetella Pertusis. Haupt-4411) wurden als feste Träger verwendet. blutentnahmen erfolgten 7 bis 12 Tage nach den Injektionen.
f) Progesteron (Ikapharm, Code Nr. 2680) wird als Stan- c) Die Gammaglobulinfraktion von Anti-Prostaglandin dardantigen verwendet. F2a-Serum wurde durch Ammoniumsulfatfällung isoliert, ge-
g) Das für die Enzymbestimmung verwendete Substrat be- io folgt von DEAE-Cellulose-Chromatographie und Reinigung steht aus 120 mg 5-Aminosalicylsäure in 100 ml Phosphatpuf- von Anti-BSA-Antikörpern durch Immunoadsorption an fer (0,02 m; pH-Wert 6,5) und 1 ml 1 %iger Wasserstoffper- BSA-Agarose-Säulen (6 mg/ml). Die gereinigte Fraktion von oxydlösung. Anti-Prostaglandin F2a wird in der Bestimmung als Beschich-
h) Beschichtete Röhrchen werden wie folgt hergestellt: tungslösung zur Herstellung von mit Antikörpern beschichte-Die Polystyrolröhrchen werden mit Carbonatpuffer (0,05 m; 15 ten Polystyroloberflächen verwendet.
pH-Wert 9,5) gewaschen und mit Beschichtungslösung (2 ml), d) Meerrettich-Peroxidasekonjugat von Anti-BSA-Serum sorgfältig verdünnt mit Phosphatpuffersalzlösung, gefüllt wurde aus 1 g Fraktion von Anti-BSA-Serum (Miles 65-111) und 18 Stunden lang bei 4 °C aufbewahrt. Die Röhrchen wer- und Meerrettich-Peroxidase (Miles 36-451) durch Konjuga-den in 0,01 m Phosphat, 0,15 m Salzlösung, pH-Wert 7,4 tion mit Glutaraldehyd hergestellt. Das Peroxidasekonjugat (PBS) bei 4 °C gelagert und können auf diese Weise minde- 20 wurde an Sephadex G-200 Säulen gereinigt, und das Molverstens 6 Monate ohne Aktivitätsverlust aufbewahrt werden. hältnis von Gammaglobulin zum Enzym wurde durch UV-
2. Beschreibung der Bestimmung Absorption ermittelt. Das in der Bestimmung verwendete
Eine Menge an Progesteron-BSA-Konjugat wird zu einer Konjugat hatte ein Molverhältnis von 1:1.
Progesteron enthaltenden Probe gegeben, und die Mischung e) Polystyrolröhrchen (75 x 12 mm; Lab-Tek; Kt. Nr.
wird in einem Polystyrolröhrchen, das mit Antiprogesteron- 25 4411) wurden als feste Träger verwendet.
Antikörpern beschichtet ist, inkubiert. Die Menge an Proge- f) Prostaglandin F2a (ein Geschenk von Dr. F. Kohen)
steron-BSA, die an das Röhrchen gebunden ist, ist umgekehrt wird als Standardantigen verwendet.
proportional der Menge an freiem Progesteron in der Probe. g) Das für die Enzymreaktion verwendete Substrat be-
Die tatsächliche Menge an Progesteron-BSA wird mittels steht aus 120 mg 5-Aminosalicylsäure in 100 ml Phosphatpuf-
Verwendung von peroxidasemarkierten Anti-BSA-Antikör- 30 fer (0,02 m; pH-Wert 6,5) und 1 ml 1 %iger Wasserstoffper-
pern bestimmt, gefolgt von Zugabe von Peroxidasesubstrat oxydlösung.
und kolorimetrischen Bestimmungen.
h) Beschichtete Röhrchen werden wie folgt hergestellt:
Beispiel 7 Die Polystyrolröhrchen werden mit 0,05 m Carbonatpuffer
Bestimmung von Prostaglandin F2 35 (pH-Wert 9,5) gewaschen und mit Beschichtungslösung (2
1. Materialien ml), sorgfältig verdünnt mit Phosphatpuffersalzlösung, ge-
a) Das Antigen zur Herstellung von Antiprostaglandin füllt, und 18 Stunden lang bei 4 °C aufbewahrt. Die Röhrchen F2a-BSA-Serum wurde durch Kupplung von Prostaglan- werden in 0,01 m Phosphat, 0,15 m Salzlösung, pH-Wert 7,4 din-F2a (20 mg) und Rinderserumalbumin (80 mg) unter Ver- (PBS) bei 4 °C gelagert und können auf diese Weise minde-wendung von 80 mg l-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-car- 40 stens 6 Monate lang ohne Aktivitätsverlust gelagert werden, bodiimid-hydrochlorid zur Konjugation hergestellt. Das 2. Beschreibung der Bestimmung
Endprodukt wurde mittels UV-Absorption berechnet, indem Eine Menge an Prostaglandin F2a-BSA-Konjugat wird zu
Spektren von BSA bei 280 nm genommen wurden, das Kon- einer Prostaglandin F2a enthaltenden Probe gegeben, und die jugat wurde erforscht mit tritiiertem Prostaglandin F2a (5,6, Mischung wird in Polystyroltuben, die mit Antiprostaglandin
8,9,11,12,14,15 3H) N.E.N. NET-433. Es wurde festge- 45 F2a-Antikörpern beschichtet sind, inkubiert. Die Menge an stellt, dass 15 Reste von Prostaglandin F2a pro BS A-Molekül Prostaglandin F2a-BSA, die an das Röhrchen gebunden ist,
gebunden sind. Das Produkt wurde für die Immunisierung ist umgekehrt proportional zu der Menge an freiem Prosta-
verwendet. glandin F2a-BSA in der Probe. Die tatsächliche Menge an b) Das Anti-Prostaglandin F2a-BSA-Serum wurde durch Prostaglandin F2a-BSA wird mittels peroxidasemarkierter Immunisierung von Kaninchen auf folgende Weise herge- 50 Anti-BSA-Antikörper bestimmt, gefolgt von Zugabe von stellt: 2,5 mg Antigen-Prostaglandin-1 l2a-BSA in Salzlösung Peroxidasesubstrat und kolorimetrischer Bestimmung.
C
Claims (10)
1. Immunbiologisches Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Haptenen, dadurch gekennzeichnet, dass a) das zu bestimmende Hapten X in ein Konjugat übergeführt wird, das geeignet ist, Antikörperbildung hervorzurufen; und das dieses Konjugat einem Säugetier injiziert wird, wodurch ein spezifischer Antikörper gegen das Hapten erzeugt wird, nämlich das Anti-X,
b) ein Konjugat des Haptens X und eines anderen Gebildes Y, das entweder ein anderes Hapten oder ein grösseres Molekül ist, hergestellt wird,
c) einem Säugetier das Gebilde Y injiziert wird, wenn Y ein grösseres Molekül ist, oder ein Konjugat desselben injiziert wird, falls Y ein kleines Molekül ist, das selbst keine Antikörperbildung hervorruft, so dass in dem Säugetier Anti-Y-Antikörper gebildet werden,
d) ein Konjugat eines geeigneten Enzyms und des Antikörpers gegen Y, d.h. ein (Enzym)-(Anti-Y)-Konjugat, hergestellt wird,
e) die Antikörper gegen X, d.h. Anti-X, auf einem Festkörper adsorbiert werden,
f) der Feststoffträger mit einer Mischung, die eine unbekannte Menge des Haptens X und eine bekannte Menge des X-Y-Konjugats enthält, in Kontakt gebracht wird,
g) nicht umgesetztes X und nicht umgesetztes X-Y entfernt wird, wobei sämtliche Anti-X-Stellen besetzt zurückgelassen werden,
h) enzymmarkierter Antikörper zugesetzt wird,
i) ein geeignetes Substrat zugesetzt wird, das eine Farbreaktion hervorruft, die Intensität der Farbe gemessen wird, welche die Menge an gebundenem Enzym anzeigt, und aus Eichkurven die Menge an Hapten X berechnet wird.
2. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das zu bestimmende Hapten ein Hormon, Vitamin, Herzglykosid, Polypeptid, Narkotikum oder dergleichen ist.
3. Verfahren gemäss Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Hapten Estradiol, Progesteron, Prostaglandin, Thyroxin oder Trijodthyroxin ist.
4. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Gebilde Y Trinitrophenyllysin, Sulfanil-säure, p-Aminobenzöesäure, p-Azophenyl-ß-lactosid, Hip-pursäure, Jodacetylaminobenzolazohippursäure, 6-Carboxy-purin, 5-Acetyluracil, Thymidin, Uridin, Dinitrophenyllysin oder Arsaniltyrosin ist.
5. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Peroxidase, vorzugsweise Meerrettichperoxidase ist.
6. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der feste Trägerstoff eine geeignete polymere Substanz, vorzugsweise Polystyrol, ist.
7. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger in Form eines Rea-gensröhrchens vorliegt, das an seiner Innenseite mit Hapten-Antikörpern, nämlich Anti-X, beschichtet ist.
8. Verfahren gemäss einem der Patentansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger ein Polystyrolre-agensröhrchen ist.
9. Testausrüstung zur Durchführung des Verfahrens gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie standardisierte Präparate von Antihapten-Antikörpern, An-ti-X; Haptenkonjugat X-Y und enzymmarkierte Anti-Y-An-tikörper enthält.
10. Testausrüstung gemäss Patentanspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen festen Trägerstoff enthält, an den Antihapten-Antikörper adsorbiert sind.
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Family Cites Families (3)
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